（测试计量技术及仪器专业论文）基于单片机和fpga的cfpcr芯片系统研究.pdf

大连理工大学硕士学位论文 摘要 聚合酶链式反应( p c r ) 技术是一种基因片段体外扩增技术，在生物及医学相关领域 中得到广泛的应用。目前，绝大部分p c r 扩增反应是在传统的商业p c r 仪上进行的，由 于采用热容较大的金属块进行热循环温度控制，升温和降温的速度较慢，一个完整的 p c r 循环通常需要l h 2 h ，甚至更长的时间。另外，微流控检测系统中的毛细管电泳分 析已经能够在体积较小的芯片上完成，如果将连续流动式p c r 芯片( c f p c r ) 与其集成 在一起，将实现生化分析的集成化和微型化。因此，对p c r 芯片的研究成为p c r 反应装 置的研究热点之一。本文开展了基于单片机和f p g a 的c f p c r 芯片系统设计，主要从事 p c r 芯片制作、温度控制及扩增实现的研究。 本文采用微电子技术和微机械加工技术，制作了以玻璃为基体的微流通沟道芯片， 并完成了集p t 金属薄膜加热器和温度传感器于一体的硅基芯片加工，经封装后构成了 c f - p c r 芯片。设计了基于单片机和f p g a 开发平台的c f - p c r 芯片的智能温度控制系统， 该系统将温度控制算法从单片机中脱离出来，利用f p g a 来实现，发挥 f p g a 集成度高、 可靠性好、设计灵活、运算速度快等优点，可提高温度控制的精度。其中，单片机主要 实现a d 采样控制、键盘按键控制以及向f p g a 传送数据指令的功能；f p g a 主要实现温 度曲线拟合、p i d 控制算法以及p w m 波形产生等功能。单片机与f p g a 协同合作，结合 外部的硬件电路，完成了多通道温度信号的采集、转换与显示等功能，有效的实现了三 温区的恒温控制。 本文利用搭建的连续流动式p c r 芯片系统，采用植物d n a 样品进行了扩增实验，并 采用琼脂糖凝胶电泳检测方法对扩增产物进行电泳检测，实验结果证明本系统基本上可 实现d n a 样品的扩增，并大大缩短了p c r 反应时间。 关键词：连续流动式p c r 芯片( c f - p c r ) ；f p g a ；温度控镧；电泳检测 大连理工大学硕士学位论文 s t u d yo fc f p c rc h i pb a s e d o nm c ua n df p g a a b s t r a c t p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o nr p c r ) t e c h n o l o g yi sa1 c i n do fd n aa m p l i f i c a t i o nt e c h n i q u e o u t s i d et h eb o d y ，w h i c hh a sb e e nw i d e l ya p p l i e dt ob i o m e d i c i n ea n do t h e rr e l a t e df i d d s a t p r e s e n t , t h ev a s tm a j o r i t yo fp c r r e a c t i o ni sc a r r i e do u ti nt h et r a d i t i o n a lc o m m e r c i a l - p c i l w h i c hu s e sl a r g e rm e t a l st oc o n t r o lt h e r m a lc y c l i n gt e m p e r a t u r e b e c a u s em e t a lh a sb i gh e a t c a p a c i t y , t h ee l e v a t i a n dd e c r e a s es p e e do ft e m p e r a t u r ei ss l o w e r ac o m p l e t ep c rc y c l e u s u a l l yr e q u i r e slh 2 ha n de v l o n g e rp 甜o do f t i m e i na d d i t i o n ，c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s a n a l y s i so fm i c r o - f l u i d i cd e t e c t i o ns y s t e mh a sb e e na b l et oc o m p l e ti nas m a l l e rv o l u m ec h i p i ft h ec o n t i n u o u sf l o wp c rc h i p ( c f p c r ) a n dc a p i l l a r ye l c c t r o p h o r e s i sa n a l y s i sc h i pr r e i n t e g r a t e dt o g e t h e r , b i n c h e m i c a la n a l y s i sw i l la c h i e v ei n t e g r a t i o na n dm i n i a t u r i z a t i o n t h e r e 触，t h i sp a p e rd a s i g n sc f - p c rc h i ps y s t e mb a s e do nm c ua n df p g a ，w h i c hm a i n l y s t u d y so np c rc h i pp r o d u c t i o n 、a m p l i f i c a t i o na n dt e m p e r a t u r ec o n t r o ls y s t e m t h i sp a p e rf a b r i c a t e sac f p c rc h i p 、i t l lt h em i c r o e l e c t r o n i c t e c h n i q u e a n d m i c r o m e c h a n i c a lp r o c e s sb yu s i n gl a b o r a t o r yp r o - d e s i g n e dc f - p c rc h i pt e c h n o l o g yt e r r i t o r y , i n c l u d i n gam i c r of l o w - t h r o u g hc h i po f # a s sm a t e r i a l ，a n dt h r e es i l i c o nc h i p sc o n s i s to fp t m e m b r a n em i c r o h e a t e r sa n dt e m p e r a t u r es e 璐o r s n 圮i n t e l l i g e n c et e m p e r a t u r ec o n t r o l s y s t e mi sd e s i g n e db a s e do nm c ua n df p g ap l a t f o r m , w h i c hs e p a r a t e st h et e m p e r a t u r e c o n t r o la l g o r i t h mf r o mm c ub yu s i n gf p g at oa c h i e v e t h i sd e s i g nn o to n l yd i s p l a y sm a n y a d v a n t a g e so f f p g a ，s u c ha sh i g hi n t e g r a t i o n 、r e l i a b i l i t yw e l l 、d e s i g n i n gf l e x i b i l i t y 、f a s t e r c o m p u t i n gs p e e da n d8 0o n , b u ta l s eg r e a t l yi m p r o v e st h et e m p e r a t u r ec o n t r o lp r e c i s i o n a m o n gt h e m ，t h em c um a i n l yr e a l i z e sf u n c t i o n so fa ds a m p l i n gc o n t r o l ，k e y b o a r dk e y s c o n t r o la n dt r a n s m i t t i n gd a t ad i r e c t i v et of p g a ；f p g am a i n l yr e a l i z e sf u n c t i o n so f t e m p e r a t u r ec u r v ef i t t i n g p i dc o n t r o la l g o r i t h m , a sw e l la sp w m w a v e f o r mg e n e r a t o r w i t h t h ec o m b i n a t i o no fe x t e r n a lh a r d w a r ec i r c u i t , t h i ss y s t e mc o m p l e t e sam u l t i c h a n n e l t e m p e r a t u r es i g n a l si nt h ea c q u i s i t i o n 、c o n v e r s i o n 、d i s p l a ya n do t h e rf u n c t i o n s t h i ss y s t e m e f f e c t i v e l yr e a l i z a t e st h et h r e et e m p e r a t u r et h e r m o s t a tc o n t r 0 1 b yu s i n gc f - p c rc h i ps y s t e m , p l a n td n as a m p l ei sa m p l i f i e da n dt h ep c rp r o d u c ti s d e t e c t e db ym e a n so fa g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o wt h a t t h i s s y s t e mc a l lb a s i c a l l yr e a l i z et h ea m p l i f i t i o no f d n as a m p l e s k e yw o r d | ：c f - p c r ；f p g a ；t e m p e r a t u r ec o n t r o l ；e l e c t r o p h o r e s i sd e t e c t i o n i i l 一 独创性说明 作者郑重声明：本硕士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得大连理 工大学或者其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的贡献均已在论丈中做了明确的说明并表示了谢意 人连理上人学硕十研究生学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“大连理工大学硕士、博士学位 论文版权使用规定”，同意大连理工大学保留并向国家有关部门或机构送 交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连理 工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，也 可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。 作者签名： 趋墨! 鍪 导师签名匣童 2 壁2 年也月j 盟日 大连理工大学硕士学位论文 1绪论 1 1 课题的提出 生物芯片技术是近年来兴起的一项综合性的高新技术，被誉为是2 l 世纪生命科学 的支撑技术，它将像计算机芯片一样成为即将来临的又一次新兴技术革命的奠基石。生 物芯片是把生化分析中许多不连续的过程( 样品制备、化学反应和分离检测) ，通过采用 日趋成熟的微电子机械系统( m i c r oe l e c t r om e c h a n i c a ls y s t e m ，m e m s ) 工艺技术，制作 以硅、玻璃、石英等为衬底的芯片，使得整个生化反应过程微型化、集成化和连续化。 它将促使微全分析系统( m i c r ot o t a la n a l y s i ss y s t e m ，j t - t a s ) i j l 得到真正的实现，对生 命科学、医学诊断、医药开发、病毒检测以及食品与环境检测等领域都将产生重大影响。 生物芯片可分为三种不同的类型，即用于样品制备的生物芯片，生化反应生物芯片 及各种检测用生物芯片。这三种生物芯片分别用于生物化学分析的三个阶段，共同组成 了完整的分析系统【2 】。p c r 芯片是生物芯片的一种，按功能可归属于样品制备生物芯片， 它用来实现生物样品的扩增，是实现生物样品放大的关键器件。在目前的p c r 芯片研 究中，连续流动式p c r 芯片( c f - p c r ) 是一种动态、快速的p c r 芯片，与其它类型的 p c r 芯片相比，不仅具有更高的反应效率，更便捷的操作，同时也更方便与微全分析系 统的其它芯片相连接。在与p c r 扩增芯片集成在一起的芯片中，应用最多的是电泳( c e ) 分析操作芯片。毛细管电泳芯片( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sc h i p ，c e c ) 是以晶体硅、玻 璃、塑料( 主要指有机玻璃) 、陶瓷和硅橡胶为基体材料，借助毛细管电泳技术，将样品 进样、反应、分离和检测等过程集成到一起的微型实验室技术【3 1 。 研制p c r 芯片就是要实现d n a 样品的有效扩增，温度是影响p c r 扩增效率的一 个重要因素。目前，国内对于p c r 芯片温控系统的研究大都以单片机为核心，由于本 文采用p i d 算法处理温度采集数据，需进行大量快速的计算，采用f p g a 技术可实现更 高的采样运算速度。因此，设计了一种基于单片机和f p g a 的c f p c r 芯片温度控制系 统，并最终实现了样品的扩增。 本课题是国家自然科学基金项目“低电压驱动集成微流控生物芯片的研究”中的部 分研究内容( 基金号：6 0 5 7 4 0 9 2 ) 。 1 2p o r 生物芯片系统简介 p c r 是聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) 的简称，它是一种利用耐高温 d n a 聚合酶体外快速扩增d n a 的技术。p c r 技术能够快速、简便、高效地使一段选定 的目标d n a 片断在体外较短时间内扩增百万倍，是目前进展最快、应用最广的体外扩 基于单片机和f p g a 的c f - p c r 芯片系统研究 增技术。p c r 芯片是种用来进行p c r 反应的微装置。随着p c r 技术在诸多领域的广 泛应用【4 - 6 ，以及人们对分析仪器集成化和微型化的要求，传统的p c r 扩增仪器已经远 远不能满足人们对p c r 反应的需求，因此，寻求一种更加高效，小型化的p c r 反应装 置成为了日益迫切的任务。m e m s 技术的飞速发展为实现这种新型的p c r 反应装置提 供了有力的技术保障，并最终促使了p c r 芯片的出现。 目前在芯片上进行p c r 扩增反应，通常的实现模式有以下两种：一种是微反应腔 式p c r 芯片( m i c r o - c h a m b e rp c rc h i p ，m c c 鼬，另一种是连续流动式p c r 芯片 ( c o n t i n u o u s f l o wp c rc h i p ，c f - p c r ) 。 微反应腔式p c r 芯片 7 1 是传统p c r 扩增系统的微缩版，其基本特征是在基片上加 工出一个或多个微反应腔，用于储存反应液。腔体上部用盖片密封并留有进出口，通过 在外部对这个密闭系统进行循环加热和降温，实现d n a 扩增目的，其结构如图1 1 所 示。微反应腔式p c r 芯片在温度循环过程中一般需要依靠静态空气进行冷却，由于冷 却速率有限，限制了芯片的整体效率。但是该种p c r 芯片体积较小，结构简单，较容 易实现批量生产，带4 成一次性的p c r 芯片。 图1 1 一种单反应腔型p c r 芯片示意图 f i g 1 1 s c h e m a t i c d r a w i n g o f as i n g k - c h a m b e r p c r c h i p 连续流动式p c r 芯片与微反应腔式p c r 芯片相比较，在实现机理上类似于做了 t i m e - s p a c ec o n v e m i o n ( 时空转换) 。它是利用微加工工艺在衬底上形成逶迤形通道口1 ，使 得反应物在微通道中沿着三个固定的温区连续循环流动，经历变性、退火和延伸过程， 每流过三个温区次就完成一次温度循环，也即完成了一次扩增反应。与微池芯片相比， 连续流动式p c r 芯片所需的反应时间短( 可以在9 0 s 1 5 8 m i n 内完成多于2 0 个的扩增循 大连理工大学硕士学位论文 环) ，能够实现快速化地批量进样分析，且易于和分离、检测系统相连接，其结构如图 1 2 所示。 i 了 厂卉 _ jf t 融r o ；誊 ；e i 卜 图1 2 一种连续流动式p c r 芯片示意图 f i g 1 2s c h e m a t i cd r a w i n go r ec f - p c rc h i p 当前，连续流动式p c r 芯片成为p c r 芯片一个重要的发展方向，引起各国科学研 究人员的越来越多的关注，主要有以下几个方面的原因【9 】： ( 1 ) 在实际d n a 高温解链时，样品液体的温度高达近1 0 0 c ，为了避免d n a 样品 液体自由液面的蒸发，样品液体必须首先驱动到恰当位置进行热循环反应，然后p c r 产物又被驱离反应位置。连续流动式p c r 芯片在操纵小体积样品液体运动时不仅方便 而且密封性好，从而能有效避免样品液体的蒸发。 ( 2 ) 连续流动式p c r 芯片是动态式反应器，动态式芯片反应器具有快速温度变化 的独特性质。在整个反应过程中，只有通道中流动液体的温度发生改变，通道壁的温度 却维持恒定，从而解决了微反应腔式p c r 芯片需要不断升温和降温的过程，提高了反 应效率。 ( 3 ) 在连续流动式p c r 芯片中，由于反应混合液处于流通状态，初始反应液的注 入与反应产物的输出都更加方便，而且这使得它可以非常方便地与毛细管电泳芯片相连 接。形成完整的分析系统。 在传统的生化分析中，从样品制备、扩增直到最后的检测，每一步都离不开温度控 制，对于p c r 扩增反应来说，温度更是关系到扩增反应成败的关键所在【io 】。为了能够有 效地进行d n a 的p c r 扩增，温度控制应满足以下几点要求：( 1 ) 热均匀性；( 2 ) 温度控制 的精度；( 3 ) 重复性；( 4 ) 加热和冷却的速度：( 5 ) 可靠性：( 6 ) 试验和操作的综合成本； 基于单片机和f p g a 的c f - p c r 芯片系统研究 ( 7 ) 物理尺寸。另外还有扩增器的自动化程度，多功能等方面的要求。按上述要求，对 传统p c r 扩增仪器的设计来说，是很难完全达到要求的。因此，必须进行革命性的变革。 而正是在同一时期，将得到迅猛发展的微机械技术应用至l j p c r ： y 增芯片的研究与发展是 必然的选择。 要把所有的生化分析都移植到生物芯片上进行，温度控制成了其中不可或缺的重要 部分。温度控制包括动态温度控制和恒温控制，由于生物芯片小型化的特点，使得生物 芯片装置的热交换和传统仪器的热交换有显著的不同，对温度控制提出了更新的要求， 主要体现在以下几点： ( 1 ) 加热物质体积少，一般只有几十微升，所以和外界进行热交换的物质体系对其 影响较大，测温和加热过程干扰较大，比较难以控制，而且热损耗相对来说较大。 ( 2 ) 因为加热的样品体积少。加热区的容器体积也小，不易进行直接温度测量。 ( 3 ) 为防止样品蒸发，加热环境密闭性要好，快速的动态温度变化不易实现。 ( 4 ) 由于生物特异性，温度控制精度要求一般不超过l 。 综上所述，传统的温度控制方法能否有效地应用于生物芯片装置系统中，还必须进 行进一步的研究和验证。 1 3p c r 生物芯片温度控制的研究现状 在对生物芯片领域中所采用的温度控制方法进行分析后发现目前针对生物芯片所 采用的各种温度控制方法，都是利用传统生物实验的各种做法，在p c r 生物芯片中，主 要利用了以下两种加热方法： ( 1 ) 与芯片分离的加热方法 主要是利用帕耳帖加热原理，这种方法采用的较多。可以实现加热和降温双向温度 控制，其特点是不需任何制冷剂，无滑动部体，无噪声，体积小，如果改变电流方向， 就可实现致冷工况和加热工况的转变。 ( 2 ) 集成芯片的温度控制加热方法 一些p c r 芯片利用m e m s 技术，把加热器件集成在p c r 芯片上，国内外很多p c r 芯 片的制作都是在芯片上集成了加热器件和温度传感器。 中科院电子研究所传感技术国家重点实验室的赵湛等【1 2 1 ，在反应腔式p c r 芯片上， 制作了如图1 3 所示的集成了铂的加热器和温度传感器。 大连理工大学硕士学位论文 图1 3 集成p c r 芯片的加热器和传感器图形 f i g 1 30 r a p h i c s o f h e a t e r a n d m s m o f i n t e g r a t e d p c r c h i p 香港大学的1 1 1 0 m 嚣m h l e e 和i m i n gh s i n g 等人制作了一种p c r - c e 芯片，其中 p c r 扩增部分采用微池式。这种芯片将p c r - c e 集成于硅片上，反应池尺寸为 5 8 m m x 3 7 r a m 0 3 5 m m ，与玻璃片键合。铂薄膜温度传感器与加热器位于微池底部。芯 片结构如图1 4 所示。 图1 4 集成加热器和温度传感器的p c r 芯片结构图 f i g 1 4 s c h e m a t i cd r a w i n g so f h e a t e ra n ds e 日k q o t o f i n t e g r a t e dp c r c h i p 基于单片机和f p ( 3 a 的c f - i c r 芯片系统研究 y u c h e n gl i n t l 4 】用散热快的硅片为基片，p y r e x 7 7 4 0 为盖片。为了便于样品的取出， 微反应池设计成微管道式( 宽1 2 0 0 9 m ，深2 0 0 i _ t m ，总长为2 5 c r a ，体积为6 0 9 l ) 。整个 装置包括一个基于p c 的p i d 控制器，用来控制继电器、风扇和热电偶等装置，其结构 如图1 5 ( a ) 所示。温度控制结构如图1 5 ( b ) 所示，温度由r t d ( p t l 0 0 ) 检测，通过转换 器并经数据处理分析后又回到p c 。利用该系统扩增丙肝相关基因片段，3 0 个循环只需 要3 0 m i n 。 ( a ) p c r 芯片结构图( b ) 温度控制结构图 图1 5p c r 芯片及温度控制系统结构图 f i g 1 5 s c h e m a t i cd r a w i n g so f p c rc h i pa n dt e m p e r a t u r ec o n t r o l 町岫 传统的p c r 热循环仪加热装置体积大、热容大、效率低，加热和致冷的速度慢，同 时需耗用大量昂贵的生化试剂，因此工作效率较低。在p c r 芯片的背面直接集成微加热 器和温度传感器进行在片实时温度控制，可以大大提高p c r 芯片温度控制的准确性和灵 敏度。2 0 0 1 年赵湛等人【1 5 1 提出了一种基于单片机的小型温度控制装置，该装置体积小， 温度控制自动化，但是该系统的程序固定，功能简单，不能有效的进行实时温度显示， 该芯片采用空气散热，降温速度较慢，尤其是整个系统只能控制单个芯片，不能满足现 代生物和化学分析中高通量信号快速检测的要求。 北京航空航天大学的徐平，余威，王健桦等【”】设计了一种采用自校正模糊p i d 控制 算法的p c r 芯片实验室温度控制系统。该系统将模糊推理控制与p i d 控制相结合，利用 p c r 芯片上溅射的p t 电阻获取温度信号，通过p i d 精确输出控制在芯片背面直接制备的 微加热器和外加的半导体致冷器件，实现了p c r 芯片的高精度快速变温控制。p c r 芯片 温控系统硬件原理框图见图1 6 。系统以8 0 5 2 单片机作为主控单元，利用恒流源将p c r 芯片上铂电阻温度传感器的电阻变化转化为电压变化，通过1 6 位a d 转换器a d 7 7 0 5 采集 大连理工大学硕士学位论文 温度信号；半导体致冷器件和铂电阻加热器的控制通过单片机产生出两路可变占空比方 波输出( p w m ) ，经两个固体继电器( s s r ) 驱动后实现。系统带有r s 2 3 2 接口，控制过程 中的所有参数可以发送n p c 机保存，也可以利用p c 机对温控系统的控制过程进行观察 和调节。控制软件用c 语言编写，采用模块化结构设计，使用k e i l c 7 3 0 编译器。程序的 主要模块包括数据采集、模糊判断、p i d 控制、信号输出、上位机通信等。 图1 6p c r 芯片温控系统硬件原理框图 f i g 1 6 s c h e m a t i cd i a g r a mo f p c rm i c r o c h i pt e m p e r a t u r ec o n t r o l l e r 中科院的邹志清等人【i 刀研制了一种基于p c 机的温度控制系统，该温度控制装置的 硬件结构如图1 7 所示。芯片的微加热器与温度传感器通过接口连接到控制电路中，温度 传感器的温度信号分别经过信号转换电路、信号处理模块、和d a q 卡( p c - 6 3 1 5 ) 连接到 p c 机，p c 机通过v b 编程的程序对数据进行运算、比较、分析，将温度信息在输出设备 上实时显示，同时将控制反馈信号通过d a q 卡输出，控制芯片加热器的电源开关，从而 实现芯片的温度实时控制。此外，一个电压基准电压模块和稳压可调电源用于整个电路 的电力驱动，若要进一步提高芯片的散热效率，也可以增加微型冷却装置( 如风扇、p e l t i e r 等) 。整个控制装置采用微电子元器件焊接封装，体积小，功耗低，稳定性高。是一种 便携式的设备。 基于单片机和f p g a 的c f - i c r 芯片系统研究 图1 7 温度控制装置的结构示意图 f i g 1 7s c h e m a t i cd r a w i n g so f t e m p e r a t u r ec o n t r o ls y s t e m 由国内外的研究状况可以看出，目前大多数的p c r 温度控制部分或采用传统的热 循环仪，或采用p c 机作为控制核心，不便于真正实现p c r 芯片的便携化。因此，仍然 有必要研究一种稳定可靠的、脱离p c 机控制的p c r 芯片温度控制系统 1 4 本文的主要工作 本文开展基于单片机和f p g a 的c f p c r 芯片系统的研究。主要工作有以下三个方 面： ， ( 1 ) 研制基于m e m s 技术的p t 薄膜温度传感器和加热器，并在m e m s 实验中心制 作以玻璃为基体的p c r 芯片。 ( 2 ) 通过分析p c r 反应过程对温度控制的要求，设计基于单片机和f p g a 开发平 台的智能温度控制系统，实现快速、稳定的控温效果，保证芯片能够进行良好的p c r 扩增反应。 ( 3 ) 对p c r 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，比较商用p c r 扩增仪与本文制作 的p c r 芯片的扩增效果，分析影响扩增效率的原因，并提出改进办法，有利于芯片的 进一步研究和实际应用。 大连理工大学硕士学位论文 2 温度控制系统的设计基础 2 1 p o r 反应原理及条件 2 1 1 p o r 反应原理 p c r 扩增d n a 的原理是 i g l ：先将含有所需扩增分析序列的靶d n a 双链经热变性 处理解开为两个寡聚核苷酸单链，然后加入一对根据已知d n a 序列由人工合成的与所 扩增的d n a 两端邻近序列互补的寡聚核苷酸片段作为引物，即左右引物。此引物范围 由所欲扩增的d n a 片段决定，一般需2 0 - 3 0 个碱基对，过少则难保持与d n a 单链的结 合。引物与互补d n a 结合后，以靶d n a 单链为模板，经反链杂交复性( 退火) ，在t a q d n a 聚合酶的作用下以4 种三磷酸脱氧核苷( d n t p ) 为原料，按5 - 到3 ，方向将引物延伸， 自动合成新的d n a 链，使d n a 重新复制成双链，然后又开始第二次循环扩增。引物 在反应中不仅起引导作用，而且起着特异性的限制扩增d n a 片段范围大小的作用。新 合成的d n a 链含有引物的互补序列，并又可作为下一轮聚合反应的模板。如此重复上 述d n a 模板加热变性双链解开、引物退火复性、在d n a 聚合酶作用下的引物延伸的 循环过程，使每次循环延伸的模板又增加l 倍，亦即扩增d n a 产物增加1 倍，经反复 循环，使靶d n a 片段指数性扩增，其反应原理如图2 1 所示： r f r r y 覆艇d i 取硅 鼻步：羹性露链同氲键断裂- 簟链形哦 r r s r r lii y r r r iii r - - 一3 j l - - 步：遇火引物与枫扳互补结台：r e r ii iiiiiiii i li iili i l 5 ，一y3 s 1 iiiiiiiiiiiiiiiiii r 一3 ， 簟三步：蘑伸堪延伸，髟成新的积链m 图2 ，1p c r 反应原理图 f i g 2 1 s c h e m a t i cd r a w i n go f p c r 基于单片机和f p g a 的c f - p c r 芯片系统研究 2 1 2p c r 反应条件及其影响 p c r 的反应条件及其产生的影响如下【1 9 删： ( 1 ) 模板核酸 p c r 可以以d n a 或r n a 为模板进行核酸的体外扩增。不过r n a 的扩增首先逆转 录成e d n a 后才能进行p c r 循环。不同来源的核酸标本必须经处理后才能用于p c r 的 扩增，处理不当或处理过程中d n a 掉失都会导致p c r 扩增失败。采集标本方法不当， 未能获得所要检测的靶d n a 都会导致出现假阴性。但是，如果待扩增标本中模板d n a 浓度太高，也会导致扩增失败。 ( 2 ) 引物 p c r 结果的特冥性取决于引物的特异性，扩增产物的大小也是由特异引物限定的。 因此，引物的设计与合成对p c r 的成功与否起着决定性的作用。合成的引物必须经聚 丙烯酰胺凝胶电泳或反向高压液相层析( h p l c ) 纯化。因为合成的引物中会有相当数量 的“错误序列”，其中包括不完整的序列和脱嘌呤产物以及可检测到的碱基修饰的完整 链和高分子量产物，这些序列可导致非特异扩增和信号强度的降低。因此，p c r 所用引 物质量要高，且需纯化。冻干引物于2 0 至少保存1 2 - 2 4 个月，液体状态于- 2 0 可保 存6 个月。引物不用时应存于2 0 保存。 p c r 反应中引物的量也影响p c r 扩增效果，当p c r 引物量太低，则产物量降低， 会出现假阴性。引物浓度过高会促进引物的错误引导非特异产物合成，还会增加引物二 聚体的形成。非特异产物和引物二聚体也是p c r 反应的底物，与靶序列竞争d n a 聚合 酶，矾t p 底物，从而使靶序列的扩增量降低。一般认为p c r 反应中引物的终浓度为o 2 l l t m o f l 为宜，但我们实验发现，最适浓度远远低于此浓度。 ( 3 ) 缓冲液 p c r 反应的缓冲液的目的是给t a qd n a 聚合酶提供一个最适酶催反应条件。目前， 最为常用的缓冲体系为1 0 - 5 0 m m o l lt r i s - h c i ( p h s 3 8 8 ，2 0 ) 。t r i s 是一种双极性离 子缓冲液，2 0 1 2 时其p k a 值为8 3 ，a p k a 值为0 0 2 1 1 2 。因此，2 0 m m o l l t r i s h c i ( p h 8 3 ， 2 0 ) 在实际p c r 中，p h 变化于6 8 7 8 之间。改变反应液的缓冲能力，如将t r i s 浓度 加大到5 0 m m o l l ，p h g 9 ，有时会增加产量。 反应混合液中5 0 m m o l l 以内的k c i ，p h 8 9 ，有利于引物的退火，5 0 m m o f ln a c i 或5 0 m m o l l 以上的k c i 则抑制t a qd n a 聚合酶的活性。有些反应液中以n h + 4 代替 k ? ，其浓度为1 6 6 m m o f l 。反应中加入小牛血清白蛋白( 1 0 0 i t g n d ) 或明胶( o 0 1 ) 或 t w e e n2 0 ( 0 0 5 0 1 呦有助于酶的稳定，反应中加入5 m m o l l 的二硫苏糖醇( r r ) 也 大连理工大学硕士学位论文 有类似作用，尤其在扩增长片段( 此时延伸时间长) 时，加入这些酶保护剂对p c r 反应 是有利的。 ( 4 ) m 矿+ m 9 2 + 浓度直接影响着酶的活性与忠实性，这是t a qd n a 聚合酶活性所必需的。另 外它还影响着引物的退火，模板与p c r 产物的解链温度，产物的特异性，引物二聚体 的形成等。m f + 浓度过低时，酶活力显著降低；过高时。通常会导致非特异性扩增产物 的累积。p c r 混合物中的d n a 模板、引物和d n t t 的磷酸基团均河与m f + 结合，降低 m 9 2 + 实际浓度。因为t a qd n a 聚合酶需要的是游离m 9 2 + 。 ( 5 ) 三磷酸脱氧核苷酸( d n t p ) 四种脱氧核苷三磷酸( d a t p 、d c t p 、d g t p 、彻) 是d n a 合成的基本原料p c r 反应中d n t i 含量太低，p c r 扩增产量太少、易出现假阴性。过高的d n t i 浓度会导致 聚合将其错误掺入( 即所谓的“热力背信”) ，因此应当避免。一般认为最合适的d n t i 浓度为5 0 2 0 0 p m o l l 。d n t p 的质量也直接影响p c r 反应的成败。 ( 6 ) 耐热d n a 聚合酶 p c r 之所以能得到广泛应用，主要是因为t a qd n a 聚合酶取代了大肠杆菌d n a 聚合酶i 大片段。t a qd n a 聚合酶是从水生栖热菌t h e r m u sa q u a t i c 舳s ( t a q ) 中分离出的 热稳定性d n a 聚合酶，使用t a qd n a 聚合酶不仅简化了p c r 程序也极大地增加了 p c r 特异性及p c r 扩增效率。该酶的最适温度很高( 7 9 c ) ，使引物在高温下进行退火 和延伸，这样便增加了反应的总强度并减少了与错配引物的延伸。在p c r 反应中，每 1 0 0 t t l 反应液中含l - 2 5 9 lt a qd n a 聚合酶为佳，酶的浓度太低会使扩增产物产量降低， 如果酶的浓度太高则会出现非特异性扩增。t a qd n a 聚合酶保存不当而失活是p c r 实 验失败的常见原因。 ( 7 ) 温度循环参数 变性温度与时间 p c r 反应中模板d n a 的变性十分重要。只有完全性的模板d n a 和p c r 产物双链 完全解开，才能有效的和引物结合。这种结合是p c r 扩增的基础。变性温度越高，时 问越长变性就越充分。但温度过高、时间过长又会影响t a qd n a 聚合酶的活性，所以 通常选用变性温度为9 5 c3 0 s 为宜。在p c r 反应中第一个循环变性最重要，需时问较 长，因模板d n a 的链比较长。 复性温度与时问 变性温度是p c r 反应成败的关键，复性温度决定着p c r 的特异性。温度越低复性 越好，但是容易出现引物与靶d n a 的错配，增加菲特异性结合，温度太高不利于复性， 基于单片机和f p g a 的c f - p c r 芯片系统研究 大多数p c r 反应的复性温度在5 5 左右。确定了复性温度后，复性时间并不是关键因 素，但复性时间太长会增加非特异的复性。 延伸温度与时间 引物延伸温度一般为7 2 ( 2 ，这个温度既考虑了t a qd n a 聚合酶的活性，又考虑到 引物和靶基因的结合。不合适的延伸温度不仅会影响扩增产物的特异性，也会影响其产 量。7 2 c 时，核苷酸的合成速度为3 5 1 0 0 个核苷酸s ，这取决于缓冲体系、p h 值、盐 浓度和d n a 模板的性质。7 2 延伸i m i n 对于长达2 k b 的扩增片段是足够的。然而，延 伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。对很低浓度底物的扩增，延伸时间要长些。 循环数 循环数决定着扩增的产量。在其它参数都已优化的条件下，最适循环数取决于靶序 列初始浓度。靶序列的初始浓度较低时，要增加循环次数。另外，酶活性不好，或量不 足时也要增加循环次数，以便达到有效的扩增量。 2 2 温控系统相关原理 2 2 1p i d 控制算法 在制作p c r 芯片中，实现温度控制的关键技术是快速热循环和恒温控制。热循环 系统一般包括三部分：数据采集部分，数据处理单元，热发生单元。恒温控制要求三个 温区要在尽量短的时问内达到所设定的温度值，以使d n a 得到有效的扩增。为了达到 尽快地恒温控制，就需要采用一种有效的算法处理温度采集数据，通过数据的计算结果 来控制热发生单元的加热时间。在工业上常采用p i d 算法，本文也采用此算法【2 l 】。 在模拟控制系统中，控制器最常用的控制规律是p i g ) 控制。常规p i d 控制系统原理 框图如图2 2 所示，系统由模拟p d 控制器和被控对象组成。 p i d 控制器是一种线性控制器，它根据给定值r c t ) 与实际输出值砸) 构成控制偏差： 郇) = “f ) 一c ( f ) ( 2 1 ) 将偏差的比例( p ) 、积分( d 和微分( d ) 通过线形组合构成控制量，对被控对象进行 控制，故称p i d 控制器。其控制规律为： 螂啦瞅卅i 1p ) a t + 半1 ( 2 2 ) 或写成传递函数形式： 大连理工大学硕士学位论文 g ”器= 砟( 1 + 1 和哪) ( 2 3 ) 式中，k r 为比例系数；乃为积分时间常数；巧为微分时间常数。 图2 2 模拟p 1 1 ) 控制系统的原理框图 f i g 2 2 s i m u l a t i o nb l o c kd i a g r a mo f p i dc o n t r o ls y s t p i d 控制器各校正环节的作用如下： ( 1 ) 比例环节：及时成比例的反应控制系统的偏差信号印) ，偏差一旦产生，控制 器立即产生控制作用，以减少偏差。 ( 2 ) 积分环节：主要用于消除静差，提高系统的无差度。积分作用的强弱取决于积 分时闻常数乃，写越大，积分作用越弱，反之贝l j 越强。 ( 3 ) 微分环节：能反映偏差信号的变化趋势( 变化速率) ，并能在偏差信号变得太 大之前，在系统中引入一个有效的早期修正信号，从而加快系统的动作速度，减小调节 时问。 在实际的控制中，通常采用微机控制，因此需要采用数字p i d 算法。数字p i d 算法 主要分为位置式p i d 算法和增量式p i d 算法。下面介绍位置式p i d 算法。 在数字p i e ) 算法中，式( 2 2 ) 中的积分和微分项不能直接准确计算，只能用数值计 算的方法遥近。若温度的采样周期为r ，第n 次采样得到的输入偏差为e ( 的，调节器输 出为u ( k ) ，用求和代替积分，用后相差分代替微分，则有： i “d = e ( 分t ( 2 4 ) a e - ( t ) ；e ( k ) - = e 一( k - 1 ) ( 2 5 ) 出r 由式( 2 。2 ) 、( 2 4 ) 、( 2 ，5 ) 可以推出： 基于单片机和f p g a 的c f - p c r 芯片系统研究 “( 七) ：k p 【b ( 七) + 吾窆e u ) + e ( k ) - 彳e ( 一k - 1 ) 】 ( 2 6 ) 11 - 0 1