（食品科学专业论文）土霉素对异育银鲫毒性和残留研究.pdf

土霉素对异育银鲫毒性和残留研究 摘要 本试验以异育银鲫( a l l o g y n o g e n e f i cc r u c i a n ) 为实验对象，首先进行了土霉素对 异育银鲫的急性毒性试验，并在此基础上，设计了6 组不同土霉素剂量的饲料( o 、 1 0 0 、2 5 0 、6 2 5 、1 5 6 3 、3 9 0 7m g k g ) 并进行喂养试验，通过测定对生长、生理生化、 指标的研究，探讨其对异育银鲫的生理和毒理学影响。同时，通过测定土霉素在异 育银鲫组织中的残留消除规律，为水产品的食用安全性提供科学依据。 1 以体重为4 5 7 + _ 5 9 的异育银鲫为试验材料，2 6 c 条件下，测定腹腔注射土霉 素的2 4 h ，4 8 h ，9 6 h 的死亡率。结果表明腹腔注射后的2 4 h ，4 8 h ，9 6 hl d 5 0 分别为 1 9 0 9 k g 、1 3 0 9 k g 、1 2 0 9 k g ，初步表明土霉素对异育银鲫为低毒。 2 通过对6 组异育银鲫投喂添加不同剂量土霉素的饲料，于试验的第2 、4 、 6 、8 周末取样测定土霉素对异育银鲫的生长、鱼体营养成分及肝胰脏和肠道内消化 酶的活性的影响。结果表明：除剂量为1 0 0 m g k g 剂量组鱼体粗蛋白较对照组有显 著的影响( p 0 0 5 ) 和2 5 0m e c k g 剂量组中粗脂肪较对照组有显著影响，其他剂量 组中鱼体成分均较对照组无显著变化，且剂量高于6 2 5m g k g 时对异育银鲫的生长 呈轻微抑制作用。试验前期( o 4 周) ，土霉素对消化酶活性均呈促进作用；试验 后期( 4 8 周) ，高于2 5 0m e c k g 剂量组肠道蛋白酶活性在剂量时呈抑制作用，肝 胰脏脂肪酶活性和淀粉酶也都随剂量增加而逐渐减小，肠道内脂肪酶和淀粉酶活性 则变化不明显。 3 通过对6 组异育银鲫投喂添加不同剂量土霉素的饲料，于试验的第2 、4 、6 、 8 周末取样，测定土霉素对异育银鲫肝胰脏中的s o d 、c a t 、g s h p x 的活性，m d a 的含量及n a ll ( + a t p 酶活性的影响。结果表明，在喂养试验初期，各剂量组s o d 、 c a t 、g s h p x 的活性均被诱导，m d a 含量变化不明显；试验后期，剂量高于2 5 0 m g k g ，s o d 活性逐渐降低； c a t 活性随着剂量的增加先升后降，但仍然高于对照 组；g s h p x 活性呈上升趋势，并在剂量组1 5 6 3 m g l 【g 和3 9 0 7 m g l 【g 处升高明显；肝胰 脏中m d a 含量较对照组有显著的增加。n a + k + a t p 酶活性则不断降低。上述结果表 明，当土霉素剂量低于2 5 0m g k g 时，异育银鲫体内的抗氧化系统会诱导抗氧化酶活 性的增加清除体内的氧自由基；高于此剂量会导致体内的抗氧化系统失衡，肝胰脏 和鳃组织受损。 4 通过对6 组异育银鲫( a l l o g y n o g e n e f i cc r u c i a n ) 投喂添加不同剂量土霉素的 华中农业大学2 0 0 8 届硕+ 学位论文 饲料( o 、1 0 0 、2 5 0 、6 2 5 、1 5 6 3 、3 9 0 7m p d k g ) ，饲养两个月后，测定了土霉素对异 育银鲫血清生理生化指标的影响，同时采用聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法，对不同剂 量组异育银鲫的肝胰脏和肾脏内e s t 同工酶和s o d 同工酶进行了电泳分析，以了 解土霉素对异育银鲫的毒性机理。结果表明：小于2 5 0m g k g 剂量的土霉素对血清 生化指标都没有显著影响，大于2 5 0m g k g 剂量的土霉素能引起谷草转氨酶活性的 降低，总蛋白和白蛋白含量减少，而甘油三酯、葡萄糖、总胆固醇、尿素氮、肌酐 和血清钾离子含量都较对照组明显升高，肝胰脏和肾脏的两种同工酶活性都较对照 组明显减小，肝功能和肾脏机能明显发生障碍。 5 通过对6 组异育银鲫( a l l o g y n o g e n e f i cc r u c i a n ) 投喂添加不同剂量土霉素的饲 料( o 、1 0 0 、2 5 0 、6 2 5 、1 5 6 3 、3 9 0 7m g k g ) ，饲养两个月后，测定了土霉素对异育 银鲫脾脏指数，头肾指数，血清抗菌活力和溶菌酶活力，以评价土霉素对异育银鲫 非特异性免疫功能的影响。结果表明：土霉素对异育银鲫的异育银鲫的免疫器官指 数和抗菌活力的变化都没有明显的影响，仅最高剂量组溶菌酶活力有明显的下降。 土霉素对异育银鲫免疫器官发育没有明显的影响，仅对非特异性免疫功能有轻微的 影响。 6 利用高效液相色谱法研究土霉素在异育银鲫肝胰脏、肌肉中的残留与消除 规律，利用高效液相色谱法研究土霉素在异育银鲫肝胰脏、肌肉中的残留与消除规 律，确定了合适的色谱条件：流动相为乙腈0 o l m o l l 磷酸二氢钠水溶液( 体积比 7 7 ：2 3 ) ，p h2 5 ，3 5 5 n m 检测波长下检测。土霉素的线性范围为o 1 “n 1 l 一1 5 1 x g m l ， 在肝胰脏和肌肉中的回收率在8 0 5 4 一9 2 9 4 之间。在2 4 2 6 的水温条件下测定 土霉素在鲫鱼体内的残留结果表明：在肝胰脏中，o t c 的浓度在1 2 h 后达到最大值 6 2 4 m g k g ，4 8 h 后就降到较低的水平0 2 6 m g k g ，9 6 h 后低于o 1 m g k g ，在肌肉中 在9 6 h 后0 1 5m g l 【g 。 关键词：土霉素；异育银鲫；毒性；酶活性；生化指标；同工酶；残留 2 十霉素对异育银鲫毒性和残留研究 s t u d yo nt o x i c i t ya n dt i s s u ee l i m i n a t i o no fo x y t e t r a c y c l i n ei n a l l o g y n o g e n e t i cc r u c i a n a b s t r a c t e f f e c t so fo x y t e t r a c y c l i n eo np h y s i o l o g i c a la n dt o x i c o l o g yo fa l l o g y n o g e n e t i cc r u c i a n w e r ea n a l y s i z e db yd e t e r m i n i n gt h ei n d e xo fg r o w t h ，p h y s i o l o g ya n db i o c h e m i s t r ya f t e r t h ed i f f e r e n td o s a g e ( 0 、1 0 0 、2 5 0 、6 2 5 、1 5 6 3 、3 9 0 7m g k g ) w e r ef e dt oa l l o g y n o g e n e t i c c r u c i a ni no r d e rt oi n v e s t i g a t ea l la c u t et o x i nt e s to fo x y t e t r a c y c l i n et oa l l o g y n o g e n e t i c c r u c i a nc a r p t h et i s s u ee l i m i n a t i o no fo x y t e t r a c y c l i n ei na l l o g y n o g e n e t i cc m c i a nw a s a l s os t u d i e d t h er e s u l t sa l ea sf o l l o w s ： 1 t h ea l l o g y n o g e n e t i cc r u c i a nc a r p s ，b o d yw e i g h t ：4 5 7 - t 5 9 ，w e r ei n j e c t e dw i t h o x y t e t r a c y c l i n ef r o mp e r i t o n e u mw h e nt h ew a t e rt e m p e r a t u r ew a sk e p ta t2 6 c ，t h e m o r t a l i t yw a sn o t e da t2 4 h ，4 8 ha n d9 6 h t h er e s u l t ss h o w e dt h a tl d 5 0o ft h e2 4 h ，4 8 h a n d9 6 hw e r e1 9 0 g k g ，1 3 0g k ga n d 1 2 0g k g ，s e p a r a t e l y t h i si n d i c a t e dt h a t o x y t e t r a c y c l i n ew a sh y p o t o x i c i t yt oa 1 1 0 9 y n o g e n e t i cc m c i a nc a r p 2 af e e d i n gt r i a lw i t ha l l o g y n o g e n e t i cs i l v e rc m c i a nc a r pw a sc o n d u c t e dt os t u d y t h ei n f l u e n c eo fd i e t a r yo x y t e t r a c y c l i n e ( o 、1 0 0 、2 5 0 、6 2 5 、1 5 6 3 、3 9 0 7m g k g ) o n g r o w t hr a t i o ，n u t r i a n tc o m p o s i t i o na n dt h ea c t i v i t i e so fp r o t e a s e ，a m y l a s ea n dl i p a s ei n h e p a t o p a n c r e a sa n di n t e s t i n a lt r a c t t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec r u d ep r o t e i nc o n t e n to f t r e a t m e n tg r o u ph a das i g n i f i c a n td i f f e r e n c ef r o mt h ec o n t r o lg r o u p t h ec r u d el i p i d c o n t e n ts i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e di nt h e2 5 0m g k gg r o u pa n dt h ef i s hw e i g h td e c r e a s e d w h i l et h ed o s a g eo fo x y t e t r a c y c l i n ew a so v e r6 2 5m g k g t h ed i g e s t i v ee n z y m ea c t i v i t i e s w e r ei n d u c e di nt h ee a r l yp e r i o do ft h ee x p e r i m e n t i nt h el a t e rp e r i o do fe x p e r i m e n t ，t h e a c t i v i t i e so fp r o t e a s ei ni n t e s t i n a lt r a c td e c r e a s e dw h i l et h ed o s a g eo fo x y t e t r a c y c l i n ew a s a b o v e2 5 0m g k g ，t h el i p a s ea c t i v i t i e sa n d a m y l a s ea c t i v i t i e si nh e p a t o p a n c r e a sa l s o d e c r e a s e dw i t ht h ed o s a g ei n c r e a s i n gw h i l et h ed o s a g eo fo x y t e t r a c y c l i n ew a sa b o v e2 5 0 m g k g t h ec h a n g eo fl i p a s ea c t i v i t i e sa n da m y l a s ea c t i v i t i e si ni n t e s t i n a lt r a c tw e r en o t s i g n i f i c a n tc o m p a r i n gw i t hc o n t r o lg r o u pw h i l et h ed o s a g ew a sa b o v e2 5 0m g k g 3 c r u c i a nc a r pw a sf e dd i e t sc o n t a i n i n g0 ( c o n t r 0 1 ) ，1 0 0 ，2 5 0 ，6 2 5 ，1 5 6 3a n d3 9 0 7 m g k go fo x y t e t r a c y c l i n ef o r2m o n t h sr e s p e c t i v e l y ，t h ea c t i v i t i e so ft h r e ea n t i o x i d a n t 3 华中农业人学2 0 0 8 届硕十学位论文 e n z y m e s ，s u c h a s s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) ，c a t a l a s e ( c a t ) a n dg l u t a t h i o n e p e r o x i d a s e ( g p x ) ，a n dm a l o n a l d e h y d ( m d a ) a sp r o d u c t so fl i p i dp e r o x i d a n t w e r e d e t e r m i n e da ta ni n t e r v a lo ft w ow e e k sa f t e rt h ef i r s tf e e d i n g t h er e s u l t ss h o w e dt h a t s o da c t i v i t i e s ，c a ta c t i v i t i e sa n dg s h p xa c t i v i t i e so ft r e a t m e n tg r o u pw a si n d u c e di n t h ee a r l yp e r i o do ft h ee x p e r i m e n t i nt h el a t e rp e r i o do fe x p e r i m e n t ，s o da c t i v i t i e s g r a d u a l l yd e c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s eo fo x y t e t r a c y c l i n ed o s a g ew h i l et h ed o s a g e sa b o v e 2 5 0m g k g ；c a ta c t i v i t i e sa l m o s ti n c r e a s e dg r a d u a l l yw i t ht h ei n c r e a s eo fd o s a g eo f o x y t e t r a c y c l i n e ，b u tag r a d u a l l yd e c r e a s i n gt e n d e n c yo fc a t a c t i v i t i e sw i t ht h ei n c r e a s e o fd o s a g eo fo x y t e t r a c y c l i n ew a so b s e r v e dw h i l et h ed o s a g e sw e r eb i g g e rt h a n2 5 0m g k g ； a c t i v i t i e so fg s h p xs h o w e dar i s et r e n d m d ac o n t e n t sh a dao b v i o u si n c r e a s e ( p 9 3 ； 盐酸，磷酸，氯化钠，碳酸钠，氢氧化钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，钼酸钠， 钨酸钠，碘酸钾，碘化钾，可溶性淀粉，三氯乙酸，甲叉双丙烯酰胺，甘氨酸等均 为国产分析纯；牛血清蛋白，固兰r r ，氯化硝基四氮唑蓝，酪氨酸，三( 羟甲基) 氨基甲烷等为国产生化试剂；丙烯酰胺，聚乙烯醇，a 一醋酸萘酯，p 一醋酸萘酯等 为国产化学纯；m d a 试剂盒，s o d 试剂盒，g s h p x 试剂盒，c a t 试剂盒，n a + l ( + a t p 试剂盒，溶菌酶试剂盒等均购自南京建成生物工程研究所。 1 1 3 溶液的配制 生理盐水：分别称取氯化钠和氯化钾，溶于蒸馏水中，使成为含0 7 5 氯化钠和 0 0 3 氯化钾的水溶液，置于4 冰箱中保存备用。 0 0 2 5m o l l 磷酸氢二钠溶液的配制：将0 0 2 5m o l l 磷酸氢二钠8 4 m l 与0 0 2 5 m o l l 磷酸二氢钠1 6 m l 混合，即为0 0 2 5m o l l 磷酸缓冲液。 o 0 2m o l lp h7 5 磷酸缓冲液的配制：将o 0 2 m o l l 磷酸氢二钠溶液8 4 m l 与 o 0 2m o l l 磷酸二氢钠溶液1 6 m l 混合，即为0 0 2 m o l lp h 7 5 磷酸缓冲液。 o 5 酪素：称取酪蛋白0 5 9 ，以0 5 m o l l 氢氧化钠l m l 湿润，再加少量 十霉素对异育银鲫毒性和残留研究 o 0 2 m o l lp h 7 5 磷酸缓冲液稀释，在热水浴中溶解，定容至1 0 0 m l ，冰箱中可保存。 标准蛋白质溶液：精确称取2 5 m g 牛血清白蛋白溶于5 0 0 m l 蒸馏水中定容，使 浓度为5 0 0p g m l 。 聚乙烯醇( p v p ) 橄榄油乳化液：称取4 0 9 聚乙烯醇( 聚合度1 7 5 0 ) ，加蒸馏 水约1 0 0 0i n l ，在小火上加热，并不停搅拌，至聚乙烯醇全部溶解，冷却后定容至 1 0 0 0m l 。用双层纱布过滤，滤液备用。取4 聚乙烯醇溶液1 5 0 m l ，加5 0 m l 橄榄 油，用高速组织捣碎机搅动6 m i n ，即成乳白色聚乙烯醇橄榄油乳化液。低温下( 4 ) 保存备用。 0 4 9 l 的底物缓冲液：精确称取9 o g 氯化钠、2 2 6 1 9 无水磷酸二氢钠和1 2 5 9 无水磷酸二氢钾置于5 0 0 m l 去离子水中，加热至沸腾溶解，称取0 4 9 可溶性淀粉 于一小烧杯中，加入1 0 m l 蒸馏水，使其混匀后加入到上述沸腾溶液中，冷却至室 温后加入5 m l3 7 甲醛溶液，再用蒸馏水稀释到1 0 0 0 m l ，此即为p h7 0 ，浓度为 0 4 9 l 的底物缓冲液。 o 1 m o l l 碘贮存液：称取1 7 8 9 碘酸钾和2 2 5 9 碘化钾，溶于去离子水中，再 缓慢加人4 5 m l 浓盐酸，一边加一边搅拌，用重蒸馏水水稀释至5 0 0 m l ，充分混匀， 贮棕色瓶中，每月配制新鲜溶液，置4 c 冰箱中保存。 0 0 1m o l l 碘应用液：将碘储存液用蒸馏水稀释1 0 倍，储于棕色瓶中，置于4 冰箱中保存。 f o l i i 卜酚试剂( 1 ) ：4 n a 2 c 0 3 与o 2m o l ln a o h 溶液等体积混合配成碳酸钠 一氢氧化钠溶液，2 酒石酸钾钠溶液与1 硫酸铜等体积混合硫酸铜一酒石酸钾钠 溶液，然后将这两种溶液按5 0 ：1 的比例混合即为试剂甲。置于棕色的试剂瓶中保 存，现用现配。 分离胶缓冲液t r i s - - h c l ( p h8 8 ) ：称取6 0 6 9t r i s ，浓h c i 调p h 到8 9 加水 定容至1 0 0 m l 。 浓缩胶缓冲液t f i s - - h c l ( p h6 8 ) ：称取1 8 1 7gt r i s ，浓h c i 调p h 到6 8 ，加 水定容至1 0 0 m l 。 电极缓冲液：称取t r i s6 0 6 9 ，甘氨酸( g l y ) 2 8 8 9 ，用水定容至1 0 0 0 m l ( p h 8 3 ) ，用前稀释l o 倍。 凝胶储备液： 称取3 0 9 丙烯酰胺( a c r ) ，o 8 9 双丙烯酰胺( b i s ) ，溶解后定容 至1 0 0 m l 。 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 染色液的配制( 朱蓝菲，1 9 9 2 ) ：e s t 染液一固兰r r 盐1 0 0 m g ，溶于6 0 m lp h 值 为6 4 的磷酸缓冲液中，过滤后力h x , 1 0 m l 含2 0 m g a 醋酸萘酯和2 0 m g 的1 3 - 醋酸萘酯丙 酮溶液。s o d 染液一1 5 m gn b t ，1 5 m gp m s j i x , 6 0 m l 的0 5 m o l l 的t r i s h c i ( p h9 5 ) 。 1 1 4 主要仪器 恒温水浴锅，h h 2 型，金坛市杰瑞尔电器有限公司； 可见光分光光度计，7 2 2 型，上海欣茂仪器有限公司； 分析天平，a b 2 0 4 一e 型，梅特勒一托利多中国上海分公司； 高速冷冻离心机，s c r 2 0 b c 型，日立； 电泳槽，d y y - 2 8 b 型，北京六一仪器厂； 稳压稳流定时电泳仪，d y y - i i l 2 型，北京六一仪器厂。 1 1 5 试验饲料的配制 鱼粉1 2 、豆粕2 5 、菜籽粕3 0 、面粉2 7 、豆油2 2 、磷酸二氢钙2 、 维生素o 1 、矿物质0 3 、食盐0 2 、氯化胆碱0 2 、羧甲基纤维素1 等组成 基础饲料，饲料成分为水分8 6 5 ，脂肪4 ，灰分8 7 1 ，蛋白质3 4 4 5 。试验饲 料为基础饲料按0 、1 0 0 、2 5 0 、6 2 5 、1 5 6 3 、3 9 0 7m g k g 添加土霉素，制成6 种不同 土霉素含量的饲料。 1 一2 方法 1 2 1 土霉素对异育银鲫的急- 性毒性 试验前将室内驯养过的实验鱼随机分成6 组，每个剂量组1 0 尾鱼。试验用水 为经曝气脱氯4 8 h 以上的自来水，水温稳定在2 6 + 9 。采用腹腔注射单次用量接毒， 腹腔注射剂量：o ，o 9 0 ，1 2 0 2 ，1 6 0 4 ，2 1 4 0 ，2 8 5 8 ，3 8 1 5m g k g b w 。用注射 器吸取配置好的土霉素混合悬液，从尾鳍下方扎入，扎针不要太深，否则易弄破肠 道或损坏器官，对鱼造成伤害，造成非药物死亡，影响试验结果；根据腹部的厚度， 扎入后推入药液。记录2 4 h ，4 8 h 和9 6 h 各组的死亡情况，并按改良寇氏法计算l d 5 0 。 土霉素对异育银鲫毒性和残留研究 l d s o = l g l x m - i ( p - 0 5 ) 】 x m 一一最大剂量对数，0 4 5 6 ： p 一各剂量组死亡率之和，1 9 ； i 相邻两组剂量比值的对数，0 1 2 5 。 1 2 2 试验设计和饲养管理 异育银鲫，购自中科院水生生物研究所养殖基地，体重为4 5 7 5 9 。试验前将 实验鱼随机分成6 组，每组3 个重复，每个重复2 0 尾，共1 8 个循环水过滤水族箱 内驯养1 5 d ，投喂空白组饲料。饲养时间为6 0 d ，试验用水为经曝气脱氯4 8 h 以上 的自来水，期间不间断充气，每天定时按鱼体重的2 投食不同土霉素含量的饵料1 次，换水二分之一并吸出粪便，水温稳定在2 6 2 。试验前每箱分别称重，试验开 始后每隔2 0 天称量各箱内鱼体重，以调整饲料投喂量。 1 2 2 生产指标的测定 试验结束时，称每个水族箱鱼体重，计算每组鱼的平均体重，平均增重率= ( 末重一始重) 始重x1 0 0 。 1 2 3 鱼体常规营养成分含量的测定 试验结束时从实验的每组中随机抽取3 尾鱼，分别称活体重，然后切成块状， 用绞肉机绞碎，称重，放入直径医用器具盒高压灭菌锅中，蒸煮3 0m i n 。取出放入 干燥箱内，3 d 后称重。用样品粉碎机粉碎全鱼样品，将样品装入样品瓶中拧紧瓶盖， 于4 保存。 全鱼样品成分测定( 吴谋成，2 0 0 2 ) ：全鱼样品水分含量采用1 0 5 c 恒重法； 粗蛋白含量采用凯氏定氮法；粗脂肪含量采用索氏抽提法；灰分采用5 5 0 。c 灼烧法。 1 2 4 消化酶活性的测定 1 2 4 1 样品的采集与酶液的制备 试验开始后，每隔2 周从各组分别随机选取3 尾擦净后剖杀，并迅速取出肝脏 和肠道，用冰冷的生理盐水冲洗干净，滤纸吸干后装袋密封，置2 0 c 冰箱中保存备 用。将所取样品置于冰浴中，加入1 0 倍体积( w v ) 预冷生理盐水，在玻璃匀浆器中 匀浆，冰箱内静置1 2 h 后于4 c1 0 0 0 0r m i n 离心1 5 m i n ，取上清液进行酶活力测定。 3 次所得数据的平均值为该取样时间下的酶活力。 华中农业大学2 0 0 8 届硕十学位论文 1 2 4 2 蛋白酶活性的测定方法 标准曲线的制作 精确称干燥的酪氨酸5 0 m g ，加少量0 2 m o l lh c l 溶液使 其溶解，然后稀释至1 0 0 m l ，配成母液。用母液分别配成o 、2 0 、4 0 、6 0 、8 0 、1 0 0 j _ t g m t l 一酪氨酸标准溶液。取5 m l 的离心管，依次向离心管中加入不同浓度的酪氨 酸溶液各l i l l l ，分别加入0 5 的酪蛋白溶液各2 m l ，于3 7 c 下水浴1 5 m i n ( 准确 计时) ，然后加入1 0 的三氯乙酸溶液3 m l ，离心除去沉淀。另取1 0 m l 试管，分 别加入上述上清液各l m l ，再加入0 5 5 m o l l 碳酸钠溶液5 m l ，福林酚试? t j ( 2 ) l m l ， 于3 7 水浴显色1 5 m i n ，在6 8 0 n m 波长下比色，测定吸光值。每个浓度重复三次。 以吸光值的平均值与酪氨酸浓度值之间进行线性回归，建立二者间的直线回归方 程。 样品测定取酶液样本l m l ，加入2 m l 的0 5 酪蛋白溶液2 m l ，混匀，操 作在冰水中进行，然后在3 7 下水浴1 5 r a i n ( 准确计时) ，立即取出离心管，放回 冰水中。每个样品设平行样。以下操作按标曲中的步骤进行。测定波长6 8 0 n m ，i c m 光径，以对照管校零。 组织中蛋白酶活性( p g 儋r a i n ) = 测定管中o d 值对应的酪氨酸微克数1 5 x f 式中：f 一酶液最终稀释倍数( 肝胰脏的为4 0 倍，肠道的为1 0 0 倍) 。 蛋白酶活性的定义：1 9 新鲜组织样品在p h7 6 和3 7 c 条件下，l m i n 水解酪蛋 白所产生的酪氨酸量( r t g ) 。 1 2 4 3 脂肪酶活性的测定方法 取0 0 2 m o l lp h 7 6 的磷酸缓冲液5 m l 于试管中，向管中加入4 m l 聚乙醇橄榄 油乳化液，充分混匀后，加入i m l 的酶液样本，混合均匀，在3 7 c 水浴锅中保温 1 5m i n ( 准确计时) 。取出后立即放于冰水中，加入9 5 的乙醇1 5 m l ，终止酶促 反应。每批试验设空白对照，不加酶液样本，加生理盐水。此部分操作在冰水浴中 进行。每个样品设平行样。将反应液转入1 0 0 m l 的锥形瓶中，试管用9 5 的乙醇 洗刷两次，并入瓶中，并加入3 滴酚酞指示剂，用n a o h 标准溶液滴定至微红，纪 录消耗n a o h 标准溶液的体积v ( n l l ) 。 组织中脂肪酶活性( p , g g r a i n ) = ( a - a o ) t xn x f 式中：a 一酶液样品消耗的n a o h 标准溶液( r n l ) ； 一空白对照消耗的n a o h 标准溶液( i i l l ) ； 土霉素对异育银鲫毒性和残留研究 n 每毫升n a o h 标准溶液的腭数； f 一酶液最终稀释倍数( 2 0 ) ； t 一酶促反应时间( 1 5 m i n ) 。 脂肪酶活性的定义：1 9 新鲜组织样品在p h 7 6 和3 7 。c 条件下，l m i n 水解脂肪 所产生的脂肪酸量( g g g m i n ) 。 1 2 4 4 淀粉酶的测定( 淀粉一碘比色法) 向试管中加入l m l 的底物缓冲液，预热5 m i n ，再加入0 2 m l 的酶液，在3 7 水浴 7 5 m i n ( 准确计时) ，立即取出，放入冰水中，加入l m l 碘应用液，6 m l 蒸馏水，混 匀。于6 6 0 n m 波长处( 1 c m 光径) ，以蒸馏水调零，测各管吸光值。每批做空白对 照，对照不加酶液样本，加o 2 m l 蒸馏水。每个酶液样本设3 个平行。 组织淀粉酶活性= 飞o d o - f o d t 等罢罟， o d o 空白管的吸光值 o d 广测定管吸光值 f - 酶液的最终稀释倍数 组织中淀粉酶活性定义：1 9 新鲜组织样品在p h 7 6 和3 7 c 条件下，3 0 m i n 水 解1 0 m g 淀粉为1 个单位。 1 2 5 抗氧化酶活性的测定 1 2 5 1 组织样品的采集与处理 试验开始后，每隔2 周从各组分别随机选取3 尾擦净后剖杀，并迅速取出肝脏， 用冰冷的去生理盐水冲洗干净，滤纸吸干后装袋密封，置一2 0 0 c 冰箱中保存备用。 将所取样品于4 。c 解冻，称重后n x l o 倍体积( w v ) 预冷生理盐水，玻璃匀浆器 中于冰浴中匀浆，冰箱内静置1 2 h 后于4 。c1 0 0 0 0r m i n 离，t 二, 1 5m i n ，取上清液进行 酶活力测定。 1 2 5 2s o d 活性的测定( 黄嘌呤氧化酶法) 取1 0 m l 的具塞试管，置于冰水中，按试剂盒的测定程序，依次加入酶促反应 试剂和5 0 i - t l 酶液样本，混合均匀后，3 7 c 水浴4 0 m i n 后，加入显色剂混匀后，室 温放置1 0 m i n ，于波长5 5 0 n m 处，l n m 光径比色杯，蒸馏水调零后比色。 2 7 华中农业大学2 0 0 8 届硕+ 学位论文 组织总s o d 活性( u m g p r o t ) = 警5 0 兽 式中：o d o 一对照管吸光值； o d 。一测定管吸光值； v 1 一反应液总体积( m l ) ； v 2 一取样量( m l ) ： n 一匀浆液蛋白含量( m g p r o t m l ) 。 s o d 活力定义：每毫克组织蛋白在l m l 反应液中s o d 抑制率达5 0 时所对应 的s o d 量为一个s o d 活力单位。 1 2 5 3g s h - p x 活性的测定 按照试剂盒的程序，依次加入酶促反应试剂和2 0 0 9 l 酶液样本，混合均匀后， 3 7 水浴5m i n 后，立即取出放入冰水中，加入试剂终止反应。混匀后3 0 0 0 - - 4 0 0 0 r m i n1 0m i n ，取上清液l m l 作显色反应。按试剂盒方法加入显色剂静置1 5 m i n 后 4 1 2 n m 处，蒸馏水调零，l c m 光径比色杯，测定各管o d 值。 组织中g s h - p x 活性( u m g p r o t m i n ) = 罢罴x 删准溶黼t 式中o d o 一对照管吸光值5 o d 。- n 定管吸光值； o d 。一标准管吸光值； o d 。一标准空白管吸光值o f 一匀浆液稀释倍数； t 一反应时间( m i n ) ； n 一匀浆液蛋白含量( m g p r o t m l ) ； g s h 一标准液浓度( 2 0 9 m o l l ) 。 g s h p x 活性单位定义：在3 7 条件下，扣除非酶促反应的作用产生的部分 g s h ，每毫克组织蛋白每分钟使反应体系中g s h 降低l g m o l l 为一个酶活力单位。 1 2 5 4c a t 活力的测定( 可见光法) 按试剂盒程序，依次加入酶促反应试剂和5 0 止的样品酶液，混匀后3 7 c 准确 反应6 0 s ，加入终止剂后，0 5 c m 光径，4 0 5 n m 处，蒸馏水调零后测定吸光值。 土霉素对异育银鲫毒性和残留研究 组织匀浆中c a t 活力= ( 对照管吸光度- n 定管吸光度) x 2 7 1 ( 斜率的倒数) ( 6 0 x 取样量x 匀浆蛋白含量) c a t 活力( u m g p r o t ) 定义：每毫克组织蛋白每秒钟分解i g m o l 的h 2 0 2 的量 为一个单位。 1 2 5 5 丙二醛m d a 含量的测定( 硫代巴比妥酸法t b a ) 按试剂盒程序加入反应试剂和2 0 0 p l 的样本匀浆液，混匀后用保鲜膜包扎，并 用针头刺一小孔，9 5 。c 水浴4 0 m i n ，取出后流水冷却，然后3 5 0 0 - 4 0 0 0 r m i n ，离心 1 0 m i n ，取上清液，5 3 2 n m 处，l c m 光径，蒸馏水调零后测定吸光值。 组织中m 。a 含量( n m 。1 m l ) = 器标准品溶液n 式中o d o 一对照管吸光值5 o d 。一测定管吸光值； o d 。一标准管吸光值； o d 。一标准空白管吸光值； n 一匀浆液蛋白含量( m g p r o t m l ) 。 标准品浓度( 1 0 n m o l l 四乙氧基丙烷) 。 1 2 5 6 组织匀浆液蛋白含量的测定( f oi n 一酚法) 福林酚试剂( 2 ) 的制备：在2 l 磨口回流瓶中，加入1 0 0 9 钨酸钠( n a e w 0 4 2 h 2 0 ) ， 2 5 9 钼酸钠( n a 2 m 0 0 4 2 h 2 0 ) 及7 0 0m l 蒸馏水，再加5 0m l 8 5 磷酸，1 0 0m l 浓 盐酸，充分混合，( 烧瓶中加入玻璃珠4 5 颗) 接上回流管，以小火回流1 0 h ，回 流结束时，加入1 5 0 9 硫酸锂( l i 2 s 0 4 ) ，5 0m l 蒸馏水及数滴液体溴，开口继续 沸腾1 5m i n ，以驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色( 如仍呈绿色，须再重复滴加液 体溴的步骤) 。稀释至1 l ，过滤，滤液即福林酚试剂( 2 ) 试剂，置于棕色试剂瓶中 保存。使用时用标准n a o h 滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1 倍，使 最终的酸浓度为i m o l l 左右。 标准曲线的制作：向试管分别加入0 、0 2 、0 4 0 、0 6 0 、o 8 、1 0 0m l 标准蛋 白溶液( 5 0 0 r t g m l ) ，加水补足1m l 。按序各加5m l 试剂( 1 ) ，摇匀，于3 0 置 放1 0 m i n ，再依次加入o 5m l 福林酚试剂( 2 ) ，摇匀，3 0 保温3 0 r a i n ，5 0 0 n m 处比 色测定。以吸光值的平均值与牛血清白蛋白浓度值之间进行线性回归，建立直线回 归方程。 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 组织匀浆液蛋白含量的测定：取3 支试管，加入o 2m l 匀浆液，用蒸馏水补 足1 o m l 。其余步骤与标准曲线中的步骤相同，将所测定的吸光值带入回归方程得 出含量。 1 2 6 鱼鳃组织中n a + k + - a t p 酶活性的测定 1 2 6 1 鳃组织样品的采集和制备 在进行1 2 7 1 步骤的同时，迅速从采完血的鱼身上取出鱼鳃，用4 c 左右的蒸 馏水冲洗干净，用滤纸吸去组织表面的水分，装袋密封，置于2 0 ( 2 冰箱中保存。 1 2 6 2 鳃组织匀浆液的制备 将鳃组织样在4 c 下解冻，用剪刀剪碎，称重，放入匀浆器中，以1 ：9 的重量 体积比( w ：v ) ，加入4 c 左右的生理盐水，匀浆得到1 0 的鳃组织匀浆液。匀浆 液在1 0 0 0 0 r m i n 离心l o m i n 。取上清液按2 0 的体积比( v ) 用生理盐水稀释成 2 的鳃组织匀浆液。 1 2 6 3n a + k + - a t p 酶活性的测定 取5 m l 的离心管，置于冰水中，依次加入酶促反应试剂，然后加入2 的鳃组 织匀浆液2 0 0 1 上l ，混合均匀后，离心管转入水浴锅中，在3 0 ( 2 下保温1 0m i n ( 准确 计时) ，立即取出离心管，放回冰水中，加试剂终止反应。混合均匀后，1 0 0 0 0r m i n 离心1 0m i n 。取上清液2 0 0 “l ，加入到1 0m l 的试管中，余下的按酶试剂盒的操作 步骤，依次加入定磷试剂，定磷，混合均匀后，定磷液在4 5 c 下水浴2 0m i n ，取 出试管，冷却至室温，6 6 0n m 处蒸馏水调零后测定吸光值。 组织中n a + k + _ a t p 酶活性( n m 。1 m e ) = 等标准磷浓度兰6 n 式中o d o 一对照管吸光值。 0 d r 一测定管吸光值； o d s 一标准管吸光值； n 一匀浆液蛋白含量； v l 一反应液总体积( m l ) 5 v 2 一取样量( i t l l ) ； 标准磷浓度( o 5 1 _ l m o l l ) 。 土霉素对异育银鲫毒性和残留研究 n a + k + _ a t p 酶活性定义：每小时每毫克组织蛋白的a t p 酶分解a t p 产生 1p m o l 无机磷的量为一个a t p 酶活性单位( t m o l p i m g p r o t h ) 。 1 2 7 血清生化指标和组织同工酶的测定 1 2 7 1 血清样品制备 血清样的制备：将尾静脉所取血液装入1 5m l 离心管中，于3 7 。c 水浴箱中静 置2 0 3 0m i n ，然后将血样在3 0 0 0 r m i n 下离心1 5m i n ，取上清液得血清样。测定前 将取得的血清样置于2 0 c 的冰箱中保存。 同工酶电泳样的制备：取冷冻组织( 肝脏、肾脏) o 5 9 ，按1 ：4 比例加入o 1 m o l lp h 值7 0 磷酸盐缓冲溶液在冰浴中匀浆，匀浆液4 c ，1 2 0 0 0r m i n 离心1 0m i n ， 取上清液。酶提取液以5 ：l ( v v ) 力l 入溴酚兰甘油混合液，混匀后用于电泳分析。 1 2 7 2 血清生化指标测定 谷草转氨酶( a s t ) ，磷酸肌酸激酶( c k ) ，总蛋白( t p ) ，白蛋i 刍( a l b ) ，甘油三酯 ( t g ) ，葡萄糖( g l u ) ，总胆红素( t b i l ) ，总胆固醇( c h o l ) ，尿素氮( b u n ) ，肌酐 ( c r e a ) ，血清氯离子( c 1 一) ，血清钾离子( k + ) ，试剂盒采用上海申能德赛诊断技术 有限公司，日立7 0 6 0 型全自动生化分析仪，湖北医药工业研究院测定。 1 2 7 3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 采用垂直板高p h 值不连续聚丙烯酰胺凝胶系统，浓缩胶浓度为3 5 ，缓冲液为 t r i s - h c i ( p h 6 8 ) ；分离胶浓度为8 ，缓冲液为t r i s h c l ( p h 8 8 ) ，电极缓冲液为 t r i s g l y ( p h 8 3 ) ，每个样品槽点样1 5 此，d y y 1 1 1 2 型稳压稳流电泳仪，恒压电泳， 预电泳2 0 0 v ，3 0 m i n ，后调整至3 0 0 v 。电泳结束后，剥胶，将胶转入3 7 预热过的 染色液中，于3 7 c 恒温箱中恒温染色至所有酶带清晰为止。染色后用水漂洗几次， 置于冰醋酸中( e s t 用5 ，s o d 用2 5 ) 固定脱色，并拍照。 1 2 8 免疫功能的测定 1 2 8 1 样品的采集 实验结束时，分别从每组随机选取5 尾，擦干后分别称取体重。再用2m l 的 注射器于尾静脉取血约1 2 m l 置于1 5 m l 塑料离心管中，静置2 h 。让血液凝固， 冰浴3 0 m i n ，让血块固缩，用移液器仔细从试管边缘剥离并取出血块，析出血清后， 于4 3 0