（水产养殖专业论文）大口鲇、鲇及其杂种f1种质遗传标记研究.pdf

华中农业大学2 0 0 5 届硕士学位论文 摘 要 大口鲇、鲇及其杂种f ，种质遗传标记研究 水产养殖 2 0 0 5 届硕士研究生王朝明指导老师邹桂伟魏开建 本研究以大口鲇、鲇为亲本进行杂交试验并获得正交f 1 ，并从蛋白质( 含同工 酶) 和d n a 水平对两种鲇及其杂种f l 进行了比较研究，探讨三者间的遗传关系及杂 种优势等问题，寻找能区分三种鲇的遗传标记。主要研究结果如下： 1 与对照组相比，杂交组受精率稍低，而孵化率、出苗率没明显差异，表明大 口鲇( 卓) 鲇鱼( 占) 的杂交组合不存在繁殖障碍或繁殖障碍较小；杂种f l 生长 ( 体重、体长) 与母本大口鲇相近，t 检验差异不显著( p 0 0 5 ) ，而与父本鲇差异 显著( p 是一荦申俸乡 选择往扩 增d n a 片断的分予生物学技术，可用于极微量，甚至单个d n a 模板的体外分子克 隆，其有快速、特弊、灵敏、简便的特点，只需少藿的d n a 样晶就可予体外快速 大攫合成所需豹d n a 片段。在鱼类季申质撩定和张群遗传结构的研究中主委是联合 r f i ，p s ，即利用限制性内切酶产生的多态性片段进行p c r 扩增，扩增的d n a 片段可 以爱夔逮赞绥耱豹多样蛙，斑对大嚣洋鳕秘2 瓣鲑瓣m t d n a 遗话多样篷戆疆究( c a r t e ta l ，1 9 9 1 ；c r o n i ne ta l ，1 9 9 3 ) 。p c r 和a f l p 可以解决制备m t d n a 需要大量组织 榉赫瓣难舔，更翻适应予惫类m t d n a 多态经繇究，为鱼炎耱蒺麓定建立了薪豹磷 究方法。假此技术缺点是难以确定等位基因，因而不适用于对杂交性的研究，另外 由于酶的消化过程对实验脊重要影响，所驻a h p 探针对d n a 的纯度要求眈较高。 1 。3 4r a p d 技术 r a p d ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ，随机扩增多态性d n a ) 技术是在 p c r 基穑主雳萃一雩l 耪露蒸鏊缢d n a 片蔽进行夔梳扩增，l 梭灏穗大量豹d n ai 蠹 传变异，克服了p c r 中双引物合成的难题，具有快速、准确、灵敏度、无种属特异 性簿优点，在鱼类种质研究中褥到了广泛盼应用，如大日鲒分子潦传标谗研究( 牵 学英等，2 0 0 1 ) 和菏包纽鲤抗寒憋状相关分子标记的检测( 梁利群等，1 9 9 8 ) 、蕈 鱼种群遗传结构( 薛国雄等，1 9 9 8 ) 、罗非鱼种内与种间遗传相似度( d i n e s he ta l ， 1 9 9 6 ；k n a p i k e t a l ，1 9 9 8 ) 、斑马惫( p o s t e t h w a i te t a l ，1 9 9 4 ) 、鲤( 孙效文等，2 0 0 0 ) 基因组高密度连锁图谱的制作等研究中，r a p d 技术占据了主导地位。 毽是r a p d 繇麓亏| 耪簸，逯失温凄繇，影确瀚素多，蒸稳定瞧、可魄牲较差， 因此必须严格控制实验条件，增加实验结果的重复性，提蹴实验结果的可靠性，且只 产生显往标记，敌适合自交系和融交群体精不能确定杂合子。 1 3 5d n a 之r f l p s 技术 是对艇因组中诸多单拷贝d n a ( s i n g l e c o p yn d n a ：s c n d n a ) $ 1 j 用r f l p s 技术， 弼鞭鞠往内甥酶游纯棱d n a ，秀与特雾羧鹣搽铮杂交，获蠢魂定逡部分d n a 弱遗转 变异。它包含有d n a 指纹技术和r f l p s 技术，联合应用多种探针和多种限制性内切 4 华中农业大学2 0 0 5 届硕士学位论文 酶，才可满足种质鉴定的需要。 1 3 6 微卫星d n a 技术 微卫星d n a 又称简单重复序列( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，简称s s r ) ，由几个核 苷酸( 2 5 个) 为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列，p 1 3 ( g a ) n ，( a c ) n ， ( g a a ) n 等，在染色体上呈随机分布，由于重复次数不同及重复程度的不完全而造成 了每个基因座上等位基因的多态性( w e b e r ，1 9 8 9 ) 。微卫星具有极高的个体特异性， 重复性好，能提供丰富的多态位点信息等特点。可以利用某个微卫星d n a 两端的保 守序列设计一对特异引物，扩增这个位点的微卫星序列，经聚丙烯酰胺凝胶电泳即 可显示不同基因型个体在这个s s r 位点上的多态性。把微卫星技术用于鱼类种质鉴 定较晚，还在起步阶段，如t e r r y 等( 2 0 0 0 ) 用微卫星标记技术用于不列巅哥伦比 亚北部两条河流中的硬头鳟的原种鉴定并获得成功。董仕等( 2 0 0 3 ) 用微卫星d n a 技术分析鉴别了克隆香鱼。 1 3 7 小卫星d n a 技术 小卫星d n a 主要位于染色体近端粒处，由长度为1 6 0 b p 的重复单位组成，在不 同个体间存在串联数目的显著差异，产生易于检测的不同长度的d n a 片段，可以进 行多态性分析和染色体定位。鱼类这方面的研究目前还处于起步阶段，国外已从卢 特拉美洲鲽( m o y e re t a l ，1 9 9 8 ) 、鲤( d a t t ae t a l ，1 9 9 8 ) 、罗非鱼( f r a n k e ta l ，1 9 9 2 ) 、 鲑科( g o o d i e r e ta l ，1 9 9 3 ) 、绿鳕( d e n o v a n e t a l ，1 9 9 0 ) 等鱼类基因组克隆了小卫星d n a ， 并初步应用于鱼类的群体结构、种系发育等研究中。国内学者在这方面也做了不少 工作，方国盛等( 1 9 9 7 ) 利用人工合成的4 5 b p 的寡核苷酸单链作探针，分析了草鱼、 鲤、鲢、鳙的d n a 指纹图谱；简纪常等( 1 9 9 9 ) 克隆了鳙小卫星d n a 。 1 3 8d n a 测序技术 最充分揭示d n a 多样性的方法是d n a 序列分析。经典的d n a 方法有化学测序 法和双脱氧链终止法。除经典的测序方法在技术环节上不断改进外，近年来又发展 了一些全新的d n a 测序方法，如毛细管凝胶电泳法、阵列毛细管凝胶电泳法、超 薄层凝胶板电泳法以及不用电泳分离的直接测序技术，如杂交法、质谱法、原子探 针法、流动式单分子荧光检测法等( 赵晓娟等，1 9 9 7 ) 。我国在d n a 测序技术上 的发展比国外相对落后，目前仍然是以双脱氧法为经典模式进行测序。 王朝明大口鲒、鲇及其杂种f 。种质遗传标记研究 第1 章文献综述 1 3 9 其它衍生技术 以p c r 、r a p d 、r f l p s 为基础衍生出诸如s c a r s 、s t s 、s s c p 、i ns i t up c r 等技术，适合于基因组d n a 特殊d n a 片段的分析，也可以作为鱼类种质鉴定技术。 1 3 9 1 s c a r s ( s e q u e n c ec h a r a c t e r i z e da m p l i f i e dr e g i o n s ：特征序列扩增区域) 首先克隆基因组两端序列并测序，设计与两端序列相对应的引物，然后将引物 直接用于基因组d n a 的p c r ，产生扩增多态性区域，若没发生扩增片段多态性， 那么扩增片段就易于用限制性内切酶酶切，从而检测出扩增片段的多态性。它比 r a p d 更优越，若将r a p d 标志的片段转化为s c a r s 就更可靠。 3 9 2s t s ( s e q u e n c e t a g g e ds i t e s ：染色体序列标志位点) 是基因组中单拷贝d n a 片段，序列和染色体位已知，该位点可作为染色体上 特异性位标，其排列次序与间隔就构成s t s 物理图谱。 1 3 9 3s s c p ( s i n g l e s t r a n dc o n f o r m a t i o np o l y m o r p h i s m ：单链构象多态性) 该方法测定d n a 多态性更快速、有效，它仅用于相对短的d n a 片段，能鉴定 同等分子量d n a 片段的杂合性，甚至能检测少量核苷酸的变化，可用于人类遗传 疾病诊断，转基因鱼中外源d n a 片段的检测。 1 3 9 4i n s i t u p c r ( 原位p c r ) 是直接在细胞或组织上原位扩增目的基因的d n a 或r n a 片段，并在原位检测 其扩增产物。可用于转基因鱼中外源d n a 或m t d n a 检测和定位。 目前分子遗传标记技术发展非常迅速，应用也非常广泛。推动分子遗传标记技 术研究迅速发展的动力，一方面是原有技术存在的缺点或应用上的限制( 表卜1 ) ， 另一方面就是分子遗传标记技术的广泛应用及其取得的长足进步。分子遗传标记技 术已广泛应用于生物基因组研究、种群遗传、生物的遗传育种、起源进化、分类、 医学及法医等诸多方面、并成为现代分子遗传学和分子生物学研究与应用的主流之 一。 但从总体上来说，无论是国内还是国外，将分子遗传标记技术应用于水产养殖 业目前还很不广泛，尚处于起步阶段。 6 兰! 窒些查堂! 塑! 星堡圭堂堡堡茎 表卜1 常用的分子标记的特点 t a b l e1c h a r a c t e r i s t i c so fu s e f u lm o l e c u l a r g e n e t i cm a r k e r s 分子标记优点局限性 r f l p 多位点，高变异对d n a 质和量的要求高 稳定性强只能检测内切酶识别位点上的变异 盂德尔遗传需用探针，检测方法较繁琐，成本高 d n a 指纹谱多位点，高变异对d n a 质和量的要求高 稳定性强只能检测内切酶识别位点上的变异 盂德尔遗传需用探针，捡测方法较繁琐，成本高 r a p d 操作简便易行，成奉低稳定性差 样品d n a 的质和量要求不高显性标记 可在不了解遗传背景下应用 d a f提供信息高于r a p d 技术较为复杂 s r s p p c r 操作简便易行，成本低需前期研究基础 对样品d n a 的要求不高 s s c p p c r 操作简单可能漏检些突变 共显性标记 s s r 共显性标记需前期研究基础 v n t rd n a 多态性很高探针缺乏 以s o u t h e r n 转移为基础，实验周期较长 小卫星d n a 分布较为集中 d d r t - p c r 可同时检测基因和表达的差异对操作和样品d n a 要求严格 a f l p 多态性丰富受专利保护 结果稳定可靠试剂盒价格昂贵 所需d n a 量少对操作和样品d n a 质量要求严格 孟德尔遗传主要用同位素标记 涉及的位点多态性的基础 多位点核苷酸序列 多位点核苷酸序列 多位点核苷酸序列 多位点核苷酸序列 多位点核苷酸序列 单位点核苷酸序列 单位点基因座上等位基因 单位点基因座上等位基因 单位点基因座上等位基因 多位点核苷酸序列 1 4 蛋白质标记和r a p d 标记方法的适用范围 同工酶及其它蛋白质标记技术主要以其低廉的成本、不需要特殊的设备、操作 简便、可以快速大量地检测分散于整个基因组中各个基因座位等位基因之间的表型 变异，而且同工酶技术有大量的前人研究资料可供借鉴，统计方法标准，因而特别 适合用于种群遗传学和特殊品系或个体的遗传标记研究( p a r ka n dm o r a n ，1 9 9 5 ) 。 但是同工酶及蛋白质所能够检测到的基因座位，仅占全部结构基因的很少一部分， 而且不能检测到占基因组9 9 的其它非编码区的碱基变异，所检测到的变异，也只 是那些在蛋白表达上表现出来的差异，由于遗传密码的兼并性，遗传密码的第三个 7 王朝明走f = ： 鲇、皱及其杂种f 1 种质遗传标记研究 第1 章文献绦述 碱墓的变异一般不靛被蛋自愿多获链上的氨蘩酸反获跑来，群戳当需簧掌搓萃孛群内 个体爱多的遗传关系的信息，缺乏足够变异的等位酶，显得不太适用，而且对于一 些狭域分布的地方种群或者灏危物种而言，往往缺乏多态性饿点，或者难| 三l 获得新 鲜的实验豺戡，无法遴芎亍等位酶分板。等位黪的统诗分析中邋零假设其不同基因型 为选择中性也不够科学，例如等位基因频率的地理差肄就可能是自然选择的结果， 象激等位酶分褥技拳程磅究镁竣稿暌必对象土郯存在较大豹鼹疆蛀。 r a p di 主j 于费用的低廉，结果易于得到，对d n a 量的要求相对不高，成为很多 研究领域静蓄选分子标记之一，它静主要饶势在予数据产生豹浃捷。健是r a p d 对 p c r 反应的祭件比较敏感，遐火温度、m 9 2 + 浓度、模板d n a 质量和浓度，以及所 使用的聚合酶的标准化对p c r 反应的可重复住极为熏要，同时r a p d 标记是一种孟 德尔分离的曼性标记，无法判别位点的纯合性和杂合性，大大降低了分析的精确度， 加上不同结果之间的可比性比较差，所以r a p d 标记技术更加适合种群遗传变异分 辑、遗簧结构鞫晶系浆定等承乎以上豹磅究领域。 表t - 2 常用分予标记的优点和不足的比较( 吴清江，楗建芳，1 9 9 9 ) t a b 1 - 2t h ea d v a n t a g e sa n dd i s a d v a n t a g e so f s o m eg e n e t i cm a r k e r s 不同的遗传标记鬣然技术手段和数据分掰不一样，餐蔫它稻都怒放不嗣豹焦度 去认识和分孝厅不同的物种、种群或个体间的d n a 特征和蓑异，事实上每种遗传标 记都脊着各自的优缺点和特定的适用范围( 表1 - 2 ) ，研究者应该禳攒自己的研究西 的以及实验塞酌砑究条传 乍爨适当的选择。 2 研究目的与意义 大日鲢( s i l u r u sm e r i d i o n a l i sc h e n ，又名南方大日鲢) 帮鲒( s i t u r u so s o i 蕊s s 华中农业大学2 0 0 5 届硕士学位论文 l i n n a e u s ) 在分类学上同耩鳕科鳐耩的不黼耱，褥者矫形和肉质十分福镪，毽在经 济彤状上有羲显羲差异。大口鲇怒一种主要产于我国长江流域、珠江流域的大型名 优经济鱼类，具裔生长快、肉嫩睬美、群体产量离、易超捕、抗寐抗病髓力强等优 点，但对瘩质要求窟( 不熊裂低畿) 、萤糖培育成活率较低；两煞对水质要求低( 能 耐低氧环境) ，苗种培育成活率高，但生长速度慢，群体产量低。大口鲇作为一种中 穰经济承产养殖露象，越来越受莽蓬者零疆港费蠹戆毒陕。疆大疆鲢是一耪强动物瞧 饵料为主的凶猛性鱼类，尤其在其苗种培育阶段嗣类相残( 或称自残) 现象严爨， 导致菌种培育成滔率较繇，严重麓约了大瑟鲒的大裁禳养殖和接广。为馊丈墨鲦养 酸完全推广开来，我国已经攻克了大口鲇菌种培肖成活率低的技术难关，使苗种生 产达到了蕊模化产业化水平。尽管国晦膏些生产荦位茁种繁育毪达至福警的规禳， 假出于其慧耪壤窘成本太高丽使褥市售大口鲇萤转混杂了其它鲇神( 主凝是鲇或是 鲇与大口鲇的杂交种等) 。而且它们在外形上不易区分造成种的混杂，区分纯种和杂 交耱在生产主套蛰重要意义。因憩窍必要建立遗捷标记，弦蠖对太口鲇、鲒及荬杂 交后代进行鉴别，确保大口鲇养殖业的健康发展。 本磷究鞋太弱雏、懿爱萁杂耱f l ( 大习鼙辛鳐) 秀实验繇究霹象，瑷遗传 学为基础，以蛋囱质( 含同工酶) 水平和d n a 水平等不同水平的遗传标记技术为 技术依手卺，对三种鲒进行种质遗传标记研究。寻找髓区分三秘鳐的遗传标记，尤其 怒能区分大口鲇与杂种麟代的特异性遗传标记，以便为大口鲇的种质鉴定、良种选 宵和定向育种等罐供依据。 9 华中农业大学2 0 0 5 届硕士学位论文 第2 章大西鲒与鲇的杂交试验 大阴鲇( s i l u r u sm e r i d i o n a l i sc h e n ) 和鲇( s i l u r u sa s o t u sl i n n a e u s ) 在分类学上 瓣藩鲢瓣鲢嚣，瓣者辨澎羟瓷艨十分稳叛，毽在经济稳状上褒避著差菇。太露髓是 种主产于我国长江、珠江流域的大型名贵经济鱼类，具有生长快、群体产量、高 抗病力辫等优点，僵对永质要求较高( 不耐 氐裁) ，菌斡培育成活率较低；丙鲢矮有 对水质凝求低( 能耐低飘环境) ，苗种培育成活率高的优点，但生长速魔慢，群体产 量低。 大鄹鲒播称海鲢、鲢巴郎( 四川) 、叉口鲇( 湖北) 、鲇拐予( 江苏) 、和大鲇鲶 ( 浙江) 等，常见个体体重约3 - 5 k g ，熳大个体有愈4 0 k g 的。大口鲇肉质细腻，无 瓿翔剩，骞一定熬药蠲纷蓬，骥绫整受广大瀵费者喜爱。建饕人民生滔零平熬不瑟 提高，对大口鲇的需求也与日俱增。国际市场鲇类走俏，大口鲇颇具竞争潜力。但 由于它楚凑食馥静遴猛鱼类，敬不戆靠蹭蓬江澄天然瓷滚大禳度提毫蘩产量，只髓 通过人工养殖的途径来满足社会的需要。但由于大口鲇的菌种培育成满率及费用等 多种原黼限甫了大霜鲇养殪，这就需要寻求一种育种手段来弥率 它的不足。 杂交育弛鼹较为经舆的育秘方法，在淡水魍类中恐有多个杂种优势的鲤品种用 于生产实践。本试验旨在为大瞄鲒定向育种、良种选育等提供依据。 1 榜糕与方法 1 。1亲本来源 大口鲇来源于长江水产研究所窑湾实验场，个体爨在8 蛾一1 5 昭，年龄奁4 龄 浚上；鳐遥麓予裁髑承产品枣场，薅重在0 ，2 5k g 墩上。杂交亲零均经过严据戆形态 学鉴定。 1 2 亲本选择 大鞠鲢与皴亲本没有婚姻魏或其热溯性摄，但在繁殖季节雌雄个体均比较誊易 鉴别。鲇雌雄的区别与大口鲇相似：雌性腹部膨大、松软，卵巢轮廓明显，嫩殖突 短瑟瑟，生殖魏扩张，蕤缝粳凝皇撬灏形、较党涛；攘性受l 楚腹寒# 较小，生穗突长 而尖，生殖孔阅锁，胸鳍较粗糙。另外，鲇雄性尾鳍叉深，达尾鳍的2 3 以上。所 = ；l 三麟明犬黜鲇、懿及箕杂静段秘囊遗传掭识霹究 墼! 里查望整望些塑銎薹蔓婺 选的雌、雄亲本必须种质纯度高，成熟好，外形端正，无病无伤。 霹以较撼上述标准选择壤产寒本惫：雌爨黢罄膨大，瑟蠢辩牲，生殖孔红瓣， 能挤出鳃粒：雄焦贝4 选择毙按出糖渡的。 3 催产 3 1 人王催产 试验设训“； 对照缀 ：大口皴( 霉) x 大日懿( 葶) 对照缀i l ：皴( 筝) x 鲒( g ) 聂交组：大蕊赘( 雩) 懿( 苦 反交缀；懿( 雩) 大鍪鲢( g ) 催产药物及药物缀合： 鳃脑垂体( p g ) 鱼用绒毛膜促性腺激索( h c g ) 健黄俸释放激素类似甥( 搀熙2 号，l r h - a 2 ) p 0 2 m g k g + h c g 2 0 0 0 i u k g + l r h - a 2 3 | 剑眩 注菇方法：暴翔警爹零飘爨二次滢疼重法 第一铥剂壁雌鱼必总裁量孵i 6 ，攘鱼不注射，雌受第二钳注射余爨，雄垒裁 豢为罐鱼魏量豹一半；杂交鬣鳕较大硝懿效反对闯短2 - 4 h ，凝俸视永温而定。赞锺 嘏据东溢丽定，般为1 0 1 2 h 。 1 3 2 催产后刺激 蔻了簿会亲爱最链产雾要求瓣环麓条件，辩催产焉靛蛙雄浆本受努嚣教入不屈 的产癸池，著给以逶羹豹微滚水划激准确判酝亲筵发携瓣羚时蠛，逶对臻鱼聚郛采 耩。 1 。4 人工授精 装鱼在注射催产剡詹，时刻注意寒煎的淫动情况。特到效应时间的雌鱼用手轻 叛鳆帮，豁粒滚畅，寮蠢撵性基透弱；瓣鱼刘对揍爨糟滚。人工授精魏方法耨豢售 的相 蛙，霹宠揆出糖波壁予o 。8 豹生理慧求孛糕存答耀，露接予法净平僚戆瓷筮巾， 迅速将精郛瀛合，同毽尊加入少许生理艋水湿法授精，并糟羽象搅拌、混匀，褥褥受 精彝均匀毯激在辩车| 二濑中的耐靖上，然瑟进行徽流承孵铯。 1 2 华中农业大学2 0 0 5 届硕士学位论文 1 5 人工孵化 将布有受精卵的网片置于孵化池中微流水孵化，水深保持l m ，网片浸入水中。 孵化过程中要求保证水质清新、溶氧充足。受精卵的脱膜时间与水温关系密切，在 适温范围内温度越高，脱膜越快。仔鱼全部出膜后应即时将网片捞出。 1 6 苗种培育 当孵出的仔鱼卵黄囊基本消失时，开始投饵。以网目大小为2 5 2 5 p m 2 过滤 的熟蛋黄浆作开口饵料，并陆续引入鲜活饵料：早期以轮虫和小型水蚤为主( 经4 0 目筛绢筛出) ，中后期投喂水蚯蚓。每日投喂3 次，保证饵料充足。定期适时排污， 保持水质清新。当仔鱼达3t i l l 以上时，及时过筛，分级分池饲养，进入鱼种培育阶 段。 1 7 受精率、孵化率、出苗率的计算 从各组人工授精获得的卵中任意抽取1 0 0 2 0 0 粒，均匀平铺在直径为2 0 哪的培 养皿中，每批取2 个重复，放入5 0 l 的塑料容器中孵化( 静水) ，孵化过程中加若干 个气石增氧，达到原肠中期计算卵的总数和受精卵数。然后，将坏卵剔除，每个培 养皿单独放入1 0 l 的塑料容器中，冲气继续孵化，仔鱼出膜后计数鱼苗出膜数。之 后，继续冲气直至仔鱼平游开口摄食，计数平游开口摄食仔鱼数。计算公式如下， 每批统计的3 个样取平均值。 受精率= ( 受精卵数检查卵总数) x1 0 0 孵化率= ( 出膜鱼苗数受精卵总数) x1 0 0 出苗率= ( 平游鱼苗数受精卵总数) 1 0 0 2 结果 2 1 受精率、孵化率和出苗率的比较 f 交组即大口鲇( 挈) 与鲇( 方) 杂交试验中平均受精率略低于2 个对照组， 而其平均孵化率、出苗率与对照组则无明显差异( 如表2 - 1 ) 。 反交组合杂交试验中同样得到了高受精率( 8 5 以上) ，但就孵化率( o 。0 5 ) ，氇逡步诬绢了这一点。另外，在试猃过程中毫疆遭杂交缀戆受精 率高于对照组i i 的受精率，两种人工繁殖的父本是一样的都是鲇，受精率的差 异应秘咎子母本，是卵子质爨影响了受精率，这可髓与鲒可懿多次产辩漪习糕有关。 此外，我们对反交组合( 鲇( # ) x 大i ：= 】鲇( 方) ) 进行了多次实验：均可获得 高受精率( 9 8 5 ) ，但孵化率、出菌率却较低( 1 5 ) ，畸形苗比正交组合要高得 多( 达8 ) ，两且正鬻反交麓在短对闽内稠继廷亡。一般面畜，鱼类杂交其正交可 以获得成功，反交应该也可以。尽管鱼类形成远缘杂交种的能力在脊椎动物中是最 强豹，渗及耱、羼阕，甚至葶萼、器潮豹运缘象交都蠢疆遂( c h e v a s s u s ，1 9 8 3 ) ，餐是 一般情况下亲缘关系相当远的杂种发育中，精子虽然可以使卵核受精并产生两性原 核量发育成象释躯稔，但在戳着静发育过程串出瑶辕褥露逐渐死亡。本试验中出瑰 的反交试验中出现的现象属于此类型，还是其它原因造成呢? 我们不得而知，到底 是什么原因导致这种正反交缀合杂交差异有待于今厨迸一步研究。 3 。2 杂交优势 杂交改变了杂交后代的藻因组合，增加了基因的杂合性，改变了不同位点上基 因互佟，在缭大多数鏊因型帮环境之游获褥一静福蠢诲谲静平餐，麸瑟提齑杂释匏 生活力、繁骥力和生长速度的重要遗传性状。杂交优势的遗传基础熄杂交基因的杂 合性，亲缘关系愈遮或遗传相差越大的个体间进行杂交，所产生的杂种优势常愈大 ( 方裳熙等，1 9 7 9 ) 。本实验寒本无论在生长适宣水溺上，遥是形态、生理特性及地 理分布上都有较大熬异，可能会产生一定的杂种优势。但在生产上能否产生明显的 经漭效盏给感绢确庭_ 沦还为嚣雩过单，获以毒必要遴抒必要豹生化、分子等水乎款检 测与镳定。 1 6 华中农业大学2 0 0 5 届硕十学位论文 图2 - 3 鲇鱼 f i g 2 - 3s i l u r u sa s o t u sl i n n a e u s 图2 _ 4 大口鲇 f i g 2 _ 4s u u r u sm e r i d i o n a l i sc h e n 图2 - 5 杂种f l f i g 2 - 5t h eh y b r i df lo fs u u r u sm e r i d i o n a u sc h e n ( ，挈jx s i l u e u sa s o t u s 1 7 华中农业大学2 0 0 5 届硕士学位论文 第3 章杂种f 。及其双亲蛋白质和同工酶的 比较研究 1 9 5 7 年，h t m t e r 籁m a r k e t ( 1 9 5 7 ) 将鬣鑫质淀粉凝胶电泳与缀绫纯攀染色技 术结合起来，创立了礞白质媳泳酶谱分析方法。m a r k e t 和m o r t l o e r ( 1 9 5 9 ) 用此法 发现了乳酸脱氢酶( l d h ) 在不同组织、不同个体以及不同种类中的不同存在形式， 扶焉姆致了鄹工酶( i s o z y m e 或i s o e n z y m e ) 概念的产生。同工酶是攒同一珊属中功 能相同但结构不同的组酶，它是由不同基因位点或等位基因编码的多肽镳单体、 缝聚体或杂聚俸。1 9 6 9 年，p r a k a s h 等( 1 9 6 9 ) 姨广义熬嗣王酶概念孛提毫了一个 新的概念，把同一基因做点的不同等位基因所编码的一种酶叫做等位酶 ( a l t o z y m e ) ，获诧辩电泳酶谱有了瑟准确煞遗传掌意义。黼王酶可鞋分瓣杂合予 和纯台子( 王中仁，1 9 9 6 ) ，所以既可作为生理指标又可作为遗传榕记，应用于生 物群体的遗传进亿和分类等研究中。 融于网工酶电泳技术所鬻要的专门设备铰少，消耗相对便宜，熙同工酶大多数 由单灌因座俄控制，结果具肖较好的同源性和可比饿，因而在过去的3 0 多年里， 鼓广泛应震予穗群遗媸结麴( b e n a s s ie ta l ，1 9 9 5 ；j o n s s o ne ta l ，1 9 9 6 ；k e n n i n g t o n e t a l ，1 9 9 8 ) 、系统进化( c r a w f o r d e ta l ，1 9 8 7 ；l a n ge t a l ，2 0 0 0 ；s o m ae ta l ，1 9 9 4 ) 、 标记辕动弯稃( 接建芳等，1 9 9 7 ；s c h m i d a i n g e t a t ，1 9 9 9 ) 秽基嚣缀终鹫( b l a c k e t a l ，1 9 9 6 ：w e b be ta l ，1 9 9 2 ) 等研究领域。 鱼类同工酶的遗传学研究始予6 0 年代裙赣，霹蓊鱼类逡傣分轿常焉戆蠲工酶 包括酪酶( e s t e r a s e ，简称e s t ) 、乳酸脱氢酶( l a c t a t ed e h y d r o g e n a s e ，简称l d h ) 、 异柠檬酸脱氢酶( i s o c i t r a t ed e h y d r o g e n a s e ，简称i d h p ) 程超氧化物吱优酶 ( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，篾稼s o d ) 。近年束发震起来的水乎切片淀粉凝胶媳泳法， 由于具有无毒、高效等特点已经给同工酶研究带来了新的活力，这也是鱼类同工酶 标溆磷究孛簸缮推广靛手段之一( 王孛仁，1 9 9 6 ) 。 材料与方法 1 9 王朝明大口鲇、鲇及其杂种f 。种质遗传标记研究 第3 章杂种f 。及其双亲蛋白质和同工酶的比较研究 1 1 实验材料 大口鲇2 0 尾，由长江水产研究所窑湾试验场提供；鲇1 5 尾，选购于湖北荆州 水产品市场；杂种f l 在长江水产研究所鱼类育种试验场杂交获得，取样l o 尾。受 试个体均为健康正常个体并经过严格的形态学鉴定。其部分生物学指标列表如下 ( 见表3 1 ) 。 表3 一l 大口鲇、鲇及其杂种f l 生物学指标 t a b 3 - 1t h eb i o l o g i c a li n d e x e so f s i l u r u sm e r i d i o n a l i sc h e n , s i l u e sa s o t u s l i n n a e u sa n dt h e i rh y b r i df t 种类数量( 尾)体重( g )全长( c m ) 体长( c m )头长( c m )吻长( c r n )眼间距( c m ) 1 2 实验方法 1 2 1 主要试剂 0 3 辅酶i 溶液 1 5 a p 2 卜醋酸萘酯 2 2 2 a c r - b i s 凝胶母液 1 m乳酸钠溶液 o 2 5 mt r i s h c lp s 8 0 0 5 mt r i s h c lp h 7 1 t r i s g l y 缓冲液母液p h 8 9 1 2 2 胶的制备 根据需要用a c r b i s 凝胶母液配制不同浓度的胶。各浓度胶的配剂如表3 - 2 。 1 2 3 蛋白质、同工酶样品制备 华中农姚大学2 0 0 5 届硕士学位论文 血渍榉品嵩备：涯体怒动脉搬盘2 - 3 m l ，1 0 0 0 r r a i n 离心5 r a i n ，取上演滚保枣 子2 0 冰箱备用。 裘3 - 2 不恳浓淡胶熬缝成残分 t h b 3 - 2t h ec o m p o n e n to fd i f f e r e n tg e l 注：惑体稷冀5 0 m l n o t e ；t h et o t a lv o l u m ei s5 0 m l 酶样潮备：滔体馥滗失盘压，立邵凌琢浴条传下拣鞭蒡手、瞥、飘岗、沦、l 受鞠 脾簿6 种缀织，用o 。8 的生理盐水洗去搬污，滤纸吸于水分秤重。然后按l ：3 5 ( w ：v 即霞量( g ) 耽体积( l ) ) 的眈铡加入冷的0 蕊辅酶i 溶液( 可拥也可不船) ， 并立即在冰浴中匀浆。匀浆液在4 条件下以1 2 0 0 0 r r a i n 鬟复离心3 次，每次3 0 r a i n ， 直到上清液澄清。离心完始后吸取上清液保存于- 2 0 冰箱中冷藏备用。 2 毒纛撵 样品与2 0 的蔗糖溶液( 加微量的溴芬蓝作指示剂) 混合，点样量1 0 u l 。 1 2 5 电泳 采爱聚嚣爆酝蒎承乎平叛电濠鼓寒，攥l k b 2 2 1 9 零瀵控翱系统垮承滋控爨强? ，使用l k b 2 1 9 7 电源供给系统和l k b 2 1 1 7 泓稳压稳流电泳仪，电泳缓冲液为 t f i s g t y 溶液( p h 8 9 ) ，簿个点弹孔热祥约1 0 u l ，戳溪酚兰事# 蠢示翔。趣样兹，电 流调为5 0 m a 预电泳3 0 r a i n ( 除去聚丙烯酰胺凝胶中的杂质) ；加样后，前电泳电流 5 0 m a ( 使样品尽快迸入凝胶孔) 当指示嗣移动至平板中线处辩，调电流歪2 0 m a ， 开始正式电泳，电泳时阉依蛋白鹱或同工酶的不闲磁不同。 1 2 6 蛋白质和同工酶的染色方法 1 2 6 撩自矮染色方法 血清鬣白和肌肉蛋白的染色采用氨基照染色法( 吴鹤龄等，1 9 8 3 ) 。取1 0 0 m l o 。1 n 2 l 王朝明犬口鲇、鲇及其杂种f t 种质遗传标记研究 第3 章黎秘f t 及其双采蛋鑫矮释褥王酶熬撼轻鹾究 n a o h 溶液，l g 氨基黑( 溶解于乙醇中) 配成蛋白质染色液。谯室温下染色至带谱 清渐为止，洗去附在胶寝面的染色液，掰水漂洗2 3 次，然后放入5 的乙酸溶液中 过2 - 3 天，即可褥到清晰的图谱。 1 2 6 2 同工酶染色方法 露王酶染惫窝霾定参照寒蘸萋( 皋菠菲，1 9 9 2 ) 煞方法送行。各蛰霹工酶染色 配剂见液3 - 3 。 液3 嗣工酶染色系统 t a b 3 4 s t a i n i n gs y s t e m so fi s o z y m e s 注：上述染色液总体积为1 0 0 m 1 。 n o t e s ：t o t a l v o l u m ei s1 0 0 m l 1 。2 7 拍照 染傻、固定居的凝胶用n i k o n 数码糨极拍照、记豢，并掇摄胶冀绘制模式翔， 按照条带的迁移速度，由阴极朝阳极的出现顺序对其进行编号。并将拍照后的凝胶 划套残予胶。 2 结果 2 1 越清蛋囱的比较 袁潺蛋鑫惫溶强谱翔銎3 - 1 ，共梭溺密1 1 条带。按爨条繁豹迁移速度，垂瓣投 朝阳极的出现顺序对其谶行编号。杂种f l 的血清蛋白活性明显比其双浆的活性高。 杂种f l 继承了双亲静所有谱带，并与鲒瀚带谱一魏，共1 1 条带；大口鲒缺少b a n d l l ， 共l o 条带。电泳图谱愚示三种鲇的谱带清晰无多态。 2 2 肌肉蛋囱的比较 薹莛渴蛋鑫熬奄濠露灌魏国3 - 2 ，共梭溅窭? 条豢。菝爨蘩豢豹迂移速度，瑾；l 酾 极朝阳极的出现顺序对其进行编号。杂种f l 继承了双亲的所有谱带，并与大口鲇的 带谱一致，共7 条带；籀鱼的魏瘸蛋自强谱缺少了b a n d 4 穗b a n d 6 ，共5 条蒂。电 泳图谱照示三种鲇的谱带清晰光多态。 臻中表她大学2 0 0 5 翁硕士学位埝文 2 。3 醇脱氯酶( a d h ) 妻冬比较 三种惫韵a d h 为二聚体( 李思发等，1 9 9 0 ) ，由2 个基因庶位编码。实验可看到 a d h 仅寇箭艘和肾脏中脊集中酶带，且瞥胶的同工酶带浅，活性弱。 三种鱼肝脏组织的a d h 同工酶的电泳图谱和模式图见图3 3 。为便于统计分析， 爻搴器位点或譬位纂联按a l l e n d o r f u t t e r ( 1 9 7 舛戆方法予以编号，帮把掇瑗最多麴 位点或等位基因缡为1 0 0 ，其余的均按棚对于馒点或等像基阑t 0 0 的耀对迸醪拳黪 露分毖来余震。检测烈：三耱鲒装彀泳9 条繁：大秘懿表澄5 条带，杂种f 1 6 象 謦，鲢6 条豢。毁接近骥掇爨馨一条带着售深，霹刿舔篷_ 冀活性强，淹一令蘩因窿位 a 2 编码；a d h - b 凌位上有5 个等位鏊因( b 产，b 2 ，如1 据，b 2 黼，b 2 s 3 ) ：a d h - a 和a d h - b 窿位之间裔3 个等位鏊嚣( a b 托，a b ，a b 嘲) 。大翻酩和杂种f l 群脏 的2 个a d h 基因座位为单淼，而鲇在a d h b 座位出现多态，表现为3 种表挺，即： 1 0 0 1 3 3 ，9 0 1 1 7 和1 0 0 1 1 7 。比较三种站麴酶落发现，杂秘f l 与大口馘的藤谱穗 似，继承了火口鲇的a 2 、a b 的3 个等能基因和b 2 1 0 0 ；碱鲇不袭达a 2 ，并缺少了 a b 嬲一个等位基毽a b 觉。燃终，凌杂秘f l 带漤孛滋璎彳一条# 亲本带b 2 娃7 ，认 必怒大口蛙期鲒杂交后等位罄固发生结枣奄上的改变从嚣产嫩父本秘母本均无懿祭 鬻。 i234 678 1 0l i i 2i 3i 4 i 5 i 6l ? 1 8 0 。b a n d i ，tb a n d - 2 二二二魏n d _ 3 一一，b a n d 一4 二二0 b a n d - 5 一、b a n d s 、b a n d - 7 。一一、b r o a d 一8 一、b a n d - 9 、 、j 、瓿& b a n d - 1 豳3 - 1 大口鲇、杂种f i 和鲒的血清蛋臼魄泳髑谱 0 - 6 海大蜀镳，7 - 1 2 必杂耱f i ，1 3 1 8 为懿) f i g 3 - 2e l e e t r o p h e r g r a mo f s e r u mp r o t e i n o f t h r e ek i n d so f f i s h ( 1 ，4 ，7 ，1 0 ，1 3 ，1 6 ：s i l u r u sm e r i d i o n a l i sc h e r t ；2 ，5 ，8 ，1 1 ，1 4 ，1 7 ：t h eh y b r i d f t ；3 ，6 ，9 ，1 2 ，1 5 ，1 8 ：s i l u r u sa s o t u sl i n n a e u s ) - - ) + ) 0 王朝骧丈“懿、熬及其祭种f 。耪盛遗传耩记磷究 第3 章杂斡f ，蔑箕双豪爨鑫震鞠辫王簿静敷鞍麟究 黼争i 凝r i d - 2 一 b a * l d - 3 一“ b a n 争4 b 辅d - 5 一 b a n d - f i b a n d - 7 。 0 ( + ) 鞭3 2 丈瑟熬、杂秘魏囊鳐豹瓢凑蘩囱邀濠灏港 ( 1 - 6 瓷太弱皴，7 - 1 2 淹杂耱f l ，1 3 1 8 必懿) r i 9 3 - 2e l e c t r o p h e r g r a mo fm u s c l ep r o t e i no ft h r e ek i n d so f f i s h f l ，莲，7 ，l ，1 3 ，1 6 ：s u m u sm e r i d i o n a l i sc h e n ；2 ，5 ，8 ，1 1 ，1 4 ，1 7 ：t h eh y b r i d f l ：3 ，6 9 ，1 2 ，1 5 ，1 8 ：s i l u r u s a s o t u sl i n n a e u s ) 糯志捌b 燕。捣赢 l l l l l l l l l l l l m _ _ 鼙鞲m _ 篡：篓：釜薰= ：譬：i ：黧：1 _ _ | 一“一* 一w * * 一一一一豢”- i i i * * i l l - 一_ 一 一 “l l 藏露 | l ? l 篱i 1 7 骥3 - 3 太弱懿、杂释f l 窝懿翳黢瓣鞠 l 藏z 酶嘏泳图谱及箕摸茂嚣 f i 9 3 - 3 e l e c t r o p h e r g r a m o f a d h i s o z y m e s f r o m t h e l i v e r o f t h r e e k i n d s o f f i s h 娃，4 ，7 ，1 0 ，1 3 ，1 6 ：s i l u r u sm e r i d i o n a l i sc h e n ；2 ，5 ，8 ，1 1 ，1 4 ，1 7 ：t h eh y b r i d f 1 ；3 ，6 ，9 ，1 2 ，1 5 ，1 8 ：s i l u r u sa s o t u sl i n n a e u s ) 女舻拶骚盛袋瓣壤嚣露撵器瓒 华中农业大学2 0 0 5 履硬士学位论义 2 4 乳酸脱氢酶( l d h ) 的比较 l d h 难研究最早、最深入的一种酶，现已知道大多数脊椎动物的l d h 同i 酶是 囊a 、b 、c - - 个霞纛决定，c 位点矮寿缝缓夔差爨，莫缀褥豹蛋爨蕨毫蘩与a 、辣程 异。研究袭明l d h 同工酶为四聚体，在通常情况下由两个独立位点决定a 、b 两个旺 骜，再由这秀个巍基夔税缀合成5 耱丽工辩，b 甄簇迁移率夫子a 鞭基( 邓思平等， 2 0 0 4 ) 。 l i v e r k i 幽e y m u s c l eh e a r t e y es p l e e n 、 1 2 34578 91 01 。11 2 。1 ”31 趸一。羁l 彝l ? i 晷 十， 图3 q 大口蠢占、杂种f i 和鲇6 种组织的l d h i 司正酶电泳图谱 ( 1 ，4 ，7 ，1 0 ，1 3 ，1 6 炎大疆鳔；2 ，5 ，8 ，1 1 ，1 4 ，1 7 海杂耪数；3 ，6 ，9 ，1 2 ， 1 5 ，1 8 为鲇) f i g 3 - 4e l e c t r o p h e r g r a mo f l d hi s o z y m e sf r o ms i xt i s s u e so f t h r e ek i n d so f f i s h f l ，4 ，7 ，1 0 , 1 3 ，1 6 ：s i l u r u s m e r i d i o n a l i s c h e n ；2 ，5 ，8 ，1 1 , 1 4 ，1 7 ：t h e h y b 婀d 段；3 ，6 ，9 ，1 2 ，1 5 ，1 8 ：s m u sa s o t u sl i n n a e u s ) 三种鲇不 司缎织的l d h 电泳翮谱如图3 4 所示，肝、肌和脾显带清嘶，心、肾和 h 爨组织的酶带色浚。6 秽缎织的电泳酶谱郡存在逶移率最小的两象媸，即袭达基隧像 点a 4 和a 3 黔。肾表现为2 条酶带( a 4 和a 3 b ) ，肝、心、眼、脾表现为3 祭带( a 4 、 岛b 纛a 2 8 2 ) ，鼹凑缝织戈垂5 条繁( a 4 、a 3 b 、a 2 8 2 、a b 3 秘b d ，来发现c 位点。 这充分说明了l d h 的组织特异性。肝组织l d h 同工酶图谱履示三种鲇无蓑异，均为3 祭带( a 4 、a 3 b 帮a 2 8 2 ) ，瓶离鬣织熟l d h 同工懿图谱显示3 释鱼枣差异，鳝钓l d h 酶谱表现为经典的“五带谱型”，从阴极到阳极分别由、a 3 b 、a 2 8 2 、a b 3 、b 4 控 制；而大韶鲒与杂种f l 的酶谱一致，缺少由b 4 控制的基磷位点，袭现为4 条带；硷溺 三； 申鱼肌肉的l d h 同工酶还发现