（动物学专业论文）海洋无脊椎动物氨基酸类神经递质hplc测定和免疫组化研究.pdf

鲁东大学硬士学位论文 摘要 氨基酸类神经递质作为神经系统中一类重要的神经递质，在生物进化过程中具有重 要的作用。运用邻苯二甲醛( o p a ) 和9 芴甲氧羰基( f m o c ) 联合衍生，c 1 8 ( h y p e r s i l a a - o d s2 1x 2 0 0 m m ，51 1m ) 为色谱柱，二极管阵列检测器检测的高效液相法( h p l c ) ， 对腔肠动物、扁形动物、纽形动物、软体动物、节肢动物、棘皮动物、脊索动物等海洋 无脊椎动物中枢神经系统中氨基酸类神经递质谷氨酸( g l u ) 、天冬氨酸( a s p ) 、y 氨 基丁酸( g a b a ) 和甘氨酸( g l y ) 的含量进行测定，结果表明：黄海葵神经系统中娜、 g l u 、g l y 、g a b a 含量分别为0 2 4 m g g 、0 4 8 m g g 、0 2 4 m g g 、5 0 6 m g g ；纽虫神经系统 a s p 、g l u 、g l y 、g a b a 含量分别为0 0 8 m g g 、0 0 6 m g g 、0 0 7 m g g 、0 9 1 m g g ；锈凹螺 神经系统a s p 、g l u 、g l y 、g a b a 含量分别为l m g g 、0 9 8 m g g 、o 1 9 m g g 、6 6 8 m g g ； 刺参幼参神经系统a s p 、g l u 、g l y 、g a b a 含量分别为0 2 2 m g g 、0 9 1 m g g 、0 0 5 m g g 、 0 2 m g g 。可见神经系统中神经递质g l u 、a s p 和g a b a 的含量随着无脊椎动物神经系统 的进化整体上呈现上升的增长趋势，仅在纽形动物以及棘皮动物中出现明显地降低；而 g l y 的含量在无脊椎动物神经系统进化的过程中基本未发生明显变化，这可能与它们不 同的生活环境和习性有关。因此推测，这几种氨基酸类神经递质g l u 、a s p 、g l y 、g a b a 在海洋无脊椎动物神经系统中承担不同的作用，参与不同功能的调节。 运用免疫组织化学s a b c 染色方法( 即采用生物素标记的第二抗体与结合有辣根过 氧化物酶或者碱性磷酸酶的链霉亲和素连接来测定细胞及组织中抗原的方法) ，对黄海 葵、三角涡虫、纽虫、嫁蟓脉红螺、扁玉螺、中国蛤蜊等海洋无脊椎动物中枢神经系 统中氨基酸类神经递质g l u 和g a b a 进行了免疫组织化学的定位研究。结果发现：神经 递质g l u 、g a b a 在研究的几种海洋无脊椎动物中枢神经系统中都检测到有阳性反应， 分布范围较广，在外周神经系统中也有少量分布，说明g l u 、g a b a 在海洋无脊椎动物 的进化过程中一直被保留下来，并且在研究的几种动物体的许多行为活动中具有重要的 意义，对不同的功能担负着重要的调节作用。 探讨一氧化氮( n i t r i co x i d e ，n o ) 对氨基酸类神经递质的影响，运用邻苯二甲醛 ( o p a ) 和9 芴甲氧羰基( f m o c ) 联合衍生，c 1 8 ( h y p e r s i la a o d s2 1 2 0 0 m m ，5 l - tm ) 为色谱柱，二极管阵列检测器检测的高效液相法( h p l c ) ，测定扁玉螺在分别用 n o 两种抑制剂l - n a m e 和l - n m m a 处理后，中枢神经系统中氨基酸类神经递质含量的 变化。结果显示：扁玉螺在分别用0 2 m m o l l 浓度的n o 抑s d 3 幕t j l n a m e 、l - n m m a 处 理2 h 时，氨基酸类神经递质g l u 、a s p 、g a b a 的含量与对照组比有明显的降低；处理4 h 鲁东大学硬士学位论文 后g l u 、a s p 、g a b a 含量开始增加。说明n o 含量的增加或减少影响着扁玉螺中枢神经 系统中氨基酸类神经递质的释放。 关键词：海洋无脊椎动物，中枢神经系统，氨基酸类神经递质，高效液相色谱，免 疫组织化学 鲁东大学硬士学位论文 a b s t r a c t a m i n oa c i dn e u r o t r a n s m i t t e r s ，雒t h eo n eo ft h ei m p o r t a n tn e u r o t r a n s m i t t e r so ft h ec e n t r a ln e r v o u s s y s t e m ( c n s ) ，p l a ya l li m p o r t a n tr o l ei nt h ep r o c e s so fb i o l o g i c a le v o l u t i o n a m i n oa c i d n e u r o t r a n s m i t t e r s g l u t a m i ca c i d ( g l u ) ，a s p a r t a t e ( a s p ) ，y - a m i n o b u t y r i ca c i d ( g a b a ) ， g i y c i n e i n ( g l y ) 】i nc e n t r a ln e r v o u ss y s t e mo fs e v e r a lm a r i n ei n v e r t e b r a t e si n c l u d i n g c o e l e n t e r a t a ，p l a t y h e l m i n t h e s ，n e m e r t i n e a ，m o l l u s c a ，a r t h r o p o d a ，e c h i n o d e r m a t a ，c h o r d a t a ， w e r ea s s a y e du s et h eh i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) m e t h o dt h a t d e r i v a t i z a t i o nw i t ho - p h t h a l a d e h y d e ( o p a ) a n d9 - f l u o r e n y l m e t h y l o x y c a r b o n y l ( f m o c ) ，t h e c o l u m nw a sc18 ( h y p e r s i la a - o d s2 1x2 0 0 m m , 5i lm ) a n dt h ed e t e c t i o nw a sc a r r i e do u t w i t hd i o d ea r r a yd e t e c t o r t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ec o n t e n to fa s p ，g l u , g l y ，g a b ao f n e r v o u ss y s t e mi na n t h o p l e u r ax a n t h o g r a m m i c ai s0 2 4 m g g ，0 4 8 m g g ，0 2 4 m g g ，5 0 6 m g g ； i nn e m e r t e a ni s0 0 8 m g g ，o 0 6 m g g ，o 0 7 m g g ，0 9 1 m g g ；i nc h l o r o s t o m ar u s t i c u mi sl m g g , o 9 8 m g g ，o 1 9 m e g g ，6 6 8 m g g ；i na p o s t i c h o p u s j a p o n i c u si s0 2 2 m g g ，o 9 1 m g g ，o 0 5 m g g ， 0 2 m g g 1 1 l er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h en e u r o t r a n s m i t t e r s ：t h ec o n t e n to fg l u t a m i ca c i d ( g l u ) ， a s p a r t a t e ( a s p ) a n d7 - a m i n o b u t y r i ca c i d ( g a b a ) a p p e a r e d t r e n do fg r o w t hw i t ht h ee v o l u t i o n o fm a r i n ei n v e r t e b r a t e sn e r v o u ss y s t e m ，o n l yn e m e r t i n e aa n de c h i n o d e r m a t ao b v i o u s l y a p p e a r e dr e d u c t i o n ；b u ta n o t h e rn e u r o t r a s r n i t t e r s ：t h ec o n t e n to fg l y c i n e i n ( g l y ) d i dn o ta p p e a r o b v i o u sc h a n g e si nt h ep r o c e s so fm a r i n ei n v e r t e b r a t e sn e r v o u ss y s t e me v o l u t i o n t h i sm a y b ec a u s e db yd i f f e r e n tl i v i n ge n v i r o n m e n t sa n dh a b i t s t h e r e f o r e ，t h e i rm a y b ep l a yd i f f e r e n t r o l e si nm a r i n ei n v e r t e b r a t e sn e r v o u ss y s t e m t h ed i s t r i b u t i o no fg a b aa n dg l ui nc e n t r a ln e r v o u ss y s t e mo fs e v e r a lm a r i n e i n v e r t e b r a t e si n c l u d i n ga n t h o p l e u r ax a n t h o g r a m m i c a ，d u g e s i a ，n e m e r t e a n ，c e l l a n at o r e u m a ， r a p a n av e n o s a , n e v e r i t ad i d y m a ，m a c t r ac h i n e n s i s ，w a ss t u d yb yt h em e t h o do ft h es a b c ( s p r e p t a v i d i n b i o t i n - p e r o x i d a s ec o m p l e xm e t h o d ) i m m u n o h i s t o c h e m i c a lt e c h n i q u e t h er e s u l ti n d i c a t e d t h a tp o s i t i v el a b e l i n gw i t l la n t i b o d i e dt og e n e r a t i v ee n z y m e sf o rt h en e u r o t r a n s m i t t e r sg l ua n d g a b aw e r ep r e s e n ti ns e v e r a lm a r i n ei n v e r t e b r a t e sc e n t r a ln e r v o u ss y s t e m s ，d i s t r i b u t e d w i d e l ya n di np e r i p h e r a ln e r v o u ss y s t e mt h ed i s t r i b u t i o nw a ss m a l l n er e s u l ts u g g e s tt h a t g l u ，g a b aw e r er e s e r v e di nt h ee v o l u t i o no fm a r i n ei n v e r t e b r a t e s ，a n dm a y b ep l a ya n i m p o r t a n tr o l ei ni t sm a n ya c t i v i t i e sa n da c tg r e a ts i g n i f i c a n c ef o rd i f f e r e n tm o d u l a t i o n si nt h e c n s t oi n v e s t i g a t et h ee f f e c t so fn i t r i co x i d eo na m i n oa c i dn e u r o t r a n s m i t t e r s t h eh i g h i i i 鲁东大学硬士学位论文 p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) m e t h o dw a su s e dt oo b s e r v et h ed i f f e r e n t e x p r e s s i o n so fa m i n oa c i dn e u r o t r a n s m i t t e r sc o n t e n ti nt h el - n a m ea n dl - n m m ag r o u p w h i c hd e r i v a t i z a t i o nw i t h o - p h t h a l a d e h y d e ( o p a ) a n d9 - f l u o r e n y l m e t h y l o x y c a r b o n y l ( f m o c ) ，t h ec o l l 】m nw a sc 1 8 ( h y p e r s i l a a - o d s2 1x 2 0 0 m m ，5um ) a n dt h ed e t e c t i o n w a sc a r r i e do u tw i t hd i o d ea r r a yd e t e c t o r t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tw h e n2 ht r e a t m e n t 、析m d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fn i t r i co x i d ei n h i b i t o rl - n a m e ，l - n m m a t h ec o n t e n to fg l u , a s p ，g a b ai nt h ec n s o fn e v e r i t ad i a y m aw e r el o w e rt h a nt h ec o n t r o lg r o u p ；a f t e r4 h t r e a t m e n t , t h ec o n t e n to fg l u , a s p ，g a b ai nt h ec n so f n e v e r i t ad i d y m ab e g a nt oi n c r e a s e t h er e s u l ts u g g e s tt h a tt h ec o n t e n to fn i t r i co x i d ei n c r e a s eo rd e c r e a s ei nc n sc a l li n f l u e n c e o nt h ea m i n oa c i dn e u r o t r a n s m i t t e r sr e l e a s e k e yw o r d s ：n l 撕n ei n v e r t e b r a t e s ，t h ec e n t r a ln e r v o u ss y s t e m , h p l c ，a m i n oa c i d n e u r o t r a n s m i t t e r s ，i m m u n h i s t o c h e m i s t r y 鲁东大学学位论文原创性声明和使用授权说明 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成 果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表 或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式 标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：佐东破 日期：加7 年多月甲e l 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权鲁 东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“4 ”) 作者签名：崔表锹 导师签名：触， 日期：泸年多月罗e t 嗡川每具夕日 鲁东大学硕士学位论文 第一章综述 l 无脊椎动物在神经生物学中的应用 无脊椎动物中许多作为模式动物，现在已经被广泛应用于神经系统和肌肉接头的实 验研究中，并取得了大量有重要意义的成果。神经系统的进化方向是由分散到集中，脊 椎动物神经系统高度集中，与脊椎动物相比较，无脊椎动物的神经系统相对简单，在其 简单的中枢神经系统中存在许多易于鉴定的大型神经元和巨轴突，而且神经元数量相对 较少，神经网络之间的联系相对简单，并且具有简单的行为活动模式，这些独特的优势 对探讨神经细胞行为活动机理和发育生物学有关的各种问题都有重要意义。在无脊椎动 物上进行的实验经常能够对哺乳动物相关研究起到重要作用。 果蝇( d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r ) 、线虫( c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s ) 作为遗传学模式 生物，在有关神经系统发育、学习、记忆以及行为的细胞和分子生物学基础的核心问题 上提供了广泛的遗传学途径。而其它无脊椎动物比如蜜蜂、蝗虫、龙虾、螯虾和水母等， 在神经科学的一些重大研究中都起到了关键的作用。k a t z 和m i l e d i t l 】用枪乌贼星状神经 节为材料，确定了突触前终末电位和递质释放量之间的精确关系，随后k a t z 与e u l e r 、 a x e l r o d 因为发现神经末梢的体液传递物质及其贮藏、释放、失活机理而荣获1 9 7 0 年诺 贝尔奖。 早在2 0 世纪6 0 年代末，d u d e l 和k u f f l e r 利用小龙虾神经接头上对突出前抑制进行 了阐述，突出前抑制导致兴奋性神经末稍释放的递质量减少【2 】。随后，o t s u k a 和k r a v i t z 等利用龙虾确定丫- 氨基丁酸( 丫a m i n o b u t y r i ea c i d ，g a b a ) 是神经接头的一种抑制性递 质【3 】。在这一时期，有大型神经元的软体动物、甲壳类动物、环节动物和昆虫再次引起 神经生物学家的兴趣，并得到许多开创性成果。利用水蛭( h i r u d om e d i c i n a l i s ) ，k u f f l e r 等阐明胶质细胞在控制神经元的环境所起的重大作用。k e h o e ，a s c h e r ，k e r k u t 等用软 体动物神经元得到了更好的结果。k a n d e l 对软体动物海兔( a p l y s i ac a l i f o r n i c a ) 水管回 缩反射环路( s i p h o nw i t h d r a w a lc i r c u i t ) 的深入研究，为解释神经细胞间的信号传导机制 做了许多开创性工作【4 】，并获得2 0 0 0 年诺贝尔奖。s e l v e r s t o n 及其同事详细地描述了甲 壳类动物口胃神经节功能间的相互作用【5 】。 无脊椎动物还被用在分析动物的复杂性为上，诸如螯虾和蜗牛等的姿态反射、摄食、 昼夜节律、逃逸反应和游泳这类协调的、基本行为单元的神经环路分析1 6 ，7 1 。昆虫中枢 神经系统已被用来研究发育和再生、飞行、行走、导航以及通讯等许多生物学问题【8 。1 1 1 。 在细胞和分子水平上，揭示了果蝇的嗅觉学习机制，同时也发现在果蝇中与记忆有关的 1 鲁东大学硕士学位论文 基因在哺乳动物中也保留其功能。b a r g m a 和同事发现了线虫( ce l e g a n s ) 中神经肽y 受体的突变型，它将决定动物是采取群居还是单独的摄食行为。 虽然果蝇、线虫对经典的神经生理学贡献不大，但是它们已经成为新一轮神经生物 学研究的关键模式生物。在对果蝇的研究中，b a t e 等人阐述了几个关键基因在神经系统 的发育中所起到的作用【1 2 1 ，d a v i s 等利用学习型的突变体发现了参与学习和记忆过程的 几个重要基因【1 3 】。同时，由于线虫的神经系统特别简单，性成熟的个体只用3 0 2 个神经 元，这些优点引起了神经生物学的广泛注意。 尽管已有一些对了解神经退行性病变具有一定指导意义的研究，但是在有关基本分 子机制方面的却比较少，这就需要应用正向和反向遗传学技术【1 4 1 5 】。因此，传统的无脊 椎模式生物所具有的种种优点仍将在神经生物学中不断地做着贡献。 2 研究无脊椎动物神经递质的意义 中枢神经系统包括大量形态不同、类型各异的神经元，同时它们所产生和释放的神 经递质也有所不同，在一定程度上决定了神经系统功能的多样性以及复杂性，最终导致 了迥异的神经系统功能。随着分子遗传学手段和模式生物在发育生物学中的应用，对神 经递质的研究取得了重要的突破。免疫组织化学技术为神经递质的研究提供了有效手 段，包括乙酰胆碱( a c e t y l c h o l i n e ，a c h ) 、5 - 羟色胺( 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e ，5 - h t ) 、谷 氨酸( g l u t a m i ca c i d ，g l u ) 、y 氨基丁酸( 丫a m i n o b u t y r i ca c i d ，g a b a ) 、甘氨酸( g l y c i n e ， g l y ) 等，这些神经递质通过传递各种信息而实现调节机体生理功能的作用。自上个世 纪8 0 年代初期，由于免疫组化、放射性免疫测定等技术的兴起，对无脊椎动物神经递 质的研究也进入了全面发展的时期，人们先后对软体动物头足纲和腹足纲中许多种类神 经系统的神经递质定位进行了研究。乙酰胆碱( a c h ) ，是最早被确定的一种经典的神经 递质，在软体动物海兔( a p t y s z a ) 、静水椎实螺( l y m n a e as t a g n a l i s ) 的神经元中发现 a c h ，这说明乙酰胆碱可能在海兔的神经功能中发挥特殊作用；单胺类递质：5 - 羟色胺 ( 5 - h t ) 、多巴胺( d o p a m i n e ，d a ) 被发现在腹足动物的中枢神经系统中分布十分广泛， 有证据表明其对动物的摄食【1 6 8 1 、运动【1 9 ，2 们、心血管功能2 、内分泌【2 2 l 、生理节律【2 3 】 等进行调节。 氨基酸不仅是生物体中的营养物质和代谢产物，它们在神经系统中还发挥着某些重 要的生理功能。在脑中，它们是不可或缺的神经递质，事实上，脑内大多数神经递质是 氨基酸类，而经典的神经递质如单胺类和乙酰胆碱类神经元只占脑内的一小部分，尽管 如此，目前对以氨基酸为递质的神经元的发育的了解还非常有限【2 4 1 。近十年来，高效液 2 鲁东大学硕士学位论文 相法( h p l c ) 已大量用于生物样品中氨基酸的测定【2 5 2 6 ，其结合柱前衍生技术具有快 速、灵敏、一机多用等优点，使用于神经系统生物样品中递质类氨基酸的测定。 神经递质的相关研究主要与电生理相结合，用于了解各种神经递质的性质以及神经 递质的解剖学定位、受体定位和分类；受体兴奋剂和拮抗剂的特异性及其应用。近年来 的研究表明，除神经递质在神经调节中起作用外，还有神经调质也在发挥作用。神经调 质是神经细胞和某些内分泌细胞所释放的一些物质，它们不直接引起所支配细胞的机能 变化，而是调制突触前末梢释放经典递质的活动以及突触后细胞对递质的反应。对神经 递质的研究虽然取得了很大的成就，但远没有达到成熟的程度，人们对有些神经递质引 起疾病的机理尚不清楚，对神经递质问的相互作用也不能作理论解释。现代色谱技术 h p l c 、h p c e 的迅速发展为人类探索生命的奥秘起到了很大的作用 2 7 1 。 3 无脊椎动物中氨基酸类神经递质研究概述 中枢神经系统中广泛存在氨基酸类神经递质，根据其对中枢神经元的不同可分为： 兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸。谷氨酸( g l u ) 、天冬氨酸( a s p a r t a t e ，a s p ) 、丫氨基丁 酸( g a b a ) 、甘氨酸( g l y ) 均为经典神经递质，且属氨基酸类神经递质。在脊椎动物 中，g l u 、a s p 是主要的兴奋性神经递质，g a b a 、g l y 则是主要的抑制性神经递质。 3 1 兴奋性氨基酸类神经递质的研究 3 1 1 谷氨酸 很多年前人们就知道谷氨酸通过神经元的长轴突传输刺激性信号，在高等动物中枢 神经系统中具有重要的作用。事实上，在哺乳动物中枢神经系统中有数十亿长轴突神经 元，多数使用谷氨酸作为它们的主要运输体以及作为兴奋性神经细胞。 g l u 是中枢神经系统中含量最多的氨基酸，也是氨基酸类神经递质中作用最广、研 究最多的一种物质，其作为一种重要的兴奋性神经递质与神经的正常功能有关。已有实 验证明谷氨酸在哺乳动物的中枢神经系统【2 8 1 以及甲壳动物神经肌肉的连接处【2 9 】均是一 种重要的兴奋性神经递质，而且在许多无脊椎动物中是刺激肌肉的主要递质。除了在突 触传递中的作用，对h e l i s o m a 的中枢神经系统的研究发现，g l u 还可以促进神经元的 再生，以及分离的和完整的神经元的萌芽。 中枢模式发生器( c e n t r a lp a t t e mg e n e r a t o r ，c p g ) 是一些基本的神经网络，控制有 节律的行为。对控制脊椎动物节律性行为的中枢模式发生器进行药理学分析，强调了神 经递质谷氨酸存在的重要性；另外指出，谷氨酸在其兴奋性中间神经元形成的部分模式 鲁东大学硬士学位论文 发生网络( p a r to f t h es e g m e n t a lp a r e m g e n e r a t i n gn e t w o r k ) 中也起着重要作用【3 0 】。同样， g l u 在无脊椎动物c p g 网络中也具有很大的重要性，比如大家早已熟知的甲壳类的口胃 神经系统。后来，又有研究表明g l u 受体在软体动物摄食系统中有重要作用。这些都表 明了g l u 可能作为一种兴奋递质在c p g 网络的中间神经元发挥功能。 谷氨酸受体的命名是混乱的。根据生化药理研究结果，可将哺乳动物中枢神经系统 的g l u 受体分为离子型受体和代谢型受体。前者包括n 甲基d 天冬氨酸( n m e t h y - d a s p a r t a t e ，n m d a ) 受体，海人藻( k a ) 受体和0 【氨基羟甲基恶唑丙酸( a l p h a - a m i n o - 3 - h y d r o x y 5 - m e t h y l 4 i s o x a z o l e p r o p r i o n i ca c i d ，a m p a ) 受体；后者包括l 2 氨基4 - 磷 丁酸( l a p 4 ) 受体、反氨基环戊烷二羧酸( a c p d a ) 受体【3 1 1 。哺乳动物神经细胞和肌 肉细胞表达的离子型g l u 受体多与g a b a 受体通道相关。一些节肢动物和软体动物也存 在g l u 和g a b a 共同的受体【3 2 】。离子型g l u 受体也广泛存在于甲壳动物神经组织、肌 肉组织和内分泌系统，介导调控多种生理活动。如甲壳动物胃上神经节细胞表达抑制性 谷氨酸受体通道( i g l u r s ) ，介导抑制中枢对节律性活动组织的控$ 1 1 1 3 引。 在海兔神经系统中，证实乙酰胆碱和谷氨酸是兴奋性的神经递质3 4 。7 】。在脊椎动物 神经肌接头中是以乙酰胆碱作为快速兴奋性神经递质，在甲壳类动物和昆虫中虽然也存 在乙酰胆碱，但是主要的兴奋性神经递质是谷氨酸。谷氨酸作为一种重要的兴奋性神经 递质与神经的正常功能有关口引。枪乌贼大型突触内所含神经递质的特性研究的不多【3 9 4 0 l ，用药理学的方法已经证明谷氨酸作为一种神经递质大量存在于枪乌贼大型的神经突 触中【4 1 1 ，并在其神经系统中细胞间信号的传递过程中起着重要的作用【4 2 1 。谷氨酸在脊椎 动物中枢神经系统是一种重要的兴奋性神经递质，而且在许多无脊椎动物中是刺激神经 肌肉的主要递质【4 3 】。越来越多的实验证明谷氨酸在脊椎动物和无脊椎动物神经系统中的 神经胶质细胞信号传递中起重要作用4 4 1 ，而且能够使星形胶质细胞去极化【4 5 4 6 1 。谷氨酸 分别可以与d a e 4 7 1 、g a b a 4 8 】等神经递质共存。谷氨酸与g a b a 共存时，g a b a 起强的 抑制性作用，谷氨酸起强的兴奋性作用【4 9 j 。 3 1 2 天冬氨酸 天冬氨酸在中枢神经系统中也是主要的兴奋性神经递质，在学习记忆【5 、神经元 损伤【5 1 ，5 2 1 等生理病理过程中起关键作用。当天冬氨酸也在中枢神经系统中被发现并且对 神经细胞有刺激作用的时候，虽然知道它可以被从内在神经细胞中释放但很少知道它的 准确位置和作用。在一些主要的传入神经元中，天冬氨酸对于运输体有高亲和力，但对 谷氨酸受体是低亲和力，这也就解释了天冬氨酸只作为反向运输体而没有更多生理效应 的原因。这一问题应受到进一步研究【5 3 1 。 4 鲁东大学硕士学位论文 3 2 抑制性氨基酸类神经递质的研究 正如谷氨酸、天冬氨酸在中枢神经系统是主要的兴奋性神经递质，其他两种氨基酸 g a b a 和甘氨酸是主要的抑制性神经递质。g a b a 和甘氨酸在哺乳动物整个中枢神经系 统发现，但g a b a 在几乎每一个脑区作为一种神经递质，甘氨酸在大脑尾端的部分， 脊髓，视网膜扮演着主要的作用。 3 2 1 t 氨基丁酸 非蛋白氨基酸g a b a 在几乎所有的真核细胞生物内被发现，包括植物。它存在于哺 乳动物大脑在5 0 年前被描述，后来证明是一种重要的中枢神经递质f 5 4 1 。g a b a 由谷氨酸 合成，以c a 2 + 依赖方式从神经末梢释放。1 9 6 1 年，d u d e l 和k u f f l e r 用小龙虾( c r a y f i s h ) 神经肌肉接头为样本，发现抑制性神经元释放的g a b a 作用于神经末梢的g a b a a 产生抑 制性突触后电位，使神经末梢兴奋性下降，神经末梢释放兴奋性递质谷氨酸减少【5 5 1 。多 年来，众多神经化学，免疫细胞化学和电生理学研究以及近来的研究使g a b a 受体的克隆 成为可能，g a b a 运载体和酶是g a b a 合成的原因，已证实g a b a 能突触贯穿整个中枢 神经系统。此外，g a b a 在许多神经细胞中被发现有助于识别大脑区域间的通路。 g a b a 是一种抑制性神经递质其主要功能是引起膜极化作用，从而减少神经 细胞的活动。g a b a 通常被看作是一种经典的抑制性神经递质，但在某些情况下它能引 起明显的兴奋性作用，并且这看起来是它在神经系统发展中的另一种作用。在哺乳动物 中，g a b a 主要通过细胞膜上存在的a 、b 、c 三种类型受体发挥作用。( 3 a b a b 受体通 过g 蛋白和细胞内第二信使与钙离子通道或钾离子通道偶联【5 6 1 ；g a b a 和g a b a c 受 体是配体门控氯离子通道【5 7 , 5 5 。一些研究结果表明，不同的物种或不同的组织对g a b a 的反应不同。如黄道蟹( c a n c e rb o r e a l i s ) 胃上神经节大部分细胞对g a b a 产生兴奋性 反应，少数细胞产生抑制性反应【5 9 。 g a b a 作为一种神经递质在很多腹足动物中唧】被研究过，而且已证明g a b a 在软 体动物中枢神经系统中能够起兴奋和抑制两种作用1 6 。任何复杂的行为都是由发挥不同 作用的神经网络相互协调而产生【6 2 1 ，g a b a 在后鳃亚纲( c l i o n el i m a c i n e ) 的摄食过程 中起兴奋作用【6 3 石7 】；g a b a 在海兔神经细胞中能够产生兴奋性应答6 8 , 6 9 。在哺乳动物中 枢神经系统中g a b a 是主要的抑制性神经递质，但在有的种类中g a b a 是兴奋性神经 递质【7 0 l 。有的实验已证明g a b a 与动物的新陈代谢水平有一定的关系，g a b a 仅存在 于hl u c o r u m 的脑中，而且含量很低，且冬眠过程中也有g a b a 的存在；g a b a 在蜥 蜴脑中含量很高，而且在蜥蜴冬眠过程中g a b a 的含量明显增加，这意味着蜥蜴冬眠 5 鲁东大学硕士学位论文 过程中g a b a 在抑制细胞活性方面起着重要的作用【7 1 】。许多脊椎动物和无脊椎动物为 了适应环境压力( 如：冬眠或者缺氧) ，它们就会减低新陈代谢水平，神经递质在调节 新陈代谢水平过程中起着重要的作用，例如：在动物脑中增加抑制性神经递质g a b a 的含量，可以通过抑制神经细胞活性来降低新陈代谢水平【_ 7 2 1 。已有很多研究报道指出 g a b a 分别可以与氨基乙酸( 西y c m e ) ( 7 3 1 、三磷酸腺苷( a t p ) 【7 4 】、谷氨酸、d a 7 5 1 等共存。 在过去的几十年中，大家已经普遍认同g a b a 作为抑制性递质不仅存在于中枢神 经组织，而且还存在于外周组织中，比如节肢动物7 6 1 、环节动物【7 7 1 和线虫纲动物【7 8 1 、 脊椎动物【7 9 】等。有关报道指出g a b a 免疫反应阳性细胞存在于几种腹足动物的中枢神 经系统中【6 0 ，8 0 ，8 1 1 ，并且g a b a 阳性纤维存在于腹足动物外周神纠8 1 】。g a b a 在海兔神 经细胞中的作用已被研究过【6 1 】，g a b a 在中枢神经和外周神经中都起抑制作用。在静水 椎实螺的中枢神经系统和某些肌肉的支配神经中都有少量g a b a 免疫阳性反应细胞的 分布，g a b a 在其脑神经节和足神经节中是对称分布的，中央纤维网中只有很少的阳性 神经纤维【8 2 1 ，也许这些阳性神经纤维是接受上皮细胞传来信号的传入神经纤维【8 3 】；在肠 的神经组织中，g a b a 可能参与平滑肌的调控晔】。除了作为神经递质，有证据表明在脑 外，g a b a 可能还有其它形式的发挥作用【8 5 1 。在无脊椎动物中，g a b a 的抑制效应首先 是在小龙虾的牵张感受器神经元中发现的。它的抑制作用还表现在上昆溉p o m a t i a 的心脏 肌和棘皮动物a s 纪r i a sr u b e n s 的消化系统中【8 6 1 。研究氨基酸递质除采用放射免疫测定、 生化分析等传统手段外，免疫组化法、原位杂交法、微电泳、放射自显影术和放射性核 素标记法以及损毁神经通路的方法也都被广泛应用于研究相关神经通路中含氨基酸类 递质的性质、神经胞体分布和纤维联系等 8 7 1 。 3 2 2 甘氨酸 甘氨酸是另一种抑制性氨基酸神经递质，也是所有氨基酸中最简单的，它牵涉到许 多代谢途径，是蛋白质的主要成分，主要分布于中间神经元【黯】。脑干和脊髓的g l y 能神 经元被认为可控制运动节律的产生。脊髓前角g l y 能抑制性中间神经元还可协调多种脊 髓反射【8 9 】。g l y 通过激活脑干和脊髓内士的宁( s t r y c l l i l i n ) 敏感的甘氨酸受体而快速抑 制突触传递。在脊髓背角【9 0 】，g l y 能神经元和g a b a 能中间神经元参与背角浅层抑制性 局部环路的形成。在中枢神经系统的某些区域g l y 与g a b a 同步释放【9 1 1 。以往认为g l y 受体主要分布于下为中枢、脑干和脊髓，但近年来以原位杂交技术研究表明，g l y 受体 在中枢神经系统分布较为广泛。至今尚未发现明确的g l y 能神经投射通路。 甘氨酸与g a b a 类似，储存在突触囊泡中。在某些情况下，神经元可以释放g a b a 6 鲁东大学硬士学位论文 和甘氨酸，包裹进相同的囊泡中。这种联合释放的程度和意义现在还不清楚，但它的作 用将明显取决存在于突触前和突触后受体的类型。 甘氨酸受体可以被一系列简单的氨基酸包括甘氨酸、p 丙氨酸和牛磺酸激活，并被 高亲和力竞争性拮抗剂士的宁选择性阻断。甘氨酸受体最初在士的宁束缚下被从脊髓膜 分离出。在突触后膜中甘氨酸受体同g a b a 受体一样，通常产生超极化i p s p 。在脑干 中，甘氨酸受体被证明存在突触前末端，在那里它们诱导小的去极化作用激活c a 2 + 通道 并且增加神经递质的释放。不同于g a b a a 受体，甘氨酸受体被一些类固醇抑制，不受 苯二氮类药物影响并且相对于巴比妥酸盐不敏感。 1 9 5 1 年，c a m i e n 等在研究胁m a r l 姻v u l g a r i s 和m a i as q u i n a d o 的肌肉神经元中发现高 浓度的甘氨酸，暗示甘氨酸作用是调节渗透压【9 2 】。甲壳动物只m a r g i n a t u s 黏膜柱状上皮 细胞中富集高浓度的甘氨酸，这可能与只历口曙f 聆口如8 的生长和成熟有密切的联系【9 3 】。在 研究裸鳃亚目软体动物海蛞蝓( a r c h i d o r i sm o n t e r e y e n s i s ) 的心脏是运动机制时发现海蛞 蝓的心脏收缩性受几种神经递质调解，但甘氨酸对心脏没有影响【舛】。 4 一氧化氮对无脊椎动物中枢神经系统神经递质影响 19 8 0 年f u r c h g o r 等在研究血管舒张作用时，发现血管内皮细胞可产生并释放一种舒 血管活性物质，并提出所谓有内皮细胞源性舒张因子( e i m f ) ，后经证明e r d f 就是一 氧化氮( n o ) 【9 5 1 。 n o 是近二十年来发现的一种新的气体信使分子，其结构简单，具有易扩散、反应 性强、性质活泼而不稳定，广泛存在于生物体内各组织器官，当人们发现作用于n m d a 受体的兴奋性神经递质谷氨酸刺激脑胶质细胞产生n o 时，才第一次认识到n o 在神经 系统中的作用【9 6 1 。 l 一精氨酸是n o 生成的前体，在一氧化氮合酶( n i t r i co x i d es y n t h a s e ，n o s ) 。催化下 l 精氨酸转化为n o 和l 瓜氨酸，并以还原性辅酶i in a d p h 作为氢供体和电子供体。根 据酶的细胞或组织来源不同，可以将n o s 分为神经元型n o s ( n e u r o n a ln o s ，n n o s ) 、 诱导型n o s ( i n d u c i b l en o s ，i n o s ) 、内皮型n o s ( e n d o t h e l i a ln o s ，e n o s ) 。 n o s 可以作为证明n o 作用的重要标记物，而n o s 可以通过免疫组化或组织化学染 色显示n a d p h 黄递酶技术进行定位。由于n n o s 的结构和化学特性与n a d p h 黄递酶 有共同之处，在许多情况下n o s 免疫反应的分布和n a d p h 一黄递酶染色的情况是相似 的。应用n a d p h 黄递酶染色，发现在无脊椎动物的中枢和外周神经系统中都有这种酶 分布9 7 。9 9 1 。同样，在软体动物的许多物种中，如l y m n e as t a g n a i l s 1 0 0 ，1 0 1 1 、a p t y s i a 7 鲁东大学硕士学位论文 c a l i f o 聊良d 10 2 1 、h e l i xp o m a t i a 1 0 3 ，1 0 4 和p l e u r o b r a n c h a e ac a l i f o r n i c a 1 0 5 1 都检测到n o 和n o s 的存在。利用n a d p h d 组化技术，在食草性软体动物【1 0 0 】的食道前段和唇中，大量的n o s 分布在外周感官神经元中；l s t