（食品科学专业论文）黑曲霉UB52产植酸酶及酶学特性研究.pdf

摘要 本文对黑曲霉进行诱变及诱变菌株的最佳产植酸酶条件优化、产酶动力学、植酸酶的纯化和 酶学性质的研究；对植酸酶的最佳包被条件及其体外消化实验进行了探讨。 以黑曲霉$ 3 0 6 为山发菌株，采用紫外、溴化乙锭以及两者的复合诱变，经多轮诱变得 到一株液态发酵产酶活力为4 7 0 0u m l 的菌株( u b 5 2 ) ，其遗传性状稳定。 在获得到诱变菌株( u b 5 2 ) 最佳发酵营养条件的基础上，对三角瓶和1 0 l 罐中的最佳 培养条件进行研究。1 0 l 罐在最佳条件下生物量达1 1 9g 干重1 0 0m l 发酵液，最高酶活达到5 8 0 0 u m l 发酵液，并建立发酵动力学模型预测发酵过程。 对黑曲霉u b 5 2 液态发酵所产粗酶采用s e p h a d e xg 1 0 0 凝胶层析和d e a e 一5 2 离子交换柱 层析分离，得到纯化的酶，经s d s p a g e 检验为单一谱带，相对分子量为6 3k d ，该植酸酶的等 电点口i 为4 5 ，以植酸钠为底物的米氏常数k m 为0 3 1m m o l l 。植酸酶氨基酸分析结果显示吉酸 性氨基酸多，碱性氨基酸少，这和其等电点偏酸性是一致的。 以微孔淀粉为载体，采用流化床干燥法，对植酸酶进行了包被研究，通过正交实验，包被最 优条件为：蔗糖的添加量为植酸酶重量5 ，盐用量为淀粉重量的1 0 ，明胶用量为淀粉量的1 ，5 。 对包被的植酸酶进行体外消化试验显示：添加包被植酸酶的2 1 日龄日粮消化透析液中氨基酸、 微量元素及磷的含量都较添加裸植酸酶的对照样高1 3 6 、3 2 6 、1 2 o 。 关键词：植酸酶，发酵，动力学，酶学性质，稳定化 a b s t r a c t o nt h eb a s i so fm u t a t i o n ，an e w a s p e r g i l u sn i g e ru b 5 2i so b t a i n e d t h i sp a p e rm a i n l ys t u d i e st h e o p t i m a lc o n d i t i o n sa n dt h ek i n e t i cc h a r a c t e r i z a t i o no fi t sp r o d u c i n gp h y t a s ea n dt h ep h y t a s ep u r i f i c a t i o n ， c h a r a c t e r i z a t i o na sw e l l m e a n t i m e ，t h eo p t i m a lo fs t a b i l i z e dp h y t a s ew a sp r e p a r e da n dt h ed i g e s t i o no f t h es t a b i l i z e dp h y t a s ew a sd e t e c t e d a n i g e r $ 3 0 6i sm u t a t e dw i t ht h em u t a g e n so f u l t r av i o l e tr a y ( u v ) ，e t h i d i u mb r o m i d e ( e b ) a n d t h et w oc o m b i n e d m u t a g e n a f t e rs e r i e so ft r e a t m e n t ，a n i g e ru b 5 2 i sa b t a i n e d i t sp h y t a s e a c t i v i t yi n l i q u i df e r m e n t a t i o ni s4 7 0 0u m l ，a n di t sh e r e d i t yi ss t a b l e t h e o p t i m a lc u l t u r em e d i u m f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o ni naf l a s ka n d1 0l f e r m e n t o ro fs u b m e r g e d f e r m e n t a t i o nw i t h a n i g e ru b 5 2w e r ed e t e r m i n e d u n d e rt h eo p t i m a lc o n t i o ni n 1 0lf e r m e n t o rt h e b i o m a s sr e a c h e d1 1 9gd r yw e i g h t l o o m lf e r m e n t a t i o nl i q u i d t h ea c t i v i t yo fp h y t a s ei s5 8 0 0 u m lj n f e r m e n t i n gl i q u i d t h ek i n e t i cm o d e lo f f e r m e n t a t i o nt h a tc a np r e d i c tl i q u i d s t a t ef e r m e n t a t i o nw a ss e t u p p h y t a s ep r o d u c e db y a n i g e ru b 5 2 w a s p u r i f i e dw i t hs e p h a d e x g 1 0 0a n dd e a e 一5 2 t h e p h y t a s e i n s p e c t e dw i t hs d s p a g e s h o w e d ：ab a n d ，p l4 5a n dt h er e l a t i v em o l e c u l a rw e i g h to fp h y t a s e6 3k d ， k i no 3 1m m o l l a tt h es a m et i m e ，t h ea m i n oa c i d sf r o m p u r i f i e dp h y t a s es h o w e dt h a ti tc o n s i s t e do f m o r ea c i d i ca m i n oa c i d sa n dl e s sa l k a l ia m i n o a c i d s ，a n dt h i sc a ne x p l a i nt h ep io fp h y t a s e w a sa c i d w i t h m i c r o p o r o u ss t a r c h a st h ec a r r i e ra n df l u i d b e da st h e c o a t i n gm e t h o d ，t h em e t h o d o f s t a b i l i z a t i o nw a s s t u d i e d b y t h e o r t h o g o n a le x p e r i m e n t t h e o p t i m a l c o n d i t i o no f c o a t i n g w a s d e t e r m i n e dt ob e5 t h es u c r o s ea d d i t i o no fp h y t a s ep o w d e r , 1 0 t h ec o a t i n gs a l to fm i c r o p o r o u s s t a r c h 1 5 c o a t i n gg l u t i no fm i c r o p o r o u s s t a r c h t h ed i g e s t i o no ft h es t a b i l i z e dp h y t a s ew a sd e t e c t e d i nv i t r o ，a n dt h er e s u l ts h o w e dt h a tt h eq u a n t i t yo fa m i n oa c i d ，t r a c ee l e m e n t ，p h o s p h o r u si nd i a l y s i s l i q u i do fd i g e s t e dc o r n - s o y b e a nm e a ld i e to f2 1db r o i l e rw i t hs t a b i l i z e dp h y t a s ew e r eh i g h e r l 3 6 、 3 2 6 、1 2 0 t h a nt h a to ft h ec o n t r 0 1 k e yw o r d s ：p h y t a s e ，f e r m e n t a t i o n ，k i n e t i c s ，e n z y m a t i c ，c h a r a c t e r i z a t i o n ，s t a b i l i z a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：协宣，白 时间： 砌年f 月冈日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：苗奇，l 幻时间：三一1 3 年f 月f 孑日 聊虢膨尹帆叫年月 缩略词及符号列表 动力学参数 维持常数 相对酶活( ) 起始酶活( ) 动力学参数( h 。1 ) 基质浓度( g t 0 0m l ) 菌体生物量( g 1 0 0m l ) 最大菌体生物量( g t 0 0m l ) t 时刻的菌体生物量( g 1 0 0m l ) 初始菌体生物最( g 1 0 0r n l ) bh p n 啦s x 矗 善 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 第一章绪论 1 1 前言 植物中的磷大部分( 6 0 7 0 ) 以植酸磷的形式存在i 1j ，单胃动物消化道中无植酸酶，饲料 中大量的植酸磷不能被利用而随粪便排入环境，既浪费了资源，义对环境造成了磷污染，我国每 年从畜禽粪便中排山的磷达2 5 0 万吨之多叫，是水体富营养化污染的主要原因之一。植酸酶能分 解植酸及植酸盐释放出磷，提高植酸磷的利用率，我国饲料工业和畜禽养殖业广泛推广应用植酸 酶，不仅可以充分利用植物饲料中本身所含有的植酸磷资源，大幅度降低动物粪便排出的磷，同 时由于植酸酶可替代磷酸氢钙，故可关停一批污染严重的磷酸氢钙工厂。从这两方面看，植酸酶 的研究与开发具有重要的理论与实践意义1 3 j 。随着我国政府和公众对我国生态环境问题的日益重 视，以及植酸酶价格的降低，耐热性能的提高，植酸酶在我国推广应用必将得到长足的发展。 植酸学名为肌醇六磷酸，化学名称为环己六醇磷酸酯，分子式为c 6 h 。8 0 2 。p 6 ，它是一种淡黄 色或淡褐色的粘稠液体，溶于水、乙醇和丙酮。植酸广泛地分布于植物性饲料中，植酸本身的毒 性很小，但有较强的抗营养作用，植酸带负电荷，具有强大的螯合能力，其作用的p h 范围很广， 尤其在酸性至中性范围内( 与胃肠p h 范围一致) ，其螯合作用更显著 5 1 。因此，植酸在自然界几 乎无游离态存在，而是与钙、镁、钠、锌、铁、铜、锰等常量和微虽矿物质形成植酸盐复合物， 这些复合物不溶于水，不能被消化吸收 4 1 。植酸的存在导致了畜禽钙、磷、铁等常量和微量元素 的缺乏与不平衡，而无机磷的添加又会加剧这种拮抗作用，使其他元素也必须相应提高至平衡程 度，否则就会因为上述这些常量、微量元素是某些酶或辅酶的必要组成成分或活性中心而将导致 活性降低以及辅酶缺乏从而影响各种营养物质的代谢；此外，在低p h 值时，植酸还可与蛋白质 分子上的碱性基团结合而使蛋白质发生沉淀，形成蛋白质金属植酸盐，这种结合降低了蛋白质 的消化吸收，同时也使消化酶的活力降低，继而影响到碳水化合物和脂肪的消化吸收【6 】。 植酸酶的来源有两种，一是植物性饲料本身含有一定数量的内源性植酸酶，种子萌发时，植 酸酶被激活并水解种子中的植酸，释放磷元素，供植物生跃需要，另外，微生物发酵也产生植酸 酶，由于植物和动物来源的植酸酶不能形成生产规模，并且作用范围没有微生物来源的广，稳定 性也较微生物来源的差，因此目前这方面的工作都集中于微生物植酸酶n 1 。微生物植酸酶的研究 工作始于本世纪6 0 年代，国外科技工作者经过2 0 年的努力，取得了可喜的成绩。与动植物植 酸酶相比，微生物所产植酸酶系比较复杂。我们通常所说的植酸酶是一个广义的概念，是指与植 酸分解有关的酶类，它实际上包括植酸酶和酸性磷酸酶两种酶。植酸酶只能将植酸分解为肌醇磷 酸酯，不能彻底分解成肌醇和磷酸，酸性磷酸酶能将肌醇磷酸酯彻底分解成肌醇和磷酸。植酸 酶包括两种组分：第一种组分最适p h 在2 5 左右，我们称之为p h y t a ，动物胃中的p h 在2 5 左 矗，这种组分主要在胃中起分解植酸的作用；第二种组分的最适p h 在5 5 ，我们称之为p h y t b ， 动物肠道的p h 在5 5 左右，这一组分主要在动物肠道中起分解植酸的作用。酸性植酸酶也包括 两种组分：第一种组分的最适p h 也在2 5 左右，与动物胃中的p h 相近，它主要在动物胃中起作 用，我们称之为p a ；第二种组分最适p h 也在5 5 左右，与动物肠道的p h 相近，它主要在动物 肠道中起作用，我们称之为p b 。微生物种类不同所产生的植酸酶系也不一样，有的只含有p h y t a ， 中图农业大学硕士学位论文 第一章绪论 有的只含有p h y t b ，有的含有p h y t a 、p b ，无花果曲霉n r r l 3 1 3 5 能同时产生四种酶活力【8 1 。 植酸酶( p b y t a s e ) 是催化植酸帆醇六磷酸) 及植酸水解成肌醇与磷酸( 或磷酸盐) 一类酶 的总称，属磷酸单酯水解酶，它实际上包括植酸酶和酸性磷酸酶两种酶。现已知有3 种类型， 即肌醇六磷酸3 一磷酸水解酶( e c 3 1 3 8 ) 、肌醇六磷酸6 磷酸水解酶( e c 3 1 3 2 6 ) 和非 特征性的正磷酸盐单酯磷酸水解酶。不同来源的植酸酶作用机理有差异，微生物产的3 一植酸酶 作用于植酸时，首先从植酸的第3 碳位点开始水解酯键而释放山无机磷，然后再依次释放出其他 碳位点的磷，最终酯解整个植酸分子，此酶需要2 价镁离子( m 9 2 + ) 参与催化过程。来源于植物的 6 一植酸酶，它首先在植酸的第6 碳位点开始催化而释放出无机磷。1 克植酸完全分解理论上可 释放出无机磷2 8 1 6m g ，二磷酸酯彻底分解成肌醇和磷酸。大多数微生物来源的植酸酶的作用机 理如图1 1 ，要想彻底分解肌醇单磷酸和肌醇二磷酸酯，需酸性磷酸酶的帮助，酸性磷酸酶在植 酸彻底分解过程中起重要作用，它可以把单磷酸、二磷酸酯彻底分解成肌醇和磷酸h 。 植酸 l d 1 ，2 ，4 ，5 ，6 - 五磷酸肌醇和d 1 ，2 ，3 ，4 ，5 - 五磷酸肌醇 l 1 ，2 ，5 ，6 四磷酸肌醇 i 1 ，2 ，5 - 三磷酸肌醇或1 ，2 ，6 三磷酸肌醇 l 1 ，2 _ 二磷酸肌醇 l 2 磷酸肌醇 图1 - l 植酸酶的作用机理 f i g1 1 m e c h a n i s mo f p h y t a s ef u n c t i o n ( 1 ) 分子量：植酸酶的分子量因来源不同而著异很大，植酸酶分子量的差异主要来是由于 糖基化，真菌植酸酶都是糖基化蛋白，随糖基化不同，分子量差异很大，糖基化对酶的专一性酶 活没有多大影响，而对于酶的分子量和热稳定性具有显著影响，对酶的等电点也有影响。 ( 2 ) 最适p m 植酸酶的最适p h 值一般在2 - 6 之间。植物来源的植酸酶最适p h 为4 0 7 5 ，大多数在 5 0 6 0 ，不太适合在单胃音禽酸性的胃中起作用，且在植物中含量很低，细菌来源的植酸酶最适 p h 一般为中性或偏碱性，真菌植酸酶为2 5 - 7 0 。( 3 ) 最适作用温度，植酸酶最适温度在4 0 6 0 范围内，不同来源的植酸酶的最适温度相差较大。( 4 ) 激活离子与抑制因子，多数二价阳离 子( c a “、f e “、z n “、m g “、c u 2 + ) 冈与底物发生强烈的络和作用而抑制酶的活力，草酸、柠 檬酸等化合物也冈与酶活性中心关键氨基酸的侧链基团反应而降低酶活，对于有的植酸酶，则存 在某种特定的金属离子可以作为电子转移载体起到酶的激活剂的作用【”】。 1 2 植酸酶在养殖业中的作用 2 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 自9 0 年代以来，芬兰、德国己开发成功植酸酶，因此对植酸酶在饲料工业的基础及实际应 用研究工作也大量地开展起来，对植酸酶在猪禽养殖业上的作用已基本肯定。主要包括以下几个 方面： ( 1 ) 能使饲料中植酸有机磷得到有效地利用。磷是畜禽不可缺少的一种必需元素，是畜禽 骨骼的重要组成物质，并参与机体的多种代谢，虽然在植物性饲料中总磷的含量较高，但大多都 是以植酸磷的形式存在，猪和禽类等单胃动物消化道内缺乏水解植酸的植酸酶，对植物性饲料中 磷的利用率较低，必须通过添加磷酸盐或含磷较高的动物性饲料来满足畜禽磷的需要。磷缺乏将 会引起畜禽骨骼发育不良和生产性能r 降。在猪和鸡的养殖过程中，可以采用植酸酶部分或全部 替代无机磷，降低饲料成本。白1 9 9 0 年s i m m o n 证实了植酸酶在鸡和猪的养殖过程中能提高饲 料中植酸磷的利用率以米，在鸡和猪的养殖过程中采用植酸酶替代无机磷的研究报道很多，都肯 定了上述结论【l ”。植酸酶在产蛋鸡日粮中的应用最为普遍，k l i s 等报道，2 0 2 4 周龄产蛋鸡低磷 日粮中添加2 5 0u k g 植酸酶水解植酸所放出的磷相当于添加1 3g r o g t ”】，g o r d o n 研究发现，在 无机磷水平为0 1 的产蛋鸡日粮之中添加3 0 0 u k g ，末出现磷缺乏现象【1 ”。植酸酶在猪日粮中 的应用也有人量研究报道，主要集中在断奶仔猪阶段，l e i 等报道，在体重为8 1 8k g 的断奶仔 猪日粮中用7 5 0u k g 植酸酶替代全部无机磷后，显著提高了磷沉积，粪中磷排泄量也相应降低， 血液中磷和钙及碱性磷酸酶活性均接近正常水平【1 4 1 ，l i 等研究报道，在体重为2 3 4k 卫生长猪玉 米豆粕日粮中添加7 5 0u r g 植酸酶全部替代无机磷，可以释放出足够的磷满足猪的生长需要， 其生产性能与添加无机磷日粮相比无差异【l “。与磷代谢有关的指标如血清中磷的含量、胫骨磷的 含量、灰分中磷的含量明显高于不加植酸酶的对照组，并且胫骨抗剪切力强度及应激能力有明显 提高。关于植酸酶的添加量，由于各实验室采用的饲料植酸含量不同，再加上饲养方式及饲养动 物种类不同，所得结果并不完全一致，从大量文献中可以看出，目前每k g 饲料中，酶最佳添加 量在3 5 0 - - 1 2 0 0 u 之间，另有报道在猪饲养过程中，植酸酶的添加量以3 5 0 _ _ 5 0 0u 即可，再高已 毫无意义，并且发现采取湿喂只需2 5 0u 即可p ，1 ”。植酸酶可以减少磷污染，采用植酸酶替代无 机磷可以使猪禽粪便中磷含量减少2 0 - 5 0 。减少数量的多少根据植酸酶添加量及替代无机磷 量而有差异1 1 7 1 。 ( 2 ) 添加植酸酶能改善畜禽生长性能。目前关于植酸酶饲养实验主要有两个目的，一个是 希望了解在不同饲料中多少单位的植酸酶可以完全替代无机磷，以维持禽兽生长性能不变，从而 可进一步了解添加植酸酶与添加无机磷相比经济上是否合算，在这种条件下，可以减少多少无机 磷对环境的污染。最近的大部分实验都是围绕这一主题。第二个方面希望知道在常规饲料( 含常 量或1 2 常量的无机磷) 中添加植酸酶是否对禽兽生长性能有所改善，早期大量实验都是关于这 方面的。大量实验表明，在肉鸡饲养中添加植酸酶可以有明显增重效应，并改善饲料利用率，降 低料肉比，在蛋鸡饲料中添加植酸酶可以降低死淘率，增加产蛋率，饲料报酬增加，对鸡也有增 重效应，在猪饲料中添加植酸酶，猪增重明显提高料肉比降低【1 ”。 ( 3 ) 在低磷或止常磷含量的口粮中添加植酸酶后，不仅促进了植酸磷的生物利用率，并且 促进了动物矿物营养的平衡，特别是钙、磷平衡和铜平衡。在畜禽日粮中添加的锌元素，均以 2 + 价的形式存在，很容易与日粮中植酸形成螯和物，致使锌生物学效价降低。b i e h l 等报道，肉 3 中国农业人学硕士学位论文第一章绪论 仔鸡采食添加植酸酶的缺锌玉米豆粕日粮后，增重和胫骨中锌含量均有提高【l ，u m 等在产蛋鸡 日粮中添加植酸酶，结果产蛋鸡具体表现为虹清中、胫骨中及肝脏中这些物质的存留增加，骨质 抗剪切力明显提高 2 0 l 。植酸酶的添加也可提高锌的利用率，t h i e l 等研究报道，在玉米豆粕日粮 中添加7 0 0u k g 植酸酶，肉仔鸡大腿骨中锌沉积增加2 0 ，相当于在日粮中添加1 5i t l g k g 的锌， 另外添加植酸酶后动物对于矿物质元素影响常导致动物组织结构的改善，1 9 9 6 年q i a n 等人比较 饲喂添加和不添加植酸酶的鸡的掌骨组织结构灰分中p 、c a 2 + 等含量增加外，还发现添加植酸酶 动物的掌骨末端肥大区减少，增生区增加，软骨组织增加，并且发现植酸酶添加可以促进软骨和 骨细胞有序化。 ( 4 ) 促进了动物对蛋白质的消化吸收。植酸是一种强酸，具有很强的螯和合能力，其6 个 带负电的磷酸根基团，除与金属离子结合外，还可与蛋白质进行有效的络合，从而降低动物对蛋 白质的消化率，当口h 低丁蛋白质的等电点是时，蛋白质带正电，由于强烈的静电作用，易与带 负电的植酸形成不溶性复合物，蛋白质上带正电荷的基团，很可能是赖氨酸的e 氨基、精氨酸 和组氨酸的胍基，当p h 高于蛋白质的等电点时，蛋白质的游离羧基和组氨酸上未质子化的咪唑 基带负电，此时蛋白质则咀多价阳离子如c a “、m 9 2 + 、z n “等为桥，与植酸形成三元复合物，植 酸蛋白二元或三元复合物的形成会改变蛋白质的结构，降低其溶解度，进而影响其消化率利功能。 从理论上讲，植酸酶水解植酸释放出磷的同时，可将与植酸络和蛋白质释放出来，便于消化道分 泌的各种蛋白酶作用，从而使其消化利用率得到提高，另外植酸可与内源酶性蛋白酶、淀粉酶、 脂肪酶等络利，降低酶活性，从而导致蛋自质消化率降低。 有人做过植酸与蛋白质络和试验，蛋白质与植酸是否形成沉淀，强烈依赖于溶液的d h 值， 具体见表1 - 2 ，当p h 为2 时，除米糠蛋白和豆饼蛋白溶解率为2 2 和9 1 p b ，其他来源蛋白质 的溶解率均达到1 0 0 ，当添加植酸以后，米糠、葵花蛋白溶解率分别降至2 8 、1 6 、2 6 酪 蛋白和豆粕蛋白的溶解率受植酸的影响最大，分别降低到1 1 12 ，若植酸在加入到蛋白质溶液 前，先与过量植酸酶水浴，则可阻止络合物沉淀的产生，细米糠蛋白质溶解率提高5 7 ，远高于 未水浴时的溶解率，其他来源蛋白质的溶解率恢复到9 3 1 0 0 。p h 为3 时，蛋白质溶解率的 变化规律与p h 为2 时相似，只是绝对值不同。 表卜2 不同的酸度条件下加入植酸后蛋白溶解率 t a b l e1 - 2t h ed i s s o l u t i o nr a t i oo f p r o t e i n0 1 1t h ec o n d i t i o no f d i f f e r e n tp h 注：1 蛋白质+ 植酸+ 植酸酶t i 蛋白质+ 植酸i l i 蛋白质 4 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 体外消化试验证明，植酸含量与蛋白质消化率呈负相关，特别是蛋白质含量较高的植物性饲 料，其蛋白消化率随着植酸含量降低而增高。j o n h b l o e 的试验表明在蛋白质与植酸沉淀形成后， 加入胃蛋白酶和植酸酶，沉淀消失速度比单独加胃蛋白酶快得多，即使胃蛋白酶浓度再提1 0 倍， 添加植酸酶仍有作用，植酸酶能够裂解植酸蛋白质复合物。促进蛋白质的消化吸收1 2 “。1 9 9 4 年 m r o z 报道在饲料中添加植酸酶后，除了使磷的消化率( a t i p ) 大幅度提高外，还能使下列物质 的消化率( a t d ) 显著提高：d m ( 1 8 ) ，o m ( 1 6 ) ，c p ( 2 3 ) ，c a ( 4 3 ) ，l y s ( 2 0 ) ，m e t ( 2 7 ) ，t y r ( 1 4 ) ，a r g ( 2 0 ) ，h i s ( 1 3 ) ，i l e ( 2 5 ) ，l e u ( 2 3 ) ，p h e ( 2 7 ) ，t h ( 2 8 ) ，v a l ( 2 5 ) 。c p 和氨基酸的消化率提高说明植酸和蛋白质键被植酸酶打 开并降低了植酸水平，从而减轻了植酸对胃蛋白酶和胰蛋白酶的影响。正是由于植酸酶具有上述 一举多得的功效，目前已成为饲料工业中的热点 8 1 。 在大多数情况下，植酸酶的应用能提高动物对蛋白质的利用率，使粪中氮排泄量减少，不 同实验结果所以不一致，很有可能与蛋白质植酸复合物的数量与分布有关，由于不同植酸与蛋白 质形成复合物的可能性大小有差异，不同来源蛋白质与植酸络合能力不同故植酸酶对蛋白质利 用率的作用，与蛋白质的来源及日粮中氨基酸是否缺乏有关。 ( 5 ) 植酸酶在家禽消化道中的作用 家禽靠喙采食饲料后，不经咀嚼即借助舌的运动很快吞下食道。食道虽较长，但它宽大且易 于扩张，因此依靠头部升举和迅速向前的动作以及食物的重力作用，未经咀嚼的饲料很快就到达 了食道膨大部，其中一部分直接进入腺胃。另一部分则在食道膨大部贮存2 小时以上( 珠海经济 特区溢多利有限公司技术开发部，1 9 9 6 ) 。食道膨大部虽仅占消化道总长的2 3 。但其中的环境 从理论上说适合植酸酶作用：( 1 ) p h 范围4 3 9 4 8 2 。适合外源性微生物植酸酶( p h 2 o 一7 0 ) 和植物性植酸酶( p h 4 o _ _ 6 o ) 酸碱度范围；( 2 ) 温度为体温，非常温和，酶活性大；( 3 ) 饮来 的水分将食物润湿和软化。此时的水分湿度足以将酶激活；( 4 ) 粉料与植酸酶的均匀混合为酶与 底物( 植酸磷) 的接触提供了大量机会；( 5 ) 食道膨大部不分泌消化液，因而没有消化酶的干扰。 因此，该部位应该对植酸酶发挥作用有一定意义i ”。植酸酶在畜禽日粮中的应用受多种因素的影 响，通常随着植酸酶的添加水平的提高，磷的释放量也增加。日粮中非植酸磷的水平也会对植酸 酶的作用产生影响，s o h a i l 等报道，在非植酸磷的水平分别为0 2 2 5 和o 3 2 5 玉米一豆粕日粮 中添加植酸酶，结果发现低水平植酸磷组肉仔鸡增重、骨中矿物质含量、骨密度和强度明显提高， 但高水平非植酸磷日粮组无变化口”。 钙的水平也会影响植酸酶水解植酸的作用，l a n t z s c h 等报道，在大麦豆粕一葵花粕日粮中添 加1 0 0 0u k g 植酸磷，增加了生长母猪磷和钙的吸收与沉积【2 4 1 。当日粮中钙水平由5g k g 增至8 酣唱时，降低了植酸酶提高磷表观吸收的作用，并建议磷利用率最佳时的钙水平为7g ，k g ， s e b a s t i a n 等指出，在肉仔鸡日粮中钙水平以0 6 为好，在添加植酸酶的肉仔鸡日粮中降低磷和 钙水平是提高植酸酶应片j 效果和肉仔鸡生产性能的最佳方式【2 ”。 “等认为，降低仔猪日粮钙水平有提高植酸酶水解植酸活性的作用，所以应避免在加酶日粮 中添加高水平的钙2 “。q i a n 报道，当仔猪玉米一豆粕日粮中有效磷水平为o0 7 或o 1 6 1 j 随 5 中国农业大学硕十学位论文第一章绪论 着钙磷比增加仔猪平均日增重、采食量和增重耗料比直线下降。植酸酶活性、钙和磷消化率和骨 指标等也随钙磷比增加而降低口”。l i u 等试验表明，在生长至育成猪的低磷玉米，豆柏日粮中添加 植酸酶，使钙磷比例由1 5 ：1 降至1 0 ：1 ，可提高猪的生产性能和磷的利用率，所以在畜禽低钙 日粮中添加植酸酶，有利于调整日粮的钙磷比，达到提高生产性能的作用j 。维生素d 的添加 对提高植酸酶的效率也有一定的作用，在仔猪日粮低磷玉米豆粕日粮中添加不同水平的植酸酶、 维生素和钙，结果发现日粮中正常钙水平能降低植酸酶的应用效果，而增加维生素d 可适当降低 钙的副作用。 其它外源酶的加入有增加植酸酶酶活能力的协同作用，非淀粉多糖酶可提高植酸酶的作用效 果，植物组织中的植酸和其它营养成分一起组成复杂的植物组织结构，植酸酶与植酸的结合受到 植物组织中其它组分不同程度的阻碍，如蛋白、纤维和淀粉等，在麦类饲料中，植酸大多存在与 种子的表层，在豆科籽实中，植酸主要分布于蛋白质的络和物中。k r z y s z t o f z y l a 等的研究结果表 明以麦类为主的饲料同时添加水聚糖可提高植酸酶的作用效果，单独添加木聚糖不会增加生长鸡 趾骨中灰份的含量，而同时添加木聚糖酶和植酸酶的大麦为主的鸡饲料在增加鸡趾骨灰份方面比 单独添加植酸酶要显著口。 1 ，3 植酸酶的稳定性对其应用的影响及解决方法 酶的稳定性即酶蛋白分子构象稳定性。从工艺角度而言，优化酶制剂稳定性即采用物理、化 学或生物技术，最大限度保证酶活力。影响饲用酶使用效果的因素主要来自三个方面：1 、贮存 中的水分活度；2 、饲喂时动物消化道内的p h 值和消化酶；3 、配合饲料加工工序中的高温高压 【3 0 】。 各种酶均有其催化反应的最适条件，在不同的温度和p h 条件下各种酶所表现出的活性也不 同，酶是一种蛋白质，易被畜禽消化道蛋白消化酶分解而失活，y i 等对植酸酶在仔猪消化道内的 活性变化情况进行了研究，结果发现，在未加植酸酶日粮和仔猪消化道内容物中均未检出植酸酶 活性，而添加了植酸酶的日粮、仔猪胃和小肠前段内容物都检测到了植酸酶的活性，而小肠的后 段食糜中未检出植酸酶活性。这说明胃和小肠是植酸酶的主要作用场所，同时还证明添加高水平 的柠檬酸会降低植酸酶的活性1 3 1 1 。 外源酶的活性受消化道低p h 、胃蛋白酶和胰蛋白酶的影响，不同酶活受各种消化道条件的 影响程度，受酶活种类以及饲料缓冲能力等因素的影响，史凯来等报道，畜禽消化道内环境的p h 值对植酸酶活性的影响较大，在真胃p h 条件下，测定的两种植酸酶活性分别降至原来的7 7 8 2 和4 9 6 1 d 2 1 。 饲料中酶制剂的稳定性一直是困扰生产上应用的难题，在饲料加工过程中，在较高的温度和 水分中进行，会影响酶的空间结构，从而变形失活，实验结果表明，环模的直径及厚度对饲料制 粒后植酸酶的剩余酶活有重要影响，制粒温度越高，酶活损失越大，含脂肪越多，损失越小，含 纤维素越多，损失越大，高温贮藏时包被的植酸酶证明更稳定，它比和散料混合的植酸酶以及颗 粒表面喷涂的植酸酶都稳定【3 3 i 。 解决酶制剂稳定性的方法有：a 、筛选耐高温的微生物菌株，利用基因重组和克隆技术来解 6 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 决这一难题，但是既要耐高温又要在低温具有较高的酶活，这是不容易克服的困难，有些嗜温微 生物中分离到耐高温植酸酶，最适温度在7 0 8 0 ，虽然有较好的耐热性，但它在3 9 4 0 下的酶活性极低，因而在饲料中无使用价值，相反，有些微生物分泌的植酸酶在3 9 4 0 下具 有较高的酶活性，但又不耐制粒时的高温 2 1 。b 、加工后添加液体酶，虽然能减少热处理对酶的直 接影响，但目前也有很多需要克服的困难，对设备的要求高，喷洒的均匀度以及液体状态下酶的 稳定性，在液态酶喷洒过程中有相当一部分植酸酶结合在颗粒料的表面，最终导致许多植酸酶集 中在粉化的小颗粒中，而这些小颗粒粉料通常被回收重新制粒，在这种情况下，喷洒的植酸酶就 被破坏了，再者酶是裸露的，易受水分、金属元素等的影响，对酶活的保持不利j 。c 、酶制剂 进行稳定化处理，目前常采用包被技术，其基本要求是，对酶活不产生重大影响；减少饲料加工 制粒及贮藏过程中的酶损失：最大限度地保证酶到达消化道中相应的位点：不能造成动物体各种 不良的免疫、凝血等反应；满足成本及大批量生产的需求。目前植酸酶市场主要存在两方面的问 题，一是植酸酶价格偏高，二是植酸酶产品的耐热性有待改进。由于我国饲料厂颗粒饲料制粒温 度较高，饲料制粒前加入植酸酶，制粒后植酸酶有不同程度的降低，经过稳定化或包被处理，可 以增加植酸酶的耐热性能p j 。 酶是蛋白质，除了极个别酶可以在9 0 。c 左右的高温保持结构和功能的稳定，大多数不具有耐 受7 0 。c 以上高温的性质。没有经过特殊稳定性处理的酶制剂很难经受住制粒工艺而仍维持较高的 活力，更不能适应膨化工艺，采用适当的包被技术可提高植酸酶的耐热性及稳定性，动物胃液的 口h 是较低的，如果酶未包被，动物进食后酶直接暴露于极酸环境及胃蛋白酶，但适当包被后， 食糜将起到缓冲作用，然后酶才释放出来，但包被太厚，会影响酶从包衣内部的释放，减少了酶 的作用时间，包被太薄，其耐热作用又有限。医药行业的缓释胶囊制造方法也不适用于饲料酶的 包被，饲料酶要求到达胃部后立即释放，而不是缓释，以达到最长的作用时间，维生素的包被方 法也不太适合饲用酶，因为饲用酶用量大，价格较低，包被成本不可能太高p “。 生物技术突飞猛进的发展有力地促进了饲用酶工业的发展，各种饲用酶产品愈来愈多。如何 对众多的饲用酶产品进行评定，选择经济有效的饲用酶产品则显得十分重要。现有饲用酶评定方 法中主要以酶活测定和动物试验评定为主，但二者均有不同程度的局限性，就酶活测定法而言， 首先所选用的反应条件均以各种酶催化反应所需的最适条件为准，而畜禽消化道内环境往往与大 部分酶催化反应所需的最适条件不相吻合，其次，酶活测定法是以特定化学物质为底物，而添加 在畜禽日粮中各种酶活的作用底物主要是日粮的养分和某些抗营养因子，第三，酶活测定不涉及 消化道内源蛋白酶对外源酶活的影响，添加在日粮中的各种外源酶活在畜禽消化道内，易受蛋白 水解酶的破坏而降低活性，动物试验相对比较可靠，能够比较真实地反映出外源酶对饲料消化率 及畜禽生产性能的影响，但该法耗时费力，很难对较多的实验结果在短时间内作出评价，并容易 受外界不可控因素的影响。 随着对单胃动物消化生理的不断深入研究，现代科学技术的发展以及各种动物消化酶的商业 化生产，单胃动物体外消化模拟技术也得到了很大的发展，大量实验表明，通过体外消化模拟技 术所获得饲料养分消化率与体内养分消化率之间存在显著相关，利用体外消化模拟法可预测饲料 体内养分消化率【7 3 8 ”“”i 。 7 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 1 4 植酸酶高产菌株的研究进展 自8 0 年代中期，欧洲就致力全面解决无机磷污染的问题，而直接的动因是即将在原欧共体 成员国实施的环境保护议会指引，核心内容之一是限制养殖业的磷排泄量，8 0 年代后期w a g n i n g e n 大学克隆植酸酶基因出现突破，才有了商业开发的可能。巴斯丈公司和荷兰的g i s t b r a d e s 都认识 了植酸酶的潜力，共同开始集中研究，进行商品化开发，率先利用转基因技术，于1 9 9 0 年首次 成功地用a s p e r g i l l u s n i g e r 工业化规模生产商品植酸酶，从此以后各国火学、研究所及商业机构 都投入了大量的力量进行研究，虽然国外的植酸酶商业化水平很高，但其研究重点是筛选能够分 泌耐低p h 值、耐高温而低温酶活又很高的菌株，e d w a r dj 分离到一株最适p h 为4 ，最适作用温 度为7 0 的霉菌1 4 ：1 。我国这方面的研究始于1 9 9 0 年，在高产菌株方面，山西大学生命科学系 首次分离到一种产植酸酶的青霉菌，此菌产酶效果较好，植酸酶活可达3 1 2u g ( 干曲) ：赵允磷 等分离出一黑曲霉菌株( a s p n i g e r 7 0 ) ，发酵5 - 6 天即可达产酶高峰，固态发酵产酶水平为4 5u g ( 干曲) ，陈红歌以黑曲霉( a s p n i g e r m a 0 2 1 ) 为出发菌，经紫外、亚硝基胍单独处理和复合处 理，获得一株植酸酶高产菌株，其植酸酶酶活力达到2 9 5 0 3 0 1 5u g ，刘德忠以无花果曲霉2 1 2 1 1 5 为出发菌株，用钴”照射诱变，获得两株产植酸酶活力较高的菌株，在最适液态培养条件下产酶 活力均在1 1 0u 惶以上【1 。黄遵锡等选育到一株液态发酵可产1 3 5u m l 的菌株黑曲霉1 4 ，姚斌 等筛选到一株黑曲霉，摇瓶发酵可达1 6 5u m l ，井对其基因进行克隆m 】。 目前都是以天然菌株进行改良获得的改良菌或通过基因一( 程技术获得的基因工程菌，v a n g o r c o m d 等构建了3 组重组a n i g e r 菌株，植酸酶产量分别达到1 1 x1 0 5u m l 、0 5x 1 0 u m l 、 2 8 1 0 5u m l ，我国姚斌等通过基因工程的方法获得了高效表达、生产植酸酶的基因工程酵母1 4 4 1 。 以微生物自然变异为基础的育种机率不高，因为这种变异率太小，一个基因的自然突变率仅 1 0 4 1 0 。1 2 左右，因此为了增大变异频率，利用物理或化学因素处理微生物细胞群体，促使少数 细胞中的遗传物质( 主要是d n a ) 的结构发生改变，从而引起了微生物的遗传性状发生变化， 然后通过目的选择标记设法从群体中筛选出少数性状优良的突变菌株。这种以诱变为基础的育种 就是诱变育种，是迄今为止国内外提高菌种产景、性能的主要手段。诱变方式有物理诱变和化学 诱变两种一j 。 物理因素中目前最广泛使用方便而且十分有效的是紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫外 线。对于一般实验室及中小型工厂都适用，也很安全。其他的几种射线都是电离性质的，有一定 的穿透力，一般都在专业设备中使用，否则有一定的危险性。实验中黑曲霉诱变的物理诱变即采 用紫外线诱变的方法米选育高产菌株。 紫外线的生物学效应是由于它能够引起d n a 分子的变化，因为d n a 分子具有强烈吸收紫 外线的能力，而且嘧啶比嘌呤敏感得多，紫外线引起d n a 构型的变化是多种多样的，如d n a 的断裂、d n a 分子双链的胶联，胞嘧啶和尿嘧啶的水合作用及嘧啶二聚体的形成等等【1 ”。其中 胸腺嘧啶二聚体形成是紫外线改变d n a 生物学活性的主要途径【l ”。 紫外线诱变的突变中g c - t a 转换是较普遍的，但也有约1 0 是码组移动的。由于胸腺嘧 啶二聚体的胶联，当d n a 复制时便会阻碍d n a 双链的分开与复制，同一链上相邻的胸腺嘧啶 8 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 之间二聚体的形成会阻碍碱基的正常配对m j 。在正常的情况下，胸腺嘧啶与腺嘌呤配对，而如果 相邻的胸腺嘧啶结合起来，就可能改变这种情况，足以破坏腺嘌呤的正常参加作用，复制便会在 这一点上突然停止或错误的进行，这样就会在形成的链上出现一个改变的碱基顺序，在随后的复 制过程中，已改变的d n a 仍然会进行自身的复制，产生出一个两条链上的碱基顺序都是错误的 分子，因而引起了突变”。 本实验采用的化学诱变剂是溴化乙锭，此物质是一种带有稠环的染料，其作用与放线素d 、 哑啶橙都一样，都是其中的杂环平面可以嵌入到d n a 的两个碱基之间，使d n a 分子发生扭曲 变形，并可以产生局部的解链区，使d n a 分子增长，嵌入的杂环可以起到附加碱基的作用。复 制时，子链容易在该位点插入额外的碱基，引起插入突变或称移位突变。 1 5 本课题研究的内容和意义 产植酸酶菌株的筛选及酶活力的提高是一项重要的基础工作，本课题以黑曲霉为出发菌株进 行物理诱变和化学诱变，提高其产酶能力，对获得高产菌株进行最佳发酵培养基配比及发酵条件 的研究，在此基础上进行发酵罐试验，研究黑曲霉的发酵动力学，建立发酵动力学模型预测发酵 过程。对黑曲霉的发酵条件，产酶动力学等有一个全面的认识。在最佳发酵条件f ，进行黑曲霉 液态发酵，对酶液进行纯化，研究纯化酶的性质，为进一步研究提供依据。 酶的稳定化是我国酶制剂行业面临的一个重要课题，这对饲料酶如植酸酶等尤为重要，本课 题对植酸酶进行颗粒稳定化研究，以便得到廉价高效的稳定化方法，对稳定化植酸酶颗粒进行耐 热试验，采用和养殖实验具有高度相关性的体外消化试验对包被及未包被的植酸酶进行体外消化 实验，进而较快地判断稳定化对消化性能的影响程度。 9 中国农业大学硕士学位论文 第二章黑曲霉的诱变选育 2 1 实验目的 第二章黑曲霉的诱变选育 自然界中可产植酸酶微生物较多，例如霉菌、酵母等，但天然菌株产植酸酶能力都较低，并 且微生物自然变异为基础的育种机率很低，故只有通过物理和化学的方法来提高天然菌株的产酶 能力，获得高产菌株。为了增大变异频率，我们采用紫外线和溴化乙锭作为诱变手段，紫外线的 生物学效应是由于它能够引起d n a 分子的变化，因为d n a