（植物学专业论文）麻疯树苯丙氨酸解氨酶（jatropha+curcas+lphenylalanine+ammonialyase）基因的克隆及功能研究.pdf

四川大学硕士学位论文 声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川大学或其他教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师指导下取得的，论文成 果归四川大学所有，特此声明。 导师签字： 矜t 爹 牲辩：芦铪 四川大学硕士学位论文 麻疯树苯丙氨酸解氨酶( j a t r o p h ac u r c a sl p h e n y l a l a n i n ea m m o n i a l y a s e ) 基因的克隆及功能研究 植物学专业 研究生：张淑文指导老师：徐莺副教授 苯丙氨酸解氨酶( p h e n y l a l a n i n ea m m o n i a - l y a s e ，p a l ) 是苯丙烷类代谢途径 的关键酶，催化苯丙氨酸转化为肉桂酸，促进黄酮、香豆素等次生代谢物的生 成。麻疯树的这些次生代谢物具有多种生物学活性，具有广阔的运用前景。从 麻疯树( j a t r o p h ac u r c a sl ) 叶片中应用r t p c r 和r a c e 技术获得麻疯树p a l 基因 e d n a 全序列，命名为j c , o a l ，登陆g e n e b a n k 的序列号为d q 8 8 3 8 0 5 。序列分析表 明：该c d n a 全长2 3 3 6 b p ，从第4 6b p 开始至f j 2 1 8 7b p 为开放阅读框，编码一个含7 1 3 个氨基酸的蛋白质。多序列比对分析显示- ，舭的氨基酸序列与多种植物苯丙氨 酸解氨酶的氨基酸序列有一定的同源性，其中与同科植物木薯的同源性最高， 达至j j 9 6 。通过生物信息学分析，发现如觑推测蛋白质的分子量约为7 7 k d a ， 等电点为6 5 9 ，可能组成四个单体的聚合物。其单体的三维结构与欧芹的p a l 非 常相似。获得的j c p a l 部分基因组序列显示，麻疯树苯丙氨酸解氨酶d n a 序列包 含一个内含子，位于j e p a l 翻译起始密码予下游4 3 5 b p 处，这与其他植物苯丙氨 酸解氨酶基因的结构类似。通过染色体步移技术，克隆出长度为1 3 3 4 b p 的j e p a l 基因起始密码子上游序列。采用在线预测和p l a c e 元件分析，结果显示其不仅具 备典型的转录起始位点、c a a tb o x 、t a t ab o x 、a 富含区，而且包含多种胁迫诱 导元件，特别是在序列中发现一些苯丙氨酸解氨酶特有的元件。为了鉴定乃觑 四川大学硕七学位论文 基因的启动子元件，使用真核表达载体p b l l 2 1 ，分别构建了四个植物表达载体， 为进一步研究j c p a l 启动子的调控和元件分析奠定基础。 将编码麻疯树苯丙氨酸解氮酶( 如明三) 的片段定向克隆至u p e t - 2 8 a 质粒， 进行原核表达。经i p t g 诱导后，s d s p a g e 检测发现麻疯树苯丙氨酸解氨酶在 p e t - 2 8 质粒中能正常表达，表达产物的分子量为8 0k d a 左右，与预测结果相符。 考虑到低温促进可溶性蛋白的表达，采用2 0 低温诱导培养2 0 h ，检测表达产物 表明该片段表达的蛋白质存在可溶性蛋白形式，其表达量占菌体总蛋白的5 0 以上。对可溶性蛋白进行活性分析，获到具有p a l 活性的粗酶裂解液，粗酶的比 活力为0 1 0 2 p m o y m i n g p r o ，低于红酵母p a l 和欧芹重组p a l 表达的比活力。表 明麻疯树重组p a l 活力不是很高，可能是一些实验条件没有得到优化。结果表 明克隆重组的麻疯树p a l 基因通过表达质粒p e t 2 8 a 在e c o l i 中能表达有催化 功能的活力酶。 麻疯树幼苗在不同光照和温度条件下，使用乙烯利处理0 h 、6 h 、1 2 h 、2 4 h 和4 8 h 后，分别取处理不同时期的麻疯树叶片进行表达分析和p a l 活性分析。结 果说明：1 ) 乙烯利对p a l 活性具有诱导作用，其诱导不依赖于光照条件，但光 照对乙烯利的诱导又具有一定的促进作用。乙烯利作用可以减弱高温对p a l 表达 的影响。2 ) 高温能够延迟或者抑制p a l 的表达。3 ) 高温对p a l 活性的这种抑制 作用依赖于外界处理条件，即：没有光照和乙烯利处理时，p a l 活性就没有变化。 关键词：麻疯树苯丙氨酸解氮酶基因克隆原核表达乙烯利光照高温 2 四川大学硕士学位论文 m o l e c u l a rc l o n e ，c h a r a c t e r i z a t i o na n d e x p r e s s i o n o f j a t r o p h a c z l f c a sl p h e n y l a l a n i n ea m m o n i a - l y a s e g e n e p h m c a n d i d a t e ：z h a n g s h u w e ns u p e r v i s o r ：p r o f x u y i n g p h e n y l a l a n i n ea m m o n i a - l y a s e ( p a l ) p l a yac r u c i a lr o l ei np h e n y l p r o p a n o i d m e t a b o l i s mp a t h w a yp r o v i d i n gp r e c u r s o r so fv a r i o u sp h e n y l p r o p a n o i dc o m p o u n d s i n c l u d i n ga n t h o c y a n i n h e r e ，w er e p o r tt h ec l o n i n ga n df u n c t i o n a lc h a r a c t e r i z a t i o no f a p h e n y l a l a n i n ea m m o n i a - l y a s e ( p a l ) g e n e ，d e s i g n a t e dj c p a l ( g e n b a n ka c c e s s i o n n o d q s s 3 s o s ) ，f r o mj a t r o p h ac “r c a $ t h ef u l l l e n g t hj c p a le d n ac o n t a i n sa n o p e nr e a d i n gf r a m eo f 2 1 4 2 b pe n c o d i n g7 1 3a m i n oa c i d t h ep u t a t i v ep r o t e i ns h a r e s h i g hi d e n t i t yt oo t h e rh o m o l o g u e s ，e s p e c i a l l ym a n i h o te s c u l e n t a , s a m ec a t e g o r y p l a n t s p u t a t i v e & p a lp r o t e i ni sa b o u t7 8 k di nm o l e c u l a rw e i g h ta n dw i t hp io f a b o u t6 5 9 ，c o m p o s i n gat e t r a m e r i cp r o t e i nw i t hf o u rs a m es u b u n i t s p a r t i a lg e n o m i e d n ao fj c p a lw a sc l o n e da n ds h o w e dt h a tt r a n s c r i p ti sd i v i d e di n t ot w oe x o n sb y o n ei n t r o n t h e1 3 3 4 b p5 u p s t r e a mr e g i o no ft h e g e n ee n c o d i n gp h e n y l a l a n i n e a m m o n i a l y a s ew a sa l s oi s o l a t e df r o md a t r a p h ac u r c a $ l b yt h ed n aw a l k i n g t e c h n o l o g y s e q u e n c ea n a l y s i sr e s u l t sr e v e a l e dt h a tt h ej c p a lp r o m o t e rs e q u e n c e c o n t a i n sn o to n l yc a a ta n dt a t ab a s i cm o d i f st h a ta r ec o n s e r v e di nt h ee u k a r y o t i c g e n ep r o m o t e r , b u ta l s ov a r i o u ss t r e s sr e l a t e dc s a c t i n ge l e m e n t s e s p e e i a l l y ，m a n y c s e l e m e n t so b s e r v e di no t h e rp h e n y l a l a n i n ea m m o n i a - l y a s ep r o m o t e r sa r ea l s o f o u n di nt h ej c p a lp r o m o t e r f o rf u r t h e rs t u d y i n go nf u n c t i o no fj c p a lp r o m o t e r , 3 四川大学硕士学位论文 f o u rj c p a l pf r a g m e n t sm i g h tb eu s e dt oi n v e s t i g a t et h e i rc o r r e s p o n d i n ge x p r e s s i o n p a t t e r n t h ec o r r e s p o n d i n gf u s i o np r o t e i n sw e r ee x p r e s s e di ne s c h e r i c h i ac o l ia n d e x h i b i t e dp a la c t i v i t yw i t h p h e n y l a l a n i n ea ss u b s t r a t e t h ef r a g m e n te n c o d i n g j c p a lp r o t e i nw a si n s e r t e di n t oa p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp e t - 2 8 aa n dw a s o v e r e x p r e s s e di ne c o l ib l 2 1 t h ep o s i t i v ec l o n e sw e r ei d e n t i f i e db yc o l o n yp c r a n dr e s t r i c t i o nd i g e s t i o n a f t e ri n d u c e db yi p t g , s d s p a g e a n a l y s i ss h o w e dt h a t t h ej c p a l p r o t e i no f8 0 k dw a se x p r e s s e d i no r d e rt oi n c r e a s et h ec y t o s o l i c e x p r e s s i o n , w el o w e r e dt h ei n c u b a t i o nt e m p e r a t u r et o2 0 f o r2 0 h t h ef u s i o n p r o t e i n sw e r ef o u n dp a r t l yi na ns o l u b l ef o r m a t i o na n di t sc o n t e n tw a sa b o u t5 0 a m o n g t o t a lc e l lp r o t e i nb yg e n eg e n i u sb i oi m a g i n gs y s t e m t h es o l u b l ef u s i o n p r o t e i n se x h i b i t e dt h ep a la c t i v i t ya so t h e rp l a n t sp a lp u r i f i e df r o mn a t i v ep l a n t t i s s u e ，b u tas l i g h tl o w t h ej c p a le x p r e s s i o np a t t e r na n d c o r r e s p o n d i n ga c t i v i t yc h a n g i n gw e r e i n v e s t i g a t e da f t e ri n o c u l a t i o nw i t he t h e p h o n ，ae t h y l e n e - r e l e a s i n gc o m p o u n d ，a n d i n t e r a c t i o n sw i t hl i g h ta n de x p o s u r et ot e m p e r a t u r e t h er e s u l t ss h o w e dt h a t e t h e p h o np l a yr o l e si nt h ei n c r e a s eo f p a la c i t i v i t y ，b u tt h ec h a n g ei sn o td e p e n d a n t i nl i g h t ；h i g ht e m p e r a t u r er e d u c e st h er i s ei ne t h e p h o n i n d u c e dp a l e n z y m ea c t i v i t y b yr e d u c i n gt h et r a n s l a t i o no f e t h e p h o n - i n d u c e dp a lm r n a ，o rb yi n c r e a s i n gt h e t u r n o v e ro f t h ei n d u c e dp a l p r o t e i n ；p a lm r n a sa c c u m u l a t ea n di n c r e a s eo f p a l a c i t i v i t yi nl e a v e so f j a t r o p h ac u r c a s ( l ) u p o ne x p o s u r et oh i g ht e m p e r a t u r ei na e t h e p h o n a n dl i g h t d e p e n d e n tm a n n e r k e y w o r d s ：d a 护o p h ac z w lp h e n y l a l a n i n ea m m o n i a - l y a s e g e n ec l o n ee x p r e s s i o ni n ec o l i e t h e p h o n l i g h t h i g h - t e m p e r a t u r e 4 四川大学硕士学位论文 第一章麻疯树苯丙氨酸解氨酶的基因克隆及序列分析 摘要 苯丙氨酸解氨酶( p h e n y l a l a n i n ea m m o m a 1 y a s e ，p a l ) 是苯丙烷类代谢途径 的关键酶，催化苯丙氨酸转化为肉桂酸，促进黄酮、香豆素等次生代谢物的生 成。麻疯树的根、茎、叶、种子中富含这类次生代谢物，且具有多种生物学活 性，应用前景广阔。本章采用同源克隆的方法对麻疯树苯丙氨酸解氨酶进行基 因克隆，并对获得的序列进行生物信息学分析。通过分析g e n b a n k 中已经公布 的苯丙氨酸解氨酶基因的序列比较，根据保守区域设计了简并引物，先以d n a 为模板，克隆一个d n a 片段。再分析上述多序列比对结果，又设计了一条引物， 再以c d n a 为模板，又获得一段靠近5 端的基因序列。最后通过3 r a c e 和5 r a c e 扩增技术，获得了麻疯树叶片表达p a l 基因( j c p a l ) 的c d n a 全长序列。 研究发现该e d n a 全长2 3 3 6 b p ，开放阅读框长2 1 4 2 b p ，编码7 1 3 个氨基酸， 在起始密码子上游有一个由4 5 个碱基组成的5 非编码区，在终止密码子下游 有一个由1 5 8 个碱基组成的3 非编码区，其后面还有一段真核生物m r n a 所特 有的p o l y ( a ) 序列。j c p a l 基因组序列分析显示，该基因全长2 6 9 7 b p ，包含一 个内含予，位于翻译起始密码子a t g 下游4 3 5 b p 处。内含子的数目和位置均 与其他植物苯丙氨酸解氨酶的类似，但是长度存在一定的差异。使用d n a d a n 软件对该蛋白进行分析，显示预测的分子量为7 7 k d a 左右，预测的等电点为 6 5 9 。基因比对分析显示，j c p a l 的氨基酸序列与多种植物苯丙氨酸解氮酶的氨 基酸序列有一定的同源性，其中与同科植物木薯的同源性最高，达到9 6 。二 级和三级结构分析发现它可能是由四个单体组成，其单体的三维结构与欧芹的 p a l 非常相似。因此，该基因的克隆为深入研究p a l 结构基因、剪切机制、表 达和调控机制以及其结构与功能的关系奠定了重要的基础。 关键词：麻疯树苯丙氨酸解氨酶基因克隆r a c e同源克隆信息学分 析 前言 5 四川大学硕士学位论文 苯丙氨酸解氨酶( p h e n y l a l a n i n ea m m o n i a l y a s e ，p a l ) 是连接初级代谢和苯 丙烷类代谢、催化苯丙烷类代谢第一步反应的酶，是苯丙烷类代谢的关键酶和 限速酶，也是苯丙烷类代谢途径中研究最多的酶。该酶能够催化苯丙氮酸脱氨 生成肉桂酸和氨，促进黄酮、香豆素等f j 体物质的合成。苯丙烷类代谢的途径 如图l l 所示( 参, 照, r i c h a r da d i x o n 和n a n c yl p a l v a 的文章“3 ) 。 囡 苯丙氨酸一一肉桂酸一一苯甲酸( 安息香酸) 一一水杨酸 c a 4 h l 香豆酸一一香豆素 4 c ll 咖啡酸一一绿原酸 苯丙烷酸的c o a 酯一一木质素 c h s + c h r c h sl 4 ，2 ，4 - 三羟氧基查耳酮四羟氧基查尔酮 c h iic h i4 二氧羟基黄酮三氧羟基黄酮一一黄酮 i f sii f s f 3 0 h 大豆苷原染料木黄酮二羟基黄醇一一山奈酚 i f o h dhfrl i f rl 吉维酮黄烷3 。4 二醇 异黄酮 a si 花色素 u f g ri 花色素苷 图1 1 ：苯丙烷类代谢的途径 f i g l 一1 ：b i o s y n t h e t i cr e l a t i o n s h i p sa m o n gp h e n y l p r o p a n o i d s ( 缩写词分别代表：c a 4 h 肉桂酸一4 一羟基酶；c h1 查耳酮异构酶：c h r ，查耳酮还原酶： c h s ，查耳酮合成酶：4 c l 4 - 香豆酸：辅酶a 连接酶：c o m t 咖啡酸一o - 转甲基酶：d h f r ，二 羟基黄酮还原酶：f 3 0 h ，黄酮烷一3 一羟化酶：lf r 异黄酮还原酶：if s 异黄酮合成酶：p a l 苯丙氯酸解氨酶：u f g t u d p 一葡萄糖黄酮醇一3 o 葡萄糖转移酶。) 1 9 6 1 年k o u k o l 和c o n n “首次从植物中发现了这种酶，此后关于这种酶的 研究迅速展开，随着基因克隆技术不断完善，已成功地从水稻“1 、马铃薯“1 、松 树和杨树“1 等多种植物中得到p a l 。除此之外，在酵母、真菌。、链霉菌。1 中 6 四川大学硕士学位论文 也发现p a l 基因。在细胞水平上，植物的p a l 主要分布在表皮下的细胞和维管组 织细胞中；在亚细胞水平上，p a l 定位于细胞质“”和一些膜细胞器如叶绿体、白 色体、线粒体、过氧化酶体、乙醛酸体“。j i n n a k u s h i m 等“”也进行了p a l 的 亚细胞定位，发现细胞间质部分p a l 活性最高，电子显微术显示，p a l 分散在细 胞的基质中，定位在高尔基体囊泡和次生壁加厚层中。 麻疯树( j a t r o p h a c h t c a sl ) 为大戟科麻疯树属植物，在我国主要分布于南 部热带和亚热带地区，它的用途广泛。在民间，很早就被用来药用，治疗多种 疾病，近年来发现它在工业用油，化妆品生产，生物病虫害防治等方面也具有 潜在的应用价值。研究发现麻疯树中富含黄酮类提取物，其中一些如芹素 ( a p i g e n i n ) 、杜荆素( v i t e x i n ) 等被报道具有抗肿瘤”“、抗炎“”和抗动脉硬 化”1 的活性，有广泛的开发前景。因此，本文通过同源克隆的方法，结合3 r a c e 和5 r a c e 技术，从麻疯树幼叶中克隆了编码苯丙氨酸解氨酶的e d n a 全序列和基 因组d n a ，并在此基础上利用生物信息学的手段对该基因的结构与功能进行研 究，为进一步探讨p a l 在麻疯树黄酮类等次生代谢物的作用奠定了基础。 1 材料和方法 1 1 材料与试剂 1 1 ，1 植物材料：从四川攀枝花地区获得麻疯树( j a t r o p h ac u r c a s l ) 的种子，选 取优质的种子播种于花瓮中，2 5 4 c - 3 0 ，2 4 h 光照条件下培养一至0 两个月，然 后采集幼嫩叶片提取r n a 和d n a ，用于麻疯树苯丙氨酸解氨酶基因的克隆。 1 1 2 菌株：大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) j m l 0 9 和t o p l o 由四川大学生命科学 院植物生殖工程实验室提供。 1 1 3 质粒载体：p m d l 8 一t 购自t a k a r a 宝生物工程( 大连) 有限公司。 1 1 ，4 试剂盒、酶：柱式胶回收试剂盒购于赛百胜生物公司；t a k a r ae xt a qd n a 聚合酶、a m v 反转录酶、r n a a s ei n h i b i t o r 、核苷酸末端转移酶( t d t ) 购自 t a k a r a 宝生物工程( 大连) 有限公司 7 四川大学硕士学位论文 1 1 5 培养基 l b 液体培养基：胰蛋白胨1 0 9 l ，酵母粉5 9 l ，n a c l5 9 l ，用5 nn a o h 调 p h 至7 0 ，高压灭菌。 l b 固体培养基：在液体培养基的基础上加入1 0 9 l 琼脂粉。 1 1 6 缓冲液 t e 缓冲液( p h8 0 ) ：t r i s h c l 1 0 m m ，e d t al m m 1 t a e 缓冲液( p h8 3 ) ：t r i s h c l0 0 4 m ，e d t a0 0 0 1 m 1 1 7 药品 t r y p t o n e 和y e a s te x t r a c t 为o x i o i d 产品；琼脂糖、琼脂粉、t r i s 、s d s 为a m e r s h a m 产品：氨卞青霉素和d n a 分子量标准d l 一2 0 0 0 购自t a k a r a 公司。 其它化学药品为进口或国产分析纯试剂。 1 。2 方法 1 21 麻疯树总r n a 的提取 使用c o n c e r t t mp l a n tr n ar e a g e n t ( i n v i t r o g e n ) ，参照r n a 抽提纯化操作手册 进行。 1 2 2 麻疯树总d n a 的提取 参照王关林等1 1 7 的方法，采用c t a b 法提取总d n a 。 1 2 3 基因片段的克隆 1 2 3 1 简并引物的设计 从g e n b a n k 上搜索拟南芥爿r a b i d o p s i st h a l i a n a 、木薯m a n i h o te s c u l e n t a 、杨 树p o p u l u st r i c h o c a r p a 茶树a m e l l i as i n e n s i s ，欧芹p e t r o s e l i n l 2 mc r i s p l 2 m 、甜瓜 c u c u m i s m e l o 、莴苣l a c t u c as a t i v a 、烟草n i c o t i a n a t a b a c u m 、水稻o r y z a s a t i v a 、 甘薯i p o m o e ab a t a t a s1 0 种植物中p a l 基因所编码的核酸序列进行比对，采用 8 四川大学硕士学位论文 p r i m e rp r e m i e r5 0 分别设计简并引物： 上游简并引物为： 5 一c a yg g wg g w 从yt t yc a rg g - 3 下游简并引物为： 5 一a c rt c yt g rt t rt g yt o yt c 一3 其中y = c ，t ；r = a ，g ：w = t ，a 。 1 2 3 2 基因片断的克隆 ap c r 反应 使用麻疯树叶片的基因组d n a 作为模板，结合设计的简并引物，按照下列 配制p e r 反应液，进行p c r 。 1 p c r 反应的配制( 5 0 9 l 反应体系) ：1 0 p c rb u f f e r5 u l ，d n t p ( 2 5 m m ) 4 u l ， m g c l 2 ( 2 5 i 邶6 u ，d n a 模板2 u l ，引物1 ( f p l ) l u l ，引物2 ( r p l ) l u l ，e x t a q 聚合酶0 2 5 ，加灭菌水至5 0 u l 。 2 将反应液用枪头混匀后，按下列反应条件进行p c r 反应。 9 4 5 m i n1 个循环；9 4 3 0 s e c ，4 8 3 0 s e c ，7 2 2 m ir l3 0 个循环；7 2 7 m i n 1 个循环；4 3 反应结束后，取出5 - 1 0 p lp c r 产物进行1 琼脂糖凝胶电泳，其余一2 0 保存。 b 切胶回收目的基因片段 获得的p c r 产物经1 琼脂糖凝胶电泳后，用赛百胜的柱式胶回收试剂盒进 行纯化。方法参照胶回收试剂盒说明书。 c 将回收的目的基因片段克隆到p m d 一1 8v e c t o r 上 连接反应体系为( 1 0 u 1 ) ：s o l m i o ni5 出，d n a4 5 山，p m d 一1 8v e c t o r 0 5u1 。1 6 ，连接反应3 0 分钟以上或者过夜。 1 2 3 3 感受态细胞的制备 转化之前先制备感受态细胞。感受态细胞制备方法参照文献“”，具体操作 9 四川大学硕士学位论文 步骤为：从培养菌种的l b 平板上挑一个单菌落，接种到l o o m ll b 培养基的l l 烧瓶中。于3 7 剧烈震摇培养约3 小时( 旋转摇床，3 0 0 转分) ，至o d 。o 3 - - 0 4 。在无菌条件下将细菌转移至冰预冷的5 0 m i 聚丙烯管中，冰上放置1 0 m i n 。 4 下4 0 0 0 转分钟离心1 0 分钟，以回收细胞。倒尽培养液，以l o m l 用冰预冷 的0 1m o l lc a c l ：重悬沉淀，放置于冰浴上。于4 c 下4 0 0 0 转分钟离心1 0 分钟，收集细胞。倒尽培养液，以2m 1 用冰预冷的0 1m o l lc a c l ：重悬细胞 沉淀。立即进行转化实验。 1 2 3 4 转化 转化参照文献“”的方法。将1 0p 1 连接片段与2 0 0 “l 感受态细胞混合；放 置于冰上3 0 m i n ；4 2 。c 水浴放置9 0s e c ：放置冰上i - - 2m i n ；加入8 0 0 “il b 培养液，培养1 小时：取i o o n i 涂l b 平板( 含a m p ) ：3 7 。c 培养1 2 小时。 1 2 3 5 转化子的鉴定及测序 取白色菌落用菌落p c r 法和转化质粒的酶切鉴定转化子。菌落p c r 法和酶 切法确认含所需的插入片段后，将液体培养物i m l 送上海i n v i t r o g e n 公司测序。 序列在i n t e r n e t 上n c b i ( 美国国家生物技术信息中心) 的b l a s t 进行分析。 同时采用d n a m a n 等软件进行序列分析。 1 2 4c d n a 全长的克隆 1 2 4 1c d n a 片段的克隆 a 引物的设计 根据己知的麻疯树苯丙氨酸解氨酶序列，由此设计下游引物： 引物f 5 r p ) ：5 一t c ag 从c a gt a tg a ag c ca t tg c 3 反转录弓l 物；5 - t c ag a ac a gt a tg a ac - c ca ? tg c - 3 7 由于已克隆的基因片段距离基因的5 端比较远，所以直接使用r a c e 的方 法克隆57 端全长比较困难。因此，再分析上述多序列比对结果，又设计了一条 引物用于p c r 的扩增，获得一段靠近5 端的序列。 引物( 5 s p ) ：57 一g c a a t gc t gg t ca g aa t ca a ca c - 3 1 0 四j i i 大学硕士学位论文 b r n a 的反转录 r n a 的反转录参照t a k a r a 反转录酶x l 操作方法进行。使用前先将反转录 中待用的每种成分混匀并快速离心，再依次加入下列成分： 总r n a8p g ，5 x b u f f e r4 肛l ，d n t p m i x t u r e ( 1 0 m m ) 2 p l ，r n a s ei n h i b i t o rl 肛l ， 反转录引物( 2 0 岬 i p l ，a m vr e v e r s et r a n s c r i p t a s ex l1 p 1 ，加d e p c 处理 的d d h 2 0 至2 0 u l 。 轻轻搅拌，移入p c r 仪器中，按照下列程序进行：4 2 下保温3 0 m i n ，9 5 5 m i n ，最后5 5 m i n ，所得的反应液用于p c r 反应。 c c d n a 片段的获得 ( i ) 1 将0 2 毫升薄壁p c r 管，放于冰上加入以下成分：灭菌去离子水 2 8 5 u l ，l o p c rb u f f e r5 ，o u l ，2 5 r a mm g c l26 o u l ，l o n nd n t p s1 o u l ，引 物( 1 0 u m ) 2 o u l ，引物l ( 1 0 u m ) 2 o u l ，c d n a5 o u l ；加0 5 u lt a qp o l y m e r a s e ( 5 u u 1 ) ，混匀将e p 管从冰上直接取出放到p c r 仪上。 2 3 0 - 3 5 循环，小于i k b 的c d n a 程序： 9 4 1 - 2 m i n ，一个循环；9 4 0 5 - 1 m i n ，5 0 0 5 - l m i n ，7 2 1 - 2 m i n 3 0 一3 5 个循环；7 2 5 - 7 m i n 3 凝胶电泳检测 d p c r 扩增片段的回收、连接，然后，转化、鉴定和测序。 参照基因片段克隆中提到的方法。 1 2 4 23 一r a c ep c r 反应 3 - - r a c e 的实验流程如图l 一2 所示，实验步骤如下： a 引物的设计 根据麻疯树已获得的序列设计出3 r a c ep c r 反应所需的引物，如下： 正向引物( 3 r p ) ：5 一t g gc g tt t ca a tg g at a at g c 一3 反向引物( r p ) ：5 一g t ca a cg a t a c gc t ac g ta a cg - 3 反转录引物( o l i g o d ( t ) 。) ： 5 一g c tg t ca a cg a ta c gc t ac g ta a cg g ca t g 四川大学硕士学位论文 a c ag t g 一0 1 i g o d ( t ) ；一一3 7 br n a 的反转录及p c r 反应 按照上述方法，使用合成的反转录引物，进行反转录，得到用于克隆3 的 末端的e d n a 。 按照p c r 反应的方法进行反应液配比，再加入引物3 r p 和引物r p ，进行p c r 反应。凝胶电泳检测，反应完成后，用l 琼脂糖凝胶电泳；p c r 扩增片段的回 收、连接，然后，转化、鉴定和测序( 参照基因片段克隆中提到的方法) 。 l2 4 35 一r a c ep c r 反应 a 引物的设计 根据麻疯树已获得的序列设计出5 r a c ep c r “( 图2 2 ) 反应所需的 引物，如下： 正向弓i 物( r p ) ：5 一g t ca a cg a ta c gc t ac g ta a cg 一3 正向引物( r n p ) ：5 一t a cg t a a c gg c at g a c a gt g 一3 反向引物( 5 r s p ) ：5 一c c tg a gt a ac c tt g aa g aa g ag t g 一3 反向引物( 5 r s n p ) ：5 一a g tg t tg a tt c tg a cc a gc a tt g 一3 反转录引物( 5 f p ) ：5 一c a tg g ag t ga t at t gt g gt t ga g 一3 ”s e = = = 錾苎= 些“ “ 蕊” 群徽 l 堆i 目、? _ w 一 1 面茹i 丙一n 7 , , m m m i p + c ao 是篇弘( n t m a s a z l a , + 1 s w 1 , , t , ： 。垫望塑竺二，“篓! 兰一。c a m m m _ t m c o i ( e ：= = = = = = = = = = = 刍 t 十t j ”i 啦 1 - 23 r a g e ( i a k a r a ) 流程图 f i g 1 2f l o w c h a r to f 3 - r a c e ( t a k a g a ) 1 2 四川大学硕士学位论文 m r n a5 一一。1 3 m 从 i在反转录酶作用下反转录 第一链e d n a = g s p r t 利用t d t 对e d n a 加尾 加尾的e d n aa a 妒t - g s p r t o l i g o d ，口姒。 土兰二竺竺 = 5 r s p 8 p r n p 耳! 乏： i 巢式扩增 口， ! 巢式扩增 卜_ 5 r s n p 图1 35 - r a c e 的技术流程示意图 f i g 1 - - 3s u m m a r yo f 5 - r a c e p r o c e d u r e b 总r n a 反转录成第一链c d n a 1 参照c d n a 片段克隆中的r n a 反转录方法 2 加入l u l r n a s em i x ，轻轻振荡，混匀，于3 7 孵育3 0 m i n ； 3 短暂离心收集反应物置于冰上，可储存在一2 0 。 c r n a 模板的去除及第一链e d n a 的纯化 用酚一氯仿抽提的方法，后用7 0 7 , 醇洗涤冷冻离心干燥，用灭菌的超纯水 配制成3 0u l ，或用柱式胶回收试剂盒纯化，用超纯水3 0u l 洗脱。 d t d tt a i l i n go fe d n a ( e d n a 的同聚合物加尾) t d tt a i l i n g 反应中使用的e d n a 量依情况而定。掘r n a 的量和目的m r n a 的丰度而定。 1 加入以下成分并轻轻混匀：d e p c t r e a t e dw a t e r6 5 u l ，5 t a i l i n g b u f f e r5 o u l 2 m m d a t p2 5 u l ，p u r i f i e de d n a1 0 o u l ，f i n a lv o l u m e2 4 o u l 2 在9 4 c 温育2 - 3 m i n ，冰上冷却l m i n ，经短暂离心后收集样品，放于冰上 3 加l u lt d t 轻轻混匀3 7 温育1 0 m i n 4 6 5 cl o m i n 热失活t d t 经短暂离心收集样品并放于冰上。 e 对加尾e d n a 进行p c r 反应并检测 1 将o 2 或0 5 毫升薄壁p c r 管，放于冰上加入以下成分：灭菌去离子水 1 3 四川大学硕士学位论文 3 1 5 u l ，l o p c rb u f f e r5 ，o u l ，2 5 m mm g c l ：3 o u l ，1 0 m m d n t p s1 o u l ，n e s t e d 5 r s p ( 1 0 u m ) 2 o u l ，p r i m e rr p ( 1 0 u m ) 2 o u l ，d a - t a i l e de d n a5 o u l 2 加0 5 u lt a qp o l y m e r a s e ( 5 u u 1 ) ，混匀，将e p 管从冰上直接取出放到p c r 仪上 3 3 0 - 3 5 循环，小于i k b 的c d n a 程序： 9 4 l 一2 m i n1 个循环；9 4 0 5 - 1 m i n ，5 0 0 5 - 1 m i n ，7 2 卜2 m i n 3 0 一3 5 个循环：7 2 5 - 7 m i n1 个循环 4 凝胶电泳检测 f 对p c r 产物进行巢式p e r 反应 1 取5 u lp c r 产物稀释到4 9 5 u lt eb u f f e r 中 2 ，在一置于冰上的0 2 或0 5 薄壁管中加入：灭菌去离子水3 3 5 u l ，1 0 p c r b u f f e r5 o u l ，2 5 州m g c l23 o u l ，l o m md n t p s1 o u l ，n e s t e d5 r s n p ( 1 0 u m ) lo u l ，p r i m e rr n p ( 1 0 u m ) 1 o u l ，初始p c r 产物稀释物5 o u l ，加0 5 u lt a q 酶，混匀，直接从冰上取出置于p c r 仪上3 0 一3 5 循环p c r 。 3 凝胶电泳检测，反应完成后，用l 琼脂糖凝胶电泳检测。 g p c r 扩增片段的回收、连接：然后，转化、鉴定和测序 参照基因片段克隆中提到的方法 1 2 5 麻疯树苯丙氮酸解氨酶基因组序列的获得 根据已经克隆的5 r a c e 的始端，设计引物a g n i ：5 一a t gg c a a c aa t ta t e g g aa a tg g tc a - 3 ，再根据已经克隆的3 r a c e 的末端，设计引物a g n 2 ：5 一a c aa a tt g ga a ga g ga g ea c ca t tc 一3 。以d n a 为模板，使用这两个引物， 在5 0 u l 的体系下：l o o n g - - 3 5 0 n g 的d n a ，2 5m md n t pm i x ( t a k a r a ) ，l o m m 各个 引物，o 5ul a7 a qd n a 聚合酶( t a k a r a