（生物物理学专业论文）耐辐射球菌dna修复蛋白的发现与鉴定.pdf

致谢 本论文是在导师华跃进教授的悉心指导利亲切关怀一f 完成的。恩师渊| 尊的知识、敏锐的 洞察力、严谨的治学态度、宽宏大量的品格以及献身科学的忘我精神，犹如一笔巨人的财富 使我终身受益。我从对生化与分子生物学一无所知到熟练掌握各种实验技术；从论文的杜j 思 到完成：从生活、思想上的教导到人生观、世界观的树立，每一份收获无不凝聚着恩师的点 点心血。值此论文完成之际，谨向恩师表示最诚挚的谢意和崇高的敬意! 二年的硕士学习与研究期间，浙江人学原子核农业科学研究所全体老师给予了热心的关 怀与支持。感谢本所陈子元院士、夏英武教授、徐步进教授、舒庆尧研究员等老师给予的关 心与帮助；感谢浙江大学辐照中心傅俊杰副教授、孙志明老师、赵小君老师等在实验上给予 的热情帮助：感谢安马殖弧公司毛君玲老师、美国应用生物系统公司刘麟老师在实验技术上 的交流与帮助；同时，也要感谢给过我关心与帮助的所有老师。在此向他们表示最崇高的敬 意! 三年的硕十学习与研究期间，浙江人学原子核农业科学研究所全体同学给予了热情帮 助。感t q j 女l j 新| 尊十、高冠军博- f ：、徐强师兄在我刚进实验室时给予的耐心指导平热情帮助： 感谢实验室所有的兄弟姐妹在实验技术上、生活上、学习上的帮助：感谢浙江人学医学院附 属第一医院尉建峰博十、浙江大学医学院病理生理实验宝沈静博士在实验上的交流与建议： 感谢师妹应南娇博士、吴嫒嫒博士平师弟许镇坚硕士对本论文的校对与斧正。还有许多关心 与支持我的老师和朋友，在此一并致谢! 三年的硕十学习与研究期间受n t 家人的大力关心与支持。本文的顺利完成离不开父 母、姐姐们的鼓励与帮助。在此向他们深深的鞠躬! 本研究受国家自然科学基金重点项目“极端环境下耐辐射球苗的适应机理及d n a 修复 和抗逆性新基因的发现”( n o 3 0 3 3 0 0 2 0 ，c 0 1 叭) 资助。 张春潮 2 0 0 4 年5 月丁浙人华家池 摘要 耐辐射球菌是一种革兰氏阳性、红色、不运动的非致病菌。最初是从辐照处 理后的肉罐中分离得到的。耐辐射球菌r l 菌株全基因组由两条染色体，一个大 质粒和一个小质粒组成。一号染色体由2 ，6 4 8 ，6 3 8 个碱基对组成，二号染色体包 含4 1 2 ，3 4 8 个碱基对，而大质粒和小质粒分别由1 7 7 ，4 6 6 和4 5 ，7 0 4 个碱基对组成。 它们共同组成了全基因组3 ，2 8 4 ，1 5 6 个碱基对。 耐辐射球菌最突出的特征是极强的抗电离辐射的能力。指数生长期的r l 菌 株即使在5 1 t g y 剂量的y 一射线照射后，其生长能力也未受影响，6 k g y7 - 射线照 射后染色体基因组产生约2 0 0 个的双链断裂碎片，但是其基因组d n a 经修复后 没有引起任何的突变。自该细菌发现以来，科学家们提出各种假设试图来解释这 种现象，即使全基因组测序工作也已经完成，但耐辐射球菌真正的抗辐射机制仍 然是个谜。 为了研究耐辐射球菌极强的辐射抗性与d n a 修复机理，我们应用双向电泳 结合银染的方法考察了野生型菌株k d 8 3 0 1 在y 射线照射前后细胞体内总蛋白组 的变化情况。差异蛋白经胰蛋自酶酶切后产生肽片段，再利用基质辅助激光解吸 电离飞行时间质谱得到肽指纹图谱来鉴定。这些蛋白行使细胞的各种功能，绝 大部分未曾报道与辐射抗性有关。 在耐辐射球菌全基因组中，大约有一半的基因产物功能尚未清楚。因此，解 释这些功能未知的蛋白可能会帮助我们更好的理解耐辐射球菌极端辐射抗性机 理。我们的研究结果中发现了一些预测的蛋白在电离辐射后，其表达水平明显增 加或诱导，其中对两个基因进行了基因敲除。这两个基因的破坏子抗电离辐射的 能力明显下降。这些结果说明利用蛋白质组学的方法来发现耐辐射球菌辐射抗性 相关蛋白是可行的。 a b s t r a c t d e i n o c o c c u sr a d i o d u r a n s ( d r ) i sag r a m p o s i t i v e ，r e d p i g m e n t e d ，n o n m o t i l ea n d n o n p h a t h a o g e n o u sb a c t e r i u mt h a tw a so r i g i n a l l yi d e n t i f i e da sac o n t a m i n a n to fi r r a d i a t e dc a n n e d m e a t t h ec o m p l e t eg e n o m es e q u e n c eo ft h er a d i a t i o n - r e s i s t a n t b a c t e r i u md e i n o c o c e u s r a d i o d u r a n sr 1i sc o m p o s e do ft w oc h r o m o s o m e s ( 2 ，6 4 8 ，6 3 8a n d4 1 2 ，3 4 8b a s ep a i r s ) ，a m e g a p l a s m i d ( 1 7 7 ，4 6 6b a s ep a i r s ) ，a n das m a l lp l a s m i d ( 4 5 ，7 0 4b a s ep a i n ) ，y i e l d i n ga t o t a l g e n u i n eo f 3 ，2 8 4 ，1 5 6b a s ep a i r s d ri sb 6 9 tk n o w nf o ri t se x t r e m er e s i s t a n c et ot h el e t h a le f f e c t so fi o n i z i n gr a d i a t i o n e x p o n e n t i a lp h a s ec u l t u r e so ft h ed r r 1s t r a i ns u r v i v ee x p o s u r et og a m m ar a d i a t i o na td o s e sa s h i g ha s5 , 0 0 0g yw i t h o u tl o s so f v i a b i l i t yo re v i d e n c eo f d n ad a m a g ei n d u c e dm u t a t i o n 6 0 0 0g y o f7 - i r r a d i a t i o nw i l li n d u c ea p p r o x i m a t e l y2 0 0d n ad o u b l e - s t r a n db r e a k si nd rc h r o m o s o m e s ， b u ti ti ss t i l la b l et or e c o n s t r u c taf u n c t i o n a lg e n o m ef r o mc h r o m o s o m a lf r a g m e n t sw i t h o u ta n y m u t a t i o n o v e rt h ep a s tf e wy e a r s ，a l t h o u g hm a n yf a c t o r sh a v eb e e np u tf o r w a r dt oe x p l a i nt h i s p h e n o m e n o n ，a n de v e nt h o u g ht h ec o m p l e t eg e n o m i cd n as e q u e n c eo fd r a d i o d u r a n si sn o w k n o w n ，t h em o l e c u l a rm e c h a n i s mu n d e r l y i n gt h i sp h e n o t y p ei ss t i l lp o o r l yu n d e r s t o o d i no r d e rt or e v e a lt h em e c h a n i s m so f e x t r e m er a d i o r e s i s t a n c ea n dd n ar e p a i ri nd e m o c o c c u s r a d i o d u r a n s ，w ee x a m i n e dp r o t e o m ec h a n g e si naw i l dt y p es t r a i nf o l l o w i n g7 - i r r a d i a t i o nu s i n g 2 - d i m e n s i o n a lp o l y a e r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i sa n ds i l v e rs t a i n i n g p r o t e i n sw e r ei d e n t i f i e d w i t hp e p t i d em a s sf i n g e r p r i n t i n gu s i n gm a t r i x - a s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o ni o n i z a t i o nt i m eo ff l i g h t m a s ss p e c t r o m e t r y ( m a l d i t o fm s ) a f t e rt r y p t i c i n - g e ld i g e s t i o n t h e s ep r o t e i n se x h i b i t e d v a r i o u sc e l l u l a rf u n c t i o n s ，m o s to f t h e mh a v en o tb e e nr e p o r t e dt ob er e l e v a n tt or a d i o r e s i s t a n c e i nd rg e n u i n e ，t h e r ea r ea b o u t5 0p e r c e n tp r o t e i n sw h i c hf u n c t i o n sa r es t i l lu n k n o w n t h u s c l a r i f y i n gt h ef u n c t i o n so ft h e s ep r o t e i n sm a yh e l pu s t ob e t t e ru n d e r s t a n d i n gt h em e c h a n i s m so f e x t r e m er a d i o r e s i s t a n c ei nt h i so r g a n i s m 【no u rr e s u l t s ，t h e r ea r eaf e wh ) ；p o t h e t i c a lp r o t e i n s w h o s ee x p r e s s i o nl e v e li n c r e a s e do ri n d u c e dr e c o v e r i n gf r o mi o n i z i n gr a d i a t i o n t w oh y p o t h e t i c a l p r o t e i n sw e r ed i s r u p t e ds u c c e s s f u l l y , a n dt h e s u r v i v a l so fb o t hd i s r u p t a n t sw e r ed e c r e a s e d d r a m a t i c a l l y t h er e s u l t so fp r e s e n tp a p e rs u g g e s tt h a t i ti sf e a s i b l et od i s c o v e r yn o v e l r a d i o r e s i s t a n c e a s s o c i a t e dp r o t e i n sb yp r o t e o m i c sm e t h o d s 3 第一章文献综述 第一节耐辐射球菌( d e i n o c o c c u sr a d i o d u r a n s ) 抗辐射机理的研究进展 删辐射球菌( d e i n o c o c c u sr a d i o d u r a n s ) ( 简称d r ) 是一种革兰氏阳性、红 色、不运动的非致病菌。曾被认为是地球上抗辐射能力最强的微生物( n i c k o l o f f e t a l1 9 9 8 ) 。该细菌由a n d e r s o n 等于1 9 5 6 年首次发现的( a n d e r s o ne ta 1 1 9 5 6 ) 。其 抗电离辐射的能力最高可达5 0 k g r a y ，是大肠杆菌的2 0 0 倍( b a t t i s t a1 9 9 7 ) 。该属 的其他物种均具有抗电离辐射、紫外线、过氧化氢的能力，尤其是d e i n o c o c c u s r a d i o d u r a n s 。因此，该细菌已成为研究d n a 修复的模式生物。其全基因组测序 也于1 9 9 9 年完成并发表( w h i t ee la 1 1 9 9 9 ) 。该细菌对辐射及其他d n a 损伤剂 的抗i 生是由其高效和准确的d n a 修复系统所决定的( m o s e l e y1 9 8 3 ) 。然而，对 该细菌d n a 修复能力的分子机理了解得十分有限，其全基因组中约有近1 2 的 基因尚不知其功能( w h i t ee ta 1 1 9 9 9 ) 。 耐辐射球菌的特征及“异常”之处： d r 是革兰氏阳性微球菌，无芽孢，不运动，能产生红色色素( a n d e r s o ne t a l 1 9 5 6 ) 。迄今为止已经从地球上许多地方分离到该细菌，并且该属的所有菌种都具 有抗电离辐射、抗紫外线及抗过氧化氢的能力( m i n t o n1 9 9 4 ) 。d r 曾被认为地球 上抗辐射能力最强的生物：指数生长期的细菌耐电离辐射的能力是大肠杆菌的 2 0 0 倍：耐紫外辐射的能力是大肠杆菌的2 0 倍( m o s e l e y1 9 8 3 ) 。3 0 0 0 g y 的y 射 线照射后，其基因组大概产生1 2 0 处双链断裂。耐辐射球菌能够在几小时内准确 无误的修复这些双链断裂而不产生任何突变( 图1 ) 。 指数生长期的细菌大多数分裂为二联体；而稳定期的细菌大多以四叠体的形 式存在( 多个基因组拷贝) 。 、 因此，该细菌被科学家首选为研究生物修复的最佳模式生物。美国能源部 ( d o e ) 因此启动的陔细菌的全基因组测序工作，该工作于1 9 9 9 年完成，并在 科学杂志发表了其基因组测序结果( w h i t ee t a l 1 9 9 9 ) 。d r 全基因组包含两 条染色体，一个大质粒和一个小质粒。预测共有3 1 8 7 个开放读框( o p e nr e a d i n g 4 f r a m e ，o r f ) ，其中一号染色体全长2 , 6 4 8 ，6 3 8 b p ，共编码2 6 3 3 个基因；二号染色 体全长4 1 2 ，3 4 8 b p ，共编码3 6 9 个基因；大质粒全长1 7 7 ，4 6 6 b p ，共编码1 4 5 个 基因；小质粒全长4 5 ，7 0 4 b p ，共编码4 0 个基因。 幽1 耐辐射球菌秕3 0 0 0 g y 辐照处理后染色体d n a 的修复( b a t t i s t ae t a l 1 9 9 9 ) l a n ei ，m a r k e r ：l a n e2 ，染也体d n a ：l a n e3 ，辐照处理后提取的染色体d n a l a n e4 一l a n e6 ，辐照处理后分别修复3 小时、6 小时和9 小时后的染色体d n a 耐辐射球菌抗辐射的性能来自何处? d r 抗辐射能力起源于何处是个十分有趣的问题。许多科学家猜测这种能力 可能源自于d r 的生存环境经常受到强烈的电离辐射。然而，电离辐射对生 物耐辐射能力的进化并没有起很大的作用( u n i t e d n a t i o n sp u b l i c a t i o n1 9 8 2 ) 。因 为，d r 抗辐射能力与选择压力没有很大的关系。m a t t i m o r e 和b a t t i s t a 等认为，d r 抗辐射能力可能是在长期的干旱环境中获得的( m a t t i m o r e1 9 9 6 ) 。他们发现d r 野 生型菌株都具有抗干燥的能力，而辐射敏感的4 1 个d r 菌株与野生型相比，却都 失去了抗干燥的能力。同时，随着干燥时阳j 的增加，d n a 双链断裂也随之增加， 提示干燥与抗辐射之间存在着一定的相关性。 耐辐射球菌抗辐射的主要机理： 目前对该细菌耐辐射的详细机理并不清楚，尽管1 9 9 9 年全基因组测序已经 完成，但其提供的基因组数据并没有给科学家理解该细菌超强的抗辐射能力的机 理带来很大的帮助。迄今为止，在该细菌中发现的与d n a 修复有关的基因，均 能在其它酬辐射能力一般甚至敏感的生物中找到。这就象一群表面看似相同的 人，而 爿j 有的财富却大相径庭。 尽管如此经过科学家们长期的不懈努力，一些与其抗辐射能力有关的基因 及可能的修复机理已经有了一定的了解。以f i n 素可能与其抗辐射的能力有关： ( 1 ) d n a 的降解与排出：当d r 暴露于电离辐射时，细菌染色体d n a 的双链 断裂片段会被细胞内的核酸外切酶切除而排出体外。这种d n a 的降解对 大多数生物来讲是不利的，然而对d r 却是一种很好的防御机制，它对维 持d r 生存非常重要( b a t t i s t a1 9 9 7 ) 。 ( 2 ) 多拷贝基因组与染色体内的重组：d r 携带4 1 0 个多拷贝基因，稳定生 长期的d r 每个细胞含有大约4 拷贝的基因组。这种多拷贝的基因组可能 使d r 更加便于利用丰裕的基因进行体内同源重组。但是目前还没有直接 的证据证明这种特性与抗辐射机理相关。而且发现有些细菌虽然也拥有多 拷贝基因却并没有很强的抗辐射能力。 ( 3 ) 指环状结构d n a 修复的魔戒? ：最近的研究发现d r 具有致密有序 的d s b s 环状堆积结构可能也是其抗辐射能力的一个关键因素。这种基因 组的指环状结构有利于d r 进行d n a 的重组修复( l e v i n z a i d m a n2 0 0 3 ) 。 这种结构与r e c a 参与的双链重组修复相互协同作用，共同促进d r 进行 d n a 损伤修复。但也有学者认为这种推测机制缺乏证据( b a t t i s t ae l a 1 2 0 0 3 ) 。 耐辐射球菌编码的d n a 修复基因与作用途径： d r 细菌修复d n a 损伤的途径有以下3 条：1 核苷酸切除修复；2 碱基切除 修复；3 重组修复。对于d r 是否存在s o s 系统，以及类似真核生物c h e c k p i o n t 系统尚存在争议。目前，已发现的d n a 修复基因以及它们的作用途径主要见下 表。 耐辐射球菌d n a 修复基因以及主要的修复途 寻： p a l h w a y p r e d i c t e db i o c h e m i c a la c t i v i t i e sa n dc o m m e n t s g o n e si adr a d i o d u r a n s n u c l e o t i d ee x c i s i o nr e p a i r c o r r e s p o n d st ou ve n d o n u c l e a i s ea ：u v r a = m t c a b ，u v r d 5 2i r r b u v r a b c d t r a n s c r i p t i o nr e p a i rc o u p l i n g m f d e x p e r i m e n t ss u g g e s tt h a tt h i sp r o c e s sm a yn o tb ep r e s e n t u ve x c i s i o nr e p a i r u v d e c o r r e s p o n d st ou ve n d o n u c l e a s eb ( u v s c d e ) b a s ee x c i s i o nr e p a i r aj k a 3 - m e t h y l g u a n i n eg l y e o s y l a s e m 1 1 g - 3 m g 3 - m e t h y l g u a n i n eg l y c o s y l a s e u n g u r a c i ld n ag l y c o s y l a s e m u g g ：um i s m a t c hg l y c o s y l a s e u n 9 2 u r a c i ld n ag l y c o s y l a s e ? m u t m f p g f a p ya n d8 - o x o g u a n i n ed n ag l y c o s y l a s e m u t y 0 q t h - l l i k e l yag ：ag l y c o s y l a s eb e c a u s em o s ts i m i l a rt om a w s m u t y n t h 一2 t h y m i f i eg l y c o lg l y c o s y l a s e m u t y n t h - 3s e c o n df a p yg l y c o s y l a s e m u t y n t h - 4u n k n o w n a pe n d o n u c l e a s e x 【h m a ya l s ob ea ne x o n u c l e a s e m i s m a t c he x c i s i o nr e p a i r m u t l s a b s e n c eo fm o t hs u g g e s t sd i f f e r e n ts t r a n dr e c o g n i t i o ns y s t e m t 1 1 a nec o l i r e c o m b i n a t i o n a lr e p a i ri n i t i a t i o n r e c f j n r qn e a r l yc o m p l e t er e e fp a t h w a y ( r e c om i s s i n g ) r e c da b s e n c eo fr e c ba n dr e c co r t h o l o g ss u g g e s t st h a tt h i sg o n e f u n c t i o n sd i f f e r e n t l yt h a ni nec o l i s b c c d h o m o l o g yt or a d s o m r e ils u g g e s t sar o l ei nd s br e p a i r r e c o m b i n a t i o n r e c a r e c o m b i n a s e ；m a ya l s or e g u l a t et r a n s c r i p t i o no f o t h e rg e n e s r e s o l u t i o n r u v a l 3 c l i k e l yr e d u n d a n tt ot h er e c gp a t h w a y r e c g l i k e l yr e d u n d a n tt or u v a b cp a t h w a y d n ap o l y m e r a s e s p o l a r e p a i rr e p l i c a t i o np o l y m e r a s e p o l c c h r o m o s o m a lr e p l i c a t i o np o l y m e r a s e p o l x d n ap o l y m e r a s eo f u n k n o w nf u n c t i o n ( p o l xf a m i l y ) l i g a t i o n d n i jl i g a t i c ma c t i v i t y i s r e q u i r e d f o ra l le x c i s i o n a n d r e c o m b i n a t i o n a lr e p a i rp a t h w a y s d n t pp o o l s ，c l e a n u p m u f r a n d n u d i xf a m i l y d n t pc l e a n u p ；m o r e ；c o p i e st h a na n yo t h e rp r o k a r y o t e n r d e f i r i b o n u c l e o t j d er e d u c t a s e n r d x r i b o n u e l e o t i d er e d u c t a s e 1 n d u c t i o n l e x at r a n s c r i p t i o nr e p r e s s o r , p o s s i b l yf o rs o sr e s p o n s e o t h e r r a d a s m s d n ad a m a g er e s p o n s e ? h e p a l i k e l yr o l ei nt r a n s c r i p t i o no rd n ar e p a i r ( o rb o t h ) ；m e m b e ro f s n f 2f a m i l y m u t s 2 p o s s i b l er o l ei nr e c o g n i z i n gm i s m a t c h e sb u tn o tl i k e l yi n v o l v e d i nm i s m a t c hr e p a i r x s c ae x o n u c l e a s ev i is u b u n i t ( b u tx s e bi sa b s e n t ) u v r a 2 e x p o r to f d a m a g e dd n a ? e x t r a c e l l u l a rn u c l e a s e s d e g r a d a t i o no f e x p o s e dd n a ? s s b s i n g l e - s t r a n dd n ab i n d i n gp r o t e i n c i n am a yr e c r u i tr e e at oc e l lm e m b r a n e x e r d s i t e - s p e c i l l cr e c o m b i n a s e 引自w h i t ee t a l 1 9 9 9 我们最近从该细菌发现一个类似开关的基因，该基因能够促进许多d n a 修 复基因r e c a ，p p r a ，s o d 以及c a t a l a s e 等的表达( h u a e l a l 2 0 0 3 ) 。几乎同时，美 国科学家也报道了该基因能够调控r e c a 的表达( e a r le la l2 0 0 2 ) 。这使我们了 解d r 细菌超强的辐射抗性机理又近了一步。 第二节蛋白质组学的发展概况与研究进展 蛋白质组( p r o t e o m e ) 的概念最先由澳大利亚m a c q u a r i e 大学的m a r cw i l k i n s 和k e i t hw i l l i a m s 于1 9 9 4 年提出，并于1 9 9 5 年首次在电泳杂志上发表，指 由一个基因组，或一个细胞、组织表达的所有蛋白质( w a s i n g e r e t a l 1 9 9 5 ) 。蛋白 质组学是在细胞整体水平上研究蛋白质的属性( 表达水平、翻译后修饰、相互作 用等) ，并由此在蛋白质水平上获得对疾病过程、细胞生理生化过程和调控网络 的广泛而完整的认识( b l a c k s t o c ke t a l 1 9 9 9 ) 。由于同一时间特定的细胞、组织或 有机体中并非所有的蛋白都表达，因此蛋白质组是高度动态的。蛋白质组学可视 为分子生物学的大规模筛选技术，目的在于归类细胞中蛋白的整体分布，鉴定并 分析感兴趣的个别蛋白，最终阐明它们的关系与功能。基因组学对基因的研究不 能充分预测蛋白的结构或动力学，这种在蛋白水平上的分析显得尤为重要，因为 绝大多数调控过程、疾病的原发过程以及大多数药物靶标均是发生在蛋白水平。 因此，在大规模基因组测序完成之后，蛋白质功能的鉴定已成为后基因组时代的 主要任务。蛋白质组学的形成和发展与两大重要的支撑技术的发展密切相关 双向聚丙烯酰胺凝胶电泳( t w o d i m e n s i o n a lp o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ) 军1 质谱( m a s ss p e c t r o m t r y ) 技术。 2 1 双向聚丙烯酰胺凝胶电泳简介 自从0 f a r r e l l 等提出双向电泳系统以来( o f a r r e l le la l1 9 7 5 ) ，双向电泳已 成为蛋白质组学研究的核心技术，它比传统的单向s d s 电泳分辨率提高了很多。 大肠杆菌双向电泳能够分辨5 0 0 0 多个蛋白点，因此该技术的发明被称为蛋白质 爆炸( p r o t e i ne x p l o s i o n ) 。该技术最主要的特点是2 - d e 凝胶分离具有出色的并 行性( p a r a l l e l ) ，用大的2 - d e 凝胶配合高灵敏的染色方法能很容易地同时分辨 1 0 0 0 个，甚至1 0 0 0 0 个蛋白点( k l o s ee la 1 1 9 9 5 ) 。尽管双向电泳有很多缺陷，人 们也曾经满怀热情地寻找蛋白质组研究中双向电泳( 2 d e ) 的替代技术，但是 都没有获得成功。可以说，到目前为止，还没有任何一个其它技术可以像双向电 泳一样，一次可以分离几千个蛋白质。 双向电泳的发展历史： 蛋白质组研究的发展以双向电泳技术作为核心。1 9 7 5 年，o f a r r e l l 首次发 表了分离大肠杆菌的双向电泳优化方法，并成功地分离约1 0 0 0 个e c o l i 蛋白( 0 f a r r e l le ta 1 1 9 7 5 ) 。第一向进行等电聚焦，蛋白质沿p h 梯度分离，至各自的等 电点：随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离。该方法在一维利用4 t 、5 c 柱状p a g e 胶，二维利用l a e m m l i ( l a e m m l i 】9 7 0 ) 的非连续s d s p a g e 凝胶系统。 在过去的二十多年，大部分2 - d e 研究都以该方法为基础。但电泳方式却经历了 从管状，垂直到水平的发展。等电聚焦也经历了从载体两性电解质梯度到固相 d h 梯度及两者混用的发展。 对于蛋白质组研究来说，2 - d e 在分离蛋白质时必须具有高的重复性和分辨 率。o f a r r e l l 提出的2 - d e 系统中利用了合成载体两性电解质( s y n t h e t i cc a r t i e r a m p h o l y t e ，s c a ) 来生成p h 梯度。但是，s c a 是通过复杂的合成过程得到的， 很难控制其重复性。更为严重的是，s c a 分子相对较小，难以固定在i e f 胶内， 因此在i e f 时，由于水引起的电渗流将导致s c a 分子向阴极漂移。这种现象导 致了p h 梯度的不稳定性。所造成的后果是p h 大于7 的蛋白丢失很多。o f a r r e l l 也注意到了这个现象，并引入了非平衡p h 梯度电泳( n o n e q u i l i b r i u mp hg r a d i e n t e l e c t r o p h b r e s i s ，n e p h g e ) 来分离碱性蛋8 ( 0 f a r r e l le la 1 1 9 7 7 ) 。所谓“非平衡 d h 梯度”是指将蛋白加在p h 7 1 0 或p h 3 5 - 1 0 的凝胶的酸性部分，电泳时间相 对较短。由于碱性蛋白迁移速率比酸性蛋白快，从而使碱性蛋白在快速形成的 p h 梯度中得到分离。但是，这种方法的重现性依然很难控制。 1 9 7 5 年，g a s p a r i c 等合成了固相p h 介质( h a g e ne la l1 9 7 9 ) ，1 9 8 2 年，固相 d h 梯度等电聚焦技术基本完善。它利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺 的共价聚合，从而形成固定的，不随环境变化的p h 梯度。使用固相p h 梯度等 电聚焦作为第一向，不但可以检测碱性蛋白，并且可阻得到整个p h 范围的双向 图谱。p h 范围可以在2 5 1 1 ，所以几乎在一张双向电泳图谱上可以得到整个细 胞产物的分离点。分辨率也比传统的等电聚焦要更高，可达o 0 0 1 p h ，是目前分 辨率最高的电泳方法。 双向电泳的流程： 双向电泳的流程主要包括：样品制备、等电聚焦、两相间的平衡及第二向 s d s p a g e 电泳。 样品制备和溶解是双向电泳成功的关键，目标是尽可能扩大样品的溶解度和 解聚，以提高分辨率。用化学法和机械裂解法破碎以尽可能溶解和解聚蛋白。样 品的预处理涉及溶解、变性和还原来完全破坏蛋白间的相互作用，并除去如脂类、 多糖、核酸等非蛋白物质。理想的状态应一步完成蛋白的完全处理( g 6 r ge la 1 2 0 0 0 ) 。近来发现，磺基甘氨酸三甲内盐( a s b l 4 1 6 ) 的裂解液效果最好( c h e v a l l e te l a 1 1 9 9 8 ) 。而离液剂硫脲( 2 m ) 和表面活性剂c h a p s ( 4 ) 的混合液对膜蛋白 的溶解十分有效( r a b i l l o u d19 9 8 ) 。中性还原剂三丁基瞵( t r i b u t y lp h o s p h i n e ，t b p ) 取代b 一巯基乙醇或d t t 可以克服蛋白在碱性区域的重氧化，并完全溶解链问 或链内的二硫键，增强了蛋白的溶解度，并导致转至第二向的增j j i ( h e r b e r te l a l 1 9 9 8 ；h e r b e r t1 9 9 9 1 。 目前，等电聚焦一般都采用固相p h 梯度及s c a 混用的方法，重复性很好， 是目前最广泛使用的方法。等电聚焦的时间一般随不同的p h 梯度、不同的上样 量和不同的胶条长度而变化，具体没有统一的标准。 在一维等电聚焦结束后，胶条可马上用于二维，但必须要两次平衡i e f 胶条。 主要是分别在含d t t 和i a a ( 碘乙酰胺) 的缓冲液中进行。之后，便是普通的 电泳。 双向电泳的缺陷与面临的挑战： 双向电泳虽然具有很多优势，但目前它仍有很多困难有待克服。主要有以下 几点：首先，2 - d e 胶作为一种平行的分离技术，其局限性最值得关注的是对低 丰度蛋白，极疏水蛋白和极碱性蛋白的无能为力( w i l k i n s1 9 9 6 ) 。许多实验室内和 实验室之间分离的重复性仍然是个很大的问题。其次，细胞膜和骨架蛋白质的回 f ) 收率不稳定，一些蛋白质可能完全被提取，而仍然有高达l o f l 蛋白质在提取后 残留在沉淀颗粒中。另外，目前还没有种力能的染色方法，能使胶上的所有蛋 白质都被染上或检测到。而且，现在已经逐渐明确了很多均匀的蛋白点还包含有 两个以上的蛋白质。对于原核生物来说，大约有2 0 的蛋白点包含一个以上的蛋 i 刍( l i n ke la 1 1 9 9 7 ) ，而对于真核细胞来说，这一数字接近4 0 。 总之，虽然双向电泳技术并不十分完美，但在目前和相当长的一段时阃内， 它可能仍然是蛋白质组学中不可缺少的核心技术。 2 2 质谱技术简介 质谱技术的发展历史 质谱的丌发历史要追溯到2 0 世纪初j j t h o m s o n 创制的抛物线质谱装置， 1 9 1 9 年a s t o n 制成了第一台速度聚焦型质谱仪，成为了质谱发展史上的里程碑。 最初的质谱仪主要用来测定元素或同位素的原子量，随着离子光学理论的发展， 质谱仪不断改进，其应用范围也在不断扩大，到2 0 世纪5 0 年代后期已广泛地应 用于无机化合物和有机化合物的测定。现今，质谱分析的足迹己遍布各个学科的 技术领域，在固体物理、冶金、电子、航天、原子能、地球和宇宙化学、生物化 学及生命科学等领域均有着广阔的应用。质谱技术在生命科学领域的应用，更为 质谱的发展注入了新的活力，形成了独特的生物质谱技术。 基本原理 质谱( m a s ss p e c t r o m e t r y , m s ) 是带电原子、分子或分子碎片按质荷比( 或质量) 的大d q l 页, 序排列的图谱。质谱仪是一类能使物质粒子离化成离子并通过适当的电 场、磁场将它们按空间位置、时阳j 先后或者轨道稳定与否实现质荷比分离，并检 测强度后进行物质分析的仪器。质谱仪主要由分析系统、电学系统和真空系统组 成。 用于分析的样品分子( 或原子) 在离子源中离化成具有不同质量的单电荷分 子离子和碎片离子，这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能并形成一束离 子，进入由电场和磁场组成的分析器，离子束中速度较慢的离子通过电场后偏转 大，速度快的偏转小；在磁场中离子发生角速度矢量相反的偏转，即速度慢的离 子依然偏转大，速度快的偏转小；当两个场的偏转作用彼此补偿时，它们的轨道 便相交于一点。与：l i n 时，在磁场中还能发生质量的分离，这样就使具有同一质 荷比而速度不同的离子聚焦在同一点上，不同质荷比的离子聚焦在不同的点上， 其焦面接近于平面，在此处用检测系统进行检测即可得到不同质荷比的谱线，即 质谱。通过质谱分析，我们可以获得分析样品的分子量、分子式、分子中同位素 构成和分子结构等多方面的信息。 有机化合物分子m 受强有力的电子束轰击后，会失去一个电子而成为分子 离子m + ，分子离子又会在电子束轰击下断裂成各种碎片，其中包括带j 下电荷的、 带负电荷的、和不带电荷的碎片。我们研究的主要是那些带正电荷的碎片。产生 这些碎片的分子离予又叫母离子。以乙醇为例，c 2 h 5 0 h + 便是它的母离子， c 2 h 5 0 一受高能电子束轰击后能产生下列分子离子和碎片： c 2 h 5 0 h + ，c 2 h 5 0 + ，c 2 h 3 0 + ，c h 3 0 + ，c 2 h 5 + ，c 2 h 4 + ，c 2 h 3 + ，c 2 h 2 + ，c h 3 + 质谱仪就是用来获得这些离子并进行分别收集和测量的仪器。由三个部分组 成：离子源、质量分析器、检测器。 但是，这种离子化的方式只能用于有机小分子的测定，对于分析大分子的蛋 白质是不可行的，因为它在离子化的过程中会破坏分子结构。直到8 0 年代术， 两种软离子化的生物质谱( 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，m a l d i - t o f 和电喷雾电离质谱，e s i ) 的发明( k a r a se l a l 1 9 8 8 ；f e n ne l a l 1 9 8 9 ) ，爿使得这 一技术用于分析蛋白质等生物大分子成为可能。它们在离子化过程中不会( 最多 只会部分) 破坏分子结构。因此，就能实现分子量大于1 0 0 0 0 单位( u ) 的生物 大分子的质量分析。 质谱技术种类 电喷雾质谱技术( e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o nm a s ss p e c t r o m e t r y , e s i m s ) 是在毛 细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小 的带电液滴，随着溶剂的蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为 大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气 相。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷l g ( m z ) 降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分析范 围，离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电荷数算出。电喷雾质谱的优势就 是它可以方便地与多种分离技术联合使用，如液一质联用( l c m s ) 是将液相色谱与 质谱联合而达到检测大分子物质的目的。在e s i m s 中