（有机化学专业论文）壳聚糖季铵盐的合成及应用研究.pdf

硕士学位论文 m a s t e r st h e s i f l 摘要 本文概述了国内外壳聚糖改性及应用方面的研究进展。以壳聚糖与2 ，3 - 环氧丙 基三甲基氯化铵反应，合成了羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖( h a c c ) ，研究了其杀菌活 性及与表面活性剂的复配性能。制备了壳聚糖壳聚糖季铵盐共混微球，研究了其吸 附性能。以壳聚糖季铵盐修饰玻碳电极，研究了其电化学性能。 主要研究内容及结论如下： 1 以壳聚糖与2 ，3 环氧丙基三甲基氯化铵反应，合成了羟丙基三甲基氯化铵壳 聚糖( h a c c ) ，研究了不同p h 值条件对水溶性壳聚糖季铵盐产率及产物溶解性的影 响，讨论了p h 值对反应的影响机理。结果表明，当反应p h 为6 0 时，水溶性h a c c 产物的产率高于p h 为4 0 、7 0 和9 0 时的产率；高效液相色谱表征发现了季铵盐 产物的分子量比壳聚糖原料的分子量低。 2 从配伍稳定性、表面张力及杀菌活性等方面研究了h a c c 与表面活性荆相互 作用的情况。结果表明：h a c c 浓度为1 1 0 。g m l 时，与阳离子表面活性剂十六烷基 三甲基溴化铵( c t a b ) 、非离子表面活性剂壬基酚聚氧乙烯醚( t r i t o n x 一1 0 0 ) 、两性表 面活性剂十二烷基甜菜碱( c 1 2 b e ) 配伍稳定；与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠 ( s d s ) 复配时，s d s 浓度超过1 1 0 。m o l l 会产生沉淀；加入h a c c 后，c t a b ， t r i t o n x 1 0 0 和c 1 2 b e 的表面张力曲线均有一转折区域，且c t a b ，t r i t o n x 1 0 0 1 临界胶 束浓度( c m c ) 增大。 3 以平板抑菌法研究h a c c 的杀菌活性，结果表明，不同分子量( m w 4 1 5 5 1 0 4 ， 9 0 2 x 1 0 4 ，3 5 7 x 1 0 4 ，0 1 7 1 0 4 ) h a c c 对金黄色葡萄球菌 a u r e u s ) ，枯草杆菌( 丑 s u b t i l i s ) ，表皮葡萄球菌假e p i d e r m i d i s ) ，以及白色念珠菌( ca l b i c a n s ) 均显示出杀菌 活性。较高分子量的h a c c 对革兰氏阳性菌显示出较强的杀菌活性，在m w 9 0 2 x l0 4 至m wo 1 7 1 0 4 之间，杀菌活性随分子量的减小而减弱。当浓度小于1 0g l 时，h a c c 对革兰氏阴性菌大肠杆菌伍c o 忉和绿脓杆菌( p a e r u g i n o s a ) 无杀菌活性。阳离子表 面活性剂，两性表面活性剂，非离子表面活性剂以及c a 2 + 、m 矿的存在对h a c c 的 杀菌活性无明显影响。 4 以乳化化学交联法制备壳聚糖壳聚糖季铵盐( c s 姒c c ) 共混微球，研究 了其对农药五氯酚钠和阴离子染料酸性铬兰k 的吸附性能。结果表明，随着壳聚糖 季铵盐含量的增加，c s h a c c 共混微球对五氯酚钠的吸附能力增强，但其成球的均 匀度和机械强度均变差。c s h a c c 微球对阴离子染料酸性铬兰k 具有一定的吸附效 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 果。 5 以共价键合法制备了壳聚糖季铵盐修饰电极，研究了低浓度的硝基苯在该 修饰电极上的电化学行为，并对其氧化还原机理进行了探讨。该壳聚糖季铵盐修饰 电极的稳定性能良好，对硝基苯的电化学氧化还原具有较好的催化活性。 关键词：壳聚糖；壳聚糖季铵盐；杀菌活性；表面活性剂；复配；微球；吸附： 修饰电极 n 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s a b s t r a c t t 1 1 e d e v e l o p m e n t so fs y n t h e s i sa n da p p l i c a t i o no fc h i t o s a nd e r i v a t i v e s w e r e r e v i e w e d 2 - h y d r o x y p r o p y l t r i m e t h y la m m o n i u mc h l o r i d ec h i t o s a n ( h a c c ) w a sp r e p a r e d t h em i c r o b i o e i d a la c t i v i t yo fh a c ca n di n t e r a c t i o nb e t w e e nh a c ca n dv a r i o u sk i n d s o fs u r f a c t a n t sh a v e b e e n s t u d i e d c h i t o s a n 2 h y d r o x y p r o p y l t r i m e t h y l a m m o n i u r n c h l o r i d e c h i t o s a n ( c s 用渔c c ) c o - m i x e dm i c r o s p h e r e s w e r e p r e p a r e d ，a n d t h e i r a b s o r p t i o ne f f e c t sw e r et e s t h a c cw a su s e dt om o d i f yg l a s sc a r b o ne l e c t r o d e a n di t s e l e c t r o c h e m i c a lp r o p e r i t yw a ss t u d i e d t h ef o l l o w i n ga r et h em a i nc o n t e n t sa n dc o n c l u s i o n s ： 1 h a c cw a sp r e p a r e db yt h er e a c t i o no fc h i t o s a nw i t h2 3 一e p o x y p r o p y l t r i m e t h y l a m m o n i u mc h l o r i d e t h ee f f e c to fl c l hi nr e a c t i o nm i x t u r eo ny i e l da n ds o l u b i l i t yo ft h e p r o d u c tw a si n v e s t i g a t e d a n dr e a c t i o nm e c h a n i s mw a sd i s c u s s e d 1 1 l er e s u l t ss h o w e d t h a tt h ey i e l do fw a t e rs o l u b l eh a c cw a sh i g h e rw h e nt h er e a c t i o nw a sa tp h6 0t h a na t p h4 0 ，7 0a n d9 0 ，r e s p e c t i v e l y h p l cw a su s e dt oc h a r a c t e r i z et h ec h a n g eo f m o l e c u l a r w e i g h t t h em o l e c u l a rw e i g h to f p r o d u c ti sl o w e rt h a nt h en a t i v ec h i t o s a n 2 t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nh a c ca n dv a r i o u sk i n d so fs u r f a c t a n t sw a ss t u d i e db y t h em e a n so fc o m p a t i b i l i t y , a n ds u r f a c et e n s i o n i tw a sf o u n dt 1 1 a tt h e r ew a sg o o d c o m p a t i b i l i t yb e t w e e nh a c ca tt h ec o n c e n t r a t i o no f1 x 1 0 。g m la n dh e x a d e e y lt r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e ( c t a b ) ，t r i t o n x - 1 0 0a n dd o d e e y lb e t a i n e ( c 1 2 b e ) t h es o l u t i o no f h a c ca tt h ec o n c e n t r a t i o no f1x1o 。j g m la n ds o d i u md o d e c y ls u l f o n a t e ( s d s ) a b o v et h e c o n c e n t r a t i o no fl 1 0 。j m o l lc o u l dc a u s ep r e c i p i t a t i o n h a c cc a u s e dt h es u r f a c e t e n s i o nc u r v et of o r mat r a n s i t i o na r e aa n di n c r e a s e dt h ec r i t i c a lm i c e l l ec o n c e n t r a t i o n ( c m c ) o f c t a ba n d 喇t o n x 1 0 0 3 c o n v e n t i o n a ta g a rp l a t em e t h o dw a su t i l i z e dt oe v a l u a t et h em i c r o b i o c i d a l a c t i v i t yo fh a c c 1 1 r e s u l t ss h o wt h a th a c cw i t hd i f f c r e n tm o l e c u l a rw e i g h t s ( m w 4 1 5 5 x 1 0 4 ，9 0 2 x 1 0 4 ，3 5 7 x 1 0 4 ，0 1 7x 1 0 4 ) s h o w e db i o c i d a la c t i v i t yo ns t a p h y l o c o c c u a a u r e u s a u r e u s ) ，b a c i l l u ss u b t i l i s ( b s u b t i l i s ) s t a p h y l o c o c c u ae p i d e r m i d i s e p i d e r m i d i s ) a n dc a n d i d aa l b i c a n s ( c a l b i c a n s ) h a c cw i t hh i 【曲m o l e c u l a rw e i g h th a dh i g hb i o c i d a l a c t i v i t yo nt h eg r a m - p o s i t i v eb a c m d a a n dt h eb i o c i d a le f f e c to fh a c cd e c r e a s e dw i t h d e c r e a s i n g m o l e c u l a r w e i g h tf r o mm w9 0 2 x 1 0 4t om w0 1 7 x 1 0 4 h o w e v e r , n o r e m a r k a b l eb i o c i d a la c t i v i t vo fh a c cw a sf o u n do ng r a m - n e g a t i v eb a c t e d ae s c h e r i c h i a c o l i ( e c o l oa n dp s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ( p a e r u g i n o s a ) a tt h ec o n c e n t r a t i o nu pt o1og l e 菇s t e n c eo fc a r l o h i es u r f a c t a n t 。a m p h o t e r i e s u r f a c t a n t , n o n i o n i cs u r f a c t a n t c 一+ a n d m r h a dn or e m a r k a b l ee f f e c to nm i c r o b i o c i d a la c t i v i t yo f t h e s eh a c cs a m p l e s i l l 硕士学住论丈 m a s t e r st h e s i s 4 as e r i e so fc h i t o s a n 2 - h y d r o x y p r o p y l t r i m e t h y la m m o n i u mc h l o r i d ec h i t o s a n ( c s h a c c ) c o - m i x e dm i c r o s p h e r e s w e r e p r e p a r e db ye m u l s i f i c a t i n g c h e r n i e a l e r o s s l i n k i n gm e t h o d t h ea b s o r p t i o ne f f e c to ns o d i u mp e n t a c h l o r o p h e n a t ea n da c i d c h r o m eb l u ekw a ss t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ea b s o r p t i o ne f f e c to ns o d i u m p e n t a c h l o r o p h e n a t ei n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s i n gr a t i oo fh a c c w h i l et h ep h y s i c a l s t r u c t u r eo fm i c r o s p h e r e st u r n e db a d c s h a c cc o m i x e dm i c r o s p h e r eh a da b s o r p t i o n e f f e c to na c i dc h r o m eb t u ck 5 g l a s sc a r b o ne l e c t r o d ew a sm o d i f i e db yh a c ct h r o u g hc o v a l e n t - b o n dr e a c t i o n n ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o ro fn i t r o b e n z e n ew i t hl o wc o n c e n t r a t i o no nt h em o d i f i e d e l e c 仃o d ew a ss t u d i e da n dt h er e a c t i o nm e c h a n i s mw a sd i s c u s s e d t h em o d i f l e de l e c t r o d e s h o ww e l ls t a b i l i t ya n dc a t a l y t i ca c t i v i t ye l e c t r o c h e m i c a lr e d u c t i o no f n i 仃o b e n z e n e k e yw o r d s ：c h i t o s a n ；2 - h y d r o x y p r o p y l t r i m e t h y la m m o n i u mc h l o r i d ec h i t o s a n ； m i c r o b i o c i d a l a c t i v i t y ；s u r f a c t a n t ；c o m p a t i b i l i t y ；m i c r o s p h e r e ； a b s o r p t i o n ；m o d i f i e de l e c t r o d e 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：二寥丘参多矿 6 5 的溶液中急剧下降；而季铵化后的壳聚糖在水中的溶 解性随p h 值的变化较小。可见，壳聚糖季铵化后其溶解性得到了明显改善，使其 在碱性条件下也可溶解。 2 2 2r a c c 的结构及分子量表征 h a c c 的结构如图2 2 。图2 3 为c s 及h a c c 2 的红外光谱图。在c s 红外图 谱中1 6 5 0c n l d 处的吸收酰氨i 谱带，1 5 9 0c m - 1 强吸收峰为氨基的伸缩振动峰，在 h a c c 2 的红外光谱图中，强吸收峰1 5 9 0g i n 以消失，在1 4 8 0 c m 1 处出现- - c h 3 的c h 弯曲振动强吸收峰，与文献 3 4 ，3 5 报道一致，表明n 上引入了羟丙基三甲基 氯化铵的季铵盐侧链。 ( c 搦够：l 图2 2 h a c c 的分子结构 3 5 3 0 2 5 0 02 0 0 01 5 0 01 0 0 0 5 0 0 w a y e n t m a b “s “m 1 ) 图2 3 c s 及h a c c 2 的红外谱图 8日口_g|享 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 图2 4 为c s 原料及相应的h a c c 2 的液相色谱图。从图中可以看出，h a c c 2 产品的分子量比对应的c s 原料的分子量有所降低，这可能是由于反应过程中较长 时间的高温条件使部分原料发生降解。 嚣 鲁 骨 凹 鲁 艺 g 口 1 0 b 0 1 5 0 0 t i m e ( r a i n ) 图2 4 c s 及h a c c 2 的液相色谱图 2 2 3p h 值对反应的影响机理 h a c c 的制各反应如下： 串 h 2 ：! 曼毫h c h 鲞h h s e p l ： i - i c h 菇档h 亩够l _ o h 随着反应的进行，壳聚糖分子中的亲核中心c 2 位氨基逐渐发生亲核取代，由 于位阻大、水合能力强的季铵盐基团的引入，壳聚糖分子间的氢键作用被大大削弱， 取而代之的是壳聚糖与水之间的水合作用，从而使其水溶性增大。因而可以推断， 产物的水溶性越好，则上述反应进行的越充分，即取代度越高。 对于上述反应，弱酸性条件有利于反应中间体缩水甘油三甲基氯化铵的环氧键 断开，增强其与- n h 2 的反应活性；且在弱酸性条件下，c s 上大部分氨基仍以游离 态形式存在，保留了自身的反应活性。 此外，部分g t m a c 与h c i 反应的产物仍可与c s 反应生成h a c c 9 5 】，只是 反应活性有所减弱： 1 6 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s h 够黯h 例茹哗h 够i i + l l c l 一氛岛茹邸h 够l - +c l 严 + e 喇c 啊掰n ( c h 够i 。 采h 翱e l - + i l e l 但当酸性过强时，c s 上氨基大部分被质子化，失去反应活性；同时，大量的 中间体g t m a c 与h c i 反应，使中间体反应活性降低。 碱性条件下，中间体g t m a c 环氧键易断开生成邻羟基 9 6 】，使其失去与c s 反应的活性： h h 嘲茹嗽h 秽l - + 糊燃lc 5 h 如侧茹郴h 蝴l 。 2 2 4h a c c 与表面活性剂配伍稳定性 实验发现，h a c c 2 与阳离子表面活性剂c t a b ，非离子表面活性剂t r i t o n x 1 0 0 、 两性表面活性剂c 1 2 b e 复配时，在所研究浓度范围内，即h a c c 2 浓度为1 1 0 弓g m l ， 表面活性剂浓度为1 l o l 1 0 。1 m o l l 时均可稳定共存，不会发生相分离现象；而 与阴离子表面活性剂s d s 复配时，s d s 浓度为1 x 1 0 巧和l 1 0 。m o l , ，l 时溶液澄清， l 1 0 。3 m o l l 时溶液浑浊，l 1 0 。和l 1 0 4 m o l l 时出现絮状沉淀。 h a c c 2 在溶液中发生电离，使大分子链带正电荷，与阳离子表面活性剂、非离 子表面活性剂及两性表面活性剂作用较弱，不会产生沉淀，溶液体系能够稳定存 在。而荷负电的表面活性剂阴离子则容易吸附于荷正电的h a c c 2 主链上，形成不 溶性复合物，使溶液产生沉淀。 以上实验结果表明，h a c c 2 可与阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂及两性 表面活性剂复配，但不宜与与阴离子表面活性剂复配。 2 2 5l i a c c 对表面活性剂表面张力的影响 图2 5 分别为有无h a c c 2 存在时，各种表面活性剂表面张力与其浓度对数的 关系。由图2 5 a 可见，对阳离子表面活性剂c t a b ，l g c 一3 5 表面张力开始缓慢下降，曲线中出现折点，这表明 高分子与表面活性剂之间开始相互作用【9 7 】。c t a b 浓度增大时，溶液中由c t a b 电离出的b r 浓度相应增大，带正电荷的h a c c 聚阳离子吸引大量b f ，形成带负电 荷的离子氛，从而吸附带正电荷的c t a b 极性基团，使分配到溶液表面上的c t a b 浓度相应减小。l g c 2 5 时，表面张力曲线出现第二个折点，这表明吸附达到饱和， 此后，未被吸附的表面活性剂浓度达c m c ，溶液表面上的活性剂浓度稳定，表面张 力不再变化，与纯c t a b 溶液表面张力曲线重合。 t r i t o n x - 1 0 0 为非离子表面活性剂，本身不带电荷，与水形成氢键后略显正电性。 因此，在图2 5 b 中，当l g e - 4 5 时，t r i t o n x 1 0 0 h a c c 体系与纯t r i t o n x 1 0 0 溶液 表面张力无明显差别；而随着t r i t o n x - 1 0 0 浓度的增大，t r i t o l l ) ( ，l o o h a c c 体系的 表面张力曲线中出现一个与c t a b h a c c 体系类似的转折区域( - 4 3 6 5 时壳聚糖在水中的溶解性差 1 0 0 】，因此，对壳聚糖进 行改性，制备在酸性和碱性环境下均有较高水溶性的壳聚糖衍生物，有可能提高其 抗菌活性。 本文制备了n - 2 一羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖( h a c c ) ，测试了其对6 种微生物 的杀菌活性，并研究了分子量、浓度、环境p h 值、表面活性剂以及c a 2 + 、m g ”的存 在对其杀菌活性的影响。 3 1 实验部分 3 1 1 材料及仪器 本实验室自制脱乙酰度9 0 ，系列分子量的壳聚糖样品；其它试剂均为市售分 析纯。n i c o l e t 3 8 0 智能傅立叶红外光谱仪( 美国尼高力公司) ，k b r 压片。t s pp 1 0 0 高效液相色谱仪( 美国热电公司) 。 实验菌种包括：金黄色葡萄球菌 a u r e u s ) 、表皮葡萄球菌 e p i d e r m i d i s ) ，枯 草杆菌 s u b t i l i s ) ，大肠杆菌幔c o l o ，绿脓杆菌旷a e r u g i n o s a ) 以及白色念珠菌( c a l b i c a n s ) ，由武汉大学中国典型培养物保藏中心提供。 琼脂培养基：牛肉膏5 9 ，蛋白胨l o g ，琼脂粉1 5 9 ，加水至1 0 0 0 m l ，置于大烧 杯中加热溶解，调p h 7 ，1 2 1 1 2 8 。c 高压蒸汽灭菌2 0 m i n ，趁热注入培养皿中。 土豆培养基：土豆l o g ，琼脂粉1 5 9 ，加水至1 0 0 0 m l ，置于大烧杯中加热溶解， 调p h 至7 ，1 2 1 1 2 8 高压蒸汽灭菌2 0 m i n ，趁热注入培养皿中。 菌悬液的制备：将菌种活化，细菌接种到营养琼脂培养基上，置恒温培养箱中， 2 1 硕士学位论文 m a s t e r + st h e s l s 细菌于3 74 c 下培养2 4 h ，真菌于2 8 下土豆培养基中培养3 8 h ，培养至菌种生长良 好。用无菌棉签蘸取少量菌落于灭菌生理盐水中，摇匀，稀释成一定浓度的菌悬液， 约1 0 6 1 0 7 c f u m l 。 3 1 2 壳聚糖季铵盐( 姒c c ) 的制备 一定量的m w 为5 0 3 7 x 1 0 4 ( c s l ) ，1 1 , 5 9 1 0 4 ( c s 2 ) ，4 3 6 x 1 0 4 ( c s 3 ) 的壳聚糖溶 解于乙酸稀溶液中，调节p h 值至9 ，使壳聚糖析出，然后把壳聚糖置于三口烧瓶中， 加入溶剂，搅拌，升温，按摩尔比1 ：4 加入缩水甘油三甲基氯化铵，以稀盐酸调节 p h 6 0 ，在8 5 c 反应1 4 h 。产物用乙醇沉淀，过滤，用7 0 的乙醇水溶液洗涤，得粗 产品。将产品用水溶解，用3 g 砂芯漏斗过滤，滤液用丙酮沉淀，过滤。重复操作2 次。再将产品用水溶解，用分子量1 x 1 0 4 的渗析膜透析3 d , 溶液在真空下浓缩干燥。 所得产品分别编号为i t a c c1 ，r a c c2 ，i t a c c3 。 同样将m w 为0 9 4 x 1 0 4 ( c s 4 ) 用水溶解，升温至4 0 。c ，以摩尔比为 n ( c s ) ：n ( g t a ) = i ：5 的比率滴加中间体2 ，3 环氧丙基三甲基氯化铵，加盐酸调p h6 0 ， 反应2 4 h ，出料。料浆以丙酮沉淀，抽滤，滤饼加少量蒸馏水溶解，再次以丙酮沉 淀，如此反复3 4 次。产品真空干燥，编号h a c c4 。 3 1 - 3 取代度的测定 按文献【3 5 方法测定季铵盐产品的取代度。 3 1 4 水溶性测定 按2 2 4 方法测定壳聚糖原料及季铵盐产品的水溶性。 3 1 s 分子量对杀菌活性的影响 以平板抑菌法测试h a c c 的杀菌活性 1 0 1 1 。 向5m l 含h a c c ( 5 9 l ) 的生理盐水中加入2 0 0 微升菌悬液，以不含h a c c 的混 合溶液作为空白对照。将上述样品置于恒温摇床，2 5 振荡1 h 。取1 5 0 微升培养后 的上述样品均匀分散于培养基上，细菌以琼脂培养基于3 t c 培养，真菌以土豆培养 基于2 8 。c 培养。2 4 - 4 8 h 后取出观察各个平板上的细菌生长情况。每个样品做三组平 行实验，取平均值计算杀菌率r 。 3 1 6 浓度对杀菌活性的影响 向5 m l 含不同浓度h a c c 的生理盐水中加入2 0 0 微升菌悬液，以不含h a c c 的混 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 合溶液作为空白对照。同3 2 4 方法进行实验，计算杀菌率。 3 1 7p h 对杀菌活性的影响 将2 0 0 微升葭悬液加) k 5 m l 含5 9 lh a c c 的生理盐水中，分别以h c i 和n a o h 调 节p h4 1 0 作为测试组。同样配制不含h a c c 的上述混合液作为对照组。同3 2 4 方法 进行实验，计算杀菌率。 3 1 8 表面活性剂对杀菌活性的影响 将2 0 0 微升菌悬液i i i i a s m l 含5 9 lh a c c 和i ( w v ) 表面活性剂的生理盐水中 作为测试组。同3 2 4 方法进行实验，计算杀菌率。 3 1 9c a 2 + 和m 9 2 + 对杀菌活性的影响 将2 0 0 微升菌悬液分别加a 5 m l 含5 e , mh a c c 和m g c l 2 或c a c l2 的生理盐水中作 为测试组。同3 2 4 方法进行实验，计算杀菌率。 3 2 结果与讨论 3 2 1 壳聚糖季铵盐的制备和表征 h a c c 的结构及红外表征见2 3 2 。表3 1 显示了h a c c 的制备及性质。 表3 1h a c c 的制备和性能 3 2 2h a c c 的水溶性 壳聚糖原料c s i ，c s 2 和c s 3 水不溶，铵化后得到水溶性的产品h a c c i ，h a c c 2 和h a c c 3 ；c s 4 和h a c c 4 均具有水溶性。图3 1 显示了0 2 的四种季铵盐产品在p h 2 _ 1 3 范围内的溶解情况。 3 2 3 分子 固3 2 4 1 5 5 x 1 0 4 硕士擘位论文 m a s t e r st h e s i s 出较强的杀菌活性。另外，在m w9 0 2 x 1 0 4 - 0 1 7 x 1 0 4 之间，h a c c 对革兰氏阳性菌的 杀菌活性随分子量的减小而减弱。h a c c l 对ca l b i c a n s 的杀菌活性比h a c c 2 、 h a c c 3 和h a c c 4 略弱。 3 2 4 浓度对杀菌活性的影响 表3 ，2 显示了不同浓度时壳聚糖季铵盐样品的杀菌活性。当浓度在0 6 3 9 l 以上时 h a c c l 和h a c c 2 对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌显示出强的杀菌活性，而 h a c c 4 对上述细菌的杀菌活性较弱。当浓度在5 9 l 以上时，h a c c l 、h a c c 2 和 h a c c 4 对白色念珠菌均有较强的杀菌活性。 m w o 1 7 x 1 0 4 - 4 1 5 5 x 1 0 4 的h a c c 对革兰氏阴性菌大肠杆菌和绿脓杆菌在测试浓 度范围( 1 0 9 l ) 内均无杀菌活性。 3 2 5p h 对杀菌活性的影响 表3 2 不同浓度时h a c c 杀菌率( ) 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 图3 3 和3 4 分别显示，h a c c 3 在不同p h 条件下对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌 均具有较强的杀菌能力，并且弱碱性条件使其杀菌能力略有增强。图3 5 显示， h a c c 3 在酸性和碱性条件下对大肠杆菌均无杀菌活性。值得注意的是，酸性和碱性 条件均不利于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长，弱酸性条件利于白色念珠菌的生长。 j i a 等 2 2 】发现壳聚糖季铵盐，n ，n - t r i m e t h y lc h i t o s a n ，n ，n - p r o p y l - n ，d i m e t h y l c h i t o s a n ，和n - f u r f u r y l - n , n - d i m e t h y lc h i t o s a n ，在弱酸性条件下的抗菌活性强于在 弱碱性条件下的杀菌活性。q i n 等认为【3 4 】，n - 2 羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的抗菌 活性在弱碱性条件强于弱酸性条件，这与本文结果致。 州 图3 3 不同p h 值时，h a c c 对a l , o g u s 杀菌活性 ( - s g lh a c c 3 ；一对照组) 州 图3 4 不同p h 值时，h a c c 对ca l b i c a n s 杀菌活性 ( 0 5 9 lh a c c 3 ；- 对照组) 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 4 5678e1 0 p h 图3 5 不同p h 值时，h a c c 对z c o l i 杀菌活性 ( 5 9 lh a c c 3 ；对照组) 3 2 6 表面活性剂对杀菌活性的影响 分别以十二烷基苯磺酸钠( l a s ，阴离子表面活性剂) 、十六烷基三甲基溴化铵 ( c t a b ，阳离子表面活性剂) 、甜菜碱( b a ，两性表面活性剂) 、曲拉通x 1 0 0 ( t x ， 非离子表面活性剂) 与h a c c 3 复配，研究表面活性剂对h a c c 杀菌活性的影响。 结果显示，l a s 浓度高于1 时与5 9 l h a c c 3 复配后有沉淀产生；c t a b 、b a 、 t x 的存在对h a c c 对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及白色念珠菌的杀菌活性无明显影 响( 表3 3 ) 。 表3 3 表面活性剂对h a c c 3 杀菌活性的影响 3 2 7c a 2 + 和m g2 + 对杀菌活性的影响 日常生活用水含c a 2 + f f m 9 2 + ，因此，有必要研究c a 2 + 和m 矿+ 对h a c c 杀菌活性 的影响。从表3 ，4 可以看出，当c a 2 + 和m 酽+ 浓度在2 0m m o v l p a时，对h a c c 对大 肠杆菌、金黄色葡萄球菌及白色念珠茵的杀菌活性无明显影响。 表3 4c a 2 + 、m g2 + 对h a c c 3 杀菌活性的影响 述激 硕士学位论文 m a s t e r st h e s l 8 s t r a i n2 0 l o502 01 05 0 3 2 8 壳聚糖季铵盐抗菌机理的探讨 关于壳聚糖的抗菌活性，人们提出了三种机理。第一种认为，壳聚糖的聚阳离 子与微生物带负电荷的细胞膜作用，使细胞发生凹陷、变形和泄露 1 0 2 ，1 0 3 ；第 二种认为，壳聚糖能够结合一些有机体正常生长所必需的金属元素，微量元素或必 需的营养物质，从而抑制微生物生长 1 0 4 1 ：第三种认为，壳聚糖透过微生物的细胞 壁进入到细胞内，与d n a 形成稳定的复合物，干扰d n a 聚合酶或r n a 聚合酶的 作用，阻碍d n a 或r n a 的合成，从而抑制微生物的繁殖 1 0 5 1 。 季铵化之后，壳聚糖成为具有高电荷密度的聚阳离子电解质。关于壳聚糖季铵 盐的抗菌活性已有一些报道 1 0 6 1 0 8 1 。阳离子抗菌剂的作用位点是带有负电荷的细 菌细胞表面 1 0 9 1 。聚阳离子杀菌剂能与细菌细胞表面产生的酸性大分子作用，形成 据电解质复合物【3 1 】。本文研究显示，壳聚糖季铵盐的杀菌活性可能与其分子量有 关。高分子量的壳聚糖能在微生物细胞表面形成聚合物膜，抑制其与外界物质和能 量的交换：而低分子量的壳聚糖季铵盐能通过微生物的细胞外膜进入其细胞内，吸 收细胞体内带有阴离子的细胞质，从而扰乱微生物的生长。壳聚糖季铵盐对于不同 的微生物的杀菌活性有不同的最适宜分子量范围。 研究结果也表明，壳聚糖季铵盐在弱碱性环境下的杀菌活性比弱酸性环境下的 杀菌活性强。这正好与一般的季铵盐杀菌剂规律一致。碱性环境下，微生物蛋白质 携带更多的负电荷，从而增强了壳聚糖季铵盐聚合阳离子与微生物细胞的细胞质间 的相互作用3 4 1 。 壳聚糖季铵盐对大肠杆菌和绿脓杆菌的杀菌作用不如对金黄色葡萄球菌、枯草 杆菌、表皮葡萄球菌和白色念珠菌的杀菌作用有效。这可能是由于它们的细胞壁不 同 1 0 6 】。金黄色葡萄球菌、枯草杆菌和表皮葡萄球菌是典型的革兰氏阳性菌，它的 细胞壁全部由肽聚糖层组成。大肠杆菌和绿脓杆菌是典型的革兰氏阴性菌，它们的 细胞壁由一层薄的肽聚糖层和脂多糖层( l p s ) 组成，其中l p s 层对外部大分子有 很强的阻碍作用；另外，壳聚糖季铵盐有很强的亲水性，但亲脂性很弱。因此，壳 聚糖季铵盐很难通过大肠杆菌和绿脓杆菌的细胞壁。 3 3 结论 m w0 1 7 x 1 0 4 - 4 1 5 5 x 1 0 4 的n 2 羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖具有良好的水溶性。 这种壳聚糖季铵盐对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、表皮葡萄球菌和白色念珠菌具有 杀菌作用，而对大肠杆菌和绿脓杆菌无杀菌活性。分子量对h a c c 的杀菌活性有一 定的影响。在m w 9 0 2 x 1 0 4 0 1 7 x 1 0 4 之间，h a c c 对革兰氏阳性菌的杀菌活性随分子 量的减小而减弱。m w4 1 5 5 x 1 0 4 的h a c c 对白色念珠菌的杀菌活性比其它被测试样 品略弱。h a c c 在弱碱性环境下的杀菌活性比弱酸性环境下的杀菌活性强。阳离子 表面活性剂，两性表面活性剂，非离子表面活性剂以及c a 2 + 乘 m 9 2 + 的存在对h a c c 的杀菌活性没有明显的影响。阴表面活性剂不能和h a c c 配伍。 壳聚糖季铵盐具有良好的水溶性和保湿性能，在高级化妆品及外用杀菌剂方面 具有潜在的应用价值。 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 4 壳聚糖季铵盐微球的制备及应用研究 引言 大量文献报道了有关壳聚糖及其衍生物微球树脂的应用研究，涉及水体净化 【1 1 0 ，1 1 1 】，药物缓释f 1 1 2 ，1 1 3 】，蛋白质分离【1 1 4 ，酶固定化 1 1 5 ，1 1 6 】等诸多方 面的内容。但壳聚糖微球对阴离子物质吸附作用多在酸性条件下才能较好的发挥， 因为酸性条件下氨基质子化，才能有效吸附阴离子。而壳聚糖季铵化后，引入了季 铵盐基团，在溶液中电离后表现出较强的电正性，因而能更有效地吸附阴离子。 杜予民【11 7 】等用离子交联法制得羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米微球，并研究 了其对蛋白质药物模型牛血清蛋白的载药及缓释性能，结果表明，羟丙基三甲基氯 化铵壳聚糖纳米微球对牛血清蛋白具有良好的载药性及缓释效果。覃彩芹等 1 1 8 】 用反相乳液聚合法制得季铵化壳聚糖微球，并比较了季铵化前后壳聚糖微球对水中 c r ( ) 的吸附性能，结果表明，季铵化后的壳聚糖具有更宽的适用p h 范围和更好的 吸附效果。这些研究表明，壳聚糖季铵盐微球在吸附阴离子类物质方面具有良好效 果。 五氯酚钠经酸化后即得五氯酚。后者是一种亲油的惰性芳香氯化物，其p k a 为 4 7 5 ，是广泛使用的防止树木生长真菌，防治血吸虫病的杀虫剂。在使用过五氯酚 钠的地区，该物质会以阴离子的形式，缓慢地从树木、土壤中释放出来，污染附近 的水体。由于该化合物酸性较强，与其它非离子性芳香族化合物比较，更易流动， 且不易降解，因此对环境污染严重 11 9 】。 酸性铬兰k 是一种常用的阴离子染料，存在于印染工业废水中。梁锐杰等 1 2 0 报道过壳聚糖微球对该染料的吸附性能。 本文以乳化化学交联法制备了壳聚糖壳聚糖季铵盐共混微球，研究了其对农 药五氯酚钠和阴离子染料酸性铬兰k 的吸附性能。为壳聚糖在水体净化方面的应用 提供理论依据。 4 1 实验部分 4 1 1 材料及仪器 壳聚糖( 自制，m w5 0 3 7 x 1 0 4 ，脱乙酰度9 0 ) ；其它试剂均为市售分析纯。壳 聚塘季铵盐( 自制，m w 4 1 5 5 x 1 0 4 ，季铵化度8 6 5 ) ；五氯酚钠( 化学纯，天津 硕士学位论文 m a s t e r sn i e s l 8 市石英钟厂坝县化工分厂) ；其它试剂均为市售分析纯。 7 2 2 s 可见分光光度计( 上海精密科学仪器有限公司) ；t h z - _ 8 2 型恒温振荡器 ( 上海跃进医疗器械一厂) 。 4 1 2 微球的制备 将壳聚糖和壳聚糖季铵盐按一定比例混合，溶于2 的h a c ，加入适量致孔剂 p e g ，搅拌均匀，备用。向5 0 0 m l 的三颈烧瓶中力1 3 0 0 m l 液体石蜡，加入几滴司班， 搅拌使之充分乳化，再逐滴滴加将配好的c s h a c c 混合溶液。升温至6 0 。c ，搅拌 o 5 h ，以n a 0 h 调节p h9 ，加入交联剂环氧氯丙烷，搅拌4 h 。静置，倒去上层清液， 产物用5 0 的乙醇一水溶液洗2 3 次，抽滤，得微球。 4 1 3 五氯酚钠标准曲线的绘制 配置系列不同浓度的五氯酚钠溶液，用紫外可见分光光度计于3 2 0 n m 检测其吸 光度，绘制标准曲线。 4 1 4 对五氯酚钠静态吸附实验 i 句2 0 0 m l 浓度为4 5 0 m g l 的五氯酚钠水溶液中加入o 5 克微球。置于恒温振荡器， 室温下振荡。于不同时间取上层清液，用紫外可见分光光度计检测其吸光度。每个 样品做三组平行