（食品科学专业论文）花生蛋白酶解及活性肽抗氧化活性研究.pdf

摘要 本论文以花生蛋白为原料，用碱性蛋白酶( a l c a l a s e ) 、复合蛋白酶( p r o t a m e x ) 、中 性蛋白酶( n e u t r a s e ) 通过酶解制备花生活性肽，以水解度( 阴) 为指标，根据单因素和正 交实验优化了酶解条件；在此基础上，对花生活性肽的抗氧化特性进行了研究，同时探 讨了花生活性肽抗氧化特性的稳定性；分析了花生蛋白酶解液中肽的分子量分布，并对 活性肽在油脂中的抗氧化能力进行了研究。结果表明： ( 1 ) 酶解条件优化：碱性蛋白酶的水解：底物浓度4 、酶浓度 e s 6 0 0 0 u g 、反应温 度5 5 和p h 值8 0 、反应时间3 h ，此时水解度可达2 3 3 7 ；复合蛋白酶的水解：底 物浓度3 、酶浓度 e s 6 0 0 0 u g 、温度5 5 。c 、p h 值7 0 、时间3 h ，此时水解度可达 1 6 2 3 ；中性蛋白酶的水解：底物浓度为3 、酶浓度 e s 6 0 0 0 u g 、温度5 5 、p h 值7 0 、时间3 h ，此时水解度可达1 1 4 6 ；碱性蛋白酶和复合蛋白酶或风味蛋白酶的 双酶水解条件：4 5 0 0 u g 碱性蛋白酶- - 3 0 0 0 u g 复合蛋白酶，初始p h 值定为8 0 ，底物 浓度4 ，温度5 5 ，反应时间3 h ，水解度可达2 1 7 7 ，且无苦味；4 5 0 0 0 g 碱性蛋 白酶- b i o l a p u g 风味蛋白酶，初始p h 值定为8 0 ，底物浓度4 ，温度5 5 ，反应时 间3 h ，水解度可达2 1 8 6 ，不但可以去除大部分苦味，还可获得一定的风味。 ( 2 ) 花生肽具有较强的抗氧化活性及有效清除羟自由基的能力，且在本试验范围内随 水解度的增加而提高。碱性蛋白酶酶解所得肽的a o v 值最大可达2 0 4 5 m g g ，h o 清除 率最高可达8 0 4 5 ；复合蛋白酶酶解所得肽的a o v 值最大可达1 4 5 6 m g g ，h o 清除 率最高可达6 8 5 6 。 ( 3 ) 花生活性肽抗氧化特性对热( 1 0 0 ，l o m i n ) 、冷冻( 一1 8 ，2 4 h ) 基本稳定， 且在碱性环境中的抗氧化特性优于在酸性环境中。 ( 4 ) 试验范围内抗氧化活性随水解度增加而增大，且花生活性肽相对分子量在5 0 0 0 以 下时具有较高的抗氧化活性。 ( 5 ) 花生活性肽对猪油和大豆油自氧化( 6 0 下加速氧化) 有较强的抑制作用，但不 能完全抑制油脂的自氧化。 关键词：花生蛋白；酶解；活性肽；分子量分布；抗氧化活性 a b s t r a c t b i o a c t i v ep e p t i d e sp r e p a r e df r o mt h ep e a n u tp r o t e i nh y d r o l y s a t e su s i n gt h r e ef o o d g r a d e e n z y m e s ：a l c a l a s e ，p r o t a m e xa n dn e u t r a s ew e r es t u d i e di nt h ep r e s e n tp a p e r e n z y m a t i c h y d r o l y s i sc o n d i t i o n sa r eo p t i m i z e dt h r o u g hs i n g l ef a c t o r sa n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t t h e a n t i o x y g e n i cp r o p e r t yo fp e a n u tp r o t e i np e p t i d e sw a ss t u d i e db yt h r e es y s t e m s t h es t a b i l i t yo f a n t i o x y g e n i cp r o p e r t yw a se v a l u a t e db yt w om e a n s m o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o no ft h e s e p e p t i d e sw a sd e t e r m i n e db yt r i c i n e - s d s p a g e m o r e o v e r , a n t i o x i d a n tc a p a c i t yo fa c t i v e p e p t i d ei no i lw a si n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e d ： ( 1 ) o p t i m u mc o n d i t i o n so fe n z y m a t i ch y d r o l y s i s ：a l c a l a s e ：c o n c e n t r a t i o no fp e a n u t p r o t e i n4 a n de n z y m a t i cc o n c e n t r a t i o n e s 6 0 0 0 u g , p h = 8 0 ，t e m p e r a t u r e 5 5 c ，t i m e 3 o h ， u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s ，d h 2 3 3 7 ；p r o t e m a x ：c o n c e n t r a t i o no fp e a n u tp r o t e i n3 a n d e n z y m a t i cc o n c e n t r a t i o n e s 6 0 0 0 u g ，p h = 7 0 ，t e m p e r a t u r e 5 5 c ，t i m e 3 0 h ，u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s ，d h l 6 2 3 ；n e u t r a s e ： c o n c e n t r a t i o no fp e a n u t p r o t e i n3 a n de n z y m a t i c c o n c e n t r a t i o n e s 6 0 0 0 u g , p h = 7 0 ，t e m p e r a t u r e 5 5 c ，t i m e 3 o h ，u n d e r t h e s ec o n d i t i o n s ， d h l l 4 6 ：d o u b l ee n z y m a t i ch y d r o l y s i sb ya l c a l a s ea n dp r o t e m a xo rf l a v o u r z y m e ： 4 5 0 0 u ga l c a l a s ea n d3 0 0 0 u gp r o t e m a x ，c o n c e n t r a t i o no fp e a n u tp r o t e i n4 ，p h = 8 0 ， t e m p e r a t u r e 5 5 。c ，t i m e 3 0 h ，u n d e r t h e s ec o n d i t i o n s ，d h 2 1 7 7 a n db i t t e r l e s s 4 5 0 0 u g a l c a l a s ea n d1 0 i a p u g f l a v o u r z y m e ，c o n c e n t r a t i o no fp e a n u tp r o t e i n4 ，p h = 8 o t e m p e r a t u r e 5 5 c ，t i m e 3 o h ，u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s ，d h 2 1 8 6 ，n o to n l yb i t t e r l e s sb u ta l s o f l a v o r o u s ( 2 ) p e a n u tp e p t i d e sh a v eo b v i o u sa n t i o x y g e n i ep r o p e r t ya n da b i l i t yt oc l e a rh o i ne f f e c t ， a n di m p r o v e dw i t hah i g h e rd e g r e eo fh y d r o l y s i s a o vo fp e a n u tp e p t i d e sf r o ma l c a l a s ec a n r e a c hi t sc l i m a x2 0 4 5 m g g , d ( h o c l e a r a n c er a t e ) c a nr e a c hi t sc l i m a x8 0 4 5 ：a o vo f p e a n u tp e p t i d e sf r o mp r o t a m e xc a l lr e a c hi t sc l i m a x1 4 5 6 m r g , d c a l lr e a c hi t sc l i m a x 6 8 5 6 ( 3 ) t h ea n t i o x y g e n i cp r o p e r t yo fp e a n u tp e p t i d e sa r es t a b i l et oh e a ta n df r e e z i n g , f u r t h e r m o r e ， t h ea n t i o x y g e n i cp r o p e r t yi na l k a l i n ec o n d i t i o ni sb e t t e rt h a ni na c i d i cc o n d i t i o n ( 4 ) t h ea n t i o x y g e n i cp r o p e r t yo fp e a n u tp e p t i d e si m p r o v e dw i t hah i g h e rd e g r e eo fh y d r o l y s i s ， a n db i o a c t i v ep e p t i d e st h a tm o l e c u l a rw e i g h tl o w e rt h a n5 0 0 0h a v eu p p e ra n t i o x y g e n i e p r o p e r t y ( 5 ) a c t i v ep e p t i d e sh a v eo b v i o u s r e s t r a i ne f f e c tt oo i lo x i d a t i o n b u tc 蛐n o tr e s t r a i ne n t i r e l y k e yw o r d s ：p e a n u tp r o t e i n ；e n z y m a t i ch y d r o l y s i s ； b i o a c f i v e p e p t i d e ； m o l e c u l a rw e i g h t d i s t r i b u t i o n ：a n t i o x i d a t i o na e t v i t y n 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河 南工业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表 示了谢意。 论文作者签名：吏墨日期：幽：生兰! 关于论文使用授权的说明 本人完全了解河南工业大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；本 人授权河南工业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编 学位论文。( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：二型1 日期：j 生乙生丛，一一 导师签名：驻塞尘日驴2 1 弘竺一 有关知识产权的保证 本人所星交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。本人在校期间的研究成果及发表的论文，知识产权归河南 工业大学所有。本人毕业后发表的、以本人在校期间研究成果为基础完 成的论文、研究报告及其它科研成果，将署名河南工业大学为作者单位。 论文作者签名：建丝日期：趔：! ：! i论文作者签名：送盐日期：趔：! ：! ! 导师签名：至墨竖日期：把1 2 ：! ! ； 花生蛋白酶解及花生肽抗氧化活性研究 第一章国内外研究进展及立题意义 1 1 国内外研究进展 花生蛋白的组成及营养特性花生蛋白是榨油工业的副产品，主要成分是花生球蛋 白和伴花生球蛋白约占9 0 ，还含有可溶于水的清蛋白，约占1 0 。球蛋白和清蛋白 都能溶于稀碱溶液中，也能溶于1 0 n a c l 或k c l 溶液。作为植物蛋白资源应用于食品 工业中，其溶解性、发泡性和持水性等功能特性是食品加工过程中非常重要的性质和质 量控制指标。花生蛋白粉的溶解性、发泡性和持水性受p h 值、温度和浓度的影响较大。 在等电点p h = 4 5 时，其溶解性、发泡性和持水性都最低。当温度达到5 5 时溶解度开 始下降，但随着温度的升高，起泡性增加，持水性下降。在蛋白质浓度约3 时，其起 泡性最好“0 1 。 植物蛋白中，花生蛋白在含量及营养方面仅次于大豆蛋白，是较理想的食用蛋白 资源。花生仁中有2 4 3 6 的蛋白质，与红肉类似。与几种重要的油料作物相比， 仅次于大豆，而高于芝麻和油菜。花生蛋白中约有1 0 清蛋白，其余9 0 为碱性蛋白， 它由花生球蛋白( 约6 3 ) 和伴花生球蛋白( 约3 3 ) 组成，是一种高营养的植物蛋 白资源，其生物价( b v ) 为5 8 ，蛋白质效价( p e r ) 为1 7 ，纯消化率( t d ) 为8 7 ，易被 人体消化和吸收。花生蛋白的生物价虽然比大豆蛋白生物价( b v 6 4 ) 较低，但其消化吸收 率却比大豆蛋白高得多，花生蛋白的p e r 值比玉米( 1 2 ) 和面粉( 1 0 ) 均高，赖氨酸的含 量比大米、小麦、玉米都高，且含较多的谷氨酸和天门冬氨酸，精氨酸含量高于其它坚 果，对维护人体健康和幼儿发育有重要作用。花生中含有比大豆更少的抗营养因子，棉 籽糖和水苏糖含量只相当于大豆蛋白的1 7 ，更易消化吸收。花生可溶性蛋白质和氮溶解 指数高，作为辅料添加能起到改善食品品质、强化食品营养和改善风味的作用，是乳肉食 物的优秀替代品。花生蛋白的氨基酸组成见表l 一1 。 表1 - - 1 花生蛋白的氪基酸组成g l o o g 蛋白 河南工业大学硕士论文 由上表看出，虽然花生蛋白中含有大量的人体必须氨基酸，营养价值较高，但花生 蛋白的营养也存在弱点，即蛋氨酸和色氨酸含量较少，必需氨基酸组成不平衡，限制性 氨基酸较多。第一、二、三限制氨基酸分别为赖氨酸，苏氨酸、蛋氨酸，按照必须氨基 酸组成模式评价，其得分相应为6 4 、6 5 、6 9 ，这三种氨基酸的限制值较大，并且限制程 度接近，因此对花生蛋白单- 卒t 充某种限制性氨基酸，其营养价值改善不明显。同时由 于花生蛋白中限制性氨基酸与多数植物蛋白的限制性氨基酸相同，所以简单地将花生蛋 白与其他植物蛋白配合使用也起不到营养改善作用。因此要充分地利用花生蛋白的营养 价值，一方面应当注重其作为辅料、添加剂与肉制品、乳制品等优质蛋白质原料复配使 用后的营养、感官和经济价值研究；另一方面应当加强采用发酵、酶解等生物技术转化 花生蛋白质，提高其营养价值和附加值”1 。 目前国际上花生蛋白产品根据蛋白质的含量，主要分为花生蛋白( 纯度低于6 5 ) 、 浓缩蛋白( 纯度6 5 以上) 、分离蛋白( 纯度8 5 以上) ，其中花生蛋白粉又分为全脂、 半脱脂和脱脂花生蛋白粉，至于组织蛋白则是利用脱脂饼粕进行组织化处理而得到的档 次较低的花生蛋白产品m ”。目前我国大部分的花生都是作为原料出口，而花生深加工 产业极为薄弱，花生蛋白分离提取工艺、设备落后，产品纯度低，变性程度相对较高， 在食品工业中的应用主要是花生乳、花生酱、花生蛋白糊等传统食品加工领域，产品科 技含量少、附加值低，较国外有很大的差距。而且由于蛋白质的纯度较低，改性研究还 处于初级阶段，市场上专用功能性花生蛋白几乎处于空白状态，其作为功能性基料添加 到肉类制品、谷物烘焙制品、饮料、冷食等方面的研究甚少。目前我国花生直接食用和 食品加工占3 0 3 5 ( 其中深加工只占1 0 左右) ，即使是出口占全国7 0 的山东省， 目前也只有1 8 个花生食品专业加工厂、2 8 条生产线，而花生产量只有我国0 0 0 8 的日 本就有上千家花生食品生产厂，人均花生食品占有量是我国的3 4 倍。美国所产花生 主要以加工系列食品消费为主( 约6 0 ) ，仅1 5 的花生用于榨油，且大都是次等或工 业下脚料花生米。由此可看出我国花生产业的落后状况，目前影响我国花生食品发展的 因素主要有：一是花生行业加工设备落后，科研力量薄弱，技术创新能力差，加工出的 产品品种少，应用范围窄，大部分产品都处于初级加工阶段，缺少高附加值产品；二是 黄曲霉毒素污染严重，花生原料的其他污染，如丁酰肼、重金属、农药残留等也成为各 国检验进口花生的重要指标，也是人们健康的一个潜在威胁；三是花生过敏源问题”。 解决这些问题的根本途径是加大资金、科研投入，只要政府重视花生深加工产业，加上 广大食品科技工作者的努力工作，我们的花生产业一定会迎头赶上的。可以说，我国的 花生产业潜力是巨大的，前景是光明的。 生物活性肽氨基酸彼此以酰胺键相互连接的化合物称作肽，生物活性肽是指那些 2 花生蛋白酶解及花生肽抗氧化活性研究 具有特殊功能的肽。一般来说，一种肽含有的氨基酸少于l o 个就被称为寡肽，超过1 0 个 的就称为多肽。普遍认为：相对分子量超过1 0 0 0 0 的多肽即为蛋白质，多肽可从多种动 植物蛋白中制取，按其原料可划分为：大豆肽、乳肤、玉米肽、豌豆肽、胶原肽、卵蛋 白肽、水产肽、谷朊蛋白肽、花生肽等。我国目前应用的多肽，主要是从大豆蛋白中提 取；统称大豆多肽。大豆多肽也称大豆蛋白活性肽，通常为2 1 5 个氨基酸组成的肽类 混合物，相对分子量在3 0 0 2 0 0 0 之间。花生蛋白活性多肽是花生蛋白质经生物降解纯 化后，获得的多肽混合物，是一类有重要生理功能的活性物质，具有食品保健品和医药 的多重优点，几乎适应各类人群，是2 l 世纪科技前沿的热点项目之一，具有广泛的社会 应用性和适用性。花生蛋白多肽对人的神经系统，内分泌系统和免疫系统的修补、激活、 补充均有明显的作用。它不仅可以强身健体，提高免疫功能，对具有各种慢性病的人， 可以调节生理平衡，使疾病减轻或治愈。 自b r a n t l 等1 9 7 9 年首次从喂食酪蛋白酶解物的豚鼠小肠中发现具有类吗啡活性的 短肽以来，世界各国对利用蛋白酶解制备活性肽的研究进展迅速，活性肽独特的生理功 能逐步引起人们的重视，并日趋成为食品工业和保健产业的研究热点。肽是由氨基酸通 过肽键连接而成的化合物，是机体组织细胞的基本组成部分，是与生物体内多种细胞功 能有密切关系的生物活性物质。过去，人们一直认为人体吸收蛋白质的主要途径是氨基 酸。然而近来研究表明：蛋白质经消化道酶促水解后，主要以小肽的形式吸收，比完全 游离的氨基酸更易、更快被机体吸收利用。生物体内已发现几百种肽，是机体完成各种 复杂的生理活性必不可少的参与者，其作用涉及激素、神经、细胞生长和生殖各领域， 其重要性在于调节体内各个系统、器官和细胞。生物活性肽的生理和药理作用主要是激 活体内有关酶系，促进中间代谢膜的通透性，或通过控制d n a 转录或翻译而影响特异的 蛋白合成，最终产生特定的生理效应或发挥其药理作用。活性肽有着很多优势，首先， 与氨基酸相比，由于渗透压较低，活性肽更易被人体吸收，肽吸收具有低耗或不需消耗 能量的特点。氨基酸只有2 0 种左右，功能可数，而肽以氨基酸为底物，可合成成百上 千种，生物学功能也很多。其次，活性肽许多性能优于大分子蛋白质，若氨基酸为二度 深度开发，肽就是蛋白的三度深度开发产品。最后，活性肽的功能大大优于低聚糖类物 质，多糖类物质的分子量很大，难以消化，而活性肽分子量小，极易消化吸收和利用， 其吸收机制、活性强度和活性多样性均优于多糖类物质”】。 生物活性肽的生产制备的途径有三条：一是从自然界的生物体中提取其本身固有的 各种天然活性肽类：二是通过体内消化系统或体外蛋白质降解途径可获得具有各种生理 功能的活性肷；三是合成的方法制备生物活性肽，包括化学合成法、酶合成法和重组d n a 技术合成法。从天然生物体中提取出生物活性肽，生物体内含量很低，加工成本却很高， 3 河南工业大学硕士论文 而且大量提取会造成物种资源的萎缩，另外有机溶剂残留还会带来毒性问题。化学合成 法常用于合成高营养价值、中等长度的医药用肤，但采用这种方法制取活性肽的反应底 物和反应剂价格高，反应过程中能产生有害物质。酶合成法相对有很多优点，如反应温 和，酶催化位置有方向等，但反应副产物多，最适酶缺乏及产率过低等因素都制约着它 的发展。而使用d n a 重组技术主要合成大分子肽类和蛋白质，对于活性小肽的制备，这 种方法也受到一定限制，另外，近年来欧美等国的消费者普遍反对经过基因工程而生产 的食品。考虑到成本、技术成熟度等因素，酶解蛋白质法生产活性肽已成为一种主流， 而重组d n a 技术正在探索之中。 采用酶解方法生产生物活性肽，一是可以生产大量的小肽而且成本低廉；二是反应 底物、反应剂和反应环境没有危害。酶解方法又分为单一酶的一步反应和多种酶和复合 物进行底物保护和激活、底物去保护过程和激活过程的多步反应。目前最基本的方法是 使用蛋白酶进行简单的水解，此种方法不仅可制取具有功能性的活性肽食品而且不会损 坏其营养价值，并且将食物降解为不同接长的肽还可以使其更加容易消化。但这种酶解 法的缺点是产品其它功能如粘性、乳化性和吸水性会受到影响，需要反复调整酶解参数 来改善产品的特殊性能和去除不良的味觉成分”。 随着人们对活性肽生理功能研究的深入，发现其具有极强的生物活性和多样性，具 有特殊的营养作用和生理功能，包括抗衰老、调节植物神经系统、活化细胞免疫功能、 改善心血管功能等，这些发现为开发肽类保健品、药物提供了理论依据。很多加入活性 肽的营养品、保健品、药品具有极强的活性和功效，可增强人体免疫功能，激活人体免 疫系统，使受损或处于亚健康的免疫系统得以康复，同时还具有降血压、降脂、促进有 益菌的生长等功效“”。 不同氨基酸组成的活性肽有着很多的独特的生理功能。一、具有抗氧化作用，比如 肌肽( b a l a - h i s ) 就是存在于动物肌肉中的天然抗氧化剂，它能够抑制由金属离子、 血红蛋白、脂质氧化酶及单态氧催化的脂质氧化作用，可作为储存熟肉的酸败抑制剂， 并能很好地稳定肉的颜色。d e c k e r 研究发现，肌肽可有效抑制碎猪肉在冻藏6 个月期间 的t b a r s ( 丙二醛和硫代巴比妥酸的反应产物) 形成量，且比脂溶性抗氧化剂如b h t 和a - 生育酚的作用强。d e c k e r 等还报道，肌肽可以抑制铁或铜催化的脂肪氧化反应，其中对 铜催化的脂肪氧化反应产生的抑制作用最强“”。另外谷胱甘肽( g s h ) ，号称抗氧化剂 之王，它是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通过肽键缩合而成的三肽化合物，因此也被称 为“三倍效能的抗衰老氨基酸”其作用机理是内含一个活泼的巯基( 一s h ) ，易被氧化 脱氢，因而具有抗氧化性、能清除自由基，使生物大分子、生物膜免受损害。g s h 可阻 止h 。o ：氧化血红蛋白，保护巯基防止溶血的出现，保证血红蛋白能持续发挥输氧功能， 4 花生蛋白酶解及花生肽抗氧化活性研究 还具有防止体内生成过氧化脂质的作用。g s h 是血液中的一种精确的生物标志，含量高 的人就健康且精力充沛，含量低则患病与衰老的机率就高，通过重新补充g s h 就可以延 缓衰老的进程。二、具有激素或调节激素的功能，这些肽通过自身作为激素或调节激素 反应而产生多种生理作用，包括生长激素释放因子、白蛋白胰岛素增效肽和a m y l i n 等。 在生理状态下，a m y l i n 是调节糖代谢的胰岛素的拮抗因子。我国科学家从猪胰脏中提取 到一个由2 3 个氨基酸组成的胰岛素拮抗肽，它在整体和细胞水平上对胰岛素都有明显 的拮抗作用“。三、具有免疫活性，人免疫球蛋自来源的免疫活性肽有 t h r - l y s p r o a r g 和g l y g l n - p r o a r g ，大豆蛋白和大米蛋白来源的免疫活性肽有 g i n a r g p r o a r g ( 大豆球蛋白a l a 亚基) 、h i s c y s g l n - a r g - p r o - a r g ( 大豆蛋白胰蛋白 酶解物) 和g l y - t y r - p r o m e t t y r p r o - l e u a r g ( 大米白蛋白) 等。有些活性肽除了具有刺 激巨噬细胞的吞噬能力外，还能抑制肿瘤细胞的生长“。四、促进矿物质的吸收利用， 如酪蛋白磷酸肽( c p p ) 是含有成簇的磷酸丝氨酰基的肽类化合物，它可作为无机离子的 载体促进肠膜对钙、铁、硒、锌等的吸收和利用，可以提高动物受精能力，还具有明显 的抗蛀牙、防止钙质流失等诸多生理功能“”。五、神经调节作用，这些肽包括生长激素 抑制肽，舒缓激肽和促甲状腺释放激素。它们可起到镇痛及调节人体情绪、呼吸、脉搏、 体温的作用 i s o 六、抗菌作用，y e ，x y 等报道，他们从花生中提取出一种抗菌肽，该 肽n 一末端氨基酸序列与以往报道的抗菌肽的氨基酸序列不同，但却与花生过敏原m a h 1 具有相似的序列。经试验证实，该肽可以抑制真菌m y c o s p h a e r e l 如a r a c h i d i c o l a 、 p u s a r i u m o x y s p o r u m 及c o p r i n u sc o l 船t u s 的生长，还可以抑制艾滋病病毒( h i v ) 反转录 酶及与感染h i v 相关的n - 葡萄糖苷酶和b - 葡萄糖苷酶的活性“。七、其它功能，除了 上述功能外活性肽还具有促生长、降血压、抗血栓、减肥、调味等功能。 酶法制备活性肽的国内外研究进展蛋白质水解的应用已有很长的历史，早期人们 以肉、鱼和大豆蛋白等为原料，利用酸、碱、蛋白酶作用使蛋白质完全或部分降解，从 而改善蛋白质的功能特性。从1 8 8 6 年开始把蛋白质水解物应用于食品工业，当时水解 植物蛋白主要作为调味剂添加于食品中。蛋白水解的作用主要在四个方面：一、提高 蛋白质提取率；二、改善蛋白质在食品中功能特性，如流变学特性、乳化性、起泡性、 热稳定性以及风味特性等；三、提高蛋白质营养价值和生物利用率：四、获得低分子活 性肽。由于物理改性范围窄，化学改性存在复杂、难控制、化学残留及副产物多等缺点， 因而，人们越来越重视生物改性，通过特异的蛋白酶来水解动、植物蛋白，这方面的研 究已成为热点”“。 乳蛋白的氨基酸组成合理、营养价值高，因此对乳蛋白酶解的研究一直放在最为重 要的位置，并制备出了具有多种生理功能的生物活性肽，如a c e 抑制因子、酪蛋白的磷 5 河南工业大学硕士论文 酸肽、免疫肽等。近年来，为了充分利用蛋白质资原，寻找具有生理活性的多肽，对 各种大宗蛋白质特别是产量大、质量低的制品或者作为废物处理的蛋白质，开展了相关 的研究工作，如大豆粕、棉籽饼、花生粕、血液蛋白、葵籽蛋白、谷物蛋白、油菜籽蛋 白、海洋蛋白等。有人利用内外切肽酶水解米糠蛋白并进行功能特性研究，发现当水解 度在8 9 时，其酶解物具有良好的乳化性、溶解性和稳定性。还有人应用部分酶解的 方法来提高油菜籽分离蛋白的功能特性( 持水性、起泡性、泡沫稳定性) 。大米蛋白方 面，y o s h i y u k i s 等用酶解处理黄酒加工的副产物酒糟，分离获得了九种a c e 抑制活性的 肽。玉米醇溶蛋白方面，采用嗜热菌蛋白酶( t h e r m o l y s i n ) 水解玉米醇溶性蛋白获得了 一种具明显降血压功能的活性肽，其一级结构为p r o p r o - v a l - h i s l e u m “1 。 用不同的蛋白酶水解不同来源的蛋白质可以得到大量功能特异的活性肽，一是植物 蛋白活性肽，其中以大豆肽的开发最早，大豆肽不仅易消化吸收，而且能与体内的胆酸 结合，具有降低血压和胆固醇的功能，还有较强的促进脂肪代谢的效果，是一种有效的 减肥食品。美国早在7 0 年代就研制出了大豆肽，之后美国d e l t o w ns p e c i a t i e s 公司开始 生产食用蛋白肽产品；日本不二公司于8 0 年代开发出相对分子量介于2 4 0 0 5 0 0 0 之间的 大豆活性肽制品，具有易吸收，热稳定性好等特性，可用于功能性饮料、酸奶和味精等 的生产；千叶制品公司开发的小麦肽是食品中常见的物性改良剂；而昭和产业开发的玉 米肽具有明显的降血压作用。二是乳活性肽制品，1 9 8 9 年底，日本首先将酪蛋白磷酸肽 ( c p p ) 实现工业化生产，推出了含有c p p 的功能性食品。如森永公司开发的的4 种乳活 性肽产品，在配方奶粉、运动食品和满足特殊人群需要方面都有应用；明治公司开发的 相对分子量在1 0 0 0 以下的乳肽制品已应用于易敏者的专用奶粉中。三是胶原肽，它是明 胶的水解产物，明胶所特有的氨基酸序列使胶原肽无苦味，这使其获得了广泛的应用。 如日豪公司生产的日豪肽、协同乳业日本商事公司生产的胶原肽可应用于糕点制作及保 健食品中。四是蛋清肽制品，蛋清有优质的氨基酸组成，蛋清酶解后得到蛋清肽，近l o 年来已有7 8 种产品问世，由于蛋清肽的保湿性和低致敏性，被应用于洗发剂和化妆品 中并向食品方面转移。五是水产蛋白肽，多数水产蛋白都有一定的降血压作用，日本已 对各种鱼蛋白肽进行了研究，如沙丁鱼肽具有a c e 阻碍作用，来自沙丁鱼筋肉相对分子 量1 0 0 0 2 0 0 0 的肽，运动实验表明有降血压的作用，可应用于保健食品中。六是畜产类 多肽，畜肉和畜血类多肽种类较多，所以也显示出多种功能，如促进铁吸收作用、改善 关节炎、促进消化以及作为滋养强壮剂等。大和化学公司上市的牛血清制备的活性肽制 品无味、易溶解、呈粉末状，现已广泛应用于婴幼儿奶粉中汹棚。 国内利用蛋白酶解制备生物活性肽方面的研究起步较晚，早期对蛋白质水解的研究 主要是基于改善蛋白质的加工功能特性方面，而且大量的研究工作都集中在大豆蛋白等 6 花生蛋白酶解及花生肽抗氧化活性研究 植物蛋白。中科院上海生化所龚岳亭教授认为：“生物科学中的许多重要课题如细胞分 化、免疫防御、肿瘤病变、抗衰防老、生殖控制、生物钟节律以及分子进化等都涉及有 关的活性肽，包括胸腺激素、激肽和各种多肽类生长因子。这方面的研究不仅在理论上， 而且在实际上都有重要意义，是医学研究的源泉之一。”随着对生物活性肽具有的各种 生理功能的进一步认识，现在国内对生物活性肽的研究与生产也非常重视，其重点研究 对象主要是大豆蛋白、乳蛋白等。大豆蛋白方面，华南理工大学肖凯军等研究了木瓜蛋 白酶水解大豆分离蛋白的工艺参数，并制备出营养效价高、易于消化吸收、无异味和苦 味的大豆多肽，并把它应用于老年奶粉中”1 。吴建平等较早地研究降压肽，他们用不同 蛋白酶对大豆蛋白进行水解，通过研究证明酶解液具有降血压功能并证实酶解液中含有 a c e 抑制因子，进而确定了大豆蛋白酶解制备降压肽的最佳工艺条件，同时分析了大豆 降压肽的分子量分布、氨基酸组成和肽谱等。捌。沈蓓英、孙冀平的研究表明，大豆 肽具有抗氧化活性，而且还有解酒功能。“删。哈高科公司利用酶解方法已从大豆蛋白中 制备出具有抗氧化功能的大豆低聚肽产品。乳蛋白方面，目前我国实现工业化的乳蛋白 生物活性肽主要是酪蛋白磷酸肽，其产品中c p p 含量介于2 5 9 0 不等，广州轻化所9 0 年代开始进行c p p 的研究，现已通过技术鉴定，并实现工业化生产啪1 。杭州娃哈哈集团 添加了c p p 的铁锌钙奶保健饮品，也已经面市。近年来，国内还展开了对淡水鱼蛋白 和海洋鱼蛋白的研究与开发。随着现代蛋白质工程、生物酶工程技术迅速发展，还会有 大量的生物活性肽不断地被研究和开发出来。生物技术的应用，可生产大量的生物活性 肽，广泛应用于食品配方、功能食品、食品添加剂、药品、化妆品、无公害饲料添加剂 等。 花生蛋白改性研究进展天然的花生蛋白质虽然表现出一定的功能特性，但往往不 能满足工业生产的需要。国外的食品研究者2 0 世纪5 0 年代就采用各种物理方法、化学 方法、酶法以及基因改造方法处理花生蛋白，使其结构发生调整，从而获得了具有理想 的功能特性和营养价值的蛋白质。由于相关交叉学科发展滞后，国内花生蛋白的改性研 究始于2 0 世纪9 0 年代。中国保健科技学会专家委员陈栋梁博士和解放军总医院营养科 主任赵霖研究员认为：“研究表明，花生肽中含有人体所必需的8 种氨基酸和生物活性 很强的天然多酚类物质一白藜芦醇。因此花生肽具有抗衰老，抗氧化的功能。”华南理 工大学采用脱氨基化、乙酰化、琥珀酰化和磷酸化对花生蛋白进行改性，发现改性后的 花生蛋白溶解性、乳化性、发泡性和持水力等功能特性均有明显提高，并将脱氨基花生 蛋白应用于蛋糕、面包的生产，目前花生混合面粉、花生蛋白馒头己经上市。郑州久宝 生物工程公司、武汉天天好生物制品公司己成功地萃取出花生蛋白活性肽，在国内处于 领先地位。总体上看，尽管发达国家在蛋白改性及深度开发方面技术已相当成熟，其中 7 河南工业大学硕士论文 大豆改性系列产品已经形成工业化生产，但由于产量和饮食习惯等原因，花生蛋白改性 产品尚未形成工业化生产；而国内主要由于科研力度不够，改性技术未取得重大突破， 距工业化生产还有很长的路要走。 抗氧化食品与人体健康人体的衰老过程实质上是氧化反应的结果，是体内积累活 性氧，产生多余的氧自由基，从而导致组织的伤害，诱发各种疾病、促使机体衰老。包 括抗氧化食品在内的各种抗氧化物质，可有效地将泄漏出来的、多余的活性氧等清除掉， 从而保护细胞、组织免遭氧化伤害。自由基是人体组织中许多生化反应的中间代谢产物， 其中胞内酶催化反应是形成自由基的最重要途径。这些中间产物对消灭细菌、清除炎症、 分解化学物质等具有积极作用，且还具有促进前列腺素、凝血酶原、胶原蛋白的合成， 参与肝脏解毒、调节细胞分裂等作用。正常情况下体内自由基总是处于不断产生和消除 对动态平衡中，但化学物质、污染的空气、香烟、辐射、强光、心理压力等会激发活性 氧和自由基的产生，如自由基产生过多或清除过少，就会造成对组织的伤害。抗氧化食 品对人体健康之所以非常重要，主要在于其具有清除多余活性氧、自由基的能力。这类 物质主要包括：1 、维生素类，这是人体最重要的抗氧化物质，具有抗氧化作用的维生 素主要有维生素c 、维生素e 、维生素a 、维生素b 。、辅酶q 等。2 、多酚类物质，它们 是植物代谢过程中的次生副产物，广泛存在于水果、蔬菜中，其抗氧化机理在于向脂质 过氧化自由基提供一个电子而使之成为较稳定的过氧化脂质。此类物质主要包括茶叶多 酚、葡萄多酚、苹果多酚、芝麻多酚、可可多酚、荞麦多酚等。3 、类黄酮物质，广泛 存在于植物组织中，几乎所有植物的所有组织中均含有类黄酮物质，其抗氧化能力来自 于酚性羟基的供氢或供电子能力以及螫合金属离子( 抑制其催化氧化反应) 的能力。具 明显抗氧化活性的类黄酮主要有银杏叶类黄酮、甘草类黄酮、大豆异黄酮、竹叶黄酮、 葛根异黄酮、花色素及花色素苷等。4 、香辛料类，此类物质多含有大量的多酚、酮、 醇等有机成分，因而具有一定的抗氧化活性，其中姜、大蒜、洋葱、胡椒具有很强的抗 氧化活性及抑菌能力。5 、其它类，主要有药食两用植物、杂色粮谷、蛋白多肽等。 活性肽抗氧化性能的检测方法研究现状目前对食品抗氧化活性( a n t i o x i d a n t a c t i v i t y ) 的测定方法总体分为两类：( 1 ) 在特定环境下，通过测定样品对测试体系中脂 类物质氧化抑制能力来评定被测物抗氧化能力；( 2 ) 通过样品对人工生成自由基的清除 能力来反映待测物抗氧化活性。测定方法有多种，有直接的，也有间接的，还有简便的 总抗氧化能力( t a c ) 试剂盒等。这些方法都有一定的优缺点或局限性，测定原理各不 相同，因此，为获得确切的评价结论，常需两种或两种以上的方法进行测定。下面介绍 几种常用的检测方法： f r a p 法( 铁离子还原法) 该法原理为f e t 三吡啶三吖嗪( t r i p y r i d y l - t r i a z i n e ， 8 花生蛋白酶解及花生肽抗氧化活性研究 t p t z ) 可被样品中还原性物质还原为二价铁形式，呈现出明显的蓝色，并于5 9 3n m 处具 有最大光吸收，根据吸光度的大小计算试样抗氧化活性的强弱。它由b e n z i e 和s t r a i n 建 立，原理明确，操作简便，不需特殊仪器，易于标准化，已用于测定不同抗氧化物质、 食物与生物样品的抗氧化活性，但是它所测结果反映的不是样品针对某一种自由基的清 除活性，而是样品总的还原能力，一些学者因此认为该法测定结果可用来反映样品的总 抗氧化活性嘶”。 o r a c 法( 氧自由基吸收量测定法) 以藻红蛋白( p e ) 作指示蛋白，2 ，2 一偶氮( 2 一 脒丙烷) 二盐酸盐( 从p h ) 作为r 0 0 自由基的发生物，当上述两种化合物混合后，p e 在 a a p h 释放的r 0 0 攻击下，一定波长下的荧光强度不断衰减，直到降至本底水平，由于 不同试样清除自由基的能力不同，因此加入上述体系后对p e 的保护也不同，最后根据p e 荧光强度衰减曲线下面积计算被测试样的抗氧化能力。目前国外应用较多，它可以用来 测定样品清除r 0 0 、h 0 等自由基的能力，但该法的自动化程序需要昂贵的全自动生 化分析仪，而手工操作程序费时费力，所以很难在国内一般实验室推广应用o “。 d p p h 法二苯代苦味肼基自由基( o p p h ) 是一种很稳定的以氮为中心的合成自由 基，若受试物能清除它，则提示受试物具有降低羟自由基、烷自由基或过氧自由基等自 由基的有效浓度，打断脂质过氧化链反应的作用。d p p h 有个单电子，在5 1 7 n m 有强吸 收，其乙醇水溶液呈深紫色，加入受试物后，通过在5 1 7 咖测定其清除d p p h 自由基而引 起吸光度减少的情况可以反映受试物的抗氧化活性“1 亚油酸自氧化法亚油酸是不饱和脂肪酸，具有在空气中极易被氧化而生成过氧化 物的性质，过氧化物可把亚铁离子氧化成铁离子，铁离子和硫氰酸根形成有色络合物 f e ( s c n ) 。 ”，该络合物在4 8 1 n m 处有强烈的光吸收，在亚油酸体系中加入一定量的多肽 液，如果花生肽具有抗氧化能力，它能抑制或延缓体系中过氧化物的生成。亚油酸白氧 化速率减缓了，最终影响显色物质的生成。通过测定o d e 。值的变化，就能表示出多肽液 的抗氧化能力的强弱。 抗氧化活性的8 一胡萝h 索一亚油酸乳化液法6 一胡萝h 素是一种多烯色素，易被氧 化而退去黄色，在反应介质溶液中，由亚油酸氧化产生的过氧化物能使b 一胡萝卜素褪 色，随时间的延长吸光度越来越小。当样品在5 0 水浴中分别加热1 5 m i n 和4 5 m i n 后，由 于b 一胡萝h 素褪色，使溶液的吸光度不同程度减小，而b 一胡萝卜素褪色的程度与体系 中物质的抗氧化活性的强弱有关。抗氧化能力越强，吸光度下降越慢，则一定时间内溶 液吸光度差值与一定浓度b h t 溶液的吸光度差值之比变小，抗氧化活性越强”。 1 2 课题研究的目的和意义 9 河南工业大学硕士论文 我国花生产量居世界首位，是四大油料作物之一，同时也是重要的优质食用植物蛋 白资源，是我国为数不多的净出口大宗农作物品种之一。近2 0 年来，我国花生出口量 一直居世界前列，占国际市场份额的2 5 以上，在国际市场有一定的竞争优势。虽然我 国花生在原料来源上有较大的优势，但深加工产业落后，如何利用蛋白质改性技术来对 花生进行精深加工，对花生产业发展、农产品结构调整、农民增收、国民健康、国力增 强都有着重要的意义。 相对于动物蛋白，植物蛋白来源丰富、价格低廉、安全性高，又有较好的功能特性。 因此开发植物蛋白资源，替代工业常用的动物蛋白，对降低产品成本，提高农产品附加 值具有较好的现实意义。花生蛋白质含量高达2 4 3 6 ，相当于牛奶的8 l o 倍，牛 肉和猪肉的l 2 倍，稻米和小麦面粉的3 4 倍，在所有农作物中，仅次于大豆，而蛋 白质可消化率和赖氨酸可吸收率均高于大豆。我国计划在2 0 1 0 年前逐步实现联合国对 食物蛋白每人每天7 0 7 5 9 的摄取推荐量，并决定在改善人民中长期饮食结构中采取以 发展植物蛋白为主的战略，国内花生产业孕育着极大的潜力。相对于大豆而言，花生中 抗营养因子较少，且不存在转基因安全问题，因此发展花生蛋白应当占有重要席位。 但长期以来榨油是我国花生最主要的利用途径，榨油后剩下的饼粕由于蛋白过度变 性使得营养价值降低，主要用作饲料，这无疑