（食品科学专业论文）高压脉冲电场及超声场提取啤酒废酵母中蛋白质与核酸.pdf

摘要 摘要 啤酒酵母是一种单细胞微生物，胞内含有丰富的蛋白质、核酸、碳水化合物、矿物质等营养成 分，是一种重要的蛋白质源和核酸源。随着我国啤酒工业的迅猛发展，会产生大量的啤酒废酵母， 因此对啤酒废酵母的回收利用，具有重大的现实意义。啤酒酵母胞内物质的提取主要是通过破坏细 胞壁或者改变细胞膜通透性的方法。传统的机械破壁法耗能大、效率低，化学提取法会影响蛋白质 的稳定性，酶自溶法会使蛋白质和核酸等物质水解成小分子而失去生物活性。本文采用高压脉冲电 场法( p e f ) 和超声波法提取，利用细胞电穿孔原理和空化机制，旨在找到一种新型的不破坏提取物生 物活性的方法。 首先研究确定了啤酒废酵母的预处理工艺，在此基础上研究了高压脉冲电场法提取啤酒废酵母 中蛋白质和核酸的工艺。结果表明，随着电场强度的加大、处理温度的提高、离子强度的增大、处 理时间和p e f 处理后静置时间的延长，蛋白质和核酸的提取率增加。当场强为3 0 k v c m ，温度为4 5 ， 处理时间为4 0 0 s 时，蛋白质渗出量达到4 0 4 m g m l ，提取率为3 3 6 ，此时核酸的溶出量为 0 3 8 m g m l ，提取率为2 5 4 。 研究了超声波法对提取啤酒废酵母中蛋白质和核酸的影响。采用变幅杆浸入式超声，在不同参 数、不同理化条件下处理啤酒废酵母。结果表明，随着超声功率的增大，处理时间的延长，处理温 度和离子强度的提高，蛋白质和核酸的提取率增加；当间歇比为3 ：4 ，5 0 0 w 功率超声作用6 m i n 时 蛋白质提取率为3 4 9 9 6 ，核酸提取率为2 7 5 ：体系p h 值在中性范围内时的提取效果最差。为进一 步提高提取率，可采用二次超声法，或结合振荡后处理工艺。 在p e f 提取的基础上比较了三种后处理工艺，结果发现，超声结合处理法在短时间内就可以使 提取率有比较明显的提高，因为利用超声波的一些次级效应，如机械振动、乳化、扩散、击碎、化 学效应和热效应等可以加速被提取成分的扩散释放，进一步提高待提取物的提取率。经i o o w 超声结 合处理l o m i n ，可使蛋白质提取率达到3 9 9 ，提高6 4 ，核酸提取率达到2 9 ，提高5 9 ；经3 0 0 w 超声结合处理6 m i n ，可使蛋白质提取率达到4 1 1 ，提高7 6 ，核酸提取率达到2 9 9 9 6 ，提高6 9 9 6 。 采用氨基酸自动分析、高效液相色谱等手段，对啤酒废酵母提取液进行分析测定。结果表明： 提取液中蛋白质大部分都以大分子状态存在，只有小部分是以氨基酸形式存在的。采用扫描电子显 微镜观察p e f 处理后的啤酒酵母细胞，可以直观地了解p e p 致细胞电穿孔现象。 关键词：啤酒废酵母，高压脉冲电场，超声波，蛋白质，核酸 a b s t ra c t a b s t r a c t b e e ry e a s t , ak i n do fs i n g l ec e l lm i c r o o r g a n i s m ，w h i c hc o n t a i n sa b u n d a n tp r o t e i n s ，n u c l e i ca c i d s ， c a r b o h y d r a t e sa n dm i n e r a l s ，i sa ni m p o r t a n tp r o t e i na n dn u c l e i ca c i ds o u r c e w i t ht h er a p i dd e v e l o p m e n to f b e e ri n d u s t r yi nc h i n a , t h e r ea r em o r ea n dm o r ew a s t eb e e ry e a s tp r o d u c e d i ti so fg r e a ts i g n i f i c a n c et o h a v et h ew a s t eb e e ry e a s tr e c y c l e d t h ew a yt oe x t r a c ti n t r a c e l l u l a rm a t e r i a l si sb yd e s t r o y i n gt h e ”a s tc e l l w a l lo rc h a n g i n gt h ec e l lm e m b r a n ep e r m e a b i l i t y s o m et r a d i t i o n a lm e t h o d sl i k em e c h a n i c a lb r e a k d o w n , a r ee n e r g y c o n s u m i n ga n dl o w - e f f i c i e n t c h e m i c a le x t r a c t i o nm a yc a u s et h ep r o t e i ns t a b i l i t yl o s t , a n d e n z y m a t i ca u t o l y s i sm a yd e p r i v et h eb i o l o g i c a la c t i v i t y p u l s e de l e c t r i cf i e l d sa n du l t r a s o n i cw a v ec o u l d b ee x p e c t e dt oe x t r a c tt h eu s e f u lc o m p o n e n t sf r o mb e e ry e a s tw i t h o u td e s t r o y i n gb i o l o g i c a la c t i v i t i e s p u l s e de l e c t r i cf i e l d s ( p e f ) w a sa p p l i e dt ow a s t eb e e ry e a s tt oi m p r o v et h ep e r m e a b i l i z a t i o no f m e m b r a n es oa st oe x t r a c tp r o t e i na n dn u c l e i ca c i d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h el i b e r a t i o no fp r o t e i na n d n u c l e i ca c i di n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s i n go ft h ee l e c t r i cf i e l d si n t e n s i t y ，t r e a t e dt e m p e r a t u r e ，i o n sc o n c e r t - t r a t i o n , p r o l o n g e dt r e a t m e n tt i m ea n dt h et i m ea f t e rp u l s a t i o n t h el i b e r a t e dq u a n t i t yo fp r o t e i na n dn u c l e i c a c i d sa c h i e v e d4 0 4 m g m la n d0 3 8m g m lr e s p e c t i v e l ya t3 0k v c me l e c t r i cf i e l di n t e n s i t y ，4 5 a n d 4 0 0 峭t r e a t m e n tt i m e t h ee x t r a c t i o nr a t eo fp r o t e i na n dn u c l e i ca c i da c h i e v e d3 3 6 a n d2 5 4 ， r e s p e c t i v e l y t h ea p p l i c a t i o no fu l t r a s o n i cw a v ef o re x t r a c t i n gp r o t e i na n dn u c l e i ca c i di nw a s t eb r e w e ry e a s tc e l l w a si n v e s t i g a t e d 。t h ew a s t eb r e w e ry e a s tw a sp r o c e s s e db yp r o b eu l t r a s o u n dw i t hd i f f e r e n tp a r a m e t e ra n d s y s t e mc o n d i t i o n s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h el i b e r a t i o no fp r o t e i na n dn u c l e i ca c i di n c r e a s e dw i 廿1t h e i n c r e a s i n go fu l t r a s o u n dp o w e r ，p r o l o n g e dt r e a t m e n tt i m e ，t r e a t e dt e m p e r a t u r ea n di o n sc o n c e n t r a t i o n i ti s a l s of o u n dt h a tt h ee x t r a c t i o nr a t ea c h i e v eb e s tw h e nt h ep u l s e - o nt op u l s e - o f fw a s3 ：4 ，b u tt h ee x t r a c t i o n w a sl o w e s tw h e np hw a sa r o u n d7 s o m es u b - e f f e c t s ，s u c ha sv i b r a t i o n , e m u l s i f i c a t i o n , d i f f u s i o n , c h e m i s t r ya n dt h e r m a le f f e c t , w e r ea b l e t oi m p r o v et h ee x t r a c t i o nr a t ef u r t h e ra r e rt h et r e a t m e n to fp e f t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee x t r a c t i o nr a t e o fp r o t e i na n dn u c l e i ca c i di n c r e a s e6 。4 a n d5 9 r e s p e c t i v e l yu n d e rt h et r e a t m e n to f1 0 0 wu l t r a s o u n d d u r i n g10 r a i na f t e rp e f ；t h ee x t r a c t i o nr a t eo fp r o t e i na n dn u c l e i ca c i di n c r e a s e 7 6 a n d6 9 r e s p e c t i v e l y u n d e rt h et r e a t m e n to f3 0 0 wu l t r a s o u n dd u r i n g6 m i na f t e rp e f a n a l y s i so f b e e ry e a s te x t r a c tc a nb ea c q u i r e db ya m i n oa c i da u t o m a t e da n a l y s i sa n di - i p l c t h er e s u l t s h o w e dt h a tm o s tp r o t e i ne x i s ti nm a c r o m o l e c u l e ，o n l ys m a l lp a r te x i s ti na m i n oa c i d w ec a no b s e r v e e l e c t r o p o r a t i o np h e n o m e n o nv i s u a l l yb ys e m k e yw o r d s ：w a s t eb e e ry e a s t , p u l s e de l e c t r i cf i e l d s ，u l t r a s o n i cw a v e ，p r o t e i n , n u c l e i ca c i d n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名： 兰： 鱼日期：2 一一7 年7 月加 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：窒：= 3 壁导师签名：确鹰重 日期：z 赡9 月。e i 第一章绪论 第一章：绪论 1 啤酒废酵母简介 啤酒废酵母是指在啤酒生产过程中，经主发酵和后发酵的酿造工序后，产生的泥状酵母，即酵母 泥。酵母泥除一部分留作下一批啤酒发酵接种之用外，大部分作为剩余的酵母泥而废弃。剩余的酵 母泥数量一般约为啤酒产量的2 3 。 酵母泥是由啤酒和酵母细胞组成的泥浆状混合物。啤酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 细胞的化 学组成有碳、氢、氧、氮和一些矿物质元素，由这些元素组成的细胞干物质中含9 0 9 7 的有机 物质和3 1 0 的无机成分。蛋白质是组成细胞质的基本物质，在细胞中多和其他物质结合在一 起，成为结合蛋白。细胞中核酸含量约占6 8 。啤酒酵母细胞内的碳水化合物，除少量以可溶性 单糖、双糖形式存在外，大多数以多糖形式存在。己糖是组成多糖的基本单位，又是能量的来源。 细胞中的多糖参与细胞结构，构成细胞壁等物质，如葡聚糖和甘露聚糖。脂肪是甘油和脂肪酸组成 的甘油三酸脂，在酵母细胞中作为储藏物质，以油滴状态出现。 酵母菌的形态常随菌种培养时间，培养基等条件的不同而不同。啤酒酵母呈圆形或卵圆形，大 小一般为( 3 - - - 7 ) r t m ( 5 l o ) v m ，啤酒酵母的结构主要有细胞壁、细胞膜、细胞核、细胞质、液泡、 线粒体等。其中细胞壁占细胞质量的3 0 ，壁厚1 0 0 - - - 2 0 0 n m 。细胞壁的组成有：约4 0 的葡聚 糖、4 0 的甘露聚糖、8 的蛋白质、7 的类脂、3 的无机物、2 的己糖胺和壳多糖：细胞膜为活 性细胞质膜，具有半渗透性，厚度约1 5 0 h m ，构成物质主要为类脂、磷脂、蛋白质、淄醇等；细胞 核的直径为0 5 1 5 1 a m ，细胞核外部覆以双层核膜，核内有月牙状的核仁，双倍体细胞含有1 7 对 染色体。啤酒酵母的繁殖分无性繁殖和有性繁殖两种，在正常营养状态下，都以无性繁殖进行。 2 啤酒废酵母的营养功能 啤酒酵母是一种单细胞微生物，细胞呈圆形或卵圆形，胞内含有丰富的蛋白质、核酸、维生 素、碳水化合物、脂肪、粗纤维、矿物质等多种营养成分耵，干燥酵母的具体营养成分见表卜l 。 表卜1啤酒干酵母营养成分脚( m lo o g ) 干啤酒酵母中蛋白质含量高达5 0 ，含有1 8 种氨基酸，其中人体必需的8 种氨基酸含量及氨 基酸的组成比例接近联合国粮农组织( f a o ) 推荐的理想氨基酸的比例( 见表1 - 2 ) ，具有较重要 的氨基酸药理作用。尤其是谷类食物中的第一限制氨基酸赖氨酸，啤酒酵母中含量特别丰富。因 而，啤酒酵母蛋白食品可以改善人类的营养均衡。此外，啤酒酵母蛋白的营养价值也相当高，蛋白 质的营养一般可以采用生物价和可消化率来评价腩1 ( 见表1 3 ) ，由表1 3 可以看出啤酒酵母蛋白质的 营养价值接近动物蛋白，略高于植物蛋白。由此可见，开发啤酒酵母蛋白食品有可能成为继s c p 之后的新的食用蛋白领域。 表卜2 啤酒干酵母与理想蛋白含人体必需氨基酸对比( m g l o o g ) 江南大学硕士学位论文 表1 - 3 干啤酒酵母蛋白与动植物蛋白营养价值比较 干啤酒酵母含有2 5 3 0 的酵母多糖，主要是葡聚糖和甘露聚糖( m o s ) 。酵母葡聚糖是一种十 分有效的免疫细胞活性促进剂，具有抗肿瘤拍1 、促进和激活人体免疫力等作用h 咱1 ，因而被称为是 “生化反应修饰物”( b r f ) 。另外。葡聚糖是低热量食品，不易消化陋1 0 1 ，因而可以减少血糖含 量，预防糖尿病。甘露聚糖可以防止病源菌在肠道里定殖，促进有益微生物群的增殖，减少肠道疾 病，也可以作为免疫刺激因子，提高人体免疫力“。 啤酒酵母中维生素含量相当丰富，尤其是b 族维生素u 别( 见表1 - 4 ) ，并且啤酒酵母中的b 族维 生素一般都以磷酸酯类形式存在，易被人体吸收。啤酒酵母中还含有烟酸、叶酸、泛酸等生理活性 物质( 见表1 5 ) ，其中麦甾醇是其他食物中含量比较贫乏的，但又是人体所必需的。麦甾醇受紫外线 照射后会转化为维生素d ，而维生素d 对骨骼的形成极为重要，因此，啤酒酵母经紫外线照射以 后，可以制成强化补钙片。 表卜4 啤酒酵母中b 族维生素含量 表1 - 5 啤酒干酵母中维生素及生理活性物质含量 成分 含量( m g 1 0 0 9 ) 成分 含量( m g 1 0 0 9 ) 核黄素 硫胺素 麦角甾醇 肌醇 3 2 5 1 2 9 1 2 6 0 3 9 1 0 菸酸 泛酸 叶酸 生物素 4 1 7 1 8 9 o 9 9 2 9 v 2 7 3嘌呤( ) 0 5 9 啤酒酵母中矿物质的含量也相当丰富u 副( 见表1 6 ) ，并且还可以富集，如在啤酒发酵中，添加 一定量的铁盐，锌盐，可以促进啤酒酵母生长，而对啤酒酵母的各种理化指标没有影响，啤酒酵母 的铁、锌含量却大大提高u 引。啤酒酵母中富含天然的有机铬，能明显地改善葡萄糖耐量，提高胰岛 素的效率u 副。另外硒在啤酒酵母中很易富集，它可以预防克山病、大骨节病、心血管病及某些癌症 等。因此，啤酒酵母在缺硒地区的应用值得研究。 2 第一章绪论 表卜6 啤酒酵母中部分矿物质含量n 耵 啤酒酵母中含有丰富的核糖核酸( r n a ) ，主要存在于细胞质内，含量可达4 5 8 3 。核酸和 核苷类药物具有扩张末端血管，增加血红蛋白的浓度，增加红血球数、白血球数，减轻浮肿和抗病毒 等作用。啤酒酵母中核酸体系的分布见表1 7 。此外，酵母细胞中还含有谷胱甘肽，它是一种生物 活性三肽，对于维持生物体内适宜的氧化还原环境起着至关重要的作用，被称为长寿因子和抗衰老 因子，还可用于肝脏疾病和肿瘤、癌症的治疗“7 1 。 表1 - 7 干啤酒酵母中核酸的含量n 阳 3 啤酒废酵母的利用价值与现状 近年来，我国啤酒工业发展迅速，总产量每年以1 0 的速度递增，2 0 0 5 年达到了3 0 6 1 万吨。 而每生产1 0 0 吨啤酒就可得到含水分7 5 8 0 的啤酒酵母泥1 5 吨u 纠，因此仅2 0 0 5 年就可得到的啤 酒酵母泥约为4 6 万吨。酵母泥是由啤酒和酵母细胞组成的泥浆状混合物，营养成分十分丰富，含有 各种氨基酸，维生素，矿物质和食物纤维。以前由于没有合适的处理方法，除一部分留作下一批啤 酒发酵接种之用外，大部分作为剩余的酵母泥而废弃，不但浪费了宝贵的资源，还因其丰富的营养 增加了排水的b o d 负荷。对啤酒废酵母的利用既可以为啤酒厂创造良好的经济效益，提高入世后 的企业竞争力，也有利于社会的环境保护。在大力提倡发展循环经济的今天，啤酒废酵母的回收利 用，更具有重大的现实意义幢训。 3 1 啤酒废酵母在在食品工业中的应用 啤酒酵母由于所含氨基酸、维生素和矿物质等营养成分比较丰富，因而在食品行业具有广阔的 应用前景。 3 1 1 制备酵母抽提物 酵母抽提物( y e a s te x t r a c t ) 又叫酵母味素、酵母精、酵母浸膏，是以食用酵母为原料，利用现 代生物技术将酵母菌体内的蛋白质、核酸类物质进行降解，再经过一些精制工序得到的粉状、膏状 或液体状的产品，具有强烈的呈味性能。酵母抽提物是一种天然的高级调味品，是继味精( m s g ) 、 水解蛋f l ( h v p 、h a p ) 和呈味核苷酸( i + g ) 之后的第4 代调味料。据董家武等人报道，它含有肽 类化合物、人体所需的1 8 种氨基酸、多种核苷酸、糖分、b 族维生素、麦角甾醇、各种微量元素 等，不含胆固醇及饱和脂肪酸，同时还具有营养、辅助医疗的作用瞳川。现已形成了多种较为成熟的 工艺来生产酵母抽提物，由于科技新成果的不断推出及各生产单位生产规模及条件的限制，在国内 外生产酵母抽提物工艺上目前还没有一个统的固定模式。但主要采用自溶法生产，其工艺流程 3 江南大学硕士学位论文 为：啤酒废酵母预处理一自溶一浓缩一调配一成品。陈洁等人别研究了机械破壁、p h 值以及麦芽 根核酸酶对啤酒酵母自溶作用过程的影响，得出均质破壁能显著提高自溶速率及酵母抽提物中蛋白 质和核苷酸的含量，麦芽根核酸酶的加入有效地提高了酵母抽提物中5 核苷酸含量，啤酒废酵母 经预处理后，加入一定量的核酸酶，在4 0 m p a 下均质3 次，然后升温到5 5 ，自溶3 0 h 得到酵母 抽提物中5 一核苷酸，含量高达6 3 7 m g g 。 3 1 2 生产胞壁多糖 酵母细胞壁由8 5 - - 9 0 的碳水化合物及1 0 1 5 的蛋白质组成，约一半的碳水化合物主要 为葡聚糖和甘露聚糖，细胞壁中还含有大量甘露糖蛋白比驯。葡聚糖和甘露聚糖在人的消化道中难以 被消化，可作为膳食纤维发挥作用，根据c a r i c d 等人的报道，还具有增强细胞免疫力、提高巨噬 细胞活性及治癌等功效。国内刘煨新幢刮等采用酵母自溶与机械破碎相结合的方法提取胞壁多糖，使 得胞壁多糖得率达到1 0 ，纯度达8 3 。其提取工艺为：酵母沉淀一自溶一机械破碎一碱溶一中和 一沉淀一洗涤一分离一烘干。张玉香、尹卓容幢引用酶法从啤酒酵母中提取的甘露糖蛋白，经乙醇沉 淀和层析提纯，样品中含多糖8 8 ，含蛋白质1 2 ，薄层层析表明单糖组分中只有甘露糖。 3 1 3 生产食用酵母蛋白质 随着世界人口的快速增长，食物缺乏日益显著，尤其是蛋白质食品出现短缺。研究者们在寻求其 它新型的蛋白质食品资源，开拓了从含蛋白质的微生物中获取蛋白质的新领域一单细胞蛋白的生产 幅刮( 简称s c p ) 。目前，在澳大利亚啤酒废酵母主要用来制备酵母蛋白幢利。 3 1 4 生产营养调味品 利用啤酒废酵母可以生产富含多种氨基酸、多肽、呈味核苷酸、维生素、多种微量元素的调味 品，产品不仅滋味鲜美，而且营养丰富，是当今市场较流行的集调味、营养功能于一体的天然食 品。目前，国内利用啤酒废酵母生产营养酱油，方法有两种u 刖：一种是利用废酵母自溶液和豆粕按 一定比例发酵而成；另一种是将废酵母自溶液和不同鲜味剂调配而成。 3 。1 5 其他 在食品中还有利用啤酒酵母作培养基的主要成份，加入双岐因子经发酵生产双歧酵母保健食 品。曹凯光等人报道利用啤酒酵母取代可可粉口引，并用之加工巧克力和可可饮料，结果表明，其效 果与天然可可粉类同。最近又有席平等人的报道，酵母抽提物各组分和转移因子比较，不仅有相似 活性而且作用更强。将超滤液和截留液分别配制成功能饮料，两种饮料淡黄色，清亮，无沉淀、无酵 母味，味甜美矧。 3 2 啤酒废酵母在生物制药工业中的应用 啤酒酵母由于含有多种氨基酸、核酸、维生素、酶类和其他生物活性物质，因而在生物制药行 业中具有广阔的开发前景。目前，主要用于药用干酵母、核酸及其衍生物、果糖二磷酸钠、谷胱苷 肽、辅酶a 、b 族维生素等产品的生产和开发。 3 z 1 制取药用干酵母 药用干酵母已成功用于医疗预防，其药理作用是帮助消化，提供蛋白质、维生素等营养。目前 国内的生产工艺为：酵母泥一洗涤一脱苦一过滤一喷雾干燥一酵母粉调配一成品。 3 2 2 提取s o d s o d ( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ) 是超氧化物歧化酶的简称。作为功能性食品基料的s o d ，在食 品、医药、化妆品等行业愈来愈成为市场的抢手货，需求量大，经济效益显著。目前仅从牲畜动物 血液中提取，受到原料来源限制，且质量不稳定。从啤酒废酵母泥中提取开发s o d ，是一条利国 利民的好路子。明景熙口u 采用不同工艺流程提取s o d ，结果表明，萃取离心法提取s o d 回收率达 到7 3 ，纯化倍数达9 6 倍。 3 2 3 生产1 ，6 一二磷酸果糖 1 ，6 - - - 磷酸果糖又称f d p ，对休克、急性心肌梗塞和心肌缺血等症状具有良好疗效，是临床 上广泛应用的心血管特效药。使用啤酒废酵母生产f d p 具有一定的社会和经济价值。目前国内的 生产工艺流程为：啤酒废酵母一粗滤一反复水洗一离心分离一干净啤酒废酵母一培养、发酵一灭酶 一分离一发酵液一提取f d p 。据李祥等人m 1 研究发现发酵液中m g c l ：的浓度、p h 值是1 , 6 二磷酸果 糖最主要的影响因素。最佳发酵参数为发酵温度3 7 ，葡萄糖浓度0 4 m o l l ，p h 6 5 ，有机溶剂的添 加量约6 。发酵液中1 ，6 二磷酸果糖的量最高可达7 0 5 m g m l 。 ， 3 2 4 提取核酸、核苷酸、核苷类药物嘲 啤酒酵母中含有丰富的核糖核酸( r n a ) ，主要存在于细胞质内，提取的核酸又可降解生成核苷酸， 核苷酸可脱去磷酸根生成核苷。所以可以利用啤酒酵母作为提取核酸、核苷酸、核苷的原料。据毛 宁等人报道，核酸和核苷类药物具有扩张末端血管，增加血红蛋白的浓度，增加红血球数、白血球数， 4 第一章绪论 减轻浮肿和抗病毒等作用。核糖核酸在医学上可作为生产治疗癌症、脑震荡、肝炎、带状疱疹、冠 心病、病毒性疾病药物的原料；在农业上核酸及水解物可促进植物生长、结果，是不可多得的生长 素。 目前国内用啤酒废酵母提取r n a 的方法很多。如自溶法、酶法、盐热法、碱法等。但广泛应 用于工业化生产的是稀碱法和浓盐法。一般工艺流程为：啤酒废酵母一盐处理( 碱处理) 一菌体分 离一清液提取r n a 一过滤一干燥一成品1 。马文峰口驯研究发现，用浓盐法提取r n a ，如果控制好 盐浓度、加热温度、絮凝剂用量等条件，可使r n a 得率达到8 0 ，纯度达9 0 以上。卞菁等人m 】 在8 5 ，酵母浓度1 0 ，盐浓度1 0 条件下，提取5 h ，得到r n a 干品，纯度达到6 9 ，净得率 达1 7 8 。国外l e e j o n g $ o o 等人采用自溶方法使酵母细胞内的核糖核酸释放出来，在6 0 ， p h 7 0 的条件下自溶6 h ，磷酸嘌呤核苷酸( l m p ) 达到6 2 m g g ，磷酸鸟苷酸( g m p ) 达到 3 5 5 m g g ，腺核苷酸最佳产生条件为6 0 ，p h 6 5 ，自溶6 h 。 3 2 5 提取谷胱苷肽 谷胱苷肽具有清除自由基、解毒、促进铁质吸收及维持红细胞免疫等多种生理功能，临床用于 中毒性肝炎和感染性肝炎治疗、有机物及重金属的解毒、癌症辐射和化疗的保护、抑制白内障以及 角膜与视网膜疾病的改善，及广泛用于食品及化妆品工业等。h l i u 等人啪1 研究发现可在溶剂中添 加l 一蛋氨酸作为产生谷胱苷肽的引物，当啤酒废酵母的浓度达到3 0 9 l 时，葡萄糖和l 一蛋氨酸的 浓度分别为3 0 9 l 和1 0 9 l ，谷胱苷肽量达到1 3 1 8 m g g 。 3 2 6 制取碱不溶性葡聚糖删 啤酒酵母细胞壁所含的葡聚糖分为碱不溶性、碱溶性、酸溶性3 种。其中碱不溶性葡聚糖能增 强免疫力，有抗癌、抗病毒、降低血脂等功能。利用啤酒厂排弃的废酵母，采用碱制各法或酶一碱制 各2 种方法，可生产出白色粉末状的瞰1 3 ) d 葡聚糖。国内的生产工艺为：酵母泥一洗涤、脱色一 加蛋白酶处理、离心一加碱处理、离心一碱处理、离心一酸处理、离心一沉淀物用乙醇脱水一干燥 一成品。李花霞等人m 3 以啤酒废酵母为原料，结合自溶、酶解和碱溶等方法优化碱不溶性葡聚糖的 制各条件，结果表明：采用1 0 m o l l 的n a o h 碱溶处理啤酒废酵母7 5 h 效果较好，成品不含甘露 聚糖，碱不溶性葡聚糖得率为9 5 9 。张开诚h 采用超声波法提取酵母葡聚糖，发现得到的产品主 要为( 1 3 ) p d 葡聚糖，产品得率达3 0 ，与酸碱法、酶一酸碱法相比具有工艺简便、成本低廉、没 有酸碱废水排放、对环境污染较少等优点。f r e m u n ds t e f a n 等人1 也发现以往的热碱、热酸方法提 取酵母中的葡聚糖不仅会降低其生物活性，而且产率也不高，而采用酶法提取( 1 3 ) b - d 葡聚糖可 使纯度高达9 2 ，产量达到8 7 ，而且产品的生物活性没有受到影响。 3 2 7 从酵母细胞中提取凝血质、麦甾醇和卵磷脂 酵母细胞中含有大量的凝血质，凝血质通过凝血酶的作用使人体或动物血浆内可溶性的纤维蛋 白元变成不可溶的纤维蛋白，从而达到凝血。据华炳生报道，从酵母中提取凝血质工艺简便，安全性 高，是凝血药品的理想资源h 驯。麦甾醇即维生素d 前体，工业生产麦甾醇主要是从酵母细胞中提 取。据莫湘筠等人报道，在工业生产中，培养基中含氮增加时，酵母细胞麦甾醇积累量减少；培养达 1 6 h 时，含量达最高峰；鲜酵母经5 0 - 一5 5 水溶液中自溶1 2 h ，麦甾醇可增加2 0 。啤酒酵母由于 本身富含麦甾醇，所以它是生产麦甾醇的较好原料。啤酒酵母在提取上述两物质同时，还可以得到酵 母卵磷脂、酵母海藻糖和多种氨基酸成分- 。 3 2 8 其它 由于酵母细胞中含有2 的b 族维生素，所以还可用酵母细胞提取维生素、细胞色素c 。据 s u p h a n t h a r i k a 等人报道，在提取细胞色素c 的同时，还可以得到辅酶a 、酵母多糖和核糖核酸等多 种产品别。另外酵母是微量元素的载体，它能大量吸收和同化微量矿物质元素，并将其转化成有机形 态，成为容易被人体所利用的微量矿物质元素。在啤酒废酵母的利用领域中，日本的研究者们做了大 量的工作，处于领先地位。中国人也做出了一定的成绩。欧美各国在此领域中的报道较少，详细情况 见表卜8 ： 5 江南大学硕士学位论文 表1 - 8各国啤酒酵母利用情况一览表 国家 啤酒废酵母的利用方式 * 壬i i 时 啤酒酵母进行水解，水解产物作为一种酱色的 “ 着色剂，成为食品中的风味香料。 西班牙h 刀主要利用特殊设备尽可能回收酵母泥中的啤酒 佃萃墨i i 柚】 从啤酒酵母中分离c u ，z n ，s o d 基因，通过改变 1 11 。 物种品系，提高s o d 产量。 兰囝 利用发酵废液，8 0 度糖度的浓缩废糖浆通过适当稀 一9 释加入酵母生长素及酶，将这种糖浆转化为酒精。 澳大利亚利用酵母提取物制备酵母蛋白。 日本进行了酵母制备甘露糖、葡萄糖、海藻糖的研究。 中国 主要生产饲料添加剂，调味品及生产核酸。 3 3 啤酒废酵母在饲料行业中的应用 3 3 1 生产蛋白饲料添加剂 我国是一个饲料缺乏大国，尤其是高蛋白精饲料严重缺乏，每年花大量外汇从国外进口鱼粉和饲 料酵母。国家的“九五计划”中，将开发蛋白饲料添加剂作为重点布置，所以用啤酒废酵母生产蛋 白饲料一举两得。目前的生产工艺为嵋剖：以啤酒糟为主要原料，采用曲霉和酵母混合发酵技术，使微 生物体内的各种酶系协同作用。首先是曲霉将啤酒糟中禽畜不易消化吸收的成分转化成单糖和各种 氨基酸，然后酵母菌利用以上的糖类和氨基酸合成营养价值高、适口性好的蛋白饲料。从而大幅度 提高啤酒糟的蛋白质含量，降低粗纤维含量，改善了啤酒糟的品质，增加了饲料的利用率和消化 率。其粗蛋白的质量分数为6 3 ( 是未发酵啤酒糟的2 倍) ，粗纤维质量分数为8 7 2 ( 低于未发酵啤 酒糟的1 2 ) ，还富含多种消化酶、维生素及钙、磷。通过喂养试验证明，该饲料可以代替豆粕喂养生 长育肥猪，比豆粕对照组多盈利2 8 4 5 元头。这种饲料不仅可用于牛、马、羊等牲畜，还可用于 猪和鸡等畜禽，大大提高了啤酒糟的饲用价值，同时也可以减少环境污染。 3 3 2 生产混合饲料 将酵母泥、糖化废麦糟、过酒后的废硅藻土分别压滤、干燥，再加入制麦所得废麦根进行混合 粉碎，可制得颗粒混合饲料，产品广泛适用于饲养业，国内的生产工艺过程如下u ：酵母泥( 麦糟、 硅藻土) 一压滤一干燥一混合、粉碎一制粒一成品。一个年产1 2 万吨啤酒、1 6 万吨麦芽的啤酒 厂，每年可生产8 0 0 吨混合饲料，可创产值1 1 2 0 万元年，获利润5 0 0 万元以上。 4 啤酒废酵母中营养物的提取方法 4 1 啤酒酵母细胞壁 酵母细胞壁的厚度随种系、年龄、营养条件而异，大约7 0 r i m 到2 0 0 n m 之间，占细胞干重的 3 0 左右。这类细胞壁，主要由d 葡萄糖和d 甘露聚糖两类多糖所组成，含有少量蛋白质、脂质 和矿质。一般来讲，酵母细胞壁中的d 甘露聚糖，主要是p d ( 1 一3 ) 结合的，但有些酵母也具有 a d ( 1 _ + 3 ) 结合的单位。在叶d - ( 1 _ 3 ) 结合的d 甘露聚糖中，有些糖残基的c - 6 上连接高度分支的 甘露聚糖，此甘露聚糖具有a d ( 1 6 ) 结合的骨架，几乎每个甘露聚糖残基又再分支，通常是a d ( 1 _ 2 ) 和- d - ( 1 _ 3 ) 结合。通常d - 甘露聚糖处在细胞壁的最内层，d 一甘露聚糖存在于酵母细胞壁的 表面，同蛋白质和磷酸酯连在一起，形成磷酸甘露聚糖一蛋白质大分子瞄。酵母细胞壁结构坚韧 哺，像三明治外层为甘露聚糖( m a n n a n ) ，内层为葡聚糖( g l u c a n ) ，他们都是复杂的分枝状聚合 物，中间夹有一层蛋白质分子。 4 2 改变细胞壁通透性的方法 啤酒酵母细胞壁较厚，内部的结合与连接方式很复杂，所以很难破除，必须使用外力使之破坏 或分解。总的划分有以下大几类： 4 2 1 化学处理法破壁技术 4 2 1 1 表面活性剂处理法：酵母细胞壁含有5 1 0 的蛋白质，加入表面活性剂可以作用 于与膜结合的蛋白质，形成胶束而溶解膜，使得细胞破碎。但是需要合适的表面活性剂浓度，而且 要在适宜的p h 值、离子强度和温度下才能有效地破碎细胞。十二烷基硫酸钠( s d s ) 是较有效的菌体 破壁剂，据钟静芬等人的研究表明用s d s 处理细胞，细胞内蛋白质释放率最高达到8 崎3 1 。 6 第一章绪论 4 2 1 2 溶剂处理法：利用一些无机或有机化学试剂溶解酵母细胞壁和膜上的表面结构，使酵 母胞内物质外流。传统的水解工艺就是化学处理法之一。它是从干燥的酵母开始，将啤酒酵母重新 制成浆液( 6 5 8 5 的固形物) 。用6 m o f l 盐酸化后在清洁的薄膜蒸发器中，于1 0 0 - 1 2 0 条件下进行 水解。除盐酸处理外，常用的化学试剂有：氢氧化钠，乙醇，草酸，柠檬酸，尿素，甲醇，丙酮 等。如：韩刚凸4 1 研究发现，氮酮对生物膜类脂具有特异性溶解作用，使酵母菌细胞内膜类脂流动性 增强，可促进酵母菌体内蛋白质释放；明景熙哺副认为在从啤酒酵母中提取s o d ( 超氧化物歧化酶) 时，用异丙醇破壁效果最好。 4 2 2 机械法破壁 4 2 2 1 高压均质法：高压均质机是一种有效的微生物细胞破碎机。它是利用流体高速流动 时，在均质机头的隙缝处，产生强烈的剪切作用而使细胞破碎的。使用均质机操作时，可按对细胞 的破裂要求，反复循环操作数次。在我国，小型的工业均质机，其生产能力为6 - 7 k g , h r 可溶性细胞 蛋白，细胞的破碎率可达6 0 ，较大规格的均质机，流量可达2 5 0 l h 。为了保护胞内酶的活性， 操作中应事先将细胞料桨冷却至4 c ( 或直接以细胞悬浮液投料) ，以防剪切发热而使酶蛋白变性。 4 2 2 2 挤压法：该法是用低温挤压机( 2 5 左右) ，将含有冰晶的细胞从小孔挤出，借挤出机 的剪切作用而使细胞破裂。据曾俊华的研究报道，啤酒酵母经一次挤出，可使其中9 0 的细胞破 碎。该机每小时可处理1 0 蜒酵母细胞。该法比较适合于热敏性胞内物的提取。 4 2 2 3 研磨法：利用研钵、石磨、球磨、珠磨机等研磨器械所产生的剪切力将细胞破碎。使用 时常将细胞悬浮液与研磨剂一起研磨，利用研磨剂与研磨剂和酵母细胞之间的互相剪切、碰撞，促 使细胞壁破裂，释放出内容物。研磨法虽然有利于破壁，在合适条件下一次操作就可以达到较高的 破碎率。但是料液损失严重。曾俊华哺驯在从酵母中提取腺苷蛋氨酸时，曾用液氮研磨酵母细胞壁来 达到破壁的效果，破壁率达到8 0 ；姚洪文“对酵母细胞破碎技术进行了实验比较后，认为纳米级 微生物细胞破碎机是理想的细胞破碎工具。 4 2 3 酶法破壁悔卜删 这是在酵母自身含有的酶以外，再另行加酶进行分解的方法。根据破坏部位不同，添加相应的酶。 4 2 3 1 外加葡聚糖酶进行破壁：鉴于酵母的细胞壁中有大量的葡聚糖成分，葡聚糖对支持酵 母细胞壁的结构有着举足轻重的作用。因此，人们在破碎细胞壁时常加入葡聚糖酶来破坏细胞壁。 但是仅加入葡聚糖酶破壁效果并不是很好，因此加酶常常结合其它破壁方法使用。 4 2 3 2 外加蛋白酶破壁法：利用酶的水解作用，在进行细胞破壁时也可以添加蛋白酶来水解 细胞壁的蛋白质层，加快细胞壁的破解。杨翠竹等人研究证明只添加蛋白酶破壁效果不是很理想， 实际应用中蛋白酶常常和其它破壁方法混合使用。一般来讲酶法破碎酵母细胞时，需要先加入蛋白 酶作用蛋白质一甘露聚糖结构，再加入葡聚糖酶作用于葡聚糖层。最后改变渗透压使细胞膜破裂， 胞内物质溶出。晏志云m 1 为了提高从酵母中提取氨基氮的量使用外加蛋白酶对酵母破壁取得了较好 的效果。 4 2 3 3 破坏甘露聚糖层：甘露糖酶可以专一地水解细胞壁上的甘露糖，使得细胞壁的结构破 坏。很多酵母破壁复合酶中就含有甘露聚糖酶。 4 2 3 4 复合酶破壁法：在人们外加一些酶来促进酵母壁溶解时，由于酶解专一性的限制，所 以常用复合酶。赵郁哺在从酵母制各氨基酸时曾用蜗牛酶与蛋白酶联用进行细胞破壁。张晓明副认 为酵母破壁预处理技术能显著地加速酵母水解过程中蛋白质的溶出；并且发现酵母受到外加蛋白酶 和葡聚糖酶的相继处理后可加速自溶。廖鲜艳副从啤酒废酵母中提取蛋白质时曾用复合酶进行破壁 处理，取得了较好的效果。 4 2 4 自溶破壁叶”1 这是利用酵母菌体本身含有的各种酶( 各种蛋白酶、葡聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶等) 的综合作 用分解细胞壁的方法。自溶一般分为诱导自溶和自然自溶。采用各种物理、化学或生物学方法处 理，可引起微生物在任何阶段产生自溶，称为诱导自溶；非人为因素引起的自溶则为自然自溶。根 据起主要作用的自溶酶类及自溶发生的主要部位，又可将自溶过程分为两种：一种是外自溶型，起 主要作用的自溶酶类是细胞内的胞壁质酶，使细胞壁中的肽葡聚糖类降解，其自溶部位主要是细胞 壁，很少涉及其它细胞成分；第二种是内自溶型，起主要作用酶类为蛋白酶，生物膜首先被破坏， 产生细胞内部结构的水解，酵母菌以此方式自溶。当酵母置于合适的p h 缓冲液中，加热( 通常是 4 0 6 0 ) 到储藏的碳水化合物( 主要是糖原) 开始自动发酵的温度时，胞内各种酶系( 主要是蛋白酶) 被激活，作用于酵母的细胞壁与细胞膜，生物膜首先被破坏，使细胞膜渐渐失去它的选择性，使得 原来有序的结构变得混乱无序直至瓦解，释放出胞内物质。据汤务霞m 报道以食盐为啤酒酵母自溶 7 江南大学硕士学位论文 促进剂的最佳作用条件是：啤酒酵母悬浮液浓度为1 0 ，在p h 5 0 、温度5 0 、食盐浓度3 ( w w ) 下，自溶4 0 h ，所得酵母抽提液氨基氮含量为0 4 9 8 9 l o o m l ，得率4 7 5 0 ，风味非常醇厚。 在酵母自溶过程中导致生物大分子降解的自溶酶类主要是水解酶类：蛋白酶、核酸酶和葡萄糖 酶。经m a d d o x a s 和j s h o u g h 的报道，到目前为止，啤酒酵母中已鉴定出4 0 多种蛋白水解酶， 但是其中只有几种是对自溶过程有重要作用的。现已发现并从酵母细胞自溶物中得到四种蛋白酶 a 、b 、c 、d ( 见表1 1 0 ) 表卜1 0 酵母细胞内主要的蛋白水解酶删 4 2 5 其它破壁技术： 4 。2 5 1 高压匀浆法：高压匀浆法( h i 曲p r e s s u r eh o m o g e n i z a t i o n ) 所用设备是利用高压匀浆机，其 原理是由于突然减压和高速冲撞使