（发酵工程专业论文）通过发酵策略及诱变选育来提高谷氨酰胺转胺酶酶活.pdf

摘要 摘要 微生物谷氨酰胺转胺酶( m i c r o b i a lt r a n s g 【u t a m i n a s e ，简称m t g ，e c2 3 2 13 ) 能催化 多种蛋白质分子问、分子内的酰基转移反应，改善各种蛋白质的功能性质，在食品、化 妆品、制药等工业领域具有广阔的应用前景。 本研究以提高吸水链霉菌( s t r e p t o m y c e sh y g r o s c o p i c u s ) w s h 0 3 1 3 发酵产谷氨酰胺转 胺酶的产量为目标，分别研究了吸水链霉菌的高密度培养和溶氧浓度对发酵过程的影响 并通过不同的诱变手段来筛选高酶活的菌株。主要内容如下： 1 对吸水链霉菌的高密度培养进行了研究。通过考察不同初始葡萄糖浓度下的分批发 酵，确定了最佳初始葡萄糖浓度为1 0 l 。通过比较了不同的流加速率，确定在8 1 6 h 采用较高的的比生长速率( o 1 5h o ) ，后期降低比生长速率( o 1 0h - i ) 这种较优的葡萄 糖流加速率组合可以获得较高的菌体量。 2 考察了添加氮源对s t r e p t o m y c e sh y g r o s c o p i c u s 发酵产酶的影响。在菌体生长到最大 值后添加氮源，促进产酶。实验结果表明，添加5 0 l 的豆饼粉酶活最高可达到5 7 9 u m l 。 3 在3l 罐中考察了不同的溶氧浓度对谷氨酰胺转胺酶分批发酵的影响，确定了在o - - 2 0h 保持3 0 的溶氧浓度，通气量1 2 5 v v m ；2 0h 后保持1 0 的溶氧浓度，通气 量1 2 5 v v m 的条件来进行发酵，最终酶活可达到5 8 8u m l ，实现了谷氨酰胺转胺酶 的高产量、高生产强度的统一。 4 采用n + 注入、紫外照射等常规诱变手段，并筛选抗2 脱氧一d 葡萄糖 ( 2 d e o x y - d g l u c o s e ，2 - d g ) 突变株。由此分离纯化获得的高产菌株d g 1 具有抗葡萄 糖代谢阻遏的能力。最高酶活可达n 8 1 9u m l ，比出发菌株提高了9 6 。 关键词：吸水链霉菌，谷氨酰胺转胺酶，指数流加，溶氧浓度，诱变，2 脱氧d 一葡萄糖 a b s t r a c t a b s t r a c t m i c r o b i a l t r a n s g l u t a m i n a s e ( m t g ；p r o t e i n - g l u t a m i n e7 - g l u t a m y l t r a n s f e r a s e ，e c 2 3 2 13 ) i sar e c e n t l yd e v e l o p e de n z y m ea n di sc a p a b l eo fc a t a l y z i n ga c y lt r a n s f e rr e a c t i o n s ， w h i c hi n t r o d u c e sc o v a l e n tc r o s s l i n k sb e t w e e np r o t e i n s ，p e p t i d e sa n dv a r i o u sp r i m a r ya m i n e s s oi th a sp o t e n t i a la p p l i c a t i o ni nf o o dp r o c e s s i n g ，c o s m e t i c ，p h a r m a c ya n do t h e ri n d u s t r i e s t h i ss t u d yi sm a i n l ya i m e da te n h a n c i n gt h ep r o d u c t i o no fm i c r o b i a lt r a n s g lu t a m i n a s e ( m t g ) b ys t r e p t o m y c e sh y g r o s c o p i c u s t h er e l a t i v e l yh i g hc e l l d e n s i t yc u l t u r ew a s i n v e s g a t e d t h ee f f e c to fd oc o n c e n t r a t i o na n dt h ee f f e c to fm u t a g e n e s i so fs t r e p t o m y c e s h y g r o s c o p i c u sw e r er e s e a r c h e d ，r e s p e c t i v e l y t h ef o l l o w i n gr e s e a r c h e sh a v e b e e nd o n e ： 1 t h er e l a t i v e l yh i g hc e l ld e n s i t yc u l t u r eo fs t r e p t o m y c e sh y g r o s c o p i c u sw a si n v e s t i g a t e d ， t h eo p t i m i z e di n i t i a lc o n c e n t r a t i o no fg l u c o s ew a s10g l t h ee f f e c t so fe x p o n e n t i a l f e e d i n go fg l u c o s ea n dt h ea d d i t i o no fn i t r o g e ns o u r c eo nm t gp r o d u c t i o nw e r e i n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tk e e p i n gah i g hs p e c i f i cg r o w t hr a t e ( 0 15h - i ) i n8 16 ha n dar e l a t i v el o w s p e c i f i cg r o w t hr a t e ( o 10h - 1 ) d u r i n gl a t e rt i m ec o u l do b t a i nh i g h c e l l d e n s i t y e f f e c to fn i t r o g e ns o u r c e sa d d i t i o no nm t gf e r m e n t a t i o nb ys t r e p t o m y c e sh y g r o s c o p i c u s w a si n v e s t i g a t e d n i t r o g e ns o u r c e sw e r ea d d e du n t i lt h ee n do fc e l l sg r o w i n g t h er e s u l t s s h o w e dt h a tm t g a c t i v i t yr e a c h e d5 7 9u m lb ya d d i n g5 0g ls o y b e a n t h ee f f e c to fd i s s o l v e do x y g e n ( d o ) c o n c e n t r a t i o no nt h eb a t c hp r o d u c t i o no fm t gi na3 ls t i r r e df e r m e n t o rb ys t r e p t o m y c e sh y g r o s c o p i c u sw a ss t u d i e d i tw a sf o u h dt h a tk e e pt h e d oa t3 0 d u r i n go 一2 0h ，a n d10 d u r i n gl a t e rt i m e ，t h ea i rf l o wr a t ew a sc o n t r o l l e da t 1 2 5v v l t ia l lt h et i m ei nt h ef e r m e n t a t i o np r o c e s s ，t h ef i n a lm t g a c t i v i t yr e a c h e d5 8 8 u m la c h i e v i n gt h eu n i f i c a t i o no f h i g hm t gy i e l da n dh i g hp r o d u c t i v i t y s t r e p t o m y c e sh y g r o s c o p i c u c c t c cm 2 0 3 0 6 2w a s m u t a g e n i z e db y u va n d n 十一i m p l a n t a t i o n ，a n ds c r e e n e db y2 - d e o x y - d g l u c o s e d g 1 ，w h i c hi sr e s i s t a n tt o c a t a b o l i t er e p r e s s i o n ，w a ss c r e e n e d t h eh i 【g h e s ta c t i v i t yr e a c h e d8 19u m l ，i n c r e a s e db y 9 6 o v e rt h ep a r e n ts t r a i n k e y w o r d s ：s t r e p t o m y c e sh y g r o s c o p i c u s ；m i c r o b i a lt r a n s g l u t a m i n a s e ；e x p o n e n t i a lf e e d i n g ； d i s s o l v e do x y g e n ( d o ) c o n c e n t r a t i o n ；m u t a g e n i z e ；2 - d e o x y - d g l u c o s e z 王 禾 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究3 - 作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注扣致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 边区鲻 日 期： 垫! ! ：! 垒：! z 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签 名：达蝴导师签名：j 丞【萤茜 日 期： 2 1 2 皇仝：旦：咀 第市前言 1 i 概述 第一章前言 裕氟酰胺转胺酶( 蛋白质谷氨酸- t - 谷氨酰胺转胺酶，t r a n s g l u t a m i n 粘e ，简称t g ， e c2 321 3 ) ，又称转谷氨酰胺酶或t - 谷氨酰胺酰基转移酶，【叮以催化蛋白质分子自j 或分 r 内发生变联反应、蛋白质分子内谷氮酰胺基的水解以及蛋白质和氨基酸之自j 的连接 i i - 3 1 , 从而进一班改荐蛋白质功能性质，提高蛋白质的营养价值，是生产高营养价值的 新型虽r i 食品的重要酶制剂之一，在食品加工业具有巨人的应j i 前景，具有“2 l 世纪超 绒食仙粘合剂”的美称。 凹卜1m t g 的虽门质分广三维空阃结构 f i g i - 1o v e r a l ls t r u c t u r eo f m t g 同前，无论发达国家还是发展中国家都迫切要求新型蛋白食品的问世，它不但能提 供高的营养价值、口感好，而且容易包藏、方便运输、可以降解，没有剐作用、外观吸 引等特点1 4 】。对于发达国家的人们来说，动物蛋白质的过多摄入严重损害了人体的健康 ( 如高血压、心脑血管病患者人数增多) 同时也给环境造成了严重的危害，而对发展中国 家的人们来说，则由于动物蛋白质摄入的贫乏，造成人们营养普遍不良。全球耕地的不 断减少，而人口却与日俱增，因而对新型营养蛋白食品的需求量只益增大。但是许多食 品蛋白质由于氪基酸组成不理想或缺乏适当的结构和构象，使得这些蛋白质缺乏良好 的功能性质，如溶解性、发泡性、乳化性和乳化稳定性，且本身的营养价值也不高。对 这些蛋白质进行化学修饰来改善它们的功能性质，人们曾经做过广泛的研究，但是考虑 到化学试剂的安全性问题及其对食品营养可能造成的不良影响这些方法最终未能被人 们普遍接受和应用。而酶法修饰由于安全，快速、专一性强、对食品营养无破坏，越来 越得到人们的认可p 一。因此用谷氨酰胺转胺酶修饰蛋白，是开发新的蛋白质食品最 江南人学硕十学位论文 有前景的方法之一。 1 2 谷氨酰胺转胺酶的功能性质 1 2 1 谷氨酰胺转胺酶的来源 谷氨酰胺转胺酶存在于动物、植物和微生物中，包括来源于动物体的谷氨酰胺转胺 酶( g u i n e a - p i gt r a n s g l u t a m i n a s e ，简称g t g ) 及来源于微，物的谷氮酰胺转胺酶 ( m i c r o b i a lt r a n s g l u t a m i n a s e ，简称m t g ) 。m t g 是一种胞外酶，分子量在4 0k d 左右， 活性中心包含一个游离的c y s 巯基，与g t g 相比，m t g 表现出很多优势，如对c a 2 + 的非依赖性，对热、p h 的稳定性，以及易贮存性。 m t g 主要是来源于微生物中的链霉菌。不同来源的t g 的主要制备方法见表1 1 所 示。 表1 1 不同来源谷氨酰胺转胺酶的制备眇1 t a b l e1 ip r e p a r a t i o no f d i f f e r e n ti r a n s g l u t a m i n a s e sf r o mv a r i o u ss o u r c e s 2 第一章阿二 1 2 2 谷氨酰胺转胺酶的作用机理 谷氨酰胺转胺酶是一种催化酰基转移反应的转移酶，托! i | 掣反麻如j 划1 i 】。利片j 这些催化反应，在各种蛋白质分子之f e l 】或者之内引起共价空联，从m 坩各种食品蚩白质 进行改性。 图1 - 1 蛋白质分子经m t g 作用模型 f i gi - 】m o d a lo f p r o t e i np r o c e s s e db y m t g 粹氨酰胺转胺酶以肚链中谷氪酰胺戏肇的t 一羧酰胺基作为酰址 【体，而酰j i i ；受体可 以是： ( 1 ) 多肽链中赖氨酸残基的一氨堪，形成蛋白质分r 内和分子问f f j 嘶一谷氧酰) 柏氨酸异 肽键 图i - 2 a ) 使蛋白质分子发生交联，从而改变食物的质构，改善蛋白质的溶解性、 起泡性、乳化性等许多物理t t 质： ( 2 ) f l 腋基，形成蛋白质分子和小分子伯胺之m 的连接( 图i - 2 b ) ，利用缓反应l j 丁以将一些 限制性氨基酸引入蛋白质以提高其营养价值： ( 3 ) 水，当不存在伯胺时，水会成为酰基受体，其结果是谷氧酰胺残基脱去氨基，t 成谷氨 酸残基( 国1 - 2 c ) 。该反应可用r 改变蛋白质的等电点及溶解度l 。 6 竹c o _ n h2 州h ，一? “。c o n h r + n h ， 1i c i g i n + c o - n hzhohg i nc o o h + n h j 图i - 2 m t g 的作用特点 f i 9 1 - 2 c h a r a c t e r i s t i c so f r e a c t i o a s t h a t m t g 船t a l y z e d 1 3 谷氨酰胺转胺酶在食品工业中的应用 m t g 广泛麻用在食品加工业的各个领域，主要包括肉制品，而制品，乳制品，焙烤 制品，水产品等，可替代有致癌作用的强筋剂溴酸钾可部分替代亚硝酸盐、硝酸盐等 稳定剂，提高食品的营养价值，口感更好，延长保质期等。现在食品安全倍受关注，m t g 是天然酶制剂，比化学添加剂更加健康安全，该酶的使用可以取代或者部分取代许多化 学添加剂的用量，可用于新型绿色健康食品的生产。 目前我们使用在食品生产中的酶制剂6 0 以上为辅酶类，蛋白质组分改性的酶制剂 以往通常只有蛋白酶。采用各种蛋白水解酶柬改善蛋白质的功能性质和营养价值其基 洲 + 叫 *舌i 一 nh洲凸c 嘶i a b 江南人学硕十。学化论文 本机理是将大分子蛋自质水解，使分子变小，这将对食品中1 j 蛋门质大分子特性相关的 一些性质( 如蛋白质的凝胶性等) 起到柑反的f l j l j 。 谷氨酰胺转胺酶f i 仅可以催化同种蛋广j 质之1 1 j j 的交联，还能催化不同蛋白质之间的 交联。各种蛋白质的氨基酸组成互不相同，冈而f i m 的蛋白质中的限制性氨基酸不一定 相同，通过t g 将它们连接起来，可以达剑优辨忆补的效果，提高蛋白质的营养价值。 经t g 改性后，蛋白质的胶凝性、塑性、持水性、水溶性、稳定性等均会得到改善。t g 在食品加工中的主要作用包括：( 1 ) 保护食矗 蛋r l 质r 1 的赖氨酸避免发生化学反应；( 2 ) 提高蛋白质的营养性；( 3 ) 包埋脂类或脂溶性物质；( 4 ) 形成耐热耐水性的膜；( 5 ) 提高食 品的弹性和持水能力等。 谷氨酰胺转胺酶在食品工业中的应用情况如表1 2 所示。 表l 一2 谷氨酰胺转胺酶在食品工业中的主要应角概览 t a b l el 一2o v e r v i e wo fm t g a p p l i c a t i o ni nf o o dp r o c e s s i n g 4 第一章前言 1 4 谷氨酰胺转胺酶的市场前景 神：发达国家，m t g 已开始普遍推广应用。同本在1 9 9 3 年率先把m t g 推向市场， 获得了li 人的经济效益，2 0 0 0 年同本m t g 相关的食品销售额达2 0 0 0 亿同元。日本从 1 9 9 3 2 0 0 3 年的十年中m t g 需求量增长了7 2 0 ，未来还有更大的增长空间。由于发达 国家对食品安全、卫生、营养的苛求性和严格性，推动了m t g 市场需求一直呈快速上 升的趋势。谷氨酰胺转胺酶在日本已成为食品工业中仅次于0 c 淀粉酶的第二大酶种的事 实也说明，该酶的推广应用前景非常广阔。 中国是世界上最大的肉制品消费大国和全球最大的肉制品市场，屠宰及肉制品加工 业是最具优势产业之一。2 0 0 4 年全国肉类总产量7 2 6 0 万吨，居世界第一位。2 0 0 4 年中 国屠宰及肉类加工规模以上企业共2 1 5 5 ，总资产1 0 1 4 4 3 亿多元，实现工业总产值 1 6 0 7 6 6 亿元，工业销售产值1 5 7 9 2 7 亿元。形成了双汇、金锣、雨润、得利斯、唐人神、 辛i 中争等大型企业和名牌产品，品种。高温低温、中式西式等七大系列近1 0 0 0 个品种， 肉类总产量7 2 4 5 万吨。 中国也是世界上的乳制品消费大国，根据国家统计局的统计显示：2 0 0 5 年1 1 2 月 全国累计乳制品产量为1 3 l o 万吨，比上年同期增长2 7 9 7 ；2 0 0 5 年1 1 2 月全国累计 液体乳产量为1 1 4 6 万吨，比上年同期增长2 9 3 7 。据海关统计，2 0 0 5 年，我国乳品进 口金额增幅i 纠落，进口数量同比降低，出口数量和出口金额大幅增长。2 0 0 5 年乳制品进 出口总额为5 4 0 5 4 万美元，比上年同期增长了8 ，其中进口金额占进出口总金额的 8 4 9 ，比上年同期下降了3 9 个百分点；乳品进出口总量为3 9 万吨，比上年同期下降 4 3 ，其中进口量占总进出口量的8 2 1 ，比上年同期下降了3 1 个百分点。国家粮油 中心数据显示制粉小麦9 9 0 0 万吨左右。 我国食品工业是一个大产业，近年来发展相当迅速，但是目前的发展水平仍无法满 足农业产业化发展的要求。我国食品的总产值仅为农业总产值的5 0 ，而发达国家可以 达到1 0 0 2 0 0 。在广度和深度上加强食品加工应用方面的开发是赋予食品新的高附价 值的重要途径。随着国家食品安全法的出台，以及人们对食品质量要求的日益提高， 低档、有害的食品添加剂将逐步退出市场。如目前面制品中使用的溴酸钾添加剂，国家 从2 0 0 5 年7 月1 日起明令禁止使用，这为m t g 在食品工业中的大量使用创造了政策条 件。 以肉制品加工为例：目前我国每年肉产量7 0 0 0 万吨，加工比例为4 5 ；按新型酶 制剂的开发促进其中1 0 产品添加m t g ，在肉制品加工中m t g 的添加量为0 1 一0 3 ( 1 0 0 u g ) ，取平均值o 2 ，则年m t g 需求量为6 0 0 吨；按每吨4 0 力- 元的价格计算， 每年将新增产值2 4 亿元。 以- 孚i , n 品加工为例：2 0 0 5 年我国乳品总产量2 0 0 0 多万吨，其中7 0 用于加工奶粉、 酸奶和乳酪等可通过添加m t g 改善食品品质的；按新型酶制剂的开发促进其中1 0 产 5 江南人学硕十学位论文 品添加m t g ，加工中m t g 的添加量为0 0 3 ( 1 0 0 u g ) ，则年m t g 需求量为4 0 0 吨； 每吨4 0 力元的价格计算，每年将新增产值1 6 亿元。 由以上分析可以看出，仅在肉制品和乳制品两项中若1 1 0 的产品使用m t g 改善品 质，即可使m t g 的产值超过4 亿元。 实际上，新型酶制剂的开发和大范围应用，还可以显著提高加工食品的产品质量， 增加加工食品的市场份额，提高食品加工行业的产值，经济效益极为显著。 综上所述，实现m t g 酶制剂的大规模工业化，开发新型分子改造技术，注重食品 安全，将促进食品加工业和酶制剂工业的迅速发展，对国民经济的发展将作出重要贡献。 1 5 谷氨酰胺转胺酶的生产 1 5 1 动植物组织中提取 f o l k 等人在动植物组织中发现t g ，并得到纯化了2 3 0 倍的t g 。此后，不少研究者 对来自动物体( 主要是豚鼠肝脏) 的t g 的纯化方法、性质以及应用进行了广泛研究。豚 鼠肝脏是近3 0 年来商用t g 的唯一来源，由于酶的来源稀有、分离纯化工艺复杂，导 致酶的价格十分昂贵，仅限于基础研究所用。来自植物体( 豌豆种子、羽扇豆种子) 的t g 的分离纯化工艺则还不成熟。由此可见，来自动物、植物中的t g 很难应用于食品工业。 1 5 2 微生物发酵法 2 0 世纪8 0 年代末，利用微生物发酵法生产m t g 的报道开始出现。1 9 8 9 年，a n d o 【1 6 j ， m o t o k i 等人 1 7 , 1 8 1 首先报道用微生物发酵法生产m t g 。在工业化生产方面，同本味之素 公司和天野公司于1 9 9 3 年已成功利用微生物法生产该酶，并投入市场，取得巨大成功。 国外对m t g 微生物发酵生产的研究内容主要包括( 1 ) 适宜的m t g 产生菌的筛选( 2 ) 合适 培养基的选择及培养条件的研究( 3 ) 采用遗传工程手段对菌种进行改良。a n d o 等人以葡 萄糖为基质，利用s t r e p t o v e r t i c i l l i um s 一8 11 2 生产t g ，发酵6 5h 酶活达2 0u m l ；吴介 文等筛选的l a d a k a n u m ，在2 5 - 2 8o c ，1 0 0 - - 1 5 0r m i n 的培养条件下培养4d 酶活达 到2 1u m l ；z h u 等人以淀粉为基质，利用& m o b a r a e n s e 生产m t g ，发酵4 0h 酶活达 1 8u m l 。 国内对发酵法生产m t g 的研究起步较晚。本研究室是国内较早开展微生物法发酵 生产m t g 的科研单位。郑美英等人【1 9 之1 1 以茂原链轮丝菌( s t r e p t o v e r t i c i l l i u mm o b a r a e n s e ) 为出发菌株，通过在发酵过程中控制温度，p h 等参数，在2 5l 发酵罐中m t g 平均酶 活为2 9 4u m l ，最高达到3 3 7u m l 。柏映囤等人【2 2 】用传统方法筛到一株高产谷氨酰胺 转胺酶的菌株w s h 0 3 1 3 ，用高产菌株进行1 5 0l 中试，m t g 酶活最高达到4 2 0u m l 2 3 1 。 本研究室程力等通过促进酶原活化技术使酶活达到5 0u m l 【2 4 】。在工业化生产方面，只 有泰兴一鸣精细化工有限公司小规模的生产，其他还都处于实验室研究阶段。 表1 3 国外和本研究室发酵生产m t g 的情况介绍 t a b l el - 3c o m p a r eo fm t g p r o d u c t i o na b r o a da n do u rl a b 6 第1 章前言 1 5 3 基因工程菌构建方面的研究情况 利用基因工程菌来生产谷氨酰胺转胺酶方面w a s h i z u 等人【2 5 】和t a k e h a n a 等人【2 6 】首 先用基因克隆的方法构建出基因工程菌用来生产谷氨酰胺转胺酶，但是酶活水 ，都很 低，无法达到工业化生产的要求。d a t e 等人【27 】将编码谷氨酰胺转胺酶的皋冈转入 c o r y n e b a c t e r i u m g l u t a m i c u m 中表达，并同时将一段可以特异切割谷氨酰胺转胺酶i j 订提酶 原的蛋白酶( s a m 4 5 ) 基因转入宿主表达，结果获得了很高的产量。 1 6 立题背景和意义 目前国内对谷氨酰胺转胺酶发酵特别是工业化生产还缺乏伞面、有效的研究。目自 ， 我国能生产这一酶种的企业极少，国内市场正面临同本生产厂商的巨大冲击。传统发酵 技术主要依靠优势菌种和发酵优化及控制技术，在菌种方面现在大部分利用的放线菌主 要是链霉菌，通过从自然界筛选更优菌种很难再有突破，本研究窄已经从土壤中筛选到 一株吸水链霉菌，在国际上还未见利用其发酵产m t g 的报道。对该菌种通过传统的营 养条件和环境条件的发酵优化技术产量提高到5 0u m l 。 据报道，m t g 在营养菌丝的的生长阶段并不分泌，而是在分化形成气生菌丝时j 开始分泌和活化，并在形成孢子后停止活化【2 8 】。在此过程中足否可以采用一些发酵策略 来提高谷氨酰胺转胺酶的发酵产量值得研究。 微生物发酵的生产水平不仅取决于生产菌种本身的性能，而且还要赋予合适的环境 条件才能充分发挥出发菌株对目标产物的生产能力【2 9 1 。因此必须通过各种研究方法以了 解有关生产菌种对培养环境( 如温度、p h 、溶解氧等) 的要求，为合理的生产工艺的提 出和实现提供理论依据。 通过发酵策略来优化谷氨酰胺转胺酶的发酵过程，结果发现酶活提高幅度不是很 大，高产谷氨酰胺转胺酶菌种的选育是国内研究的热点，所以期望通过诱变手段来得到 高酶活的高产菌株。离子注入技术是一种新型的诱变技术，它的致死曲线与紫外照射不 同，另外它还具有损伤低，突变频率高突变谱广性状稳定等特点，这些表明它与其它常 规诱变及化学诱变过程有明显的差异，所以我们利用本实验室筛选的天然野生菌经过 旷注入、紫外照射等常规诱变手段，并筛选抗2 脱氧d 葡萄糖( 2 d e o x y - d g l u c o s e ，2 - d g ) 突变株并通过分离纯化得到稳定的高产菌株。 谷氨酰胺转胺酶的应用十分广泛，我国对该酶制剂的需求量也将不断增大。因此尽 快实现我国m t g 的产业化不仅能够促进我国食品工业、医药工业和纺织品工业的发展、 改善人民群众生活质量，而且对加速我国酶制剂工业的结构调整、提升行业效益也具有 十分重要的意义。 7 l ：南人学硕十学化论文 本实验室丌展m t g 的发酵尘产及产酶机理研究近十勺i 来，已f | l 请争利5 项( 国内 共授权有关微生物m t g 酶制剂的专利1 2 项) ，移 累了火最的实验资料和卡富的实验经 验，传统发酵生产达到圈内领先水平。在此研究基础上，利川本实验气i 自行筛选的吸水 链霉菌，通过发酵策略来提高谷氨酰胺转胺酶的酶活，并通过再种诱变手段对其进行诱 变选育，为将来实现该产品的低成本高产量的：i ：业化打- 卜坫础。 1 7 主要研究内容 本研究利用本实验室自行筛选到的吸水链霉菌( s t r e p t o m v c e sh y g r o s c o p i c u s ：c c t c c m 2 0 3 0 6 2 ) ，通过各种发酵策略及诱变手段来进一步提高谷氨酰胺转胺酶的酶活，主要研 究内容如下： 1 研究吸水链霉菌的高密度发酵，考察不同初始葡萄糖浓度对分批发酵的影响，在此 基础上考察不同的流加速率对细胞生长和产酶的影响。在菌体量得以提高的基础上 补加不同的氮源促进产酶，最终确定豆饼粉为既经济又要实际效果的氮源，并进一 步确定豆饼粉的添加浓度。 2 环境条件对菌体发酵影响较大，实验过程在3l 发酵罐水平上考察溶氧对谷氨酰胺 转胺酶分批发酵的影响，确定合适的溶氧浓度范围，从动力学的角度对发酵过程进 行分析，基于菌体比生长速率和比产酶速率，提出溶氧分阶段控制策略并验证其可 行性。 、 3 考察不同的诱变方法对吸水链霉菌的诱变效果，最终发现2 脱氧d 葡萄糖作为葡萄 糖的结构类似物可以作为吸水链霉菌的抗性筛选剂，确定不同诱变方法的最佳剂量， 各种诱变手段相结合，经过分离筛选得到一株稳定的高产菌株。 第一二章材料与方法 第二章材料与方法 2 1 材料 2 1 1 菌种 吸水链檬l g ( s t r e p t o m y c e sh y g r o s c o p i c u s ) c c t c cm 2 0 3 0 6 2 ，系本实验室从土壤中筛选 得到。 2 1 2 培养基 斜面培养基( l ) ：麦芽汁5 0 ( 1 0 。b e ) ，酵母膏5 ，葡萄糖5 ，琼脂2 0 ，p h7 0 。 种子培养鉴( g l ) ：玉米淀粉2 0 ，蛋白胨2 0 ，酵母膏5 ，无水硫酸镁2 ， 磷酸氢二 钾2 ， 无水磷酸一：氢钾2 ，p h 7 0 。 发酵基本培养展( l ) ：葡萄糖1 0 ， 蛋白胨2 5 ，酵母膏5 ，无水硫酸镁2 ， 磷酸 氢二钾3 7 5 ，无水磷酸二氢钾o 2 5 ，碳酸钙5 ，p h8 0 。 发酵培养基( l ) ：玉米淀粉5 ，甘油1 5 ，葡萄糖5 ，蛋白胨2 5 ，酵母膏5 ，无 水硫酸镁2 ， 磷酸氢二钾3 7 5 ，无水磷酸二氢钾0 2 5 ，碳酸钙5 ，p h8 0 。 分离培养基( l ) ：可溶性淀粉1 0 ，k n 0 3l ，k 2 h p 0 40 5 ，n a c l0 5 ，m g s 0 40 5 ， f e s 0 40 0 1 ，琼脂2 0 。 2 - d g 分离培养基：m m 培养基中加入一定量的2 一脱氧一d 葡萄糖。 2 1 3 培养条件 种子培养：接一铲生长良好的斜面培养物至装有1 0 0m l 种子培养基的5 0 0m l 三角 瓶中培养，摇瓶转速为2 0 0r m i n ，温度3 2o c ，培养时间2 4h 。 摇瓶培养：将培养好的种子按6 的接种量接入发酵瓶中，5 0 0m l 三角瓶装液量为 5 0m l ，摇瓶转速2 0 0r m i n ，培养温度3 2o c ，培养时间4 2h 。 流加发酵：3l 全自动发酵罐( l i f l u sg mb i o t r o n ，k o r e a ) 中装液量为1 5l ，接种 量6 ，前期培养条件同分批发酵。待葡萄糖消耗完毕向发酵罐中按要求流加营养物， 通气量1 2 5w m ，搅拌转速7 0 0r m i n ，温度控制在3 2 0 c ，对发酵过程的p h 不进行控制。 分批发酵：3l 全自动发酵罐( l i f l u sg mb i o t r o n ，k o r e a ) q b 装液量为1 5l ，接种 量6 ，通气量1 2 5v v i l l ，搅拌转速随溶氧的变化而变化，温度控制在3 2 0 c ，对发酵过 程的p h 不进行控制。 溶氧浓度控制：当d o 低于或高于设定值时，搅拌转速自动升高或降低来维持在设 定的溶氧值。起始搅拌转速设定为2 0 0r m i n 。 2 1 4 主要试剂 n a c b z g l n g l y ( n a l p h a c a r b o b e n z y l o x y - g l u t a m i n eg l y c i n e ) s i g m a 公司 l 谷氨酸丫单羟胺酸s i g m a 公司 9 江南大学硕十学位论文 i 羟f i 毖氨基甲烷( t r i s ) 盐酸羟胺 三氯乙酸 三氯化铁( f e c l 3 6 h 2 0 谷光什肽( 还原型) 】服葡萄糖 2 1 5 主要仪器 上海化学试剂厂 上海化学试剂厂 上海化学试剂厂 上海化学试剂厂 华美生物工程公司 山东祥瑞药业有限公司 恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂 高压火菌锅 电热恒温水浴锅 1 1 0 0 电子天平 台式高速离心机 紫外可见光分光光度计( u v 7 5 0 0 ) 精密数显酸度计 s b a 一4 0 c 双功能生物传感分析仪 s k 1 型快速混匀器 无锡市第二医疗器械厂 江苏省医疗器械厂 m e t t l e rt o l i d op l 2 0 0 2 上海医用分析仪器厂 上海天美科学仪器有限公司 上海天达仪器有限公司 山东省科学院生物研究所 江苏金坛医疗仪器厂 2 2 分析方法 2 2 1 谷氨酰胺转胺酶酶活测定 比色法3 0 1 测定酶活：以n a c b z g l n g l y 为作用底物，以l 谷氨酸吖单羟胺酸做 标准曲线。1 个单位谷氨酰胺转胺酶酶活定义为：3 7o c 时每分钟催化形成1 x r n o ll 谷氨 酸丫单羟胺酸的酶m ；( u m l ) 。酶促反应过程为： l o 第二章材料与方法 囝一洲h 喾。m 枷心。渊 e h 2 古二 l n h z t gp m b 翻 p n h 3 囝即一m 1 筝洲姝m 0 0 h 占h ： o l h o h 雄羟艏敬 毒f e c i ) t c a 三价铁络含物( n 诒x - 5 2 5 n m ) 试剂a ：1 0 0m g 的n 0 【一c b z g l n g l y 溶解于2m l0 2m o l l 的n a o h 溶液中， 加入0 2m o l lp h 6 0 的t r i s h c 缓冲液4m l ，0 1m o l l 羟胺2m l ，0 0 1m o l l 的还原 型谷胱甘肽2m l ，并调节p h 至6 0 。 试剂b ：3m o l l 的h c l ，l2 t c a ，5 f e c l 3 按1 ：1 ：l 混合。 配制o 4i t m o l m l 的l 谷氨酸y 单异羟肟酸标准溶液。取1 m li 丈剂a 与0 4m l 不同浓度的l 谷氨酸吖单异羟肟酸标准溶液混合，3 7o c 水浴1 0 分钟。加o 4m l 试剂 b 终止反应，在5 2 5n l n 比色，绘制出标准曲线。以0 4m l 经适当稀释的酶液代替标准 溶液，在相同条件下保温和比色，从标准曲线求出酶活。以1 0 0 。c 加热1 0 分钟的离心 后的上清液为空白。 酶活力( u m l ) = ( 6 8 5 4 8 x o d 5 2 5 - 0 0 1 6 4 ) x 稀释倍数 2 2 2 细胞干重的测定 取发酵液4m l ，先1 0 0 0 0r m i n 离心1 0m i n ，再用o 2m o l l 的稀盐酸水洗2 次，最 后再用蒸馏水水洗2 次，离心，1 0 5o c 干燥至恒重后称重。 2 2 3 葡萄糖测定 采用s b a 一4 0 c 双功能生物传感分析仪。 2 2 4 菌体比生长速率计算方法 菌体比生长速率用如下公式表示：= 三宰，其中x 为菌体量( l ) ，f 为时间( h ) 。 工t t 用o r i g i n 绘图软件对菌体的生长数据进行线性拟合后进行插值计算( 时间步长为o 1h ) ， 再用e x c e l 软件求解得到不同时刻的，再经平滑处理，得到不同初始葡萄糖浓度下 菌体比生长速率一时间关系曲线。 妻j ：南人学硕十学何论文 2 2 5 残糖的测定 采用改进的葸酮硫酸法【3 l 】。 精确吸取稀释至适当浓度的发酵上清液o 2m l 置于1 0m l 比色管中，冰浴中准确 吸入1m l o 2 蒽酮硫酸溶液，混合均匀。2 5 。c 下静置反应1 0m i n ，用7 0 硫酸稀释 至刻度，在波长6 2 0n n l 处( 光程1c m ) n 定吸光度，同时用蒸馏水作一jr l 对照，查标准 曲线换算浓度。 2 2 6u v 诱变方法 单孢子悬浮液的制备：用3 0m l 左右的生理盐水洗涤培养好的菌体斜面，并用接种 铲轻轻将孢子刮下。将洗涤液倒入装有玻璃珠的2 5 0m l 无菌三角瓶中，f 摇床l2 0 0 r m i n 振荡约3 0m i n ，将成团孢子打散，并用脱脂棉过滤。稀释至1 0 6m l ，然后将孢 子悬浮液于3 2o c 下放置2m i n ，使孢子热活化，即可进行诱变处理。取5m l 于9c m 的无菌培养皿中，磁力搅拌，1 5w 紫外灯距离3 0c m 分别照射3 0 、6 0 、9 0 和1 2 0s ，每 皿取o 1m l 涂布，3 2o c 避光培养3 - 一4d 后计算菌落数， 以未经紫外照射的孢子悬液 为对照组，计算致死率。以照射时f 、日j 为横坐标，再生菌落数为纵坐标，绘制菌体紫外诱 变剂量效应曲线，并确定紫外诱变的合适诱变剂量。 2 2 7n + 注入诱变方法 长好的新鲜斜面，加无菌水制成孢子悬液，脱脂棉过滤，收集单孢子悬液，取稀释 l o 倍的孢子悬液均匀涂布在无菌平皿中风干，于注入机靶室进行脉冲式注入，离子能量 为1 5k e v ，注入剂量分别为2 0 1 0 、4 0 x 1 0 1 4 、6 0 x 1 0 、8 0 x l o h 、l o o x l 0 1 4i o n s c m 2 。 2 2 8 抗性筛选物浓度的确定 经诱变处理稀释后的菌液分别涂布于不同质量浓度的2 脱氧d 葡萄糖分离培养基 上培养7 2h ，与相同稀释度诱变处理后的菌体比较计算致死率。若致死率为9 0 以上， 则选定此质量浓度进行筛选。 2 2 9 初筛 接种一环生长良好的斜面培养物至装有5 0m l 发酵培养基的5 0 0m l 三角瓶中培养， 摇瓶转速为2 0 0r m i n ，温度3 2o c ，培养时间4 2h 。 2 2 1 0 复筛 接种一环生长良好的斜面培养物接入种子培养基中，在转速2 0 0r m i n ，3 2o c 下生 长2 4h 后，按6 的接种量接入5 0 0m l 三角瓶，装液量为5 0m l 发酵培养基，摇瓶转 速2 0 0r m i n ，培养温度3 2o c ，培养时间4 2h 。 1 2 第一：章结果j 讨论 第三章结果与讨论 3 1 吸水链霉菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶的补料研究 流加发酵即补料分批培养( f e d b a t c hf e r m e n t a t i o n ) ，是一种介于连续发酵和分批发 酵之问的特殊培养模式，它足n ：微生物的分批培养过程中向生物反应器中间歇或连续补 加一种或多种限制性底物虹到培养结束后j 。排出培养液的一种操作方式【3 2 1 。早在1 9 1 5 年酵母生产者就将流加发酵技术心用于调节面包酵母在麦芽汁中分批培养的生长速度， 但直到19 7 3 年才由y o s h i d e t 3 3 1 捉 l “补料分批培养”这个术语，并从理论上采用数学模 型对其进行了深入的研究。补料分批培养操作能使发酵系统中保持低的营养物浓度，一 方面消除了碳源快速利用引起的阻遏效应，- 另一方面又避免了培养基中某些成分的毒害 作用，而且还可以起剑稀释发酵液以降低粘度的效果。由于流加发酵可以延长细胞对数 生长期和平衡期的持续时问，增j j | l 尘物鼍和平衡期细胞代谢产物的积累，因此发酵工业 中大多采用这种培养方式进行牛产【3 4 】。 补料分批培养的类型很多，按补料的方式分有连续补料、不连续补料和多周期补料 等；而每次补料又分为快速补料、恒速补料、指数速度补料和变速补料等等。在分批补 料培养过程中，新鲜培养基的加入将使发酵液的体积不断发生变化，对细胞生长、底物 消耗和产物的形成进行物料衡算2 9 1 ，分别有： 掣：( 3 - 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