（茶学专业论文）广东茶树种质资源遗传多样性AFLP分析.pdf

摘要 茶树【c 口m p f f f 口j f n p h s 括仁j o k l u l t z e 原产于中国，现已成为一种世界性的重要经济作 物。近年来分子标记等分子生物技术在茶树领域中的研究，取得了一定进展。a f l p 技术 是9 0 年代兴起的一种分子标记，以其稳定性好、重复性高、覆盖面广、多态检出率高等 优点被迅速且广泛地运用于生命科学的各领域中。本研究采用a f l p 技术对2 5 个广东地方 茶树群体品种和5 个对照品种进行遗传多样性分析和种质鉴别研究，并对乐昌白毛茶群 体内各单株的遗传多样性进行分析。主要研究结果如下： 1 、采用氯仿：异戊醇一次抽提法提取茶树基因组d n a ，再经纯化，获得用于a f l p 子标记的模板d n a 。结果表明，此法提取的d n a 其o d 2 6 0 0 d 2 肋值在1 6 0 1 8 5 之间，相 对分子量2 3 k b ，且能被e c o ri 酶解完全，并能获得清晰p c r 图谱和a f l p 指纹图谱。 此d n a 提取方法快速、高效、经济，提取的d n a 质量好，特别对样品数量多、工作量大 等情况下的研究尤为适用。 2 、用a f l p 技术对2 5 个广东茶树群体品种和5 个对照品种进行遗传多样性分析，获得 清晰可见的d n a 指纹图谱。结果表明，5 对引物共扩增出4 0 1 条带，平均每对引物扩增 8 0 2 条带，多态性条带3 3 8 条，占总带数的8 4 3 。扩增片段大小在5 0 5 8 0 b p 之间。3 0 个茶树群体品种之间遗传相似性以清凉山茶和清远笔架茶最高( o 8 7 2 4 8 ) ，桂北大叶种和 风凰水仙之间最低( o 5 0 0 0 0 ) ，清凉山茶和清远笔架茶遗传距离最小( 0 12 7 5 2 ) ，桂北大 叶种和风凰水仙之间的遗传距离最大( 0 5 0 0 0 0 ) 。本实验结果表明广东茶树群体品种遗传 多样性十分丰富。采用d p s2 0 0 0 软件中的u p g m a 法，对实验数据进行聚类分析，得到 a f l p 聚类图。在遗传距离为o 4 0 处取一结合线，可以将3 0 个茶树品种分为3 大类，分别 是：第一类包括凤凰水仙、石古坪乌龙、南昆山白毛茶、连南大叶、丰顺马图茶、东源山 菀茶、清凉山茶、清远笔架茶、五华天竺山茶、广州小叶青心、阳春白毛茶、高州白心、 惠阳小叶、罗定小叶、普宁小叶、云南大叶、海南大叶、广州青桂大叶、兴宁官田茶、乐 昌苦茶；第二类类包括乐昌白毛茶、仁化白毛茶、乳源白毛茶、台山白云茶、凌云白毛茶、 广州小叶白心、广宁大叶青心、平远锅了茶；第三类包括桂北大叶和江西宁州种两个茶树 品种。从聚类结果可以看出，广东地方群体品种亲缘关系的多元性和相对集中性。 3 、利用5 对引物对乐昌白毛茶各单株和5 个对照品种进行a f l p 分析，获得清晰可见 的d n a 指纹图谱。共扩增出3 4 5 条带，平均每对引物扩增6 9 条带，多态性条带2 5 7 条， 占总带数的7 4 5 。扩增片段大小在5 0 5 8 0 b p 之间。本实验结果表明乐昌白毛茶品种内 遗传多样性比较丰富，但品种内的多态性条带低于品种间( 8 4 1 3 ) 。1 7 个样本的遗传距离 分析表明，以4 号单株和1 号单株的遗传距离最大( o 6 0 1 2 9 ) ，桂北大叶种和江西宁州种 的遗传距离最小( o 1 7 6 4 7 ) 。从聚类图上可以看出，在遗传距离为o 5 4 处取一结合线，可 以将1 7 个样本分为3 大类，3 号单株和4 号单株单独分开聚类，5 个对照品种与其他单株 聚为一大类，这一结果显示了乐昌白毛茶品种内遗传的多样性和复杂性。 4 、用a f l p 技术对3 0 个茶树种质资源进行品种鉴别分析，结果显示，选用的5 对引 物中有3 对引物对3 0 个供试材料的鉴别率均是1 0 0 ，另外2 对引物的鉴别率是9 8 。仅 以一条特异标记带的差别就可以区分2 3 个品种，其余品种也可以通过2 条或3 条特征性 条带区分开来。此结果表明a f l p 是种高效的分子标记技术。 关键词：茶树；分子标记；遗传多样性；a f l p l i a b s t r a c t t e ap l a n t 聊e 盯胁s f n p 坨s 括( l ) o k 删z p 】o r i 百n a t e d 舶mc h i n a ，i t h a d b e e ns p r e a dt o m a n yc o u n t r i e sa n db e c 姗em ei m p o n a n te c o n o m i cp l a n ti nt h e 、v o r l d t h ei n i t i a t o d rr e s e a r c h e s a b o u tm 0 1 e c m a rm 甜k e rt e c l l d 0 1 0 9 ya n dg e n e t i cd i v e r s 时o ft e a p l a l l th a dm a d es o m e a c h i e v e m e 址si nr e c e n ty e a r s m a n ys m d i e so fl i f es c i e m i f i cf i e l d sm i n gb e e nd o n er 印y u s i n ga f l pm a r k e r sf r o mi t sp r o d u c i n gd a y ，b e c a u s ei th a sm a n ym e r “s ：t l l ei d e n t i f i c a t i o no fa 伊e a tn 啪b e ro fp o l y m o r p h i s m s ，h i g h l yr e p r o d u c i b l ea n ds t a b l e i nt 1 1 i sp a p e r ，g e n e t i cd i v e r s i 廿e s w e r ee v a l u a t e da l l da i l a l y z e da t 也ei n 锄。a n di n t r a s p e c i f i co ft e ap l a n t ( a f l pa n a l y s i so n3 0 c u l t i v a r sa n de v e r yp l a n to fl e c h a i l 曲a i m a o c h a ) ，w ea l s od e t e c t e dd n aa n de v a l u a t e dt h e s p e c i a la f l pm 盯k e r si n3 0c u l t i v a r s t h em i nr e s u h sw e r ea sf o l l o w s ： 1 g e n o m i cd n a 抒o mt e ap l a n tw a si s o l a t e du s i l l gc h l o r o f b m 】锄di s o 锄y la l c o h 0 1o n j yo n c e 1 1 1 er e s u h ss h o w e dt h a tt h ev a l u eo fo d 2 6 徊d 2 b of o rd n as 锄p l e so b t a i n e d 谢t 1 1t h i sm e t h o d w a sb 咖e e n1 6 0a n d1 8 5 ；t h em o l e c u l a rw e i g h to f d n a w a sm o r et h a n2 3 k b ，t h ed 咐a sw e r e c o m p l e t e l yd i g e s t i b l e 、 ，i t he c o r ia i l da m p l i f i a b l ei n 吐l ep c r ，a n da f l p6 9 u r cw e r eo b t a i n e d ni sar a p i da i l dh i 曲e m c i e n tm e m o d ，a n de s p e c i a i i ys u j t a b l ef o rt h es i t u a t i o nt h a tt h es t u d yh a s a1 0 to f s a m p l e ，锄o u n to f w o r ka i l da1 m l et i m e 2 t h ea f l ps i l v e rs t a i l l i n gp r o t o c 0 1w a su s e df o ra i 】1 p l i n c a t i o nr e a c t i o ni nt l l ee x p e r i m e n t ， 却e m y n v el o c a lc u l t i v a r so fg u a n 鲥o n gp r o v i n c et e ap l 锄ta 1 1 d 行v ec o n 廿a s t i v ec u l t i v a r sw e r e t e s t e da i l da 1 1 a l y z e du s i n g5p m n e rc o m b i l l a t i o n s ，4 0 1b a i l d sw e r eo b 扭i i l e d ，3 3 8b a i l d s ( 8 4 3 ) o ft h 啪w e r ef o u i l dt ob ep 0 1 y m o r p h i c ，8 0 2b a n d s 、e r eo b t a i n e db ye v e r yo ep r i m e rp a i r a v e r a g e t h ea m p l i n c a t i o nf a g m e mr a n g e 丘o m5 0 b pt 05 8 0 b p a m o n gt 1 1 e3 0c u l t i v a r s ，廿1 en e i l ic o e 币c i e mb e t 、v e e nq i n g l i a n g s h a l lt e aa i l dq i n g y 咖b 司i at e a ( o 8 7 2 4 8 ) i sm eh i 曲es t a 1 1 d b e 觚e e ng u i b e i d a y ca n df e n g h u a i l g s l m i ) 【i a n ( o 5 0 0 0 ) i st h el o 、v e s t c o n 订a r i l y ，t h eg r e a t e s t g e n e t i cd i s t a i l c e si sb e t w e e n ( m i b e i d a y ea n df e n 曲u a l l g n m i x i a n ( 0 5 0 0 0 ) ，t 1 1 el o w e s tg e n e l i c d i s t a i l c e i sb e 柳e e n q i l l 9 1 i a n g s h a i l t e a a n d q i n g y u a i l b 日i a t e a ( o 1 2 7 5 2 ) w ed e p o r t h e r e 也a t t h e 1 0 c a lt e ap l a n to fg u a n g d o n gp m v i n c ec h 啪c t e r i z e db ya 越g hg e n e t i cd i v e r s i t y ad e n d m g r 锄 s h o w i n gg e n e t i cr e l a t i o n s h i p sb e t w e e nt h e m 、v a sc o n s 协l c t e db ya nu n 、v e i g h t e dp a i r - g r o u p m e m o d 州t ha r i t h m e t i c a la v e r a g e s ( u p g m a ) o fd p s2 0 0 0 3 0c u l t i v a r sc a 工lb ed i v i d e di n t o t h r e eg r o u p sa c c o r d i n gt om ec o m b i n el i n e0 4 0o fm eg e n e t i cd i s t a i l c e ：m ef i r s tt y p ew h i c h c o n t a i n s f e n g h u a n g s h u i x i a l l ，s h 培u p i l l g w l l l o n g ， n 洳s h a n b a i m a o t e a ，l i a n n 趾d a y e ， f e n g s h u m n a t i l t e a ， d o n g y u a n s h a l l w a l l t e a ，q i n g l i a n g s h a l lt e a ， q i n g ) ，u a n b 巧i a t e a ， w u l l u a t i a i l z l l u s h a l l t e a ，g u 锄g z h o u x i a o y e q i n g ) ( i n ，y a i l g c h l l l l b a i m a o t e a ，g a 0 2 1 1 0 u b a i x i n ，h u i y a n g x i a o y e ，l u o d i n g ) 【i a o y e ，p 1 1 n i n g x i a o y e ，y - 唧a 1 1 d a y e ，h a i l l a i l d a y e ，g u a l l g z h o u q i n g g u i d a y e ，x i n g 工l i n g g u 锄t i a nt e aa n dl e c h 肌g k ut e a ；t h es e c o n dt y p ec o n t a i n sl e c h a n 曲a i m a ot e a ，r e i l l l u a b a i m a ot e a ， t i l r u y u a n b a i m a ot e a ，t a i s h a l l y u n b a it e a ， l i n g y u n b a i m a 0 t c a ， g u a n g z h o u ) ( i a o y e b a i x i n ， g u a l l g n i l l g d a y e q i n g x i n a 1 1 d p i n g y u a i l g u o i i a ot e a ；t h e t 1 1 i r dt y p ec o n t a i n sg u i b e i d a y ea n d j i a n 群i 1 1 i n g z h o u z h o n 舀t h i sr e s u l ts h o w sm a tg 啪g d o n gl o c a lt e ap l a l l t s c o n s a l l g u m e o u s r e l a t i o n s h i pi sd i v e r s i 母a n dc o n e e n t r a t i v e 3 a f l pt e c l l l l o l o g yh a sb e e nu s e di na n a l y z i n gg e n e t i cr e l 撕o n s h i p sa n dg e n e t i cd i v e r s n yo f 1 2p l a n t so fl e a l l g c h a l l 曲a i n l a ot e aa n d5c o n t r a s t i v ec u l t i v a r sb yu s m g5p r i m e rp a i r s n i e a f l pn n g e r p r i n t i n gw a so b t a i n e d 3 4 5b a n d sw e r eo b t a i n e d ，2 5 7b a n d s ( 7 4 5 ) o ft h e mw e r e f o u n dt ob ep o l y m o r p h i c ，6 9b a n d sw e r eo b t a i n e db ye v e r yo n ep r i m e rp a i r a v e r a g e 1 h e 跚p l m c a t i o n 矗a g m e mr a n g ef r o m5 0 b pt 05 8 0 b p a m o n g 此1 7s a n l p l e s ，也e 伊e a t e s tg e 戚c d i 咖n c e si sb e t w e e nn u m b e r4a n dn u m b e r1 ( 0 6 0 1 2 9 ) ，t h el o w e s tg e n e t i cd i s t a l l c ei sb e t w e e n g l l i b e i d a y ea i l dj i a n 影i 血n g z l l o l l z h o n g ( o 17 6 4 7 ) 1 7s 锄p l e sc a nb ed i v i d e di m ot 1 1 r e eg r 0 1 l p s a c c o r d i n gt ot h ec o m b i n el i n eo 5 4o ft h eg e n e t i cd i s 乜n c e ：n 岫b e r3a 1 1 dn u m b e f4a s s e m b l e d s e p a r a t e l y ；t h eo t h e rp l a n t sa n d5c o n t r a s t i v ec u l t i v a r sw e r ea s s e m b l e dt o g e t h e lt h j sr e s u l t s h o w st 1 1 a tl e c h a l l 曲a i m a ot e ag e n n p l a s m r e l a t i o n s l l i pi sd i v e r s 毋a i l dc o m p l e x i 够 4 t oo b t a i na f l pm a r k e r si nt e ap 1 觚tg e 咖p l 髓mr e s o u r c e s ，m ef i v ep o l m o 印h i c 州m e r s w e r eu s e d ，nw a sf o u n dt h a tt h et l l r e ep r i m e rp a i r sc a l ld i s t i n g u i s ha l l 也e3 0c u h i v a r sa to n e t i m e ， t h ep r o b a b i l i t yw a s1o o ，t h eo t h e rt w op r i m e rp a i r s p r o b a b i l i t yo fd i s t i n c d o nw a s9 8 t h e r e s u l ta l s os h o w e d2 3c u l t i v a r sh a du i l i q u ea f l pf i n g e 巾r i n t i n g ，t h eo m e r sc o u l db ei d e n t m e db y 2 - 3b a n d s ，a f l pt e c h n i q u ei sap o w e r f l l la n de f f i c i e r l tt 0 0 1 k e y w o r d s ：1 e ap l a m 【c h 聊e 肼as f 胛p 玎j 括( l ) 0 k u n t z e ；m 0 1 e c u l a rm a r k e r ；g e n e t i cd i v e r s i t y a f l p 独创性声明 本人声明所呈的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不 包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学 或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本 研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了感意。 研究生签名 问套竿 时间年0 6 只f 嵋 关于论文使用授权的说明 本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学 校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可 以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 导师签名 阅房等 丫多扒 时间：d 年”钿解日 时间：彳年占月，日 第一章前言 l 茶树种质资源的研究现状 1 1 茶树的起源、分布与传播 1 1 1 茶树的起源 茶树，是一种多年生的木本、常绿植物。学名全称为c 日小e ，f 如5 咖p m 话m 1o k u m z e 。 茶树的故乡在中国，现已为广大茶学界所公认。分布在云南西南部地区数量众多、品种繁 杂的野生大茶树，更为国内外茶业界人士所瞩目。早在1 7 5 3 年，瑞典著名植物学家林奈 ( c a r lv o n l i 肌e ) 根据我国灌木型茶树将其命名为砌p 口。加p 刀s 括l i l l l l e ( 中国茶树) 。后来又 将其改名为c 俐p ? ，抽s f h 口h s 括li 衄e 。1 9 5 0 年我国植物学家钱崇澍根据国际命名法和对茶 树特征的研究，首先确定以c 矗研p 磁口5 所p 珊括( l ) o k u l l _ 钯e 为茶树学名，1 9 8 1 年被我国植 物学家张宏达对茶树进行系统分类后所确认，目前已为中国所通用【1 圳。 研究茶树起源是一项十分复杂的工作，也是一项基础性和应用性很强的科学研究【5 一。 对于茶树起源的问题我们应该以科学的态度来探讨，利用现代科学、细胞分类学( 染色体组 型) 、化学分类学( 化学成分、同工酶、可溶性蛋白亚基) 、形态分类学、数值分类学等，从 细胞水平和分子水平特别是d n a 水平的研究它们之间亲缘远近的关系，加以综合分柝，将 有助于茶树起源的探索。 1 1 2 茶树的分布 我国是世界上最古老的茶叶生产国，茶区辽阔，茶类繁多，茶树品种丰富，地形复杂。 全国分为4 个茶区，即华南茶区、西南茶区、江南茶区、江北茶区。江北茶区，是我国最 北的茶区：江南茶区，在长江以南，大樟溪、雁石溪、梅江、连江以北；西南茶区地形复 杂，大部分地区为盆地、高原：华南茶区位于大樟溪、雁石溪、梅江、连江、浔江、红水 河、南盘江、无量山、保山、盈江以南，包括闽中南、台、粤中南、海南、桂南、滇南。 华南茶区茶树资源极其丰富，荟集了中国的许多大叶种( 乔木型或小乔木型) 茶树， 适宜加工红茶、普洱茶、六堡茶、大叶青、乌龙茶等。而广东省位于该茶区的中部，水热 资源丰富，全区大多为赤红壤，部分为黄壤。整个茶区高温多湿，年平均温度在2 0 以上， 三l o 积温达6 5 0 0 以上，无霜期3 0 0 3 6 5 天，年极端最低温度不小于一3 ，大部分地区 四季常青。全年降水量可达1 5 0 0 毫米。 1 1 3 茶树的传播 李蟠【2 1 2 l 认为茶树从原产地云南，向各个方向扩展，由于地理气候不同以及经过人 工和自然的选择，形成了不同的茶树类型。由西藏山系和云贵高原发源下来的诸河流沿岸 山林中蕴藏着许多的野生茶树，各条江河中下游分别流入印度、越南和缅甸等国家，这些 国家的大叶种茶树，它们和云南大叶向西和南传播是有极深的历史渊源的。印度生长的野 生茶树，据考证就是阿萨姆茶，是云南大叶茶的栽培类型；而缅甸和越南所称的掸部种， 与我国广泛分布在云南、广西的栽培类型白毛茶一致。世界上其他产茶国的茶树均直接或 间接的源于中国【2 ”j 。 根据对茶树酯酶同工酶的研究结果，初步认为茶树从原产地，是呈扇状向外传播扩散 的。一条是从地势高的云南向地势低的东南方向扩散，后沿海北上；另一条是向西北方向 扩散。在传播过程中，从海拔高向海拔低的地方传播要早于向西北方向扩散【2 l3 1 。游小青和 李名君( 1 9 9 2 ) 从茶树资源的帖烯指数( t i ) 推测茶树在我国有4 条主要传播途径，第1 条从云南经广西、广东、福建到浙江，即沿海路传播；第2 条从云南先经四川，再进入陕 西：第3 条从云南沿长江，自四川、湖北传至安徽和江苏；第4 条从云南经四川到贵州、 湖南进入江西和浙江。日本竹尾忠一 2 1 4 】等根据茶树帖烯指数( t i ) 的研究也认为茶树起源 于云南，然后沿长江和沿海逐渐向东和南方传播。 广东省的茶树资源是从茶树原产地云南沿第1 条传播途径首先传播到的，所以广 东省具有很丰富的茶树资源，加上广东省属于南亚热带季风气候区，气候温暖，雨量充沛， 无霜期长，是适宜各种茶树生长的最佳区域。广东省在具备很好的茶树资源的同时，又具 有优异的地理条件，能够很好的保存、利用茶树资源，并能进步选育开发更多的优异茶 树资源。 1 2 茶树遗传多样性研究 1 2 1 茶树表型多样性 遗传多样性为物种涵盖的群体间和群体内个体间遗传变异的总和，包括表型、生化、 染色体、蛋白质、d n a 和碱基序列等多层次遗传变异u q “j 。形态特征是遗传和环境、结构 基因和调节基因综合作用的结果，形态特征的变化可作为遗传变异的表征【l2 ”j 。各类生物 包括现在的转基因植物，其很多表型特征具有遗传稳定性【1 4 。1 ”，因此，表型变异是遗传多 样性研究的重要内容【他引】。形态特征与植物的营养和其他生理、生态因子，以及植物的繁 殖密切相关，因而具有研究价值1 2 2 。”j 。 茶树的表型特征包括：树型、树姿、新梢、芽叶、花器官等。通常可以通过茶树的外 部特征特性来衡量其产量性状、品质性状、抗逆性的优劣。单位面积内芽叶数量与每个芽 叶平均重量( 简称“芽数”与“芽重”) 是构成茶叶产量的两个基本因素。根据福建茶叶 研究所和浙江杭州茶叶研究所的研究，芽叶与产量之间的相关比芽重与产量之间的相关更 为密切，相关系数在o 8 以上，在鉴别产量高低时，更应侧重芽数】。另据有关资料总结， 性状与产量有一定的相关性( 见表l 一1 ) 。同时，相关关系因栽培地点、品种类型及树龄等 因素而异，例如发芽密度和产量虽呈高度正相关( 相关系数r = o 7 8 6 ) 。茶氨酸与绿茶品质 等级呈显著正相关，相关系数为o 7 8 7 0 8 2 6 【2 “。 表1 1 茶树性状与产量的相关性 t 曲l e1 一lr e l a 廿o n s h i p 跏d y s i sb e t w e e nd i v 盯s 畸o f p h e n o 泖ea i l dc h a r a c t e r 、十十+ 分别代表p 印度品种 中国品种 肯尼亚品种 斯里 兰卡品种 越南品种 日本品种 中国台湾品种。统计分析表明，种群内个体之间的变异最 大，变异程度达7 2 。对遗传距离的计算结果也表明，来自不同国家的茶树品种，在种群 内都存在丰富的遗传变异。黄建安【坶”依据“双假测交理论”，以祁门4 号潮安大乌叶的 f 1 代群体为材料，采用2 2 对引物组合，对a f l p 标记在f 1 代群体的多态性及分离方式进 行研究，结果表明：a f l p 标记在该f 1 代群体中的多态性较高，多态分离位点出现的平均 频率为2 5 2 0 。分离方式有孟德尔分离、偏孟德尔分离及异常分离3 种。在p = 0 0 1 水平 上，3 种分离位点出现频率分别为9 3 3 7 、6 1 8 、o 5 2 ，其中孟德尔分离位点占分离位 点总数的7 3 4 0 ：在孟德尔分离位点中发生1 ：1 分离位点为6 9 4 1 ，发生3 ：1 分离的 位点为3 0 5 9 。 4 本研究目的和意义 4 1 研究目的意义 本项目是广东茶树资源评价研究项目的一部分，属于“种性”分类研究。本研究 采用a f l p 分子标记技术，研究广东地方群体茶树品种间和品种内的遗传多样性及遗传差 异。目的在于揭示广东茶树地方群体品种的遗传多样性、亲缘关系、类群划分和资源鉴定， 为广东茶树资源利用、保存、种质的鉴定、筛选提供初步的科学依据。 4 2 研究内容 本研究的主要内容是：用于a f l p 分析的d n a 模板的制各；广东茶树种质资源遗传 多样性a f l p 分析；乐昌白毛茶品种内遗传多样性a f l p 分析；广东地方群体茶树品种的 鉴定。 4 3 技术路线 技术路线如下图所示 第二章模板d n a 的制备 1 材料与方法 1 1 材料 将采自广东茶叶研究所的2 5 个广东地方群体品种和5 个对照品种( 共5 1 7 个单株) 1 芽2 叶夏梢于7 0 冰箱保存。供试材料名称及来源见表2 - l 。实验材料性状见表2 2 。 表2 1 供试材料名称及来源 t a b l e2 1 t h en a m ea n dr e s o u r c e s o f t e ag e n n p l a s m so f g u a l l g d o n gp r o v i n c e 注：c k 表示对照 伸拿毒草 拿拿 肇 0拿触 垛蚓，撩蜡 垛翳 _ 鞋啭 撩骠嫩媾 _ 璺嚆绦氍冰骤，精蜊礞蚓，撩粗垛蜊，梅媾搬划，梅嘶梅蜡，帐i； 噬霉撇蟮翳掣精蠼浆掣精蜒鬣掣撒辗馥越精搽释掣撇辗疆掣擀辖晒掣竹擐搿蛆精堰隈啦撇堪 疆掣精鞲精爆蛆精据精 螓划，糕掇寸 爆掣精螭怠 嚆醛啭啭嫩 求妊 水嚣求嚣 鳗牛螋帮 圆罂毕 酬廿 苫k 崇土卅*临 千 忙 雉旺* l 嫌岬廿摊匠心一 囤罂 爿导 古岳 崇士f 扑 * 擗 彗忙 f l 长l 句犯古辜l 2 直辖半 州廿 廿壬 桀崴牡 * 蝉 掣忙 毫l * l 0皿r|善l! 蝾 水罐 坦撂本辎，匣篓 “哥 4 廿廿 卷鬃* 临 掣姆 斡目* l 垛叮1圳帐斟嘲c1 曙 球疑 趟撂 匣罂 州廿 古、，张隶* * 避 掣僻 蝌蜒* l 撩联钾蚪蜒2 蛹 求菠 牛 匿颦 删廿 古岳 采欺 * 蕈 驵忙 哺避婚l 搬r r l 婚蜒 = 撩 球捃 匣罂 爿廿 古 涨隶 * 期 掣蜒 娶仆* l 垛圃唧琶件 孛 翳嫩，媾球薛，求蘼塑器，牲末鲻，凰嚣 甜岳 古杉脒胩斛 * 晦 蜡隧噼磷蜡爨，骈 冰烬水妊销凝求凝g 凝 理撂 匾嚣半 鞘畔 古杖 制铷* 帐 荦忙 掣悼 怔埘髅l亏姐长l k 怔埘 垛m 皿 啦 h 国罂蛆 州廿 亡廿 卷束井*憔 蚶忙 酶辞* l 糕钾皿蜡辞 心 衄证婚l 嵌惮皿j吐怔 n 凰耀半 甜岳 旨哥耩崴* 长帱 掣忙 晕u * l 辅岬皿晕u 寸 鲁任 圆嚣丝 州廿 f 一杉 悟删 * 性掣忙 叫啦妊l 糕岬皿叩妊 n 懈器* l 栽凹鼾忸悼 n d 彩 匿霉丛 甜叶 古导 悄删*临掣忙 诫掰长l 罩* 圃区 _ 【 掣幂螋 蛆剡撼 忡材 古搬 羽醢 古蚺 旧占 蹊钲划 、f ，杖 剥瓤 映 亡酶 t 古 蹴嚣 刮霉 蒋萁 蛩址延 心 簿婶蟮茫世 。口州2aiio勺ubno-o协盎葛叠dl置豁时d=o。一苗馏3葛州。奢n曲o_icig 琳啦妲葵掣龚萁禽籍n文憾 竺2 舄蜀 翻 篇葛 高罱高 篙 是 媒蝾 垛啭，撩鼎 酶熊帐婚糕蜡垛蝾_ 聋骤搬啭枨嘶 挂鼎，搬骠 _ 聱捌嵌蚓帐错 嘿掣精蝠矮掣滕辐穗掣黹撼穗掣锵蟮暇芝馘塔嘿辩掣精蝠嘿蚶滕蟮积掣馓蟮最掣撇塔踩舔芒黼蝎蹲群掣精辖嚓越黹蜒鼎越骷壤 神乎氡瞅怠限奄龟峨氡 辩 氨婚争 嚣柱啭噼媾 醛醛球捃 蝣嘶嚣嘶嘶如蝾域媾 蠹水圆 求疑水菇 球凝球培 ，求装议菇 式凝球君球帮 承疑 米粒栽凝 ，球罐 牛 ，理蓉 乒 睁理器趟帮趔蟊| 耀墅 融 圆器国举回器凰罂鼠颦翠匿器 匾攀盥 匿筚圆嚣翠匦颦半圆嚣匦霉翠凰攀 蝌廿 划岳 划岳圳州廿 州导圳昏 州导 圳乎州*圳斗刊斗州廿 古d 占k n 廿百亡岳 古杉 亡哥亡廿占岳 占k古古 + i i 岳 拦隶讣 * 燃 犁忙 * 蝰陋i 采鼠* * 收 蛆忙 町瞒* l 装隶 * 收 蚶年 辜幄* l 爱束 * 蝉 掣忙 卅浆* l 擞士*长临 掣怔 卅粒幅l 崇懿斗*帐 誊忙 十l 幅l 崇隈井 * 燃 誊忙 * l 婚l 畿隈扑*帐 掣忙 埘瞧* l 装墩 * 耙 掣年 蝌牛* l 拦隶升长惚 赳怔 h蝌随l 悄删 * 憔 蛆率 导舔怔嫩 崇鼠斗 * 栋 _ 辩忙 辫播怔咐 拦索* * 帐 掣忙 匪礞* l 藤毛卅般工i帐牝町0 皿系妲糕fj_|扭扣永 古如蜘 言k 蜒扯十l幸糖言k * l亡删除嫩阳蟮熠*岬皿赵古k 怔瓣亡k 怔m占医稚 1 2 主要仪器与试剂 主要仪器：移液器、离心管、冷冻离心机( m i k r 02 2 r 型z e n u f u g e n 公司) 、紫 外分光光度计( u v - 2 5 5 0 型，s h i m a d z u 公司) 、稳压稳流电泳仪( d y y - i i i 5 型，北京六 一仪器厂) 、电泳槽、p h 计、电热恒温水浴锅( h l s y 2 1 n i 型，北京长源实验设备厂) 、 微波炉( g a l a nz 公司) 、净化工作台( 苏州净化设备有限公司) 、p c r 扩增仪( p t c 1 0 0 型，m j r e s e a r c h i n c ) 、分析天平( p b 3 0 3 n 型，m e t t e r r i 、o l e d og r o u p ) 、雪花机 ( g r a n t 公司) 、超低温冰箱( n v m r 公司) 、立式压力蒸汽灭菌器( l s b 5 0 l 型，上 海医用核子仪器厂) 、冰箱( h a i e r 集团) 、超纯水器( b a m s t e a d ) 、紫外透射仪( r e p r o s t a r 3 型，c a m a g 公司制造) 主要试剂：d n a 提取液【0 4 m o l 1 葡萄糖，1 0 可溶性p v p ，2 n a 2 s 2 0 5 ( 用时再加) 1 、 c t a b 裂解液【0 1 m o l l t r i s c l ( p h 8 0 ) ，1 4 m 0 1 1 n a c l ，2 0 m m o l l e d t a ( p h8 o ) ，2 c 1 a b l 、 s d s 裂解缓冲液【0 1 m o l l t r i s c l ( p h 8 o ) ，1 4 m o l l n a c l ，2 0 m m o l 1 e d t a ( p h8 o ) 】、2 0 s d s 、 2 0 n a 2 s 2 0 5 、i a 酶、氯仿：异戊醇：乙醇( v v = 8 0 4 1 6 ) 、异丙醇、无水乙醇、t e 缓冲液、3 m o l 1 n a a c ( p h 5 2 ) 、5 m 0 1 l n a c l 、t a e 电泳缓冲液、e b ( 溴化乙锭) 溶液、溴 酚蓝上样缓冲液 o 2 5 溴酚蓝，4 0 ( w v ) 蔗糖，1 0 m m o l l e d t a ( p h 8 o ) 、琼脂糖。 1 3 试验方法 1 3 1 试验材料处理方法 将l 芽1 ，2 叶夏梢洗净，用吸水纸吸干，贴上标签，放入液氮中约1 分钟，迅速拿 起放入超低温冰箱冰冻保存备用。 1 3 2d n a 提取方法 d n a 提取方法参照黄建安等( 2 0 0 3 ) 【1 9 9 1 并作改进。 操作步骤： ( 1 ) 称取o 5 9 新鲜材料或冰冻材料( 干样称o 1 2 5 9 ) ，放入研钵中，于冰上研磨成粉 末状，加3 4 m l c t a b 裂解液，6 0 0 u l2 0 n a 2 s 2 0 5 ，充分混匀，室温放置1 0 1 5 m i n ； ( 2 ) 均匀分装于6 个1 5 m l 的离心管中，加入等体积( 7 0 0 u 1 ) 氯仿：异戊醇：乙醇 ( v 厂v 一8 0 4 1 6 ) ，轻摇萃取5 m i n ； ( 3 ) 1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ( 1 8 ) ； ( 4 ) 上清液转入新的1 5 m l 的离心管中，等体积的异丙醇沉淀d n a ，用宽口t i p 头吸 出沉淀，再用7 0 的乙醇洗涤2 次，放在净化工作台上吹干( 5 m i n ) ： ( 5 ) d n a 沉淀用4 0 0 l t e 溶解，加入终浓度为1 0 p g m l r n a s e ( 4 1 ) ，3 7 保温处理 3 0 m i n ： ( 6 ) 加入等体积的氯仿：异戊醇：乙醇( v v = 8 0 4 1 6 ) ，轻摇萃取5 m m ；1 2 0 0 0 r d m 离心l o m i n ( 1 8 ) ； ( 7 ) 上清液转入新的1 5 m l 的离心管中，加入0 5 体积5 m n a c l 和2 倍体积的无水乙 醇沉淀d n a ；用宽口t i p 头吸出沉淀，沉淀用7 0 的乙醇洗涤2 3 次，干燥5 m i n ； ( 8 ) 将d n a 溶于适当体积的超纯水或t e 中，部分样品用于检测d n a 的浓度和质 量，其余2 0 保存。 1 3 3d n a 质量检测方法 1 3 3 1 紫外检测d n a 的纯度 ( 1 ) 单株的d n a 样品纯度和浓度检测：将提纯后的各d n a 样品适当稀释，经紫外 分光光度计检测，读取o d 2 6 0 和o d 2 8 0 ，o d 2 6 0 o d 2 8 0 ，并根据2 6 0 衄的光吸收值计算d n a 的浓度。 ( 2 ) 群体品种d n a 样品纯度检测：根据( 1 ) 检测所得d n a 浓度，将单株样品稀释 至浓度为2 0 0 n g u l ，各取5 u l 混匀作为该群体的d n a 样品，紫外检测纯度。 1 3 3 2 电泳检测d n a 的完整性 电泳在稳压稳流电泳仪上进行，以川) n e c o r j + h i n d i i i 为标准分子量于1 0 的琼脂 糖凝胶( 含0 5 肛g m l 的e b 溶液) 进行电泳，电压为3 5 v c m ，电泳缓冲液为1 a e ，以溴 酚蓝为指示剂，待溴酚蓝跑至离胶的2 3 远处停止电泳，并在紫外透射仪下检测d n a 降解 情况和r n a 消化情况，同时根据分子量标准判断d n a 分子大小。 1 3 _ 3 3d n a 的限制性内切酶消化 提纯的d n a 用限制性内切酶e c o ri 于3 7 水浴中消化4 h ( 反应总体积为5 0 ul ，含 1 0 b u 圩e r5 “l ，d n a 5ug ，e c o ri5 u ， d d h 2 0 加至5 0 | l1 ) 。结束后于1 0 的琼脂糖凝 胶( 含o 5 p g m l 的e b 溶液) 进行电泳。并在凝胶成相仪上观察、照相。 1 3 3 4 d n a 的p c r 扩增 反应在p c r 仪上进行。实验采用2 5 u l 反应体系，其中含t e m p l a t e d n a5 0 n g ，1 0 p c r b u 旋r ( 含2 0 m m m g c l 2 ) 2 5u l ，1 0 m m d n t p so 5 l ，1 0 m m 引物s 8 2o 5 u l ，1 0 m m 引物s 2 5 1o 5ul ，t a q 酶( 2 l 】u1 ) 1 5 u ，加水至2 5ul 。反应条件为9 4 预变性3 m i n ，9 3 变性5 0 s ，3 8 退火1 m i n ，7 2 延伸1 0 0 s ，4 0 个循环，最后7 2 延伸5 m i n 。p c r 产物 1 0 u l + 2 16 b u 圩e r ，于1 6 琼脂糖凝胶电泳( 含e b 0 5u 咖1 ) 。在紫外分析仪上观察、 照相。 1 9 2 结果与分析 2 1 采用改进的c t a b 法提取的d n a 经紫外可见分光光度计检测，结果如表2 3 ，表 2 - 4 所示。从表2 3 、2 4 可看出，用此方法提取的d n a 质量较好，颜色均为白色或无色， o d 2 6 0 ，o d 2 8 0 值均在1 6 0 0 1 8 5 0 之间，表明本试验提取的d n a 纯度均较好。 表2 33 0 个品种资源d n a 的紫外检测结果 t a b l e2 3t h eu l t r a v i o l e ta b s o r b a n c eo fd n a 表2 4 1 4 号群体