（遗传学专业论文）拟南芥mir393基因转录、加工及其非生物胁迫中的功能初探.pdf

浙江大学硕士学位论文 中文摘要 日益增多的研究表明m i e r o r n h s 在真核生物发育进程和应激反应的基因表 达调控中起着重要的作用。一些植物m i r n h s 的表达水平受非生物胁迫上调或下 调，它们可能在植物非生物胁迫反应的基因转录后调控中起着作用。本文主要 通过以拟南芥m i r n h 3 9 3 家族为研究对象，初步探索了植物m i r n a 3 9 3 的生物 合成和表达模式，及干旱和盐胁迫中m i r n a 表达差异对拟南芥耐逆性的影响， 主要结果如下： 1 构建了m i r n a 3 9 3 的三类不同前体茎环结构的植物表达载体：( 1 ) 克隆拟 南芥内源m i r 3 9 3 基因家族的两个成员m i r 3 9 3 a 和m i r 3 9 3 b ，构建超达载体 3 5 s ：m i r 3 9 3 a 和3 5 s ：m i r 3 9 3 b ；( 2 ) 以拟南芥m i r 3 1 9 a 的茎环结构，人工构建 m i r 3 9 3 超表达载体3 5 s ：a m i r 3 9 3 ；( 3 ) 以哺乳动物大鼠m i r l5 5 的茎环结构，构 建m i r 3 9 3 超表达载体3 5 s ：m m i r 3 9 3 。 2 通过农杆菌介导法转化拟南芥，潮霉素筛选获得转基因株系5 个，并经 过g u s 染色、p c r 和r t - p c r 检测。转m i r n h 3 9 3 基因拟南芥没有观察到明显的表 型差异。 3 为了检测转基因株系中m i r n a 前体和成熟m i r n a 的表达水平，进行了r e a l t i m er t - p c r 和n o r t h e r nb l o t 分析，结果显示3 5 s ：m i r 3 9 3 b 三个株系的 p r e - m i r 3 93 b 和成熟m i r 3 9 3 表达量均明显增加；采用动物前体结构的 3 5 s ：m m i r 3 9 3 的转基因株系中前体p r e - m m i r 3 9 3 大量表达，但是成熟m i r 3 9 3 的 积累水平没有明显变化，说明动物来源的m i r n a 前体茎环在植物中不被加工或 者加工效率很低。 4 对拟南芥m i r n a 合成过程中的三个关键酶突变体缈，j o ，d e l l - 1 ，a 9 0 1 ， 以及m i r 3 9 3 过量表达的转基因株系进行了p e g 模拟干旱和高盐胁迫实验。结果 显示：d e l l - 1 和a 9 0 1 突变体对干旱和高盐环境的敏感性比野生型高；妙，j o 突变体比野生型具有更强的耐脱水能力，而对高盐条件敏感。过量表达m i r n a 3 9 3 转基因株系对干旱和高盐的耐受能力没有提高。 5 通过克隆拟南芥m i r 3 9 3 a 和m i r 3 9 3 b 茎环序列上游区域1 5 k b - 2 k b 的 片段，构建了g u s 基因的启动子分析载体：p m i r 3 9 3 a ：g u s 和p m i r 3 9 3 b ：g u s ， 浙江大学硕士学位论文 进行拟南芥转基因实验。对转基因小苗的叶片进行g u s 染色，结果显示：在 正常培养条件下，转p m i r 3 9 3 a ：g u s 基因小苗没有观察到g u s 基因表达；转 p m i r 3 9 3 b ：g u s 基因小苗叶脉中表达g u s 基因。推测m i r 3 9 3 a 和m i r 3 9 3 b 基因 启动子中存在着不同的调控元件。各种胁迫条件下g u s 基因表达的实验正在进行 中，将为非生物胁迫反应中m i r n a 3 9 3 基因自身表达调控机制的研究提供更多的 数据。 关键词：m i c r o r n a ；茎环结构；转录；加工；m i r 3 9 3 ；非生物胁迫 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t a ni n c r e a s i n ga m o u n to fs t u d i e sd e m o n s t r a t e dt h a tm i c r o r n a s p l a yc r i t i c a lr o l e s i ng e n ee x p r e s s i o no fb o t hd e v e l o p m e n t a lp a r e m i n ga n dp h y s i o l o g i c a lp r o c e s s e s t h e e x p r e s s i o no fs e v e r a lp l a n tm i r n a sw a sf o u n dt ob eu po rd o w nr e g u l a t e db y d i f f e r e n te n v i r o n m e n t a ls t r e s s e sa n dm a yp a r t i c i p a t ei nt h e s es t r e s sa d a p t a t i o n s w e i n v e s t i g a t e dt h a th o wp l a n tm i r 3 9 3g e n e sw e r er e g u l a t e da n db i o g e n e s i s ，a n di t s p o t e n t i a lr o l e si nt h er e s p o n s e st od r o u g h ta n ds a l ts t r e s s e si na r a b i d o p s i s o u r e x p e r i m e n t a lr e s u l t sw e r es h o w n a sf o l l o w i n g s ： 1 s e v e r a lo fp l a n te x p r e s s i o nc a s s e t t e sc o n t a i n i n gt h r e ed i f f e r e n tk i n do fs t e m - l o o p p r e c u r s o rw e r ec o n s t r u c t e d ：1 ) e n d o g e n o u sp r e m i r n a 3 9 3 aa n dp r e - m i r n a 3 9 3 b b a c k b o n e sw e r ec l o n e d a n dt w oo v e r 。e x p r e s s i o nc a s s e t t e so f3 5 s ：m i r 3 9 3 aa n d 3 5 s ：m i r 3 9 3 bw e r e c o n s t r u c t e d 2 ) 3 5 s ：a m i r 3 9 3 w a sc o n s t r u c t e dw i t ha n a t - m i r 3 1 9 as t e m l o o p 3 ) 3 5 s ：m m i r 3 9 3w a sc o n s t r u c t e dw i t ham u s m i r l 5 5 p r e c u r s o rb a c k b o n ef r o mm u r i n e 2 u s i n ga g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n ，f i v et r a n s g e n i cl i n e s w e r eo b t a i n e db yh y g r e s i s ts c r e e n i n g ，g u s , p c ra n dr t - p c ra n a l y s i s n oo b v i o u s p h e n o t y p ec h a n g e sw e r eo b s e r v e di nt h e s el i n e s 3 r e a l t i m er t - p c ra n dn o r t h e r nb l o t sa n a l y s i ss h o w e dt h a tl e v e l so fb o t h p r e - m i r 3 9 3 ba n dm a t u r em i r 3 9 3w e r ei n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yi nt h r e et r a n s g e n i c l i n e s a l t h o u g hl e v e lo fp r e - m m i r 39 3w a si n c r e a s e d ，a c c u m u l a t i o no fm a t u r em i r 39 3 w a sv e r yl i m i t e di n3 5 s ：m m i r 3 9 3 t r a n s g e n el i n e s i ts u g g e s t e dt h a tm i r n a p r e c u r s o rf r o ma n i m a l sm i g h tb ep r o c e s s e di n e f f i c i e n t l yi np l a n t 4 u s i n gp e g - m e d i a t e dd r o u g h tt r e a t m e n ta n dn a c i s t r e s sa s s a y , g r o w t ho f t r a n s g e n i ca n ds e v e r a lm u t a n t so fh y t l l ，d e l l ia n da g o l ，w e r em e a s u r e d t h e r e s u l t sr e p r e s e n t e dt h a td e l l la n da g o lm u t a n t sw e r eh y p e r s e n s i t i v et od r o u g h ta n d n a c l ，a n db y l l - jm u t a n tw a sm o r et o l e r a n tt od r o u g h tc o m p a r a t i v et ow i l dt y p e m i r 3 9 3o v e r e x p r e s s i o nt r a n s g e n i cl i n e se x h i b i t e dn oo b v i o u st o l e r a n c ec h a n g ei n r e s p o n s et od r o u g h ta n dn a c it r e a t m e n t 5 1 5 - 2 k bp u t a t i v ep r o m o t e rs e q u e n c e su p s t r e a mt h ef o l d - b a c ks t r u c t u r eo f v l i 浙江大学硕：卜学位论文 m i r 3 9 3 ao rm i r 3 9 3 bp r e c u r s o rw e r ei s o l a t e da n df u s e dt og u s r e p o r t e rg e n et o g e n e r a t ep m i r 3 9 3 a ：g u sa n dp m i r 3 9 3 b ：g u st r a n s g e n i cp l a n t s u n d e rn o r m a l c u l t u r a l c o n d i t i o n ，gu se x p r e s s i o nw a sd e t e c t e di nv e i n so f s e e d l i n g so f p m i r 3 9 3 b ：g u st r a n s g e n i cl i n e sb u tn o ti np m i r 3 9 3 a ：g u sl i n e s t h ed i f f e r e n t e x p r e s s i o np a t t e r no fm i r 3 9 3 aa n dm i r 3 9 3 bw a ss u g g e s t e dt ob er e g u l a t e db y d i f f e r e n ts t r e s s e sa n dm a y p a r t i c i p a t ei nt h e s es t r e s sa d a p t a t i o n s k e y w o r d s ：m i c r o r n a ；s t e m l o o p ；t r a n s c r i p t i o n ；b i o g e n e s i s ；m i r 3 9 3 ；a b i o t i cs t r e s s ； v 1 i i - 浙江大学硕士学位论文 l_l l _ 一_ _ _ _ _ _ _ - - 一 缩略词表 _ 一一_ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ 一 缩写词 英文全称 d c l id i c e r l 1 k e l h y l l a g 0 1 h e n l 砒s c p t g s c o i 0 l e r w s d s r n a d n a s i r n a 2 ，4 一d 6 b a u t r r r - p c r g f p g u s x g l u c r i f k a n a m p h y g c t a b h y p o n a s t i cl e a v e sl a r g o n a u t el h u ae n h a n c e r l r n a i n d u c e ds i l e n c i n gc o m p l e x p o s t t r a n s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n g c o l u m b i a l a n d s b e r g e r e c t a w a s s i l e w s k i j a d o u b l e s t r a n d e di 必a ； d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d s m a l li n t e r f e r i n gr n a 2 ，4 一d i c h l o r o p h e n o x y a c e t i ca c i d 6 - b e n z yl a m i n p u r i n e u n t r a n s l a t e dr e g i o n r e v e r s et r a n s c r i p t i o n - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n 3 - g l u c u r o n i d a s e 5 - b r o m o 4 - c h l o r o 3 一i n d o l y l - 3 - d g l u c u r o n i c r i f a m p i c i n k a n a m y c i n a m p e n i c i u i n h y g r o m y c i n h e x a d e c y lt r i m e t h y la m m o n i u m b r o m i d e d n t p d e o x y r i b o n u c e l e o s i d et r i p h o s p h a t e b p b a s ep m r x i - 浙江大学硕士学位论文 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得浙江太堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：签字日期：年月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解浙江太堂有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权浙婆太堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：导师签名： 签字日期：年 月日 签字日期：年 月 日 浙江大学硕士学位论文 致谢 本论文是在导师边红武副教授的悉心指导下完成的，论文从选题、方案制定 到结果分析，每一个细节都凝结着导师的心血和智慧。边老师严谨求是的治学态 度，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德，朴实无华、平易近人的人格魅 力都令我钦佩，值得我永远学习。非常感谢边老师两年来在科研学习和生活上对 我的的关怀，特别是在论文的完成过程中，边老师更是给予了我巨大的帮助和指 导，让我受益匪浅。在此，谨向我的导师表示衷心的感谢。 我还要感谢朱睦元老师，韩凝老师，王君晖老师，潘建伟老师两年来对我一 如既往的关心和帮助，特别感谢韩凝老师，在我的实验过程和论文写作中提供了 许多的宝贵建议和指导，给予我很大的帮助。 感谢陈哲皓师兄在我实验和论文完成过程中给予的指导和帮助，感谢实验室 林伟强、张明哲、王闻哲、林二培、邓敏娟、杨燕君、吴琼、金炜元等师兄师姐 在我读研期间给予的无私帮助；感谢鲍烈明、钱佳、李桃、李璇、汤在明、余文 静、朱宇斌、张新明等同学，大家一起营造了一个温馨的集体，祝愿这个集体持 续健康蓬勃发展。另外，也要感谢马骋、马慧、孟萱、杨晓睿等本科生在实验上 对我的帮助。 感谢我的爷爷，爸爸，妈妈，多年来对我的养育之恩，感谢姐姐姐夫的关心 和帮助，是他们一直在背后默默地支持我，使我能够安心投入学习和工作中，并 能够以平和的心态应对困难。感谢所有关心我的亲人、老师、同学、朋友，谢谢 你们! 徐小红 2 0 0 8 年6 月浙江大学 生科院细胞与遗传研究所 浙江大学硕士学位论文 第1 章文献综述 植物中m i c r o r n a 的合成及功能的研究进展 在生物体中含有丰富的r n a ，它们具有重要的生物学功能，但在很长一段 时间里，对基因的研究主要集中在蛋白质编码基因上，对r n a 的认识也仅仅局 限在与蛋白质的合成直接相关的r r n a 、t r n a 和m r n a 。后来陆续发现了核酶 和反转录酶，对r n a 的认识才有了一个突破。研究发现，r n a 具有重要的生物 学功能，如参与基因的表达调控、r n a 的定点修饰，以及染色质的结构组织等 等。r n a 在基因表达调控中的作用越来越受到人们的重视。目前，双链r n a ( d o u b l e ss t r a n d e dr n a ，d s r n a ) 介导的r n a 干扰( r n ai n t e r f e r i n g ，r n a i ) 已 成为研究的热点。在多种生物中，外源双链r n a 导入细胞，与d s r n a 同源的 m r n a 会被降解，导致转录后基因沉默( p o s tt r a n s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n g ， p t g s ) 。与此同时，研究发现在生物中广泛存在一类非编码蛋白的r n a ，它们 被命名为而m i c r o r n a ( m i r n a ) 。m i r n a 由基因编码，其表达具有组织和时期 特异性，其中一些基因在进化上有很高的保守性( l e ee ta 1 ，2 0 0 1 ；d a v i dp b a r t e l ， 2 0 0 4 ) 。这类新发现的r n a 具有调节其他基因表达的活性，在生物发育过程中 发挥着重要的作用，成为近几年生命科学研究的重要内容之一。2 0 0 2 年， m i c r o r n a 的研究被s c i e n c e 杂志评为十大科技突破第一名，被称为r n a 的第二 次革命，为人们提供了一种全新的角度来认识基因及其表达调节的本质。 m i c r o r n a ( m i r n a ) 是包括动物和植物等真核生物中发现的一类单链、 长 度约为2 0 一2 4 m 的内源性非编码的调控r n a ，能够通过与靶m r n a 特异性的 碱基配对引起靶m r n a 的降解或者抑制其翻译，从而对基因进行转录后表达的调 控( b a r t e ldp ，2 0 0 4 ；o d o n n e l lk ae ta 1 ，2 0 0 5 ) 。m i r n a 本身不编码任何蛋 白质，无开放阅读框：架( o p e nr e a df r a m e ，o r f ) ，具有序列保守性、表达时序性和组 织特异性等特点( l e ee ta 1 ，2 0 0 1 ) m i r n a 的功能并不局限于发育调节，还可 能控制着生长发育和生理机能的很多方面( c h e nx u e m e i ，2 0 0 5 ) 。随着大量 m i r n a 在各种物种发现，其广泛存在与进化保守性也暗示着它在生命活动中必 不可少的调节作用，对基因表达、生长发育和行为等都具有十分广泛和深远的影 响。 植物m i r n a 的系统研究始于2 0 0 2 年。研究认为m i r n a 能够识别特定的 m r n a ，并在转录及转录后水平有负调控基因的表现( y uh ，k u m a rpp ，2 0 0 3 ) ， 对植物基因表达、生长发育、抵抗胁迫等都有十分广泛和深远的影响( k i d n e rc a ，m a r y i e n s s e nra ，2 0 0 3 ) 。目前植物m i r n a 的研究多集中在模式植物拟南芥 ( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) d f z ，本文主要介绍以拟南芥为主要材料的关于植物m i r n a 浙江大学硕士学位论文 合成和功能等方面研究的一些进展。 1 1m i r n a 的发现 早在1 9 9 3 年l e e 等利用遗传分析方法在线虫中发现一个编码2 2n t 的小分 子非r n a 的基因l i n 4 。该基因具有以下特点：长度较小，不编码任何蛋白质，转 录成具有发夹结构的前体r n a ，前体r n a 在某种机制下被加工成长度约2 0 个 核苷酸r n a ( l e erc e ta 1 ，1 9 9 3 ) 。进一步研究表明，该r n a 是线虫异时发育 时钟途径( h e t e r o c h r o n i cd e v e l o pm e n t a t i m i n gp a t h w a y ) 基因( 砌一1 4 ，l i n 一2 8 ) 的反义 翻译抑制物( a n t i s e n s et r a n s l a t i o nr e p r e s s o r ) ( w i g h t m a nb e ta 1 ，19 9 3 ；m o s sege t a 1 ，1 9 9 7 ) 。l i n 4r n a 可以和后两个基因m r n a 的3 端u t r 序列互补而抑制其 翻译。在正常情况下它们编码的蛋白质在幼虫期是被l n 4 基因产物抑制。由于 n 4 基因突变，抑制作用丧失，突变体就不能正常发育。 n 4r n a 被发现后，并未引起研究者太多的注意，因为尚未在其他生物中 找到类似的r n a 。直至r e i n h a r t 等发现了另一个类似的具有转录后调节功能的 小分子r n a ：e t 7r n a ( r e i n h a r tbje ta 1 ，2 0 0 0 ) 。由于两者卓越的时序调节功 能，被命名为小分子时序r n a ( s m a l lt e m p o r a lr n a ，s t r n a ) 。随后，在人、鼠及 植物等物种中相继发现了它们的存在( p a s q u i n e l l i a e ，2 0 0 0 ) ，2 0 0 1 年世界不同 国家的三个研究小组在线虫( ce l e g a n s ) 、果蝇( d m e l a n o g a s t e r ) 和人体中发现 了近百个这样的基因，于是国际统一将这类小r n a 命名为m i c r o r n a ( m i r n a ) ， m i r n a 的研究也成为新的热点。相对动物而言，植物m i r n a 的研究起步较晚， 但其进展却迅猛异常。2 0 0 2 年，3 个研究小组分别报道从模式植物拟南芥中发现 了m i r n a ( b a r t e ldpe ta 1 ，2 0 0 2 ；c a r r i n g t o i ljce ta 1 ，2 0 0 2 ；c h e nxe ta 1 ， 2 0 0 2 ) 。 1 2m i r n a 的分离鉴定 现在新的m i r n a 的分离鉴定主要依靠克隆测序方法和生物信息学方法。克 隆测序方法是目前最有效、可信的方法，植物中最早的m i r n a 的获得就是采用 该方法( l l a v ece ta 1 ，2 0 0 2 ) 。迄今，运用直接的m i r n a 克隆测序策略已在许多 物种中鉴定了大量的初始m i r n a s 然而该方法的局限性是一些表达量较低，仅 限于部分组织或某些特异胁迫处理条件表达的m i c r o r n a 至今仍难以获得。运用 生物信息学策略，可以排除这些干扰。利用m i r n a 进化上的保守性、m i r n a 前 体具有的发卡结构( h a i 印i n ) 、m i r n a 与靶基因的互补性等特征，人们设计开发 了分离鉴定植物m i r n a 的生物信息学软件和方法，预测和鉴定了一批新的 m i r n a ( m l o t s h w ase ta 1 ，2 0 0 5 ；j i ny xe ta 1 ，2 0 0 5 ) 。缺点是这些预测并不能 针对所有可能存在的m i r n a s ，尤其是系统发生学上不保守的序列，而且所有的 序列预测仍需独立的实验性验证。近年的文献中报道了m i c r o a r r a y 技术的利用， 浙江大学硕士学位论文 即在阵列上添加预测的成熟m i r n a 序列，用于m i r n a 表达谱的分析。这种 m i r n a sm i c r o a r r a y 技术能在一次实验中检测所有已知的m i r n a s 转录物，有利 于快速地分析植物m i r n a 的表达模式，发现m i r n a 在不同组织、不同处理或 不同基因型之间的差异表达。该方法对于发现已知m i r n a 的新功能，以及 m i r n a 基因自身的表达调控有一定的优势。但是，其最大的问题是所用的探针 都来源于已知的m i r n a 序列，却不能发现新m i r n a 。 为了提高小r n a 的克隆效率，c u m m i n s 等建立了m i r a g e 新方法，即传统 的m i r n a 直接克隆技术和能有效发现新基因的s a g e 技术相结合。该方法的主 要过程是先分离纯化1 8 2 6 n t 的r n a 分子，然后连接上特殊的接头并逆转录成 e d n a ；接着，用s a g e ( s e r i a la n a l y s i so fg e n ee x p r e s s i o n ) 方法优化小r n a 分 子的鉴定，主要涉及c d n a 复合物的p c r 扩增、t a g 纯化、串联、克隆和测序。 m i r a g e 技术的优势在于一次测序即可鉴定包含3 5 个t a g s 的小r n a 串联体， 能极大提高新的低表达丰度m i r n a 的筛选效率。该技术首次在人类结肠细胞中 进行m i r n a s 的鉴定研究，发现了2 0 0 个已知的成熟m i r n a s ，以及1 3 3 个新的 候选m i r n a s ( c u m m i n se ta 1 ，2 0 0 6 ) 。由此可见，植物基因组中尚存在很多未发 现的m i r n a s ，m i r a g e 为大规模克隆新m i r n a s 提供了有效的实验方法。 根据最新的m i r b a s e 数据库( h t t p ：m i c r o m a s a n g e r a c u k ) ( r e l e a s el1 0 ) ，已 有6 3 9 6 种m i r n a 登记注册，而且这个数字仍在不断地增长。但许多科学家预 测仍有大量m i r n a 未被人们所发现。因此，开发高通量、高灵敏性和高可比性 的m i r n a 鉴定技术是发现未知m i r n a s 的关键因素。 1 3 植物m i r n a 的特点 植物m i r n a 除了具有一般m i r n a 的特点，比如：长度约为2 0 2 4 n t ；没 有开放阅读框( o r f ) ；基因成簇性；表达具有时空特异性；成熟的m i r n a 5 端有 一磷酸基团，3 端为羟基；5 端多以u 开头等等( d a v i dp b a r t e l ，2 0 0 4 ) ，还具 有植物本身的特点。主要有以下几点： ( 1 ) 植物m i r n a 前体的茎环结构( s t e m 1 0 0 p ) 更大、更复杂，预测的折回折 ( f o l d b a c k ) 长度变异( 6 4 3 0 3 n t ) 也比动物m i r n a ( 6 0 7 0n t ) 明显( m i l l a ra a ，w a t e r h o u s epm ，2 0 0 5 ) 。推测可能由于动物m i r n a 前体的加工是在细胞质中 完成，前体从细胞核经核孔复合物转运到细胞质需要一定的转运机制，因此前体 的分子大小要在较小的范围内才能顺利地被转运；而植物m i r n a 前体的加工是 在细胞核中，加工成熟后才被转运到细胞质中，所以分子大小的范围变化较大。 ( 2 ) 植物m i r n a 较动物m i r n a 更为保守，它们与互补序列的错配数也少于 动物m i r n a ( m i l l a r a a ，w a t e r h o u s epm ，2 0 0 5 ；c h e nx u e m e i ，2 0 0 5 ) 。这一特 点可能与植物m i r n a 一般以近乎完全互_ 辛i 、的方式与它的靶m r n a 结合有关， 而大多数动物m i r n a 和它们的靶m r n a 是不完全互补配对的( k i d n e rca ， 浙大学碰f 学位论文 m a r y i e n s s e nr a ，2 0 0 3 ；l i nh e ，g r e g o r yjh a r m o n ，2 0 0 2 ) 。但是关于植物m i r n a 采用这种方式的优越性尚不清楚。 ( 3 ) 植物m i r n a 具有簇集现象。多数m i r n a 不是分散分布的，而是两个 或多个基因由一个前体m i r n a 加工而来，成簇排列的基因协同表达，显现出在 基因表达方面的数量优势( x i e ze ta l ，2 0 0 5 ) ( 4 ) 植物m i r n a 可以与靶m r n a 的任何区域作用( 主要是蛋白编码区) ，通 过切割靶m r n a 或抻制靶m r n a 翻译实现对基因表达的调控，而动物m i r n a 则王要针对靶m r n a 的3 非编码区域( 3 u t r ) ，作用机制为押制翻译的正常进 行( b a r r e l d p ，2 0 0 4 ) 1 4 植物m i r n a 的合成过程和作用机制 14 1 动物m i r n a 的合成过程 m i r n a 基因常常定位于编码蛋白质的基因之间，多以簇状形式集中在一起 ( a m b r o s ，2 0 0 4 ；b a r t e l b ，b a r t e l dp ，2 0 0 3 ) 。m i r n a 基因是一种c l a s s i i 基因， 有自己的启动子，r n a 聚合酶i i 负责m i r n a 基因的转录，转录产物有3 p o l y a 和5 帽子( j o v e r g i l e ta l ，2 0 0 5 ) 。m i r n a 基因转录后，即开始了一系列复杂的剪 切过程，直至产生成熟的m i r n a 。动物和植物m i r n a 的加工机制不同( b a r t e l d p ，2 0 0 4 ) 。 也 o l j ；怒撼 o l 瑶暨 学 。，。l 啜圈 = = = = = = ，l c = = = c v i o o 一1 p o “h ” o i q 器 _ _ o 。d x 。妇 。l 。 f = 纂烹一 图il 动物m i r n a 生物合成模式图( b a r t e l dp ，2 0 0 4 ) 浙江大学硕士学位论文 动物成熟m i r n a 的产生过程已经初步得到了诠释( 图1 1 ) 。在细胞核内， m i r n a 基因转录产q 勿( p d m i r n a ) 被d r o s h a 酶剪切，生成p r e m i r n a 。然后， 在活化形式存在的三磷酸乌苷酸酶( r a n g t p ) 调节下，核质细胞质转运蛋白 e x p o r t i n 5 将p r e m i r n a 转运出核( z e n gy ，2 0 0 4 ；l u n d ，2 0 0 4 ) 。接着，在 细胞质中，p r e m i r n a 为d i c e r 酶识别并剪切成约2 2b p 的m i r n a m i r n a * 双 链( m i r n a * 是指与成熟m i r n a 互补的r n a 单链，通常很难用n o r t h e r n 杂交检 测到) 。最后，m i r n a m i r n a * 双链解旋，成熟的m i r n a 进入r n a 诱导的沉 默复合体( i 斟a i n d u c e ds i l e n c i n gc o m p l e x ，m s c ) 中，形成非对称的r i s c 复合物 ( a s y m m e t r i cr i s ca s s e m b l y ) ，进而识别靶基因并抑制其表达( s c h w a r z e ta 1 ，2 0 0 3 ； b a r t e ldp ，2 0 0 4 ；l e ey e ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 1 4 2 植物m i r n a 的合成过程 植物成熟m i r n a 产生的研究主要在拟南芥中进行。拟南芥m i r n a 的成熟 过程如图1 2 所示，包括转录、加工成熟及功能复合体装配3 个主要步骤。首 先，在细胞核中，内源m i r n a 基因转录产生初级转录产物( p r i m i r n a ) ，然后 d i c e r - l i k e l ( d c l l ) 蛋白( 一种r n a s e l i i 家族的d i c e r 同源物) 和双链r n a 结合蛋白 h y p o n a s t i cl e a v e s i ( h y l l ) 组装成类似小r n a 加工复合体结构，将 p r i m i r n a 剪切为p r e m i r n a ，然后再将p r e m i r n a 剪切为m i r n a m i r n a * 双 链，m i r n a m i r n a * 双链的3 末端又被e n h a n c e r l ( h e n l ) 甲基化( y ue ta 1 ， 2 0 0 5 ；c h e nx e ta 1 ，2 0 0 2 ；v a z q u e zfe ta 1 ，2 0 0 4 ) ，最后由e x p o r t i n 5 的同源 蛋白h a s t y ( h s t ) 将甲基化的m i r n a m i r n a * 双链输送至细胞质中( h a l l m he ta 1 ，2 0 0 4 ；t o m a r i & z a m o r e ，2 0 0 5 ) 。最后，基化的m i r n a m i r n a * 双 链解旋，成熟的m i r n a 在a r g o n a u t e l ( a g 0 1 ) 蛋白辅助下进入r i s c ，形成 非对称的r i s c 复合物，进而指导靶基m r n a 裂解或阻止其翻译( j o v e r - g i le ta 1 ， 2 0 0 5 ；b a u m b e r g e r & b a u l c o m b e ，2 0 0 5 ) 。a g 0 1 蛋白是r i s c 中的主要组成成分， 所有的a g 0 1 蛋白都包含有一个与m i r n a s i r n a 结合的p a z 结构域以及一个 与核酸内切酶r n a s e h 相关的具有剪切活性的p i w i 结构域。 由图1 2 可以看出，在m i r n a m i r n a * 双链中，只有一条链可以结合到 r i s c 上，成为成熟的m i r n a ，而另一条链则被降解，但是生物体是如何分辨哪 一条链是m i r n a ，哪一条链进入降解途径的呢? 实际上，m i r n a m i r n a * 双链 是不完全配对的，m i r n a 链上靠5 端有一个不与m i r n a * 链对应位置配对的突 起，有学者认为正是这个突起显著地减弱了m i r n a 链5 端的稳定性，而成熟 m i r n a 的产生趋向于选择更不稳定的5 端( s c h w a r z dse ta l ，2 0 0 3 ) ，因此， m i r n a 链被选中的机会要大大多于m i r n a * 链 浙缸人学碗学位论文 + 掣厂、 “。“4 _ 幅) + o “，四 乓缫 。r + 一，田 叫山i i i i “i l i l p 一e n t 雠8 x 孙。蕊潍“舶 争l 垦 。盆盈脚“ t m i r n a d e gr a d a 衄n ：鬻尹“。端o 1 。r aj日ig 图12 拟南芥中m i r n a 台成模式田( j o n e s - r h o a d e se t a l ，2 0 0 6 ) f i g i2 a m o d e l f o r m i e r o r n a s b i o g e n e s i s i n a r a b d o p s l s 1 4 3 参与植物m i r n a 的合成过程的关键蛋白 ( i ) d i c e r - l i k e l ( d c l i ) 拟南芥有4 种d i c e r - l i k e 基因：d c l i 、d c l 2 、d c l 3 和d c l 4 ，它们编码的 蛋白的作用参与各种小r n a 的生物合成。这些酶在植物中行使不同的功能，但 只有d c l l 是m i r n a 生物合成所必需的d c l i 无效等位基因纯合子的胚胎会 死亡( s c h a u e re ta l ，2 0 0 2 ) ，一些非致死d c l l 突变体如d e l l ，d c l l 7 的m i r n a 积累量减少，而其它d c l 基n ( a c t 2 - 4 ) 突变并不影响m i r n a 积聚量或造成严重 的发育缺陷，表明d c l 2 4 可能与m i r n a 合成；碳( b a r t e l b a r t e i ，2 0 0 3 ；c h e n x ，2 0 0 5 ) 。 ( 2 ) h y p o n a s t i cl e a v e s if h y l d 前文已经提及，h y l i 和d c l 可组装成类似于小r n a 加工复合体 f m i c r o p r o c e s s o r ) l 均结构。该复合体的分子量恰好等于h y l i 与d c l i 之和( h a m 浙江大学硕- 上学位论文 e ta 1 2 0 0 4 ；t o m a r i 和z a m o r e2 0 0 5 ) 。h y l l 蛋白有两个双链r n a 结合构型( m o t i f ) ， 与秀丽隐杆线虫的r d e 4 和果蝇的r 2 d 2 同源。r d e 4 和r 2 d 2 是r n a i 途径 中的双链r n a 结合蛋白，d i c e r 与r i s c 相互作用时，r d e 4 和r 2 d 2 蛋白呈现 双链r n a 结合活l 生( l i u e ta 1 2 0 0