（微生物学专业论文）维生素b12高产菌株的选育及其发酵过程优化.pdf

维生素b l2 高产菌株的选育发其发酵过程优化 论文题目：维生素b 。：高产菌株的选育及其发酵过程优化 专业：微生物学 硕士研究生：陈静 指导教师：刘建忠副教授 摘要 维生素b 。2 ( 氰钴胺素) 是一种人体和动物必需的维生素，作为辅酶参与体 内许多生化代谢反应。临床上主要用于因维生素b 。：缺乏所致疾病，如恶性贫血、 白细胞减少症、吸收不良等疾病的预防和治疗，也用于治疗三叉神经痛、神经炎、 皮炎、舌炎、慢性皮肤溃疡、扁平疣和偏头痛等疾病。它还和其他维生素一起构 成多种维生素制剂，作为非处方类药物而广为销售。除此之外，它还被大量应用 于动物饲料、营养补充剂和食品加工方面。 目前，国际上几大公司都己采用微生物发酵法生产维生素b - 2 ，国内也有少 数几家大公司利用引进的国外技术来生产，但是技术水平与国外先进水平相比仍 存在较大差距。为此，选择维生素b 1 2 高产菌株的选育及其发酵过程优化作为学 位论文题目，希望缩短国内差距，开发自有技术，推动维生素b 1 2 的发展，满足 国际与国内市场上对维生素b t 2 的需求。 本论文选用谢氏丙酸杆菌( p r o p i o n i b a c t e r i u ms h e r m a n i i ) 结合理性育种技术， 分别采用亚硝基胍( n t g ) 和紫外线( u v ) 诱变结合抗代谢抑制剂法成功地得 到一株稳定的高产菌株，命名为只s h e r m a n i in u 一1 1 。在原始的发酵条件下，高 产突变株ps h e r m a n i in u - 1 1 摇瓶发酵7 2 h 的维生素b 1 2 产量( 2 7 0 6m g l ) 较 之母株r s h e r m a n i iy - 3 1 ( 1 5 8 9m g ，l ) 提高了7 0 3 。 利用单次单因子法确定了该突变株ps h e r m a n i in u 1 1 合成维生素b 1 2 的 最佳碳源为葡萄糖+ 糖蜜：最佳碳源含量为1 5 ；最佳氮源为玉米浆；对产维 生素b 1 2 有促进作用的金属离子按照c a “、k + 、f e “、舢“、c d “、b a “、m g + 、 ! ! 堕旦! 些叁堂型! ! 兰些堡兰 上! 生 z n 2 + 、c u “、m n 2 + 的顺序，其促进作用依次增强；最适c 0 2 + 离子浓度为7 0m l ； 最适m 9 2 + 离子浓度为1 0m g l ，并且最适镁盐为m g c l 2 ；最佳装液量为2 0 ； 最佳菌龄为1 6 h ；最佳接种量为1 2 5 。通过单次单因子优化，突变株p 曲e m 口n i in u 1 1 发酵7 2 h 的维生素b 1 2 产量( 4 1 1 9r a g l ) 较原始培养条件下 维生素b 1 2 产量( 2 7 0 6m g l ) 提高了5 2 2 。 利用p l a c k e t t b u r m a n 设计法从初始p h 值、总碳量、w * t - ：w * 曩、玉米 浆、k h 2 p 0 4 、( n h ) 2 h p 0 4 、f e s 0 4 、m g c l 2 、m n s 0 4 、c a c l 2 、n a c i 和c o c l 2 的浓 度共十二个因子中筛选出w q - ：w * 女、玉米浆、m n s 0 4 和c a c l 2 四个因子对维 生素b 1 2 的产量影响较大。这四个因子对目标的影响的显著水平分别是9 3 、 9 2 1 、9 2 4 和9 2 5 。 采用响应面法之一的中心组合设计来确定w 自- _ ：w * 蜜、玉米浆、m n s 0 4 和c a c l ：这四个因子的最佳条件，并研究了这四个因子之间的相互影响关系。w 自蝻：w 鼍t 和e a c h 的浓度对突变株p s h e r m a n i in - u - 1 1 的维生素b 1 2 产量有显著 的负影响，玉米浆浓度对目的产物有显著正影响。最终得到一个廉价高效的发酵 培养基( 每1 0 0 0 m l 蒸馏水中) 及培养条件：葡萄糖2 2 9 ，糖蜜1 2 8 9 ，玉米浆 2 2 5g ，k h 2 p 0 41 2 5g ，f n h ) 2 h p 0 42 5g ，f e s 0 4 7 h 2 05m g ，m g c l 21 0m g ， m n s 0 4 h 2 01 7m g ，c a c k5m g ，n a c i1 0m g ，c o c l 2 6 h 2 07 0m g ，t w e e n - 8 01g ， 5 , 6 - 二甲基苯丙咪唑o 0 7g ，p h7 5 ，恒温摇床3 0 c ，1 2 0 r m p ，发酵培养9 6 h 。 对发酵条件优化前后突变株p s h e r m a n i in - u 1 19 6 h 的生长与合成维生素b 1 2 能力进行了比较，发现维生素b 。2 产量都是在9 6 h 达到最高值。统计优化条件下， 最高维生素b 1 2 产量达8 1 6m g l ，较之原始条件( 2 5 6m g l ) 和单次单因子条 件( 4 6 5m g l ) 分别提高了2 1 7 和7 5 5 。 比较发酵条件优化前后还原糖与p h 值的变化情况。发现统计优化条件下还 原糖的消耗量最少。三种发酵条件的p h 值都有相同的变化趋势。发酵6 0 h 后， 统计优化条件下的p h 值稳定在6 6 左右，原始条件和单次单因子条件下的p h 值保持在5 8 附近。 关键词：维生素b 1 2 ，p r o p i o n i b a c t e r i u ms h e r m a n i i ，发酵过程优化，单次单因子 法，p l a c k e t t b u r m a n 设计法，响应面法。 n 堡兰壅塾! 塑兰堕堡盟垄塞墨墨丝壁塾垦垡些一一 t i t l e ：s e l e c t i o no fh i g hy i e l dv i t a m i nb 1 2m u t a n t so f p r o p i o n i b a c t e r i u ms h e r m a n i i a n do p t i m i z a t i o no fi t sf e r m e n t a t i o np r o c e s s m a j o r ：m i c r o b i o l o g y m a s t e rd e g r e ec a n d i d a t e ：j i n gc h e n s u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep r o f e s s o rj i a n z h o n gl i u a b s t r a c t v i t a m i nb 1 2 ( c o b a i a m i n ) a st h ec o e n z y m et a k i n gp a r t si nm a n yi nv i v o m e t a b o l i cb i o c h e m i c a lr e a c t i o n s ，i sak i n do fe s s e n t i a lv i t a m i nf o rh u m a na n d a n i m a l s v i t a m i nb 1 2i sm a i n l yu s e dt oc u r ea n dp r e v e n td i s e a s e sc a u s e db yb 1 2 d e f e c ts u c ha sp e r n i c i o u sa n e m i a ，l e u k o c y t ed e f i c i e n c y ，a s s i m i l a t eb a d n e s s i tc a n a l s ob eu s e df o rt h et r e a t m e n tf o rt r i g e m i n a ln e u r a l g i a ，n e u r i t i s ，d e r m a t i t i s ，g l o s s i t i s ， c h r o n i cs k 协u l c e r , f l a tw a r ta n dm i g r a i n eh e a d a c h e e t c c o m b i n e dw i t ho t h e r t a v i t a m i n s ，v i t a m i nb 1 2i su s u a l l yp r o d u c e da sm u l t i v i t a m i np r e p a r a t i o nt os a l e a s o t c ( o v e rt h ec o u n t e r ) i na d d i t i o n ，v i t a m i nb 1 2i sw i d e l yu s e di na n i m a lf e e d s t u f f ， n u t r i t i o ns u p p l e m e n t sa n df o o da d d i t i v e s a tp r e s e n t ，v i t a m i nb 1 2i sp r o d u c e df r o mm i c r o b i a lf e r m e n t a t i o nb ys e v e r a l i n t e r n a t i o n a lc o r p o r a t i o n s t h et e c h n o l o g i e sw e r ei n t r o d u c e di n t oc h i n ab yaf e w d o m e s t i cc o r p o r a t i o n s t h e r ei sag r e a t e rd i s p a r i t yc o m p a r e dw i t ha d v a n c e dl e v e li n f o r e i g nc o u n t r i e s t h u s ，p r o p i o n i b a c t e r i u ms h e r m a n i iw a sm u t a g e n i z e db ym e a n s o fn t ga n di r r a d i m i o no f u vt oo b t a i nt h eb i o c h e m i c a lm u t a n t t h e n ，t h e f e r m e n t a t i o np r o c e s sw a sa l s oo p t i m i z e d w ea i mt os h o n e nd o m e s t i cd i s p a r i t y ，t o d e v e l o po w nt e c h n o l o g y ，t op r o m o t et h ed e v e l o p m e n to fv i t a m i nb 1 2 ，a n da l s ot o m e e tt h ed e m a n df o rv i t a m i nb 1 2o nw o r l da n dd o m e s t i cm a r k e t am u t a n tw i t hh i 曲e rp r o d u c t i o nc o u l db eo b t a i n e db y u s i n gn t ga n d i r r a d i a t i o no f u vm u t a g e n sa n dm e t a b o l i ci n h i b i t i o na sar a t i o n a l s c r e e n i n g t e c h n o l o g y u n d e rt h eo r i g i n a lc o n d i t i o n sf o rv i t a m i nb 1 2p r o d u c t i o n ，t h em u t a n t 只 m ! 堕曼生当生堂竺! ! ：兰堡堡= j ! ；堡坠 s e ，w l 口，l i in u 1 1b i o s y n t h e s i z e dm o r ev i t a m i nb 1 2 ( 2 7 0 6r a g l ) t h a nt h ep a r e n t s t r a i n ( 1 58 9 m g l ) b y7 0 3 t h em e d i u ma n dc u l t u r e c o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e db yu s i n g o n e f a c t o r a t a t i m em e t h o d t h eo p t i m u mc a r b o ns o u r c ew a st h ec o m p o u n d o fg l u c o s e a n dm o l a s s e s ，a n dt h en i t r o g e ns o u r c ew a sc o r n s t e e pl i q u o r t h ei n o c u l u ma g ew a s 1 6h o u ra n dt h ev o l u m ew a s1 2 5 o ft w e l v ef a c t o r s ，f o u rf a c t o r sw i t hh i g h e rs i g n i f i c a n tl e v e lw e r es e l e c t e do u t b yu s i n gp l a c k e t t b u r m a nd e s i g n i t w a sf o u n dt h a tt h es i g n i f i c a n tl e v e lo f w g l i i c o s e ：w m o h 鲻幅，c o r n - s t e e pl i q u o r ，m n s 0 4a n dc a c l 2 w e r es e p a r a t e l y9 3 ，9 2 1 ， 9 2 4 a n d9 2 5 f o ro b t a i n i n gt h em u t u a li n t e r a c t i o nb e t w e e nt h ev a r i a b l e sa n do p t i m i z i n g t h e s ev a r i a b l e s ，a2 4f a c t o r i a lc e n t r a lc o m p o s i t ed e s i g nu s i n gr e s p o n s es u r f a c e m e t h o d o l o g yw a se m p l o y e d c o m s t e e pl i q u o rh a das i g n i f i c a n tp o s i t i v ee f f e c to n t h ev i t a m i nb 1 2p r o d u c t i o n w 羽唧辩：w 啪h 站嘴a n dc a c l 2h a das i g n i f i c a n tn e g a t i v e e f f e c t f i n a l l y ，t h eo p t i m i z e dm e d i u mw e r eo b t a i n e d ：g l u c o s e2 2g l , m o l a s s e s1 2 8 g l ，c o r n s t e e pl i q u o r2 2 5e l , k h 2 p 0 41 2 5g l , ( n h ) 2 i - i p 0 42 5 叽f e s 0 4 。t h 2 0 5m g lm g c l 21 0m g km n s 0 4 h 2 01 7m g lc a c l 25m 叽n a c l1 0 r a g l , c o c l 2 6 h 2 07 0m g lt w e e n - 8 01 l5 , 6 一d i m e t h y l b e n z i m i d a z o l0 0 7g l t h e f e r m e n t a t i o nw a sc a r r i e do u ti n1 0 0m le r l e n m e y e rf l a s k si n2 0m lf e r m e n t a t i o n m e d i u mo na r o t a r ys h a k e ra t1 2 0r p m ，i n i t i a lp h 7 5a n d3 0 f o r9 6h t h ev i t a m i nb 1 2p r o d u c t i o nw a si n c r e a s e db y2 1 7 c o m p a r e dt ot h a tu n d e r u n o p t i m i z e dc o n d i t i o n s t h eh i g h e s tv i t a m i nb 1 2p r o d u c t i o nw a s8 1 6m g r lw h e n t h ef e l q l l e n t a l i o nt i m ew a s9 6 h t h eu t i l i z a t i o no fg l u c o s ea n dt h ec h a n g eo fp hw e r ed e t e r m i n e du n d e ro r i g i n a n do p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n t h e yh a ds i m i l a rd o w n t r e n du n d e ra l l f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n k e y w o r d s ：v i t a m i nb 1 2 ，p r o p i o n i b a c t e r i u ms h e r m a n i i ， o p t i m i z a t i o n ， o n e - f a c t o r a t - a t i m e m e t h o d ，p l a c k e t t b u r m a n d e s i g n ，r e s p o n s e s u r f a c e m e t h o d o l o g y l v 维生素b ：高产菌株的选育及其发酵过程优化 第1 章前言 1 1 维生素b 1 2 的结构特征 维生素b 1 2 结构上是一类含钴的复杂有机化合物，如图1 1 所示。1 9 4 8 年 r i c k e s 等【2 i 结晶化了首例维生索b 1 2 1 9 5 6 年h o d g k i u 及其小组通过对结晶物大量 数据和图表的研究，并用x 射线技术确定了其空间结构【3 1 。维生素b 。2 分子式为 c 6 3 h 9 0 c o n l 4 0 “p ，其所含的三价钴位于类卟啉的咕啉环平面的中心【4 1 。 自然界中的维生素b 1 2 有四种左右的类似物，主要是其分子中与钴离子连接 的基团( x 基团) 不同，分别为o h 、一c h 3 、n 0 2 和h 2 0 ，但它们具有相同 的生理活性。自然界合成维生素b t 2 的终产物是5 脱氢腺苷酸钻胺素和甲基钴 胺索。工业生产的维生素b 1 2 称作氰钴胺素：c y a n o c o b a l a m i nf c n c b l ) ，它是在提 取细菌体内的维生素b 1 2 过程中，由提取物的氰基取代x 基团而得到的性状稳定 的维生素b 1 2 【”。 k 。? jv 懒 5 t d c o x y a d c n o s y l c o b a l a m i n 2a d e n o s y l c a 】b a l a m i n ( 脱氢腺苷酸钴胺素) a & k ? b l ，c o e l l z y m eb i 2 ) x = c h 3 m e t h y i c o b a l a m i n ( 甲基钴胺素) f m e c b l ) x 。o h l l y d r o x o c o b a l a t n i l l t ( 羟钴胺素) x = c c y a t m c a b a l a m h a ( 氰钴胺索) c n c b , i ，v i t a m i r lb 1 2 】 图1 - i 维生素b 1 2 的结构f 5 】 f i g 1 - 1s t u c t u r eo fv i t a m i nb 1 2 2 0 0 5 届中山大学硕l 学位论文 陈静 1 2 维生素b 1 2 的理化性质 维生素b ，：又称钴胺素，是b 族维生素之一，为深红色针状结晶或结晶粉末， 无一定熔点，在3 0 0 至3 2 0 c 分解；无臭无味，溶于水、乙醇和丙酮，不溶于氯 仿、丙酮和乙醚。其水溶液为中性，具左旋光性，在波长2 7 8 、3 6 1 和5 4 8 n m 处 有最大吸收。维生素b 1 2 的结构性质相当稳定，在弱酸性溶液和中性溶液中耐热， p h 值3 以下和9 以上则易分解，日光、氧化剂和还原剂均能破坏维生素b 1 2 的 活性f 6 j 。 1 3 维生素b 1 2 的应用及生物学功能 维生素b ，2 是当今世界生物学和医学领域里最引人注目的分子之一。最初， 它作为抗恶性贫血因子而被发现。二十世纪四十年代，两家大型制药公司的研究 小组：一个由美国m e r c k 公司的f o l k e r s 领导，另一个由英国g l a x o 公司的s m i t h 领导。这两个小组几乎同时从肝脏中分离得到一种红色晶体复合物，它能抗恶性 贫血并被命名为维生素b 1 2 2 1 。接着，在牛奶粉，牛肉浓缩物和许多细菌的培养基 中都发现了维生素b 1 2 7 1 。 关于维生素b - 2 的功能研究已经非常清楚，它在医药、人体和生物营养上具 重要应用价值，在各种水生态系统中也发挥不可替代的重要作用i “ 。 临床上主要用于因维生素b ，2 缺乏所致疾病 8 1 ，如恶性贫血、自细胞减少症、 吸收不良等疾病的预防和治疗。随着对维生素b 1 2 药理的深入研究，近年来又发 现了其许多新的用途1 9 1 ，如维持神经组织的正常功能，在临床上用于治疗三叉神 经痛、神经炎、神经萎缩和神经麻痹等神经系统疾病。也可用于病毒性肝炎、肝 硬化、肩周炎、皮炎、舌炎、慢性皮肤溃疡、扁平疣和偏头痛等疾病的治疗。最 新的医学观点认为，哺乳、妊娠、长期素食者、吸收不良综合症、肝脏疾病、反 复发作的溶血性贫血、甲状腺机能亢进、慢性感染、胰及肠道癌肿、严重肾病等 都应适当补充维生素b 1 2 。它还和其他维生素一起构成多种维生素制剂，作为非 处方类药物( o v c rt h ec o u n t e r , o t c ) 而广为销售，如施尔康、善存和2 1 会维它等。 维生素b t 2 也广泛用于饲料工业上，它可用于动物饲料添加剂、营养补充以 2 维生素b ：高产菌株的选育发其发酵过程优化 及食品加工等方面【，如维生素强化面粉、婴儿食品等。 目前美国市场上维生素b 1 2 药用约占4 0 ，饲料用约占3 6 ，食品用约占2 4 。 而国内的维生素b 。：主要用于医药方面，目前营养食品和饲料添加剂中也开始应 用维生素b 1 2 ，虽然这方面用量不大，但增幅较大。 喽型，n h ：o r 7 、 p r o p a n o l ( 瓣醇) t , 2 t p m p 。n c d i o l ( 1 , 2 - 丙二醇) p r o p i o 岫l 如h y & ( 丙醛) p r o p m n y j l o a ( 丙二酰辅酶a ) 匦亟基五巫垂蝈c 乙 一曼譬。矿 列+ j 、 e t h a n o l a l # i n e ( 乙醇氨) l l s ：0 a a c e 堋d e h y 出( 乙醛) 鋈亘垂三三受垂垂基回c 甘油脱水酶， m 、 1 1 l h 黼o l ( 乙醇) a c c t y l g ；o a ( 乙酰辅酶a ) o 州篝争c ，、m 厂_ 一。一 弋 墨2 r ，、。 图1 - 2 细菌中依赖脱氢腺苷酸钴胺素的生物反应示意图f 1 7 】 f i g 1 - 2 a d e n o s y l c o b a l a m i n - d e p e n d e n tr e a c t i o n sk n o w ni nb a c t e r i a 维生素b i 2 是一种人体和动物必需的维生素，作为辅酶参与体内许多生化代 谢反应。图i - 2 描述了细菌中依赖脱氢腺苷酸钻胺素的生物反应，及其能b , ，。- 、 2 0 0 5 届中山人学颂卜学位论文 陈静 碳代谢和还原型等价物再生所需要的步骤。 维生素b 。2 参与细菌中重要的生物代谢途径。如产乙酸菌在生成乙酸的代谢 过程中，需要脱氢腺苷酸钻胺素的参与【”1 ：在严格厌氧的古细菌中，甲基的转换 这一过程需要甲基钴胺素的参与【1 3 】；主要在细菌中发现的依赖于腺苷酸钴胺素的 还原酶，是一种i i 型核糖核苷酸还原酶，它在细胞代谢中起着重要作用【1 4 】。 l ( r j m e t h y l m a l o n y l - c o a - m u t a s el ( 甲基丙二酰辅酶a 变位酶) 1 一 v d l n e ( 缬氨酸) l s a h a ：i n e ( 异亮氨酸) m e t h i o n i n e ( 甲硫氨陵) r | w c o n i n c ( 苏氨酸) o d d c h a i n f a t l ya c i d s ( 单链脂肪酸) t h y m i l ( 胸腺噎啶) ( h o l e m m ( 胆固醇) 一 m c l h y m a o n i ea c i d j ( 甲基丙二酸) | l 每：面a d o - c b l ? ，0 y nac m 声。洱删蒜。m 尘鲥舳8 o x o a l o a c c t i ca c i d ( 氧代芦荟乙酸) f r f m c t h y l m a l o n y l - c o a ( 甲酰辅酶a )s w ：c i n y i - c o f l ( 琥珀酰辅酶a ) 臣至圣曼三五互互西西团c 甲硫氨酸合成酶， h 似1 州y 蛳愀( 高半胱氨酸) m c l h l o r t ，m ：( 甲硫氨酸) i o i ，i o c v s k m e ( 高半胱氨酸) - * 。：嚣m 燮v ，m ：器b 僦i f l l l l l l 。，v t ， ”s 八人w t ： = _ 一氇f 、s 人m 尹广又n - 臣至囹t i 。i f n , n - d - m e l h y l g l y c i n 。：c m n c c 三甲铵乙内酯， l cn ，n 甲酰甘氨酸， 图1 3 人体中依赖于维生素b 1 2 的生物反应f 1 7 】 f i g 1 3c o b a l a m i n - d e p e n d e n tr e a c t i o n si nh u m a n s 4 三+ 维生素b ，2 高产菌株的选育，；6 乏其发酵过程优化 人和动物的肠道细菌中也存在着依赖维生素b 。z 的发酵过程( 图1 2 ) ，除了 e s c h e ，i c h i ac d l i ，几乎所有的肠道细菌在厌氧条件下，其丙二醇、乙醇胺和甘油 的代谢过程都需要腺菅酸钻胺素作为辅酶f 1 5 l 【1 6 。 人体正常每天从食物中摄入大概4 m g 维生素b 1 2 ，但是每天只能吸收其中约 3 z g i8 1 。动物和人体内有两种酶需要维生素b 1 2 作为辅酶( 图1 - 3 ) ，它们分别是 甲基丙二酰辅酶a 变位酶和甲硫氨酸合成酶，其相关代谢过程如图1 - 3 所示。人 体( 尤其是老年人) 缺乏维生素b 1 2 时，就会导致高半胱氨酸水平升高，最终引 起心脏疾病和血管疾病等f 1 。另外，羟基钴胺素可以用于氰化物中毒时的紧急解 毒剂，因为羟基钴胺素可以与c n 结合形成稳定的氰钴胺素。 1 4 维生素b 。：的生物合成途径 维生素b 1 2 存在于动物性食品中，植物中不含维生素b ，2 ，而且其合成只限 于在原核生物界中某些成员，放线菌、人和动物的肠道菌也能合成维生素b m 自然界存在着两种不同的维生素b 1 2 合成途径( 图1 4 ) ：一种是由法国 r h 6 n e - p o u l e n c r o r e r ( r p r ) 公司的b l a n c h e 和他的同事们，联合英国剑桥的化 学研究机构，在p s e u d o m o n a sd e n i t r i f i c a n s ( 脱氮假单孢杆菌) 这类细菌中发现的 好氧途径【2 1 】；另一种是在b a c i l l u sm e g a t e r i u m ( 巨大芽孢杆菌) 和 p r o p i o n i b a c t e r i u m s h e r m a n i i ( 谢氏丙酸杆菌) 中发现的厌氧途径【2 2 】。 由图1 - 4 可见，维生素b 1 2 的生物学功能和从头合成途径已经被阐明。其合 成分别由呼吸链中的c 5 和c 4 途径开始，生成主要中间代谢物5 氨基酮戊酸 ( 5 - a l a ) 、u r o p o r p h y r i n o g e n l i 和前钴啉环- 2 ，在前钴啉环2 时分支成好氧途径 和厌氧途径。好氧途径需要a t p 并生成副产物乙酸，厌氧途径不需。t p 并生成 副产物乙醛。最后好氧和厌氧两个分支都会生成腺苷钻啉胺酸，最终合成腺苷钴 胺素。 因为维生素b 1 2 结构的复杂性，其从头合成需要多于3 0 个基因的参与，占 一个典型细菌基因总数的1 1 2 3 】。另外在维生素b 1 2 的生物合成过程中，会同时 生成多种具有u m p o r p h y r i n o g e n i i i 的结构类似物，如细菌叶绿紊、血红素以及链 亚铁血红素等【2 “。 5 莲 基 q 暑事暑墨皇当_ao一声量辱ib口8 odojq时鲁q鲁uiq8q霄q蛊寸一s匠 匿堪划婚醚昆噼虫蛊援如霉划ni懈叫蒜寸_【匝 珏艇筵器。 f；、 秘西，舻； j￥# ；拣 飞 ，一 艟臻冀 k 藕擎 _c五_耸8 、l兽套i8q 捌q 一 、 艿 一呷誓辛寻琶 分 (避氆啦弊盛蔷旨避一 年善b t 毫毫6口蕞导五8暑s 一髅捌目鳝目蚶一生暑霉p鼍 一样蚓姑剧v生垂 盛啊醐爵8 igc譬；董童_篡 i f 一涮晡# v 、 ，丫童器蝣 l v 量o (v；蓉城簿一 ，垂生西 ，一【。 ，吉 ，i l 奢；$u 溢畿 戗掣翠扑书匿扑 0 时，表示因子蜀在高水平时对目标的影响大；当e f 0 时，则此处耿在“+ ”水平时的值，反之， 当如 0 时，则此处的取因子墨在“一”水平时的值。 2 0 0 5 届中山大学颁l 学位论文 陈静 轴点的编码值= 少，如k = 2 时，a = 1 4 1 ；k = 3 时，口= 1 6 8 根据2 七全因子中心组合设计的准则，4 因子的实验方案如表2 - 1 所示。 表2 - 14 因子中心组台设计法的实验方案【明 t a b l e2 - 1s c h e m eo f c e n t r a lc o m p o s i t ed e s i g nw i t hf o u rf a c ( o r s c o d ev a l u e c o d ev a l u e n o n o z lz 2船泓瓢nn取 111111 61- 111 2111l1 70020 311111 8111l 4o0oo1 9l1，11 5 2 0oo2 0o000 600oo2 11111 7o0002 21111 811112 31111 911112 402 0 0 1 01 1112 51111 1 11111 2 6oo02 1 220oo 2 7oo2o 1 31111 2 8o0oo 1 4o20o 2 90000 1 5o oo 2 3 01111 每个因子对目标y 的影响，可由下列多元二次方程式来描述。 y 卢。+ 卢。x 。+ 卢。工? + 卢工；z ， ( 2 - 8 ) 其中y 为预测的响应值，这里为维生素b ，2 的产量；8 0 为常数项，口。为一 2 8 维生素b ，2 高产菌株的选育及其发酵过程优化 次项系数，筘。为平方项系数：肛，为交叉项系数。 利用计算机统计软件( 如d e s i g ne x p e r t 统计软件和s a s 统计软件) 对实 验数据按上式进行回归，然后对回归模型进行方差分析，由复相关系数( 尺) 、偏 差系数( c v ) 和测定的复相关系数平方( 砰) 来表示拟合性质，并用，检验分 析显著水平。 对回归方程y - 卢。+ 卢z z t + 卢。工? + f l i z 。工，求导，便可得到其 极值点，即最优化的条件。然后对各因子的响应面等高图进行分析，便能知道因 子间相互作用的情况。 比较 2 1 1 发酵条件优化前后突变株的生长与合成维生索b 1 2 能力的 比较优化之前的原始发酵条件、初步优化之后的发酵条件以及统计优化之后 的发酵条件下，突变株的生长与合成维生素b 1 ：的能力。每隔1 2 h 分别测其菌体 浓度和维生素b 1 2 产量，然后绘制比较图形，分析三者之间的异同。 2 1 2 发酵条件优化前后的p h 值变化和还原糖含量的变化 2 1 2 1 p h 值的测定 在优化之前的发酵条件、初步优化之后的发酵条件以及统计优化之后的发酵 条件之下，每隔1 2 h 分别取其发酵液5 m l ，离心去除菌体，收集上清液分别测 定其p h 值。每次测定p h 值前对p h 计进行校准。 2 1 2 2 还原糖含量的测定f 6 8 】 ( 一) 葡萄糖标准曲线的制作 ! ! ! ! 垦生生叁兰堡! 兰些堕苎 一! ! 生 葡萄糖标准液的配制：将适量分析纯的无水葡萄糖在1 0 5 干燥至恒重， 准确称取l o o m g ，用少量蒸馏水溶解后定容至l o o m l 容量瓶中，此时葡萄糖的 浓度为l m g m l 。 取9 支2 5 2 5 0 m m 的试管，分别按表2 2 加入试剂。 将各管中溶液混合摇匀后，塞好塞子。在沸水浴中加热5 分钟，取出后立即 用冷水冷却至室温，再向每管中加入2 1 5 m l 蒸馏本，使总体积定容至2 5 m l ， 摇匀后于5 2 0 n m 波长处测其吸光值。最后以葡萄糖毫克数为横坐标，以吸光值 为纵坐标，绘制标准曲线。 表2 - 2 葡萄糖标准睦线的制作 t a b l e2 - 2s t a n d a r dc u i v co f 酎u c o s e ( 二) 发酵液中糖蜜的水解及还原糖的测定【叫 准确量取5 m l 发酵液，离心去除菌体和杂质，取上清液5 m l ，放入2 5 2 5 0 m m 的试管中，加入6m l 2 5m o l l 的盐酸溶液，盖好盖子。在沸水浴中加热 1 5 分钟。用1 0 n a o h 溶液调p h 值到9 0 ，定容到5 0 m l ，然后精确吸取上述 溶液2 0 m l 于2 0 0 m l 容量瓶中定容，混匀备用。此时原始发酵液已被稀释了1 0 0 倍。 取若干支2 5 2 5 0 r a m 的试管，分别按表2 3 加入试剂。 加完试剂后，其余操作均与制作标准曲线时相同。测定其5 2 0 n m 处的吸光 丝竺壅! ! 堕兰堕堡箜生塞墨苎垄曼壁堡垡些 值之后，在标准曲线上查出对应的糖量，用式( 2 9 ) 计算出发酵液中总糖的百 分含量。 总糖浓度( m g m l ) = 发酵液水解后还原糖毫克数发酵液稀释倍数( 2 9 ) 表2 - 3 发酵液中总糖的测定 t a b l e2 - 3d e t e r m i n a t i o no ft h et o t a ls u g a r 3 1 2 0 0 5 届中山大学硕上学位论文 陈静 第3 章结果与讨论 3 1 维生素b 1 2 高产突变株的选育 3 1 1n t g 诱变 由于菌种在长期的保藏过程中可能出现退化现象，我们将保藏菌种 p r o p i o n i b a c t e r i u ms h e r m a n i i 进行了一次自然分离，得到维生素b 1 2 产景相对较 高的p s h e r m a n i iy - 3 1 ( 1 5 8 9m g l ) ，并将菌株p s h e r m a n i iy - 3 1 作为第一级n t g 诱变的出发株。 我们研究了n t g 对p s h e r m a n i iy - 3 1 的致死情况。发现当用n t g2 m g m l ， 作用时间1 0m i n 时对p s h e r m a n i iy - 3 1 致死率为7 5 ，正突变率为5 2 。同时用 丙酸( 4 m l l ) 作为抗代谢抑制剂。 经第一级诱变得到的维生素b 1 2 产量最高的突变株为p s h e r m a n i in 3 5 ( 2 1 4 4r a g l ) 。与母株只幽e r m a n i iy - 3 1 相比，突变株r s h e r m a n i in 3 5 合成维生 素b 1 2 的能力提高了3 5 。 我们研究了突变株的抗代谢抑制剂的能力。当葡萄糖浓度大于1 0 时开始抑 制p s h e r m a n i in 3 5 菌体的生长，当葡萄糖浓度达到1 5 时，菌体基本不长。说 明突变株不适合于更高浓度葡萄糖培养；谷氨酸( 1 m g m l ) 对p s h e r m a n i in 3 5 的生长与合成维生素b 1 2 无明显影响；另外，c o c l 2 6 h 2 0 ( 1 0 0 至2 0 0m g l ) 对 p s h e r m a n i in 3 5 的生长与合成维生素b 1 2 也影响不大。 3 1 2u v 诱变 考虑到用同一种诱变剂进行多级诱变会使得菌体生长周期逐级延长，我们采 用物理诱变剂u v 诱变方法对p s h e r m a n i in 3 5 进行第二级诱变，同时也用丙酸 ( 4 m l l ) 作为代谢抑制剂。 我们先研究了u v 对p s h e r m a n i i n 3 5 的致死情况，确定当u v 作用2 m i n 时， 致死率为8 0 ，一突变率为6 2 ，当培养基中加入丙酸后，致死率大于8 0 。 丝竺壅! ! 堕兰堕堡箜生塞墨苎垄壁壁堡垡些 经第二级诱变得到的维生素b 1 2 产量最高的突变株为p s h e r m a n i in u _ 1 1 ( 2 7 0 6m g l ) ，与母株p s h e r m a n i in 3 5 相比，突变株p s h e r m a n i in u - 1 1 合成 维生素b 1 2 的能力提高了3 9 ，比原始株p s h e r m a n i iy - 3 1 提高了7 0 _ 3 。 丙酸是p r o p i o n i b a c t e r i u m 发酵过程中的主要胞外副产物，它的累积会抑制菌 体细胞的生长，如何消除自身代谢产物丙酸是p r o p i o n i b a c t e r i u m 发酵合成维生素 b ，2 的关键所在。我们所进行的两级诱变都选用了4 m l j l 丙酸作为抗代谢抑制剂， 结果表明成功的得到了高产维生素b 1 2 的突变株p s h e r m a n i in u 一1 1 。 3 1 3 突变株p s h e r m a n i in u 1 1 的遗传稳定性 为了确定突变株p s h e r m a n i in u 1 1 高产维生素b 1 2 的可靠性，我们通过传 代实验考察了突变株p s h e r m a n i in u 1 1 合成维生素b 1 2 能力的稳定性。发现在 考察的七代里，合成维生素b 1 2 水平保持稳定，依次为2 6 8 0 ，2 8 3 1 ，2 7 7 5 ，2 8 2 2 ， 2 6 5 2 ，2 6 5 0 ，2 8 1 0 6m g l 。同时我们也考察了母株p s h e r m a n i iy - 3 1 和p s