（农产品加工及贮藏工程专业论文）超高压处理对牛骨骼肌G肌动蛋白结构的影响.pdf

摘要 本研究采用牛骨骼肌，通过丙酮干燥法提取g 肌动蛋白，d e a e 5 2 离子交 换层析进行纯化后，实施不同程度的压力处理( 1 0 0 、2 0 0 、3 0 0 、4 0 0m p a ) 之 后，经s d s p a g e 法，荧光光谱法，d t n p 交换反应等技术检测g 肌动蛋白的纯 度，以及受压程度。然后对受压后的g 肌动蛋白的芳香族疏水基团、酪氨酸、 色氨酸、质量中心、恢复率、巯基基团等进行分析研究。结果如下： ( 1 ) s d s p a g e 结果表明随着压力的升高g 肌动蛋白条带颜色逐渐变淡变 细。这与超高压处理后蛋白质降解成小分子量的蛋白质，多肽或氨基酸等有关。 ( 2 ) 随着压力的升高，g 肌动蛋白的芳香族疏水基团含量升高。说明高压 处理破坏了蛋白质分子内部疏水相互作用，产生和暴露了更多的疏水性区域。 在压力升高j ! u 4 0 0 m p a 时，芳香族疏水基团含量下降。疏水性略有下降趋势。 ( 3 ) 随着压力的升高，g 肌动蛋白中酪氨酸，色氨酸等疏水性基团暴露越多，达 3 0 0 m p a 时疏水性最高。至4 0 0 m p a 时酪氨酸，色氨酸等疏水疏水基团含量性略有下降 趋势。随着压力的升高，酪氨酸在10 0 2 0 0 m p a 时显示向长波长方向移动，到 2 0 0 m p a 时出现最大波长3 4 1 n m ，然后2 0 0 4 0 0 m p a 时又向短波长方向移动。色 氨酸在10 0 3 0 0 m p a 时显示长波长方向移动，到3 0 0 m p a 时出现最长波长 3 4 0 8 n m ，然后3 0 0 4 0 0 m p a 时又向短波长方向移动。 ( 4 ) 随着压力的升高，g 肌动蛋白光散射强度下降，压力3 0 0 m p a 时达到最 低值4 6 3 4 ，解压后的恢复率为9 1 6 。显示g 肌动蛋白受压后有收缩现象。但是 到4 0 0 m p a 时光散射强度突然升高至6 3 0 8 。 ( 5 ) 对照组g 肌动蛋白质量中心为2 6 1 8 7 1 0 0 0 ( e r a 。1 ) ，1 0 0 m p a 时g 肌动蛋白 质量中心与对照组相比较稍微下降到2 6 17 9 1 0 0 0 ( c m d ) 。2 0 0 m p a ，3 0 0 m p a ， 4 0 0 m p a 时质量中心值都比对照组高，整体上呈上升趋势。显示酪氨酸残基受 压力影响较大，这是由于蛋白质三级结构的变化引起。 ( 6 ) 随着压力的升高g 肌动蛋白巯基含量升高，与对照组相比较，4 0 0 m p a 超高压处理的肌动蛋白巯基含量增加了4 9 3 。表明超高压力使二硫键断裂形 成巯基暴露到分子表面，肌动蛋白三维结构稳定性降低，蛋白质变性分解。 本研究解释了超高压对g 肌动蛋白结构的影响及其规律，在此基础上为超 高压处理而引起的肌肉蛋白质结构的变性机理提供理论依据。本研究不仅应用于食 品，而且广泛应用于生物技术领域，推广该技术在食品工业中的应用。 关键词：超高压处理；g 一肌动蛋白；分离纯化：荧光光谱 e f f e c t so fu l t r a h i 曲p r e s s u r e t r e a t m e n to ng a c t i no fb o v i n es k e l e t a lm u s c l e a b s t r a c t i nt h i ss t u d y ，g - a c ：t i nw a se x t r a c t e df i o mb o v i n es k e l e t a lm u s c l e ，t h r o u g ha c e t o n e d e s i c c a t i o ne x t r a c t i o na n db yd e a e 一5 2i o ne x c h a n g ep u r i f i c a t i o n , t h e nr e l i e do nd i f f e r e n t l l i g hp r e s s u r et r e a t m e n t ( 10 0 、2 0 0 、3 0 0 、4 0 0 m p a ) t h ep u r i t y a n dt h ed e g r e eo f c o m p r e s s i o no fg - a c t i nw e r ed e t e c t e dt h r o u g hs d s p a g e ，f l u o r e s c e n c es p e c t r o m e t r ya n d d t n pe x c h a n g er e a c t i o n a f t e rp r e s s u r et r e a t m e n t , s u c ha sh y d r o p h o b i cc o n t e n t , t y r ，t r p ， c e n t r eo fm a s s ，r e c o v e r yr a t e ，s u l f h y d r yg r o u p sw e r es t u d i e d t h em a i nc o n c l u s i o n sa r ea s f o l l o w ： ( 1 ) s d s - p a g es h o w e dt h a tt h eb a n do fg a c t i nc o l o rb e c o m et h i n n i n gg r a d u a l l y 诵n l t h ei n c r e a s i n gh i g hp r e s s u r e t h er e s u l tw a sr e l a t e d 丽t 1 1u l t r a - h i g hp r e s s u r e ，t h eg - a c t i n d e g r a d a t e di n t os m a l lm o l e c u l a rw e i g h tp r o t e i n , p e p t i d e ，a n da m i n oa c i d s ( 2 ) a f t e ru l t r a - h i g hp r e s s u r e ，g - a c t i nc o n t e n to fa r o m a t i ch y d r o p h o b i cg r o u p s i n c r e a s e d g r a d u a l l y t h i s d e m o n s t r a t e dt h a t u l t r a - h i g hp r e s s u r e c a na f f e c tt h e t r i d i m e n s i o n a ls t r u c t u r eo fb o v i n es k e l e t a lm u s c l ea c t i n w h i l ep r e s s u r eu pt o4 0 0 m p a ， t h ea r o m a t i ch y d r o p h o b i cg r o u p sd e c r e a s e d ，h y d r o p h o b i cs l i g h t l yd o w n w a r d ( 3 ) b o t ht y r o s i n ea n dt r y p t o p h a nf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fg a c t i ni n c r e a s e dg r a d u a l l y 、析mp r e s s u r ei n c r e a s e d w h i l eh i g hp r e s s u r eg o tt o3 0 0 m p a , f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yi st h e h i 曲e s t w h i l e ，4 0 0 m p at y r o s i n ea n dt r y p t o p h a no fg - a c t i nf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t ys a m p l e f l o wr a t em a k et h e md e c r e a s eal i t t l e t y r o s i n e10 0 - 2 0 0 m p as h i f tl o n gw a v e l e n g t ho f t h ef l u o r e s c e n c e ，2 0 0 m p as h o w e dt h eh i g h e s tw a v e l e n g t h3 4in m ，2 0 0 4 0 0 m p as h i f t s h o r tw a v e l e n g t ho ft h ef l u o r e s c e n c e ，t r y p t o p h a n1 0 0 3 0 0 m p as h i f tl o n gw a v e l e n g t h o ft h ef l u o r e s c e n c e ，30 0 m p as h o w e dh i g h e s tw a v e l e n g t ho ft h ef l u o r e s c e n c e3 4 0 8 r i m ， 30 0 - 4 0 0 m p as h i f ts h o r tw a v e l e n g t ho ft h ef l u o r e s c e n c e ( 4 ) f l u o r e s c e n c es c a t t e r i n gi n t e n s i t yd e c r e a s e dg r a d u a l l yv v i 也h i g hp r e s s u r ei n c r e a s e d 3 0 0 m p as h o w e dl o wf l u o r e s c e n c es c a t t e r i n gi n t e n s i t y4 6 3 4 r e c o v e r yr a t eo fg - a c t i n a f t e rh i g hp r e s s u r et r e a t m e n tw a s9 1 6 b u th i i g hp r e s s u r eg o tt o4 0 0 m p af l u o r e s c e n c e s c a t t e r i n gi n t e n s i t ys u d d e n l yi n c r e a s e d t o6 3 0 8 ( 5 ) 0 1m p a c e n t r eo fm a s so fg - a c t i nw a s2 618 7 10 0 0 ( c m q ) ，w h i l e10 0 m p ac e n t r e o fm a s so fg a c t i ns a m p l ef l o wr a t em a k et h e md e c r e a s eal i t t l et o2 617 9 10 0 0 ( c m 。1 ) 2 0 0 m p a , 3 0 0 m p 4 0 0 m p ac e n t r eo fm a s so fa c t i ni n c r e a s e 醪a 血“l yw i t hh i g hp r e s s u r e i n c r e a s e d t h a tu l 舰- h i g hp r e s s u r ec a na f f e c tt h es t r u c t u r eo fa c t i n ( 6 ) s u l f h y d r y g r o u p sc o n t e n to fg a c t i n i n c r e a s e dg r a d u a l l yw i t hh i g hp r e s s u r e i n c r e a s e d w h i l e4 0 0 m p as u l f h y d r yg r o u p sc o n t e n to fg a c t i ni n c r e a s eo f4 9 3 t h i s d e m o n s t r a t e dt h a ti tg a l la f f e c tt h et r i d i r n e n s i o n a ls t r u c t u r eo fb o v i n es k e l e t a lm u s c l e g a c t i n n l eh i g h e rp r e s s u r ei s ，t h eh i g h e rt h ep r o t e i nd e n a t u r e sd e g r e ew i l lb e e f f e c t so f u l t r a h i g hp r e s s u r et r e a t m e n to ng a c t i ns t r u c t u r ea n di t sc h a n g i n gr e g u l a r i t yw a s s t u d i e d b a s e do no u rs t u d y ，w ec a np r o v i d eat h e o r e t i c a lf o u n d a t i o ni ng a c t i nd e n a t u r e m e c h a n i s mg e n e r a t e db yu l t r a - h i g hp r e s s u r et r e a t m e n t n o to n l yi so u rs t u d ya p p l i c a b l et o h i g hp r e s s u r er e s e a r c hf i e l do f f o o di n d u s t r y ，b u ta l s ot oo t h e rf i e l d ss u c ha sb i o t e c h n o l o g y a n db i o l o g yf u n c t i o n a l i s t k e yw o rd s u l t r a h i g hp r e s s u r e ；g - a c t i n ；i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ：f l u o r e s c e n c e s p e c t r o m e t r y e ir e c t e db y ：p r o f b o r j i g i ng e r e i t a p p i ic a n tf o rm a s t e rd e g r e e ：w a n gz hif e n g ( a g r i c u l t u r a lp r o d u c t sp r o c e s s i n ga n ds t o r a g e ) ( c o l l e g eo f f o o ds c i e n c ea n de n g i n e e r i n g i n n e rm o n g o l i aa g r i c u l t u r a l u n i v e r s i t y ，h u h h o t0 1 0 0 1 8 - c h i n a ) 内蒙古农业大学研究生学位论文独创声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的 地方外，论文中不包括其他入已经发表或撰写过的研究成果，也不包 括为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任 论文作者签名： 至奎：监 日 期：墨：z 。兰：z 导师指导研究生学位论文的承诺 获得的研究结果。如果违反，我必须接受按国家及学校有关规定的处 罚处理并承担相应导师连带责任。 指导教师签名：聿盏卿日期：抖 内蒙古农业大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解内蒙古农业大学有关保护知识产权的规定，即：研 究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属内蒙古农业大学。本 人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为内蒙 古农业大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为内蒙古农业 大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电 子文档，允许论文被查阅和借阅学校可以公布学位论文的全部或部 分内容( 保密内容除外) ，采用影印、缩印或其他手段保存论文 论文作者签名：垡：髯指导教师签名：鬈旦弘鍪) 日 期：星竺：三：。量 l ， o 。 ，v 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 1 引言 1 1 概述 蛋白质是切生命的物质基础，是肌体细胞的重要组成部分，是人体组织更新和 修补的主要原料。人体的每个组织：毛发、皮肤、肌肉、骨骼、内脏、大脑、血液、 神经、内分泌等都是由蛋白质组成，所以说饮食造就人本身。蛋白质对人的生长发育 非常重要。蛋白质在食品中可以体现出不同的功能特性，影响食品的感官特性，而且 对食品在制造、加工或保藏中的物理化学性质起着重要的作用。因此蛋白质广泛应用 于食品加工的各个领域n 1 。 食品工业的飞速发展迫切需要具有功能特性和营养特性的蛋白质，作为食品的原 料成分或添加基料。因此，一方面要大力开发具有优质特性的蛋白质资源，另一方面 是要对现有的蛋白质进行改造，以满足人类的特殊要求。由于现有的大多数蛋白质来 源丰富，价格低廉，所以采用特定目的的改性技术，就可以获得较高的经济效益。蛋 白质是由各种氨基酸相互联接而构成的具有空间结构的生物大分子，其理化性质( 尤其 分子量、氨基酸组成、静电荷和表面疏水性等) 和功能特性密切相关。科学家发现一些 重要的蛋白质资源的功能特性不能满足食品加工的需要，如何改善蛋白质的功能特性， 扩大其用途和改善食品品质，近年来许多科学工作者对蛋白质的改性作了不少工作。 超高压属于一项纯物理冷加工技术，蛋白质经高压处理后使氨基酸和多肽链发生某种 变化，引起蛋白质大分子空间结构和理化性质的改变，从而获得较好功能特性和营养 特性的蛋白质。人们通过改变蛋白质的分子结构来改变其理化性质，从而达到改善蛋 白功能性质的目的豫1 。 1 2 肌动蛋白及其功能 1 2 1 肌动蛋白概述 肌动蛋白最初是1 9 4 1 年脊椎动物骨骼肌细胞中发现并加以命名的。肌动蛋白主要 存在于细胞质中，是细胞骨架细丝的主要组成成分跚。细丝是由肌动蛋白组成的直径 约7 n m 的骨架纤维，又称肌动蛋白纤维。微丝和它的结合蛋白以及肌球蛋白( m y o s i n ) 三者构成化学机械系统，细丝的分子结构( 如图1 ) 。1 9 6 3 年，h a n s o n 和l o w y 提出了肌动 蛋白单体( g a c t i n ) 以双螺旋形式构成肌动蛋白聚合体( f a c t i n ) 的理论，并且g 肌动蛋 白和f 肌动蛋白可以相互转化，这个理论极大地促进了对肌动蛋白的研究。 肌肉中的蛋白质因其生物化学性质或在肌肉组织中的存在部位不同，可以区分为 肌浆蛋白，肌原纤维蛋白和间质蛋白。肌原纤维蛋白质占肌肉蛋白质总量的4 0 - - - 6 0 ，它主要包括肌球蛋白，肌动蛋白和肌动球蛋白等。肌动蛋白占肌原纤维蛋白的1 4 ， 肌动蛋白是一种中等大小的蛋白质，由3 7 5 个氨基酸残基组成，并且是由一个大 的、高度保守的基因编码。肌动蛋白含有较多的酸性氨基酸，其等电点约为5 5 ， 肌动蛋白的等电点比肌球蛋白低。肌动蛋白与肌球蛋白相比较肌动蛋白对热较稳定， 2 超高压处理对牛骨骼肌g 一肌动蛋白结构的影响 分子量约为4 2 k d a ，但不同肌动蛋白的等电点因其氨基端氨基酸残基的变化不同而略 有不同每分子肌动蛋白有一个高亲和力结合位点，可结合一份子a t p 或a d p ，另有几 个低亲和力的结合位点可与二价阳离子结合，如m f + ，m 9 2 + 被c a 2 + 置换可以改变 肌动蛋白的动力特性。肌动蛋白还可以与不同的肌动蛋白结合蛋白相结合，以完成各 种细胞功能毋jj 。 图1 细丝的分子结构 f i g 1m o l e c u l a rs 仇l ! c u a o f t h i nf i l a m e n t 1 2 2 肌动蛋白的功能 肌动蛋白是一种重要的收缩蛋白。在肌肉细胞中，肌动蛋白细丝与肌球蛋白粗丝 之间的滑行运动引起肌肉收缩如图2 所示，肌肉收缩并不是肌球蛋白在a 带位置上的 长度变化，而是i 带在a 带中伸缩，收缩时肌原纤维中肌球蛋白粗丝和肌动蛋白细丝的 长度不变，只是重叠部分增加。当肌细胞兴奋而使胞浆：j c a 2 + 增加时，c a 2 + 便与细丝 上的肌钙蛋白结合，使其构型发生变化，使原肌球蛋白更深地移向肌动蛋白的螺旋槽 内，从而暴露出肌动蛋白纤丝上能与肌球蛋白头部结合的位点。钙离子可以使a t p 从 惰性的m g - a t p 复合物中游离出来，并刺激肌球蛋白的a t p 酶，使其活化。肌球蛋白 a t p 酶活化后，将a t p 分解为a d p 、无机磷和能量，同时肌球蛋白纤丝的突起端点与 肌动蛋白纤丝结合，形成收缩状态的肌动球蛋白。 在非肌细胞中肌动蛋白具有双重功能，一是参与细胞运动，二是组成细胞骨架， 维持细胞质的结构和细胞形状册，参与多种真核细胞的机能，包括收缩、变形、细胞 激化和细胞分裂。微丝骨架参与细胞内有许多重要的生理活动，是目前细胞生物学研 究的热点领域之一锄。肌动蛋白是骨骼肌中细肌丝和真核生物细胞骨架的重要成分。 肌动蛋白重要的作用是其在结构上和动力学上的作用，这是依靠其丝状结构的形成与 分解来完成的。肌动蛋白具有多种结合位点，可与不同的肌动蛋白结合蛋白质结合， 以完成多种细胞功能棚。 内蒙古农业大学硕士学位论文 3 肌球蛋白头部 肌动蛋白纤维 肌球蛋白纤维= = 墨= 耋套篓茎薹暑三三三一 复合体x ，钗琵 2 图2 肌肉的收缩过程 f i g 2 c o n s t r i c t i o np r o c e s so f m u s c u l a r 1 3 蛋白质的结构与功能 肌动蛋白是蛋白质的一种，所以同样具有蛋白质的多层次结构：一级结构、二级 结构、三级结构、四级结构。蛋白质的一级结构就是指通过肽链连接的氨基酸残基的 线性序列。而蛋白质分子的大多数电荷都是由组成它的氨基酸残基的侧链贡献的，所 以蛋白质的离子特性和它的溶解性都取决于它的氨基酸组成。而蛋白质的功能取决于 它的三维结构，蛋白质的三维结构是通过二级结构、三级结构、四级结构描述的。蛋 白质的一级结构是最稳定、最基本的结构，是氨基酸通过共价键结合的在一级结构的 长链中，存在不同的基团如- - h ，- - c = o ，一n h 2 ，一c o o h ，等等。它们之间也可 4 超高压处理对牛骨骼肌g 一肌动蛋白结构的影响 以相互作用，形成了分子的立体结构。这种分子中原子团间的相互作用，要比共价键 弱得多，称为次级键，主要有氢键、疏水作用盐键、范德华力等，二级结构是指通过 肽键中酰胺氮和羰基氧之间形成的氢键维持的。三级结构是指一条多肽链形成紧密的 一个或多个球状单位或结构域，三级结构的稳定性依赖于非相邻的氨基酸残基侧链的 相互作用，三级结构的形成使得一级结构中分离开的氨基酸残基可以靠得很近，例如 一个酶的活性部位的裂隙可以是由一级结构中相距很远的氨基酸残基组成。四级结构 并不是每个蛋白质都具有的，只有那些有两条或两条以上多肽链组成的蛋白质才具有 四级结构，每一条肽链称为亚基，肽链可以相同也可以不同。 高压对蛋白质一级结构没有影响，不利于二级结构的稳定，对三级结构有较大影 响，而四级结构对压力非常敏感。由于超高压有利于氢键的形成，而蛋白质的二级结 构是由肽键内和肽键间的氢键维持的，所以超高压有利于这一级结构的稳定；蛋白质 的多肽链在各种二级结构的基础上再进一步盘曲或折叠形成具有一定规律的三维空 间结构，称为蛋白质的三级结构。氢键、疏水键、二硫键对于蛋白质三级结构的稳定 上起着重要作用。一些三级结构的球状蛋白体结合在一起形成四级结构，这一结构靠 共价键间的相互作用维持。因此，高压处理作用可能会导致大分子结构的变化n 。 1 4 超高压处理技术的概述 随着科学技术的发展，多种新的食品加工和贮存方法得以研究与开发，其中超高 压技术是最近引起各方面广泛关注的高新技术之一。食品超高压技术是利用帕斯卡定 律，即利用加在液体中的压力( 1 0 0 m p a - - - 1 0 0 0 m p a ) ，通过介质，以压力作为能量因子， 作用于将放在专门密封超高压容器内的食品，在常温或较低温度下，使食品中的酶、 蛋白质、淀粉等生物高分子物质分别失去活性、变性和糊化，对食品达到杀死其中的 细菌等微生物的目的【倒。高压处理过程是一个纯物理过程，具有瞬间压缩、作用均 匀、操作安全和耗能低的特点，有利于生态环境保护。超高压加工技术除节约能源、 减少污染等优点外，其最大优越性在于这种技术是目前人们发现的能最好保持食物天 然色、香、味和营养成分的加工方法。压力能在低温或中温下延长制品的贮藏期，而 又不破坏制品的营养和风昧d 玉。它与传统的食品加热处理工艺极力完全不同。当食 品物料在液体介质中体积被压缩之后，形成高分子物质立体结构的氢键，离子键和疏 水键等非共价键即发生变化，结果导致蛋白质，淀粉等分别发生变性与糊化，酶失去 活性，细菌等微生物被杀死。但在此过程中，超高压对形成蛋白质等高分子物质以及 维生素，色素和风味物质等低分子物质的共价键无任何影响，故此超高压食品很好的 保持了原有的营养价值，色泽和天然风味，这一特点正好迎合了现代人类返璞归真， 崇尚自然，追求天然，低加工食品的消费心理。 1 4 1 国内对超高压技术在食品中的应用 内蒙古农业大学硕士学位论文 5 目前，我国超高压处理食品技术正处于早期研究阶段，在1 9 9 5 年以前，这方面的 研究报道较少，大多是发表了一些综述和翻译文章，至今，市场上尚未见到超高压食 品出售。我国超高压食品的研究及工业应用与发达国家相比还有一定的差距。对食品 超高压加工技术仍停留在理论研究阶段，还未投入实际生产应用中，我国超高压食品 产业化的最大阻碍就在于超高压设备问题。因为经超高压处理的食品虽然品质优于热 力杀菌的食品，但价格偏高，价格偏高的主要原因是未能研制出一种性能完备，造价 合适的超高压处理装置，我国目前虽能生产超高压的设备，但多用于工程力学试验， 不仅价格高，设备笨重，而且设备本身也有不适合食品加工及连续化生产的地方。超 高压技术出现已有一个多世纪，而真正被用于食品工业仅十余年时间。但是，超高压 技术利用与食品加工的观点上看，我国也已经开始认识到了高压技术的优点。国内最 早开始研究高压技术用于处理食品的有内蒙古农业大学，内蒙古包头五二所，中国农 业大学，合肥工业大学等高校及研究所。他们的研究多集中于高压处理对果汁色泽稳 定性研究；多酚氧化酶活性的抑制效果研究；酶动力学研究：食品的熟制性及持水性 研究；植物组织在冻结和解冻过程中的相变过程研究；肉类嫩化方面的研究等等。例 如靳烨等对高压处理后牛肉感官性能、酶活性和保藏性能的变化进行了详细的研究， 获得了大量有价值的数据n 5 伸j 7 1 。德力格尔桑等研究超高压对牛乳纤溶酶和脂肪酶的 钝化效应研究，液态静高压处理牛羊肌肉显微组织变化研究，得到了有利数据n 钆懵1 。 马汉军等采用高压和热结合处理对牛肉进行处理观察压力和热处理对牛肉感官特 性、脂肪氧化和组织结构的影响啪2 l 捌：白艳红等研究了高压处理对牛、羊肌肉感官 特性及显微结构，提高冷却肉生物安全性的影响一；刘熙研究了肉类经超高压处理 后肉的嫩度提高汹1 。这都为高压技术在肉类加工中的进一步应用提供了可靠的依据。 肉类经高压处理后其感官性状、组织结构都会发生明显的变化，而这些变化都与肉类 的基本组成成分具有密切的关系。中国兵器工业集团公司五二研究所利用超高压技术 研制成功了高压西瓜果肉汁、高压菜花等果蔬新产品，使产品在常温下的包装有效期 达6 个月以上，拓宽了冷态食品高压加工技术的应用领域。杭州商学院与浙江大学联 合完成了浙江省科技攻关项目“高压催陈黄酒的研究”。该研究结果表明嗍，黄酒在 5 0 - 1 5 0 m p a 压力下处理后色泽和风味不变，处理后酒味更加鲜甜、醇和、爽口、醇 香更加浓郁。内蒙古农业大学将高压技术与气调保鲜技术相结合用于牛肉保鲜的研究 上1 ，牛肉采用1 0 0 c 0 2 作为保护气体，经3 0 0 m p a 高压气调保鲜，能在5 下贮 藏2 0 - 3 0 d ，具有良好的保鲜效果。综上所述，具有“冷巴氏杀菌技术”美誉的高压加 工技术已引起越来越多的世界各国科学家的重视，并且正逐渐被应用到食品的各个领 域，这主要归功于高压加工技术满足了人们“最低加s e f m i n i m a jp r o c e s s ) ”的食品加工 新理念和对食品“新鲜”、“天然”的要求，在为人们提供既安全又方便的同时，能最大 限度地延长食品货架期，保持食品的天然特性，降低防腐剂的使用量。 6 超高压处理对牛骨骼肌g 一肌动蛋白结构的影响 1 4 2国内超高压技术对蛋白质的研究 涂宗财研究了超高压均质对大豆分离蛋白功能特性的影响汹1 及动态超高压微射 流对大豆分离蛋白起泡性、凝胶性的影响，结果表明动态超高压均质能使溶解性、 乳化陛、起泡性、凝胶性有不同程度的提高。 1 4 3 国外对超高压技术在食品中的应用 1 8 8 5 年，r o g e r 啪3 首次报道了高压能杀死细菌，1 8 9 9 年，h i r e ”首次将高压技术应 用于保存牛奶。他发现，新鲜牛奶在13 9 m p a 压力条件下处理1 h 后，在常温条件下 可保存4 d 。此外，他还发现经过1 0 1 2 h 加热和4 6 3 m p a 加压并用的条件下，牛奶 保藏期可得到进一步提高。但在早期，由于设备技术的不成熟，限制了高压加工技术 在食品领域中的进一步应用。1 9 8 7 年京都大学的林力丸先生倡议高压加工技术在食 品中应用以后，日本掀起了对高压加工技术的研究热潮，研究了高压条件下不同食品 中微生物的变化情况，压力对鱼、肉及制品的质地和风味的影响。在室温条件下经 6 0 0 m p a 压力处理1 0 m i m 的橘子汁，不仅保持了新鲜风味和v c 的含量并且果胶酯 酶仍然保持着活性：在3 0 0 4 0 0 m p a 压力条件下处理1 0 m i n ，即可使橘子汁中的细 菌、酵母菌和霉菌失活。研究还发现，经高压和高温共同处理即可使果汁中的微生物 和酶菌失活口2 棚：。目前高压食品加工己在日本、法国、美国和墨西哥等国家商业化生 产。日本是最先将高压技术应用到食品工业的国家，世界上第一个高压食品果 酱就是由日本于1 9 9 1 年首先开发出来的。1 9 9 2 年日本的f u j i c h i k u 公司开发出了高压 处理生火腿的技术。从此以后高压在肉类加工中的应用研究引起了人们极大的研究 兴趣。越来越多的国家投入大量的人力、物力和财力对高压技术在食品各个领域的应 用展开了研究，并取得了许多重要的研究成果? 高压技术在食品领域的应用也日趋广泛 m ：。日本科学家在h a y a s h i 疆5 ：的影响下，在高压技术的领域进行了许多研究，概括起 来主要是压力使蛋白质变性、淀粉糊化、常压下钝化微生物等，因压力对共价键影响 e 4 , ，所以不会改变制品的香味、颜色、维生素和产品滋味。例如蛋类、虾类、肉类、 果酱、果汁和其他各种食品都可以进行高压处理。林立丸发现利用高压可以达到杀菌、 灭酶和改善食品品质的目的嗡钔。 美国是世界上最早将高压技术应用于食品包藏的国家。1 9 9 5 年至今，美国陆军 一直保持与俄勒冈州立大学合作。前几年主要是针对2 种液体食品和4 种固体食品开 发高压罐头保藏食品。美国a v o m e x 有限公司尝试用压力处理鳄梨汁以提高其在冰箱 中的保质期，获得了较好的效果。1 9 9 7 年，该公司还首次生产出草莓风味的酸奶和 柠檬布丁。该公司目前正在探索生产其它高压食品，包括胡萝卜汁、苹果汁、大蒜泥、 芒果、番石榴和其它亚热带水果和蔬菜。日本是世界上最早将经过高压加工的食品推 向市场的国家。1 9 9 1 年，h o o v e r 等发现3 力，2 3 时经3 4 0 御a 高压处理生乳6 0 m i n ， 乳中单细胞增生李斯特氏菌的致死量达1 0c f u m l 。高压处理能改善乳制品的质量， 内蒙古农业大学硕士学位论文 7 如酸奶、干酪的品质。牛奶大约8 0 乳蛋白是酪蛋白，这些大的超分子聚合物被称为 胶束，它们足够大以至于可以使光线发生散射，从而造成了牛奶的不透明现象。而高 压处理可使微胶束破碎，因此，利用高压处理乳制品，可以增加其硬度、强度和乳清 分离的阻力。乳酪是典型的出售前需熟化数月的产品，某些情况下需要数年。有试验 表明，高压处理能加速其熟化。 1 4 4 国外超高压技术对蛋白质的研究 1 9 1 4 年b r i d g m a n 通过蛋白在压力作用下凝聚的事实证明了高压能使蛋白质变性， 他指出，蛋白质在5 0 0 m p a 压力作用下会凝固，在7 0 0 m p a 压力作用下变成硬的凝胶状 态。这是潜在应用的最基本的基础，也是抑制微生物的基本原理洲。s u z u k i 侧报道了 随着压力的增加( 3 0 0 m p a 范围内) ，牛肉中的蛋白质水解产物肽和氨基酸含量增加， 而这些物质正是牛肉风味的重要来源。澳大利亚科学家m a c f a r l a n e 首次报道压力可以 提高牛肉的嫩度后，高压处理技术在肉类加工中的应用引起人们极大的兴趣，人们开 始了高压对肉类各种特性的研究，也取得了很大的成果阳1 。 由于高压对食品成分产生的影响，它在食品加工和保藏中有着广泛的应用。高压 处理能够解聚肌动蛋白和肌动球蛋白，并能提高肌原纤维蛋白的溶解性，所以高压处 理后的肌动蛋白和肌动球蛋白的凝胶性可能发生变化( c h e f t e la n dc u l i o l i ，1 9 9 7 ； a n g s u p a n i s c he ta l ，1 9 9 9 ) ，这一应用会影响肌肉蛋白的凝胶特性，而且肌动蛋白和肌 球蛋白的结构也会有影响，这一特性在成品肉制品中具有至关重要的作用h l 2 1 。在这 种高压处理对肉组织结构有利的影响尚需进一步研究。e l g a s i m 等研究肌肉中的大部 分蛋白质在压力作用下会逐渐变性，也就是说其立体结构遭受不同程度的破坏阳，。 1 5 研究意义和目的 随着社会经济的发展和安全健康意识的提高，消费者对肉及肉制品的质量提出了 更高的要求，如安全性高、食用方便、保持天然风味和良好外观、不含防腐剂等。近 年来科学工作者将一些新技术超高压技术引入食品工业。超高压技术由于能在低温条 件下杀菌或抑菌，使食品的色泽、风味和热敏感营养物质得到最大限度的保护，故受 到研究人员和肉类生产者的关注。科学家发现一些重要的蛋白质资源的功能特性不能 满足食品加工的需要，如何改善蛋白质的功能特性，扩大其用途和改善食品品质，近 年来许多科学工作者对蛋白质的改性作了不少工作。 国内外主要研究的是高压处理对物料进行处理时的物理性质的影响。蛋白质的营 养功能和加工性能都和蛋白质组成与高级结构有关，针对超高压技术对对蛋白质结构 的影响研究甚少，本论文通过受压后肌动蛋白功能基团的变化，分析压力作用下肌动 蛋白的变性机制，解析超高压处理而引起的肌肉蛋白质的结构的变性机理。这些都为 高压技术在肉类加工中的进一步应用提供可靠的理论依据。通过探索超高压技术对蛋 8 超高压处理对牛骨骼肌g 一肌动蛋白结构的影响 白的作用机制，能推广该技术应用到食品的各个领域中。拓宽蛋自在食品工业中作为 功能性食品基料在肉制品、乳制品、焙烤制品、营养配方食品中的应用。本研究不仅 应用于食品，而且广泛应用于生物技术领域。对于产业界来讲、为食肉嫩化和成熟促 进理论，添加剂的减少( 或无添加剂食品) 等的实用化提供理论基础。同时，确立高压 加工肉制品开发，开发新机能肉类食品，推广该技术在食品工业中的应用。 2 材料与方法 2 1 材料 2 1 1 试验材料 新鲜牛肉，购于呼和浩特市西口屠宰市场卫生检验合格的成年牛后大腿肉；透析 袋m d 3 4 ，s o l a r b i o 公司进口分装；a t p ，美国s i g m a 公司；牛血清白蛋白( b s a ) ，北 京百灵克生物科技有限责任公司；二乙基氨基乙基( d e a e ) 5 2 纤维素离子交换剂， w h a t m a n 公司进口分装； i r i s b a s e ，十二烷基硫酸钠( s d s ) ，丙烯酰胺，双丙烯酰胺， b 巯基乙醇，考马斯亮蓝g 2 5 0 ，美国s i g m a 公司；低分子量标准蛋白质m a r k e r ，中 国科学院上海生物化学研究所监制；d t n p ( 2 ，2 - d i t h i o b i s 一( 5 一n i t r o p y r i d i n e ) ) ，美国 a l d r i c h 公司：8 苯胺基1 奈磺酸a n s a ( 8 n a l i n o - 1 n a p h t h a l e n e s u l p h o n i ca c i d ) ，美国 s i g m a 公司；半胱氨酸，b b i 公司 基本化学试剂：氢氧化钠，盐酸，抗坏血酸，乙醇，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾， 氯化钙，丙酮，甘氨酸，甘油，氯化钠，硫酸铜，氯化钾，t r i s b a s e ，过硫酸铵，酒 石酸钾钠，溴酚蓝，以上试剂均为分析纯 2 1 2 主要仪器及设备 q w d j l8 a 多功能绞肉机 多功能粉碎机8 7 8 a 、b 旋涡混合器h q 6 0 超速冷冻离心机 可见紫外分光光度计u v w i n 5 柱层析设备 稳流稳压电泳仪b g p o w e r 6 0 0 岛津r f 5 3 0 1 p c 荧光分光光度计 超高压食品处理装置u 口7 5 0 m p a 电子天平 冷藏柜 大功率磁力搅拌器9 9 1 恒温磁力搅拌搅拌器8 5 2 佛山市顺德区奇伟电器有限公司 美国原装进口 北京北方同正生物技术发展公司 美国b e c k m a n 公司型号x l 1 0 0 k 北京普析通用仪器有限责任公司 上海青浦泸西仪器厂 北京百晶生物技术有限公司 日本岛津公司 包头科发新型高技术食品机械公司 北京赛多利斯仪器系统有限公司 海尔集团 常州国华电器有限公司 常州国华电器有限公司 内蒙古农业大学硕士学位论文 9 制冰机x b l 3 0 t y 一8 0 5 脱色摇床 f r 一9 8 0 生物电泳图象分析系统 塑料封接机 真空干燥箱d z f 6 0 51 2 2 试验方法 以下提取过程均在4 c 条件下进行。 日本三洋公司 南京大学南达生物技术开发公司 上海复日科技有限公司 温州市鹿城黎明利波机械设备厂 上海一恒科技有限公司 2 2 1 肌原纤维蛋白质的制备 肌原纤维蛋白质的制备参考了w a b u s c h 1 的方法。 细切样品肉( 去除脂肪，结缔组织) 5 9 加6 倍量的溶液( 5 0 r a mt r i s h c l ，1 0 0 m m k c i ，5 m me d t a ，p h 7 6 ) 后用破碎机进行( 低速1 5 s e e ，高速1 5 s e c ) 破碎， 离，0 ( 3 0 0 0 r m i n ，1 0m i n ) ，抛弃上清液。沉淀上加样品重量5 倍的溶液( 5 0 r a m i r i s h c l ，1 0 0 m m k c l ，5 m me d t a ，p h 7 6 ) 后，搅拌，用破碎机进行粉粹( 高速1 5 s e e ) 。离一t = , ( 3 0 0 0r r a i n ， 1 0m i n ) ，抛弃上清液。上两步重复3 次。第4 次粉粹之后纱布过滤，沉淀上加样 品重量5 倍的1 0 0 m mk c l 溶液后，搅拌，用破碎机进行粉粹( 高速1 5 s e c ) 。离，0 ( 3 0 0 0 r m i n ，1 0m i n ) ，抛弃上清液。上两步重复2 次。沉淀上加1 0 0 m mk c l 溶液后，进 行搅拌，加1 0 0 r a mn a n 30 3m l 之后加1 0 0 m mk c l3 0 m l 低温4 保存。 2 2 2 肌原纤维蛋白质浓度的测定 肌原纤维蛋白质浓度用双缩脲法( b i u r e t 法) 测定悯。 配制双缩脲试剂：称1 5 0 9 硫酸铜( c u s 0 4 5 h 2 0 ) 和6 0 9 酒石酸钾钠 ( k n a c 凰0 6 - 4 h 2 0 ) ，用5 0 0 m l 水溶解，在搅拌下加入3 0 0 m l ，1 0 n a o h 溶液，用 水稀释到l l ，贮存于塑料瓶中。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现， 则需要重新配制。 配制标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋i 刍( b s a ) ，配制成l o m g 向的标 准蛋白溶液。 标准曲线的测定：取1 2 支试管分两组，分别加入o