（植物学专业论文）lehsp84在番茄中的反义表达.pdf

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t a l l c er ) 蛋白介 导的抵抗病毒侵入的过程中起重要作用。 从番茄c 聊蛆文库中克隆到的三如位于染色体中，全长2 5 8 8 b p ，表达 产物定位于细胞质中。序列分析证明l e h s p 8 4 是h s p 9 0 家族的一员。为了了解 h s p 8 4 在植物抵抗逆境过程中的功能，本实验利用反义技术，抑制如l 卿彳基因 在番茄中的表达。结果表明，抑制三吐五姗彳基因表达后番茄的耐受热和盐胁迫 的能力较对照并无明显差异。本论文主要结果如下： 1 ) 转基因植株的获得：p c r 和s o u m e mb l o t 结果显示转三幽基因反义片段 的番茄叶片d n a ，用n p t 引物能扩增和杂交出特异d n a 片段，而对照番茄未 见特异条带，说明三出删反义片段确实已导入番茄中。n o n h e mb l o t 结果显示 转基因番茄常温下h s p 8 4 表达量要低于对照，说明反义技术已经抑制了幽删 基因在植物体内的表达。 2 ) 番茄耐热性：将对照及转基因番茄植株分别置于4 0 、4 2 、4 4 和4 6 下热激处理2 h ，2 8 恢复四周，观察发现4 0 、4 2 、4 4 处理后很快植株就恢 复，且转反义基因番茄生长状况与对照番茄并无明显差异。4 6 处理后恢复较慢， 三周后逐渐恢复，转反义基因番茄生长状况与对照番茄并无明显差异，转基因番 茄株系的下降程度略小于对照番茄植株，而叶绿素含量变化无明显差异。 山东师范大学硕士学位论文 3 ) 番茄抗盐性：用2 0 0m m o ，的n a c l 溶液对转基因植株和对照植株进行胁 迫处理，植物生长均受到明显抑制，部分叶片变黄。但转反义基因番茄的生长情 况与对照无明显差异。对盐处理后的转基因植株和对照植株相对含水量、n a + 和k + 离子含量、脯氨酸含量、丙二醛( m d a ) 含量、s o d 酶活性的测定结果显示， 转基因番茄的这些指标与对照植株基本没有差异，表明反义上出碗诱彳基因的导入 没有明显影响番茄的抗盐性。 关键词：分子伴侣；h s p 8 4 ；转反义基因番茄；耐热性；盐胁迫 论文分类号：q 7 8 2 山东师范大学硕士学位论文 a b s t r a c t h s p 9 0 ( h e a ts h o c kp r o t e i n9 0 ) i sai n o l e c u l a rc h 印e r o n ea l l di s0 n eo ft h em o s t a b u i l d a n tp r o t e i 璐i l lu i l s 仃e s s e dc e l l s i ti sau b i q u i t o u sm o l e c u l a rc h 印e r o n ef o 咖【di n e u b a c t e r i aa n da 1 1b 姗c h e so fe u l 【a r y a ，b u ti ti s 印p a r e n t l ya b s e n ti l la r c l l 乏屺a w h e r e 私 c y t o p l 勰【1 1 i ch s p 9 0i s 器s e n t i a l 矗wv i a b i l i t ) r 衄d e ra l lc o n d i t i o 璐i i le u k a r y o t e s ，a l e b a c t 耐a 1h o m 0 1 0 9 u eh t p gi sd i s p e 璐a b l e 眦d c rn o n h e a ts 臼e s sc o n d i t i o n s i i lv i v 0 h s p 9 0i sad i m 甜cp r o t e i i lc o n s t i t u t e d b yt h r e er e 百0 1 1 s ：m en - t e n i l i n a ld o m 痂w l l i c h b i n d sm ea r p ，t 1 1 ec e n t r a ld o m a i ni n v 0 1 v e di i lt h ea 印嬲ea c t i v i t ya n di nn l e r e c o g m t i o no fc l i 饥tp r o t e i n sa n d t h ec t e r i i l i n a ld o m a i nr e s p o n s i b l ef o rt h e d 妇e r i s a t i o na n db i n d i n go fs e v e r a lc 0 - c h a p e r o n h s p 9 0l 粥n 0a c t i v 时b e f o r ei t s d i m e r i s a t i o n h s p 9 0p l a y si m p o r t 觚tr o l e si i l 疵m a lc e l l s ，b u tm e 觚t i o no fh s p 9 0i np l 孤t c e l l sh 鹬b e l e s sr e s e a r c h c d h lt 1 1 e 彳m 6 埘哪西壤口z 缸，l 毋t 1 1 i s 触i l yi n c l u d e s7 m 锄b e r s t l l ea t h s p 9 0 一1t l o u 班a m s p 9 0 - 4p r o t e i l l sc o n s t i t u t em ec y t o p l 嬲r n i c i l y ，w h e r e 嬲戗l ea t h s p 9 0 - 5 ，a t h s p 9 0 6a n da t h s p 9 0 一7p r o t e i a r ep r 础c t e dt o b ew i t h i l l l cc h l o r o p l 嬲t i d i a l ，i i l i t o c h o 瓜l r i a l 觚de i d o p l 硒m i cr e t i c u l 眦c o m p a r t i i l e m s r e c e n t a l ys t l l d ys h o w sh s p 9 0c h a p 咖ec o m p l e xi si m p o n a m t i l lp l a md e v e l o p m 咖 觚dr e s p 伽s i v e l l e s st 0e x t e n l a ls t i i n u l i h l p a m c u l 碣 h s p 9 0i sc m c i a lf o r r - p r o t e i n - m e d i a t c dd e f e n s ea g 础：l s tp a t h o g e i l s ac d n ao f2 5 8 8 b p c o d i n ga 如l l l e i l g t h 三删彳h a db e c l o n e d 舶m t o m a t o ，h i c hi sac h r o m o g e i l e 1 r e s u l to fs e q u e l l c ea 1 1 a l y s i ss h o w e dm a tt h e h s p 8 4 ，l o c a t i n gi i lc ) r t o p l 姗，w 弱am 锄b e fo fh s p 9 0f a m i l y 1 1 1 证l i ss t u d y ，孤 肌t i s e n s e三以淌彳c d n a 触舯e n t w 勰d u c e di n t 0t o m a t 0 b y 彳d 施c 玉b 一甜聊一m e d i a t e d s f o m a t i o n t h er e s u l t ss h o w c d 血a tt h er e s i s t a l l ta b i l i t ) ， t 0h e a ta n ds a l ts 臼e s so ft a n s g e i l i cp l a n t sw 嬲s i m i l a rt 0m a to fc 0 n n 0 lp l a i l t s t h e r e s u l t sw e r es h o 、) l ma sf - 0 1 1 0 w s ： 1 ) t h eg e i l e r a t i o no ft o m a t 0 髓w i t l lr 印r e s s e d 三甜姗4 ：t h er c s u no fp c ra i l d s o u t 】 1 锄b l o ts h o w e dm a tt 1 1 et o ma _ t 0p l a n t s 灯a l l s f 0 肌c dm ea n t i s e i l s e 三西五妒凹 c d n a1 j r a 舯e n th a db e e na l i l p l i f i e dd n a s e g m e n t sw i t ht l l en p t i ip 血n e r s ，w h i l et l 地 c o i l t r o lp l a n t sh a v e l l t ，、h i c hi n d i c a t et h a tt h ea i l t i s e i l s e 以五铲召颦c d n a 咖e n th a d 3 山东师范大学硕士学位论文 b e e nt r a i l s f o m e di n t ot h et o m a t o e s i l l en o r t h e mb 1 0 ts h o w e dt h a tt h ee x p r e s s l o n0 f 三矗勰阳4i nt r a i l s f - o n i l e dt o m a t ow a s1 0 w e rm a l lt h a ti 1 1t h ec o n 臼0 lp l a m s ni n d i c a t e d t h a tm e 三8 日酣羽g e n ei n 仃a 1 1 s f 0 姗e dt o m a t 0p l a i l t sh a db e e ni nr 印r e s s e de x p r e s s i o n 2 ) t h e m o t o l e m c eo ft l l et r a l l s g e n i cp 1 孤t s ：1 l l ec o i l 仃0 lp l 砌sa i l dt h et r a l l s g e n j c p l a n t sw e r ee x p o s e dt 0h i 曲t 锄p e r 舭o f 4 0 ，4 2 ，4 4 a r l d4 6 f o r2 h ，a r l d t h e nw e r e 仃a n s f e 盯e dt on o n n a lc o i l d i t i o n sf o rr e c o v e r yf o r4w e e k s t h er e s u l t s s h o w e dt h a td u r i n gt l l er e c o v e r yp h a s et h e 粤- 0 w t hs t a t eo fm e 仃a n s g 面cp l a n t sh a dn 0 o b v i o u sd i 妇向e n c e 正r o mt h ec o n n o l s b u ta 缸e r4 6 ，t h er e s u l t so f 耽d e c r e a s e s l o w e ri n 仃a n s g e n i cp l a n t st h a nt h ec o n n o l s 3 ) s a l ts t r e s so f 仃a n s g e n i ct o m a t o ：t h et m s g e i l i cp l a n t sa i l dc o n t r 0 1 sw e r e 仃e a t e d b y2 0 0 删 1 1 0 l i 。n a c l t h ep l a n tg r o w d lw 弱o b v i o u s l yr 印r e s s e da f t e rs a l t 仃e a 衄e 1 1 t f o r2 0d a y s ，a i l dp a r t i a l l e a v e ss c o r c h e d t h eg r o w ms t a t eo fm et r a i l s g e n i cp l a n t sh a d n 0o b v i o u sd i f i e r e n c e 岔o mt l l ec o m r o l s as e to fp a r a m 酏e r s ( r e l a t i v ew a c e rc o n b e m ，n a + ， c c o n t e n t ，p r o l i n ec o n t e m ，m d ac o n t e n t ， s o de 1 1 z y m ea c t i v 时) w e r em e a 8 u r e di n 仃锄s g e t l i cp l a n t s 锄dt h e c o n 臼o l sa r e rt l l e 仃e a 缸n e m t h er e s u nw a st h a tm e s e p 越吼e t e r sh a dn 00 b v i o l l sd i 虢r e i l c eb e 觚e e n t l l et r a n s g e i l i cp l a n t s 觚dt h ec o 肋0 1 s k e yw o r d s ：m o l e c u l a rc h a p e r o n e ；h s p 8 4 ；t r a n s g e n i ca n t i 工e 石毯腓4g e n et o m a t o ； t h e r m o t o l e r a n c e ；s a l ts t r e s s c a t e g o r y ：q 7 8 4 山东师范大学硕士学位论文 1 h s p 9 0 研究进展 第一章文献综述帚一早义陬琢硷 热激蛋白9 0 ( h e a ts h o c kp r o t e i n 9 0h s p 9 0 ) 是一种大量存在、且高度保守 的分子伴侣【l 】，为真核生物的生长发育所必需。h s p 9 0 这个术语来自它的定义，一 开始认为h s p 9 0 是在热激状态下上调的一组蛋白，因而被命名为9 0 k d a 热激蛋白； 后来对h s p 9 0 的表达鉴定揭示，尽管h s p 9 0 家族的一些成员的表达与应激诱导有关， 但其他成员却是组成型表达的【2 】。 动物细胞中，细胞质中的h s p 9 0 主要有两种类型：h s p 9 0 一q 和h s p 9 0 一，它 们的氨基酸序列一致性高达7 6 。内质网上存在一种分子量为9 4 k d a 、受葡萄糖调 节的蛋白质g r p 9 4 ，它与细胞质h s p 9 0 的同源性达5 0 【2 】；也有报道称，定位于线 粒体上的h s p 9 0 的远缘亲属t r a p l ，与人类h s p 9 0 一b 的同源性大约为3 5 【羽。动 物实验显示，h s p 9 0 在蛋白质的折叠、激活甚至运输过程中起重要作用。这些蛋白 质包括参与信号转导的蛋白和参与细胞周期调控的蛋白等。原核细胞中也存在 h s p 9 0 ，它与人类h s p 9 0 有4 2 的同源性，但它在原核细胞中并不是必不可少的【2 1 。 十几年前有人已从某些植物中克隆了伪刀口基因，模式植物拟南芥的删基因 也已被分离出来，但人们对它的功能和作用机制的了解仍非常有限。直到最近， 少数的实验室专注于研究植物中h s p 9 0 伴侣复合物，有关h s p 9 0 在植物对疾病抗 性及遗传隔离中的作用的报道再次引起人们的关注。研究植物中的h s p 9 0 ，在揭示 h s p 9 0 的未知功能方面有很大潜力，这些功能可能是植物特有的，也可能是在所有 生物中共有的。 1 1h s p 9 0 家族的蛋白结构 h s p 9 0 蛋白的一级结构包括三部分：n 一末端2 5 k d a 的氨基端结构域，此部分 含有核苷酸结合位点，高度保守；c 一末端1 2 k d a 的羧基端结构域；4 0 k d a 左右的中 间结构域【3 】【4 】。真核生物的n 一末端和中间域之间还有一个连接区域( 图1 ) 。 山东师范人学硕i ：学位论文 k - _ _ _ y _ _ 一， n u c k 0 6 d e b 嘲i n a k ，一 d j m e s a 6 0 n ， o 争c h a o e 门o n ei n l 晤髓屺慷d r 图lh s p 9 0 一级结构不恿阁 1 1 - 1h s p 9 0n 一末端结构域 从品体结构来看，h s p 9 0 家族的n 一术端是一个二聚物晴1 ，其一侧是一高度扭曲 的、有8 条链组成的b 折叠，另一侧被9 条a 螺旋所覆盖。在螺旋的中心有一个 “口袋 ，b 折叠链的表面透过这个“l l 袋 形成一个a t p a d p 结合域，a t p 在其 中呈现紧密构象瞄儿“! 。 n 端附近的核苷酸结合口袋是h s p 9 0 上最保守的结构域，大约为l 一2 2 0 残基。 生化和晶体学研究都表明这是h s p 9 0 同a ，f p 或a d p 结合的位点，也是h s p 9 0 抑制 剂格尔德霉素( g e l d a n 锄y c i n ，g a ) 和根赤壳霉素( r a d i c i c 0 1 ) 的作用位点。 h s p 9 0 所形成的l j 袋被认为是其底物的结合位点，调节着其底物的构象变化及其折 叠。h s p 9 0 本身构象的变化影响着口袋的大小。研究发现，h s p 9 0 有两种不同的构 象( 开放关闭) ，在开放状态下才能结合a t p ，但只有在关闭之后才具有a t p a s e 活性盯1 。 w h i t e s e l l 等首次发现苯醌安莎霉素类g a 可以与h s p 9 0 的a t p 酶位点特异性 结合，且其结合活性较人t p 高出2 5 倍。g a 与h s p 9 0 结合后，导致h s p 9 0 底物以非 折叠态存在，从而被泛素依赖的蛋白酶体途径所降解m 儿9 1 。 h s p 9 0 活性是a t p 依赖性的。i i s p 9 0n 一末端的a t p 结合能力以及a t p a s e 活性 对其伴侣活性是必需的n 0 州他1 。h s p 9 0 和a t p 的结合诱导了其n 端附近结构域的 同型二聚化，同时还引起了c 端附近的_ 聚体相互作用n 加。伴随着a ，j p 的结合和 水解，1 1 s p 9 0 的构象发生变化，随之影响h s p 9 0 与它的辅分子伴侣及客户蛋白之白j 的相互作用n 驯。 l i s p 9 0 的a t p 酶活循环n 剐( 图2 ) 具体过程是：1 ) 在h o p 介导下，核苷酸底物从h s p 7 0 转到h s p 9 0 ：2 ) n 端处于开放状态的h s p 9 0 二聚体结合核苷酸底物：3 ) a t p 的结 合导致i i s p 9 0n 一末端的二聚化，允许p 2 3 结合，此时底物被h s p 9 0 的“分子钳” ( c 1 鲫p ) 固定住；4 ) a t p 水解，l s p 9 0 的“分子钳”打开或者发丛i 其它分子结构 翟 山东师范大学硕士学位论文 变化，底物释放，进入下一个循环。 a t p a 鼬啪o f h s p 9 0 吲目j a 糍c y 舢西枷d 图2h s p 9 0 的a r p 酶活循环示意图 1 1 2h s p 9 0c 一末端 关于h s p 9 0c 末端具体结构的报道较少。所有的细胞质h s p 9 0 家族蛋白c 一 末端都有一个5 残基的m e e v d 序列，这个序列的缺失导致h s p 9 0 的稳定性及特 异性降低。这段序列的具体作用还有待研究。现在认为n - 末端与c 末端的结构密 切相关，n - 末端能影响c 末端，并可能使之二聚化。h s p 9 0c 一末端也有一个隐 藏的a t p 结合位点，当n 一末端结合a r p 后，c 一末端的隐藏位点暴露出来。c 末端具有钙调蛋白结合位点，同时还是其它多种底物蛋白的结合位点，如类固醇 受体、肌动蛋白细丝等。人类g 】姆9 6 的c 一末端能够保护蛋白激酶c k 2 的催化亚 基的稳定性，防止高温引起的变性聚集【1 6 】。 1 1 3h s p 9 0 的中间结构域 h s p 9 0 的中间结构域呈绞链状构象，通过可变的赖氨酸和谷氨酸片段( 又称为 k e k e ”区域) 进行蛋白之间的相互作用【4 1 。据预测，有一对q 螺旋双链作为“k e i ( e 区域”的一部分，参与形成c a 2 + 结合部位。 酵母h s p 9 0 的晶体研究显示，h s p 9 0 的中间结构域由三部分组成，分别形成 a b a 、a 一螺旋、仅p q 构象【4 1 。靠近c 一末端的a 一螺旋赋予整个中间部很高的弹性。 中间部通过一个疏水的表面“补丁 和一个催化环来参与n 一末端的a t p 弱e 活性， 调节客户蛋白和辅分子伴侣的结合。表面“补丁 和催化环内部突变导致h s p 9 0 7 山东师范大学硕士学位论文 的a t p 水解活性缺失。a h a l 也是通过与中间部的结合来提高h s p 9 0 的a t p a s e 活性 的，可能是因为a h a l 稳定了n 一末端和中间部的结合构象而发挥作用的【1 7 】。过量 表达a h a l 可部分恢复因中间结构域突变所造成的h s p 9 0 a t p a s e 活性缺失，最高可 恢复到突变前的1 2 【1 6 】。 真核生物的h s p 9 0 中，在n 一末端和中间结构域之间还有一个高度可变的带电 荷的l i i l l 【e r 区【4 1 。该结构通过与结合在伴侣分子n 一端的a t p 分子的丫磷酸相互作 用，在调节a t p 水解过程中起重要作用【1 7 】。点突变实验证明l i i l k e r 区对维持h s p 9 0 的a t p 水解活性具有重要的作用。 h s p 9 0 中间结构域是也是众多辅分子伴侣和底物蛋白的识别和结合位点。如 辅伴侣p 2 3 、a h a l 、底物蛋白v s r c 、g r 等。中间区域的突变也削弱了h s p 9 0 和辅分 子伴侣a h a l 及p 2 3 的相互作用，从而降低了底物蛋白v s r c 和g r 的活性。中间结构 域对底物蛋白的调节能力差别很大，如酵母h s p 9 0 的w 3 0 0 a 突变使得v s r c 对高温 极为敏感，而g r 则对高温不敏感【4 】。 1 1 4h s p 9 0 的t p r 结构 h s p 9 0 必须与其它的辅分子伴侣( c o c h a p e r o n e s ) 形成多伴侣复合体才能发 挥其伴侣功能。这些辅分子伴侣中有许多都是含t p r ( t e 仃a t r i c o p 印t i d e sr 印e a t s ) 模体 的蛋白质【1 8 】。 t p r 模体是一个由3 4 个氨基酸组成的序列单元经串联重复排列而成。它最初 是在酿酒酵母的细胞分裂周期( c d c ) 基因编码的蛋白质中发现的。根据二级结构推 测，t p r 模体可形成两个反平行的a 一螺旋结构域a 和b 。a 结构域内共有保守残 基为4 、7 、8 、l o 和1 1 位，而b 结构域中包含保守残基为2 0 、2 4 、2 7 位。 t p r 模体的q 一螺旋规律性重复排列形成了一个右手超螺旋构象并产生一个两 亲性的沟，许多靶蛋白可以与之互补结合。 与h s p 9 0 结合的t p r 蛋白中都存在四个保守的碱性氨基酸残基( l s y 一9 0 ，a 喀 一1 0 1 ，衄一7 4 和l s y 一3 2 ) ，它们可与h s p 9 0 的c 一末端的酸性氨基酸( e e v d ) 相 互作用。h s p 9 0 具有两个t p r 结构，分别位于其n 末端和c 末端，而h s p 9 0 的辅分子伴 侣t o m 7 0 有7 个t p r 结构，4 个位于c 末端，3 个位于n 末端【1 5 】。其它能与h s p 9 0 家族形 成多分子伴侣复合物的辅分子伴侣通过t p r 结构与之耦联【1 9 1 。 多分子伴侣复合体中的t p r 结构域结合可形成多种功能结构域，如肽脯氨酸拓 8 山东师范大学硕士学位论文 扑异构酶结构域，蛋白质磷酸化结构域等。有研究证明，h s p 9 0t p r 结构可识别 h s p 7 0 ，并介导h s p 7 0 与h s p 9 0 ( h s p 6 0 ，h o p ，s t i l l ) 结合【1 8 】。h s p 9 0 可能为其它t p r 蛋白提供“泊位 ，指导其它的辅分子伴侣通过t p r 结构在h s p 9 0 周围有序的结合， 形成不同的复合体，共同完成不同的生理功能。h s p 9 0 与含t p r 的辅分子伴侣的 相互作用，为h s p 9 0 功能的多样性提供了结构基础【1 8 】。 1 2 植物中的h s p 9 0 家族 植物中的h s p 9 0 家族有多个成员。拟南芥( 舭6 j 幽筘拈幼a j j a 加) 存在7 种h s p 9 0 ，分另u 称之为a t h s p 9 0 1 、a t h s p 9 0 一2 、a t h s p 9 0 3 、a t h s p 9 0 一4 、a t h s p 9 0 5 、 a t h s p 9 0 一6 及a t h s p 9 0 7 【1 7 】，这七个成员有4 5 的序列是一致的。a t h s p 9 0 一2 、 a t h s p 9 0 3 和a t h s p 9 0 4 序列高度相似，各有9 6 的序列与其它二者相同，这说明 它们在功能上可能是冗余的。a t h s p 9 0 l 、a t h s p 9 0 一2 、a t h s p 9 0 3 和a t h s p 9 0 一4 的c 末端都含有动植物细胞质h s p 9 0 所共有的m e e v d 五肽序列【2 1 。a t h s p 9 0 一5 和 a t h s p 9 0 一6 的编码基因中含有1 8 一1 9 个内含子，这与细胞质h s p 9 0 的基因一般含有 2 3 个内含子是不同的，二者分别定位于叶绿体和线粒体。a t h s p 9 0 一5 位于n 端的 6 0 个氨基酸组成的多肽引导其跨入叶绿体；a t h s p 9 0 6 位于n 端的4 8 个氨基酸组 成的多肽引导其跨入线粒体。a t h s p 9 0 7 包含1 8 3 0 个氨基酸组成的n 端信号序列 和c 端的k d e l 内质网驻留序列，推测其位于内质网上【2 】。除了拟南芥以外，在烟 草，番茄中均有人克隆到了h s p 9 0 基因的多个成员。 1 2 1 删在植物中的表达 原核细胞中的h s p 9 0 ( h t p g ) 的组成型表达水平很低，但在热激或其他环境因 素的影响下其表达水平会大大提高。h s p 9 0 在哺乳动物中的组成型表达则相对较 高，受环境胁迫时的增加幅度也较小。植物中h s p 9 0 是受发育调控的，并对冷刺 激和昼夜交替变化敏感。对植物施以生长调节物质2 4 一表油菜素内酯，在转录和翻 译水平上都会检测到删的表达量的增加。 一般而言，彳芒昭刀俨，的转录只在根部进行，但当植物受到热或重金属的刺激 后会在所有的器官中都有大量表达。a t h s p 9 0 一2 和a t h s p 9 0 3 在所有的器官中都可 检测到，但在根和花中含量最多；热激后，彳芒艏剃和彳芒肠巧仉岁的转录水平稍 有增加，而当植株被植物激素、o 1 mn a c l 和重金属处理后，两者的转录水平都有 9 山东师范大学硕士学位论文 显著增加。对爿芒胚黼和彳扰5 阳口币而言，在热激后前者表达量稍有增加，后 者不变【2 】。 1 2 2 植物发育中的h s p 9 0 格尔德霉素( g e l d a n a m y c i ng a ) 是一种h s p 9 0 抑制剂，它与a t p 竞争结合h s p 9 0 n 端的结合位点，从而改变h s p 9 0 构象，抑制其行使正常的分子伴侣功能。用g a 抑制拟南芥h s p 9 0 会导致形态学表型上低的外显率，影响植物的许多结构。如在 苗期，这种形态学变化包括偏上性的子叶，圆盘状对称或放射状对称的叶子及根 毛不正常的生长【2 0 1 。 叶绿体特异性的胳瑚俨5 突变导致拟南芥对红光应答、氯酸盐抗性的改变和 c r 8 8 突变体中组成型的叶绿体发育的延迟【2 1 1 。内质网特异性的删一7 突变在 砌咖删突变体中产生花状和放射状分生组织表型，这种表型和三种c 如陋招 ( c j y ) 突变体中的表型相似【2 2 1 。钇y 基因限制胚胎细胞的一致性，并作为w u s c h e l 的负调控因子促进细胞分化。c l v 3 是一种隐秘的配体，它连接到复合物c l v l 和 c l v 2 上，这两者都是跨膜蛋白，并拥有胞外域【7 1 。因此，c l v l 和c l v 2 可能是内 质网伴侣的目标。事实上，c l v 3 表型的过度表达在动础刑突变体中被抑制了【2 2 1 。 植物中外源的哺乳动物类固醇激素受体的成熟证明了胞质h s p 9 0 伴侣在功能 上的保守性【2 4 1 。几种植物辅分子伴侣包括h o p 、p 2 3 和亲免素在内的同源异形体己 被鉴别【2 5 1 ，通过对这些植物同源异形体的干涉，发现它们在植物发育中的功能是 多样的。但胞质h s p 9 0 在产生这些表型中的作用还有待于研究。例如，在拟南芥 中朋s 丁耽翮，基因的突变( 该基因编码的蛋白与哺乳动物亲免素f k 5 0 6 一结合蛋 白( f k b p ) 5 2 相似) ，使适应性表型高度表达，其中包括子叶中异常的细胞增殖、 胚轴中多余的细胞层及不正常的项点上的分生组织，导致细胞的伸长和增殖都受 到影响【2 6 1 。 t w i s t e dd w f 6 心1 是一种f k b p ，和h s p 9 0 相互作用【2 7 】。t d n a 插入突变使 这种蛋白失效，显示出多种发育表型，包括高度减小、结构弯曲、对油菜类固醇 不敏感【2 8 】。人们倾向于推测油菜类固醇介导的信号转导可能要求h s p 9 0 复合物的 活性与其它模式有机体中类固醇激素依赖的信号相似【2 9 】。但h s p 9 0 在植物发育中 的作用范围有待研究，其重点是在h s p 9 0 伴侣复合物的功能上。 1 2 3h s p 9 0 和植物疾病抗性 l o 山东师范大学硕士学位论文 植物免疫是由可识别病原体分子的抗性( r e s i s t a n c er ) 蛋白所介导。在诸多下 游效应中，抵抗途径的激活通常诱导超敏反应( h y p e r s e i l s i t i v er e s p o n s eh r ) ，它涉 及在感染部位局部程序性细胞死亡【3 0 】【3 。有证据证明，在烟草中由刀基因凡d 介 导的抵抗角斑病，由冗x 介导的抵抗番茄病毒j 和基因介导的抵抗烟草嵌镶病毒 都依赖于删d 。【1 7 1 病毒诱导基因沉默( v i r u s i n d u c e dg e n es i l e n c i n g ，v i g s ) 技术在研究植 物抗病方面发挥了重要的作用。在利用v i g s 技术研究番茄抗病基因所d 介导的对 丁香假单胞杆菌的抗性信号基因时，发现热激蛋白h s p 9 0 对尸幻介导的抗性是必 需的【3 2 1 。s c o f i e l d 等【3 2 】在小麦上用b s m v v i g s 研究了刷肌、5 铆和力珊汐的功 能，证明刷肼、跖刀和舾：聊基因在抗叶锈病基因埘，介导的抗性中是必需的。 h e i n 等【3 3 】用b s m v v i g s 证明刷肼，跖仃和删基因在大麦抗白粉病基因脚a 坩 介导的抗性途径中非常重要。 在烟草和拟南芥中，多个证据证明了h s p 9 0 、s g t l ( s u p p r e s s o ro fg 2a l l e l e o f s f 獬r p s s 口l r d ，j t i 力p f d ( 加d ，pp 即芒p 抽j ) 及r a r l( r e q u i r e df o rm l a l 2 r e s i s t a n c e l ) 间的相互作用。s g t l 是真核生物在细胞周期、着丝粒装配和蛋白解 聚中具有功能的保守蛋白【3 3 】。与已证实的h s p 9 0 辅分子伴侣一样，s g t l 包含一个 与h s p 9 0 结合有关的t p r ( t e t r a t r i c o p e p t i d er e p e a t ) 【3 4 】区域。另外，s g t l 的 氨基末端c s 区域( c y s t e i n e a n dh i s t i d i n e r i c h c h o r d a n ds g t ld o m a i n ) 和h s p 9 0 辅分子伴侣p 2 3 结构相似【3 3 】。拟南芥s g t l b 可通过它的c s 区域和t p r 区 域分别同h s p 9 0 的a t p 酶区域和c 末端相互作用。据推测s g t l 通过富含亮氨酸的 重复区域( 1 e u c i n e r i c hr e p e a tl r r ) 和r 蛋白相互作用【3 5 1 。r a r l 似乎同h s p 9 0 的a t p 酶区域相互作用。因为有证据表明并非所有的h s p 9 0 依赖的r 蛋白都需要 r a r l 【3 习，因此其它的互作因子可能行使相似的功能。与哺乳动物类固醇激素受体 成熟范例相类比，可以将植物s g t l 等同于类似h o p 的辅分子伴侣，而r a r l 可能 等同于p 2 3 a h a l ，它们都使靶蛋白的成熟变得容易。然而，近期的数据表明它们 的作用机制可能更为复杂。在类固醇激素受体模型中，h s p 9 0 复合物陪伴一个亚稳 态蛋白，使它保持被其他激素配体激活的稳定性。相反，缺乏病菌时，r 蛋白被内 部分子的相互作用所稳固而失活。有证据表明一旦感染病菌，r 蛋白获得了不稳定 的、易解聚的形式。这种形式暴露出它们的核酸结合位点( n u c l e o t i d e - b i n d i n g 山东帅范火学硕 ：学位论文 s i t en b s ) 区域，由该区域介导随后的信号传递【3 6 l 【3 7 1 。组成型r 蛋白传递信号导 致细胞死亡【3 7 】【3 8 】，这使病原菌识别后的有效激活所平衡的负调控机制成为必要。 近期研究认定r i n 4 ( r p m li n t e r a c t i n gp r o t e i n 4 ) 作为一种遗传负调控因子及两 个r 基因编码的两种蛋白质r p m l ( r e s i s t a n c et o 雁日瑚锄s 掣一，卫弘e e x p r e s s i n ga v r r p m l ) 和r p s 2 ( r e s i s t a n c et 0 只i 州，现呈谊ee x p r e s s i n ga v r r p t 2 ) 的互作伙伴【3 9 】，一旦与病原菌毒性蛋白互作，r i n 4 的结构就会改变，这使r 蛋白 的激活变得容易【删。 根据一些实验结果t o d das a n g s t e r 等提出了h s p 9 0 功能的模型【3 1 。( 图3 ) ! 1 谬 ， 衲；r 纵 巍2 品：掌2 基： 。鹦 奄搦、= 。j i 置夸口“堪晒哺觚鹋由曲甜舡嘲两确 曲 md 兔 曼1 h 擘馕埘3 t ，岬- 曩 e l 删臼黼竹朝e 嗍， 图3h s p 9 0 一r a r 卜s g t l 复合物介导的r 蛋白激活模型 ( 弓i 自t b d das a n g s t e r 等2 0 0 5 ) ( a ) 病原体感染前：r 蛋白与内部分子和负调控因子形成稳定复合物( 包括r i n 4 及其 互作伙伴r 州1 和r p s 2 等) ( 左) ，未与r 蛋白结合的r i n 4 ，r 蹦l ，r p s 2 复合物( 右) 。( b ) 1 2 山东师范大学硕士学位论文 病原体与r i n 4 复合物结合，复合物结构改变，从而引发r 蛋白复合物结构改变，内部分子和 负调控因子与r 蛋白分离。这种不稳定的r 蛋白易被s g t l 所募集的蛋白水解机制降解。 i s p 9 0 伴侣复合物( 包括h s p 9 0 、s g t l 和r a r l ) 可识别r 蛋白的这种不稳定结构。( c ) h s p 9 0 伴侣 复合物稳定了r 蛋白的活化结构，s g t l 介导的r 蛋白解聚减慢使信号转导得以发生( 左) 。缺 乏h s p 9 0 伴侣复合物时，r 蛋白被迅速降解或失活，导致对疾病敏感( 右) 首先，r a r l 、硒剃和删刁突变都导致了r p m l 介导的抗性的丢失和r p m l 蛋白的消失【3 3 1 。同样的，觥的沉默导致r x 蛋白水平的下降，而跖刀的沉默 没有类似效果。而且，h r 诱导和r 蛋白稳定性是遗传上可分的：不含l r r 的截 短的r 蛋白能够诱导h r ，但不稳定【3 8 】。第二，r i n 4 ( 一种r p m l 的负调节因子) 与h s p 9 0 不能和r p m l 同时发生免疫共沉淀反应【3 3 1 。第三，砌掣突变体的表型包 括组成型r p m l 和r p s 2 蛋白的信号传递及细胞死亡，并且与刷肼、删之和 膨- 尸9 饥岁的表型相反【1 9 】【3 3 】【4 2 】【4 扪。事实上，砌4 突变体的致死性被剃尼，r a r ，突变 所延迟【4 2 1 ，由此推测r a r l 和h s p 9 0 可能是r 蛋白信号传递过程的激活者。 在这些资料的基础上，可推测r i n 4 的改变导致r p m l 和r p s 2 抑制分子内互作 的丢失。h s p 9 0 一r a r 卜s g t l 复合物可通过s g t l 与l r r 区域的互作被定位到r 蛋白 上。该复合物可介导r i n 4 从r 蛋白上的转移并可稳定r 蛋白的激活形式。鉴于s g t l 在e 3 泛素连接酶聚集及蛋白解聚方面已知的功能畔1 ，假定s g t l 介导了r 蛋白的 解聚似乎是合理的。当s g t l 是h s p 9 0 一r a r 卜s g t l 复合物的一部分时，s g t l 介导的 r 蛋白解聚减慢使信号转导得以发生。因此，这一系统代表在下游信号传递激活和 r 蛋白失活间一种很好的协调平衡。尽管阐明h