（法医学专业论文）issr标记技术在植物物证鉴定中应用的初步研究.pdf

中文论著摘要 i s s r p c r 在植物物证鉴定中应用的初步研究 刖青 植物广泛存在于自然界，与人们生活密切相关。在一些刑事案件中，检验案 犯无意间带走或留在现场的植物叶片、果实、斑汁、花粉等植物物证，对确定嫌 疑人与犯罪现场的关系，认定或排除嫌疑人常起到关键作用。在实际案件中，嫌 疑人或受害人身上或尸体上附着的植物样品条件很差，凭借传统的形态学和组织 学的方法可能无法确认、区分。随着分子生物学技术的发展，可以应用d n a 技术 对这些样品进行分析、检验，确定它们的种类与周围环境的相似性。 简单序列重复区间( i n t e r - s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，i s s r ) 分子标记是在p c r 基 础上发展起来的一种d n a 多态性检测技术。其基本原理是在简单序列重复( s i m p l e s e q u e n c er e p e a t ，s s r ) 的3 或57 端锚定1 4 个核苷酸，然后对反向排歹d s s r 间 的一段d n a 进行p c r 扩增，检测其长度多态性。s s r 也称微卫星d n a ，是一类由 几个( 多为1 - 5 个) 碱基组成的基序串联重复而成的d n a 序列，其中最常见的是 二核苷酸重复，即( c a ) n 和( t g h 。s s r 在真核生物中的分布是非常普遍的，并且进 化变异速度非常快，因而锚定引物的i s s r - p c r 可以检测基因组许多位点的差异。 与s s r - p c r 相比，用于i s s r - p c r 的引物不需要预先的d n a 测序。i s s r 分子标记通 常为显性标记，呈孟德尔式遗传，具有简便、快速、稳定、d n a 多态性高等优点。 本研究采用植物分子生物学领域具有广阔应用价值的i s s r 标记技术，旨在建立一 种在d n a 分子水平对植物物证进行种属鉴定的方法，通过筛选i s s 啪用引物，对 植物种和品种进行鉴定，从而解决相关法律问题。 材料与方法 采用传统c t a b 法结合p v p 、p 巯基乙醇和r n a s ea 用于提取植物d n a ，参考 u b c ( u n i v e r s i t yo f b r i t i s hc o l u m b i a ) 公布和文献中报道的引物，筛选出扩增条带 清晰、稳定性好、多态性高的通用引物，应用p c r 技术和聚丙烯酰胺凝胶电泳结 合银染显谱的方法，对生活中常见的7 类植物( 葱、玉米、辣椒、大豆、茄子、水 稻和槐树) 和沈农2 6 5 、辽粳2 9 4 、辽星1 、r 9 3 1 1 和日本晴共5 种水稻进行分型。对 不同种属、同一种属不同品系和同一植株不同部位的扩增结果进行比较；同时对 将室温干燥、阳光曝晒、潮湿环境和农药处理的检材与未处理检材的扩增结果进 行比较；以及确定满足i s s r 分析的最低植物叶片取材量。最后采用n t s y s 软件进 行统计学分析，计算d i c e 相似系数，对同一种属不同品种间进行u p g m a 聚类分析。 结果 使用引物u b c 8 2 4 对7 类植物进行p c r 扩增，扩增产物主要分布在3 0 0 - 3 0 0 0 b p 之间，不同种类具有不同的谱带，可以区分被检7 类植物。应用引物u b c 8 3 5 对5 种水稻品种扩增，扩增产物的长度位于3 0 0 b p - 3 0 0 0 b p ，共检出了2 8 条泳动度不同 的电泳谱带，根据检出的扩增产物数目和或片段长度不同，可以区分水稻的5 个 不同品种。5 份供试水稻的d i c e 相似系数为0 4 8 - 0 7 1 ，平均为o 6 0 。本研究通过对 不同大小植物叶片和不同含量模板d n a 的i s s r 扩增产物电泳图谱分析，能够获得 可满足i s s r 分析的最低需要植物叶片取材量和模板d n a 量分别为0 1 c m 2 j 9 1 3 9 0 p g ， 远不如普通p c r - s t r 的灵敏度高。应用引物u b c 8 2 4 对分别保存于不同环境中( 室 温干燥、潮湿环境、阳光曝晒和农药喷洒) 的植物检材和保存不同时间的植物检 材的i s s r 扩增产物电泳谱带的分析结果表明，在相同环境条件下放置时间越长， 植物d n a 模板改变越明显；在相同作用时间下，阳光曝晒组可以得到更多的谱带， 潮湿环境组的条带较少，而室温放置组得到的条带最少。喷洒农药一周内各时段 提取检材与未喷洒农药检材扩增产物的电泳谱带数目、泳动位置及产物量均无明 显差异。 结论宝日l ，己 1 、采用传统c t a b 法结合p v p 、t 3 - 巯基乙醇和r n a s ea 提取植物d n a 能够 满足i s s r - p c r 分析的最小检材需要面积为0 1 c m 2 。 2 、应用i s s r p c r 技术，根据引物u b c 8 2 4 的扩增结果可区分葱、玉米、辣 椒、大豆、茄子、水稻和槐树共7 种植物；根据引物u b c 8 3 5 的扩增结果可对沈 农2 6 5 、辽粳2 9 4 、辽星1 、r 9 3 1 1 和日本晴5 种水稻检材进行区分，为法医学种 属鉴定和农业生产中的品种真实性鉴定提供了一种简便经济有效的方法。 2 3 、应用i s s r - p c r 技术对阳光曝晒、潮湿环境、干燥和农药因素作用下的检 材分析认为：环境湿度是影响d n a 降解的重要因素，而农药因素对于d n a 影响 较小，提示i s s r 标记在对陈旧、变质植物检材的种类鉴定受到一定限制。 关键词 法医植物学；植物物证；种属鉴定；i s s r - p c r 3 英文论著摘要 b a s i cs t u d yo ni d e n t i f i c a t i o no fp l a n te v i d e n c eu s i n g i s s r - p c r i n t r o d u c t i o n a 谢d er a n g eo fp l a n t se x i s t si nn a t u r e ，a n di sc l o s e l yr e l a t e dt op e o p l e sl i v e s c h e c k i n gp l a n tm a t e r i a le v i d e n c e ss u c h 邪p l a n tb l a d e s ，f i a l i t s ，j u i c ep l a q u e s ，p o l l e n s t h a tc r i m i n a l sh a dn oi n t e n t i o no ft a k i n ga w a yo rw e r es t a y e di nt h ec r i m i i l a ls c e n e o f t e np l a y sav i t a lr o l ei na s c e r t a i n i n gt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h es u s p e c t sa n d c r i m i n a ls c e n e ，i d e n t i f y i n go re x c l u d i n gt h es u s p e c t s t h o u g hi n a c t u a lc a s e ，t h e c o n d i t i o no fp l a n tm a t e r i a l sa d h e r i n go nt h ec r i m i n a ls u s p e c t so rv i c t i m so rt h ed e a d c o r p s e sa r es op o o rt h a tt h em e t h o dr e l y i n go nt r a d i t i o nm o r p h o l o g ya n dm i c r o a n a t o m y m a yh a v en ow a yt od i s t i n g u i s ht h e m w i t ht h ed e v e l o p m e n to fm o l e c u l a rb i o l o g y t e c h n o l o g y , d n at e c h n o l o g yc a l lb ea p p l i e dt oa n a l y z ea n d t e s tt h e s es a m p l e ss oa st o d e t e r m i n et h e i rs p e c i e sa n dt h es i m i l a r i t yw i t ht h es u r r o u n d i n ge n v i r o n m e n t i n t e rs i m p l es e q u e n c er e p e a t ( i s s r ) m a r k e r si so n eo fd n ap o l y m o r p h i s m d e t e c t i o nt e c h n i q u e st h a td e v e l o p e do nt h eb a s eo fp c r t h eb a s i cp r i n c i p l eo fl s s ri s a n c h o r i n g1 - 4n u c l e o t i d e si nt h e3 o r5 e n do fs i m p l es e q u e n c er e p e a t ( s s r ) a n dt h e n a m p l i f y i n gt h er e v e r s ew i t ha s e c t i o no fd n ab e t w e e ns s rt o d e t e c ti t sl e n g t h p o l y m o r p h i s m s s s i t , a l s ok n o w n 弱m i c r o s a t e l l i t ed n a ，i s av a r i e t yo fd n a s e q u e n c e st h a ti sc o m p o s e db ys o m e ( o f t e n1 - 5 ) n u c l e o t i d em o t i f so ft a n d e mr e p e a t s a n dt h em o s tc o m m o nt y p ei sd i n u c l e o t i d er e p e a ts u c ha s ( c a ) na n d ( t g ) n s s ri sv e r y c o m m o ni ne u k a r y o t e sa n dt h ev a r i a t i o n e v o l u t i o ni sv e r yf a s t , a n dm a n yl o c i d i f f e r e n c e sc a nb ed e t e c tb yi s s r - p c r , i ti sn o tt op r e s e q u e n c ef o rt h ei s s r - p c r p r i m e r s i s s rm a r k e r sg e n e r a l l ya l ed o m i n a n tm a r k e r sw h i c ha l ef o l l o w e dm e n d e l s l a wa n da r es i m p l e ，r a p i d ，s t a b l ea n dd n ap o l y m o r p h i s m i nt h i ss t u d y , w eu s et h e i s s r - p c rt e c h n i q u et h a ti sb r o a d l ya p p l i e di nt h ef i e l do fp l a n tm o l e c u l a rb i o l o g yt o e s t a b l i s has p e c i e si d e n t i f i c a t i o nm e t h o do fp l a n tm a t e r i a l sa td n al e v e l b yt h e u n i v e r s a li s s rp r i m e r s ，w em a yp r o v i d eah a n d y ，r a p i da n ds t a b l em e t h o do fp l a n t m a t e r i a l si d e n t i f i c a t i o na n ds o l v i n gr e l e v a n tl e g a lp r o b l e m s 4 m e t h o d s i nt h i ss t u d y ，w eu s e dt h ei m p r o v e dh e x a d e c y lt r i m e t h y la m m o n i u mb r o m i d e ( c t a b ) d n a e x t r a c t i o nm e t h o dt oe x t r a c tp l a n td n a a c c o r d i n gt ou b c n i v e r s i t y o fb r i t i s hc o l u m b i a ) p u b l i s h e dp r i m e r sa n dt h el i t e r a t u r er e p o r t e d ，p r i m e r sw h i c hh a d f e a t u r e so fc l e a rb a n d s ，g o o ds t a b i l i t y ，h i g h l yp o l y m o r p h i s mw e r es c r e e n e d p c ra n d p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i sc o m b i n e dw i t hs i l v e rs t a i n i n g w e r ea p p l i e dt o a n a l y z es e v e nk i n d so fp l a n t sc l o s e l yr e l a t e dt op e o p l e sl i v e s t h ea m p l i f i c a t i o nr e s t d t s o fd i f f e r e n ts p e c i e s ，d i f f e r e n tc u l t i v a ro fs a m es p e c i e sa n dt h ed i f f e r e n tp a r t so ft h e s a m ep l a n tw e r ec o m p a r e d ；a tt h es a m et i m e ，t h ea m p l i f i c a t i o nr e s u l t so ft h es a m p l e s t r e a t e db yr o o mt e m p e r a t u r ed r y i n g ，s u n l i g h te x p o s u r e ，h u m i de n v i r o n m e n ta n d p e s t i c i d ew e r ec o m p a r e dw i t ht h eu n t r e a t e ds a m p l e s a tl a s t ，s t a t i s t i c a la n a l y s i s w a s c a r r i e do u tb yn t s y ss o r w a r et oc a l c u l a t ed i c ec o e f f i c i e n ta n du p g m ac l u s t e r a n a l y s i so ft h ed i f f e r e n tc u l t i v a r s r e s u l t s s e v e nk i n d so fp l a n ts p e c i e sw e r ea m p l i f i e du s i n gp r i m e ru b c 8 2 4a n dt h el e n g t h o fm o s to fa m p l i f i e dp r o d u c t sw a sr a n g ef r o m3 0 0 b pt o3 0 0 0 b p ，a n dd i f f e r e n ts p e c i e s h a dd i f f e r e n ts p e c t r u m s ，s oi tw a sa b l et od i s t i n g u i s hs e v e nk i n d so fs p e c i e s a p p l i c a t i o n so fd i f f e r e n tr i c ev a r i e t i e sw e r ec a r r i e do u tb yp r i m e ru b c 8 3 5a n dt h e l e n g t ho fa m p l i f i e dp r o d u c t sw a sr a n g ef r o m3 0 0 b pt o3 0 0 0 b p ，a n d2 8e l e c t r o p h o r e t i c b a n d so fd i f f e r e n t m o b i l i t yw e r ed e t e c t e d , a c c o r d i n g t od i f f e r e n tn u m b e ro f e l e c t r o p h o r e t i cb a n d sa n d | o rd i f f e r e n tl e n g t ho ff r a g m e n t s ，w ec a nd i s t i n g u i s ht h ef i v e d i f f e r e n tr i c ev a r i e t i e s t h ed i c ec o e f f i c i e n to ft h ef i v er i c ev a r i e t i e sw a sr a n g ef r o m o 4 8t 0o 7 1a n dt h ea v e r a g ev a l u ew a s0 6 1 t h em i n i m u n lo fp l a n tl e a v e sa n dt h e v o l u m eo ft e m p l a t ed n af o ri s s r - p c ra n a l y s i sw e r e0 1c m 2a n d3 9 0 p g ，a n dt h e s e n s i t i v i t yw a sf a rl e s st h a nt h eg e n e r a lp c r s t r a p p l i c a t i o no fp r i m e ru b c 8 2 4 w e r e p l a n ts a m p l e ss t o r e di nd i f f e r e n te n v i r o n m e n t s ( r o o mt e m p e r a t u r ed r y i n g ，h u m i d e n v i r o n m e n t , s u ne x p o s u r ea n dp e s t i c i d es p r a y i n g ) a n dd i f f e r e n tp r e s e r v a t i o nt i m e so f t h ep l a n ts a m p l e sw e r ea n a l y s i sb yi s s r - p c ra n de l e c t r o p h o r e s i s i tw a ss h o w e dt h a t u n d e rt h es a m ee n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n st h el o n g e rt h es a m p l e sp l a c e d , t h em o r e o b v i o u sc h a n g e si nd n a t e m p l a t e ；a n di nt h es a m et i m e ，t h es u ne x p o s u r eg r o u ph a d m o r eb a n d s ，h u m i de n v i r o n m e n tg r o u ph a dl e s sb a n d s ，t h en u m b e ro fe l e c t r o p h o r e t i c 5 b a n d sa n dt h ey i e l do fp c ro ft h es p r a y i n gg r o u p so fd i f f e r e n tt i m es a m p l e sw i t h i no n e w e e kh a dn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s c o n c l u s i o n s 1 t h em e t h o do fc t a bc o m b i n e d 、析mp v p , b - m e r c a p t oe t h a n o la n dr n a s ea c o u l db eu s e dt oe x t r a c tp l a n tp l a n td n aa n dt h es m a l l e s ta r e ao fs a m p l e st om e e tt h e i s s r - p c ra n a l y s i sw a s0 1e r a 2 2 a c c o r d i n gt ot h ed i f f e r e n tl o c a t i o na n d n u m b e ro fe l e c t r o p h o r e t i cb a n d sa n dt h e s i m i l a r i t ya n a l y s i s ，s o p h o r aj a p o n i c a , o r y z as a t i v a , s o l a n u mm e l o n g e n a , s o y b e a n ， c a p s i c u ma n n u u m ，z c am a y sa n da l l i u mf i s t u l o s u mc a n b ed i s t i n g u i s h e du s 啦p r i m e r u b c 8 2 4a n df i v er i c ev a r i e t i e sc a nb ed i s c r i m i n a t e db yp r i m e ru b c 8 3 5 w ep r o v i d ea s i m p l e ，c h e a p ，e f f e c t i v em e t h o do fi d e n t i f i c a t i o no fs p e c i e sa n dv a r i e t i e sa u t h e n t i c i t yi n f o r e n s i ca n da g r i c u l t u r e 3 i s s r - p c ri sa p p l i e dt oa n a l y z ep l a n ts a m p l e ss t o r e di nd i f f e r e n te n v i r o n m e n t s ， a n di ti sf o u n dt h a tt h ee n v i r o n m e n t a lh u m i d i t yi sa ni m p o r t a n tf a c t o r i nd n a d e g r a d a t i o n , a n dp e s t i c i d e sh a dl e s si m p a c to nd n ad e g r a d a t i o n i ti ss u g g e s t e dt h a t i s s rm a r k e r sm a yh a v ec e r t a i nr e s t r i c t i o n so nt h ei d e n t i f i c a t i o no fo l dd e g e n e r a t e d s a m p l e so fp l a n t s k e vw o r d s f o r e n s i cb o t a n y ；p l a n tm a t e r i a l ；s p e c i e si d e n t i f i c a t i o n ；i s s r o p c r 6 英文缩略语 7 中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名：丝芷l 日期：五叫 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在 攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离 校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师 为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学 校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩 印或其他手段保存论文。 论文作者签名： 指导教师签名： 翌垒芝 日期： 论文 i s s r p c r 在植物物证鉴定中应用的初步研究 刖瞢 植物广泛存在于自然界，是人们衣食住行用等生活必需品的来源，与人们生 活密切相关。侦查实践过程中也常发现被害人的衣物上、遗留物品上甚至尸体表 面、胃肠中，会留有其生活环境里、案发现场上、行走路线中的植物碎片；而犯 罪嫌疑人也会在其衣物、作案工具、交通工具等上面黏附有反映与作案有关的植 物碎片。对这些物质进行分析，判定犯罪嫌疑人是否去过案件现场，或者确定第 一犯罪现场的位置，常常对一些案件的侦破具有重要作用【l 】。在实际案件中，犯 罪嫌疑人或受害人身上或尸体上附着的植物样品条件很差，凭借传统的形态学和 组织学的方法可能无法确认、区分它们。随着分子生物学技术的发展，可以应用 d n a 技术对这些样品进行分析、检验，确定它们的种类与周围环境的相似性。 简单序列重复区间( i n t e r - s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，i s s r ) 分子标记是在p c r 基础上发展起来的一种d n a 多态性检测技术【2 】。其基本原理是在简单序列重复 ( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，s s r ) 的37 或5 端锚定1 - - , 4 个核苷酸，然后对反向 排列s s r 间的一段d n a 进行p c r 扩增，而不是扩增s s r 本身，检测其长度多态 性。s s r 也称微卫星d n a ，是一类由几个( 多为1 5 个) 碱基组成的基序串联 重复而成的d n a 序列，其中最常见的是双核苷酸重复，a 口( c a h 和( t g ) b 。s s r 在真核生物中分布是非常普遍的，并且进化变异速度非常快，因而锚定引物的 i s s r p c r 可以检测基因组许多位点的差异。与s s r - p c r 相比，用于i s s r - p c r 的引物不需要预先的d n a 测序，也正因如此，有些i s s r 引物可能在特定基因组 d n a 中没有配对区域而无扩增产物，i s s r 分子标记通常为显性标记，呈孟德尔 式遗传，具有简便、快速、稳定、d n a 多态性高等优点。 本研究采用植物分子生物学领域具有广阔应用价值的i s s r 标记技术，通过筛 选i s s 嗵用引物，旨在建立一种在d n a 水平对植物种和品种鉴定的简便经济有效 的方法，解决相关法律问题。 8 材料与方法 一、实验材料 ( 一) 实验样品 1 、7 种常见植物种类( 葱，玉米，辣椒，大豆，茄子，水稻，槐树) 的叶片 检材采集于沈阳农业大学实验田。 2 、5 个水稻品种( 沈农2 6 5 ，辽粳2 9 4 ，辽星1 ，r 9 3 1 1 ，日本晴) 的叶片检材 由沈阳农业大学水稻研究所提供。 3 、玉米的根、叶、花检材采集于沈阳农业大学实验田。 ( 二) 主要试剂 1 、c t a b ( 上海基星生物科技有限公司) 2 、p v p ( 北京明日百傲科技有限公司) 3 、s d s ( 华美国产) 4 、e d t a 2 n a ( 华美国产) 5 、氯仿( 北京化工厂) 6 、异戊醇( 北京化工厂) 7 、r n a s ea ( t i a n g e nb i o t e e h ) 8 、l a t a qd n a 聚合酶，1 0 x b u f f e r ( t a k a r a 大连) 9 、d n t p ，6x l o a d h a gb u f f e r ( t a k a r a 大连) 10 、d 2 0 0 0d n a m a r k e r ( t i a n g e nb i o t e c h ) 1 1 、引物序列u b c 8 2 45 t c t c t ct c t c t c t c t c g3 ，u b c 8 3 55 - a g ag a ga g a g a ga g a gy a37 委托大连t a k a r a 生物公司合成。 1 2 、丙烯酰胺，n ，n7 亚甲基双丙烯酰胺( m e i 汜k ) ( 三) 主要仪器 1 、d n a 扩增仪( u n oi i ，t - g r a d i e n t ，b i o m e t r a ) 2 、电泳仪( p h a r m a c i a ，e p s 5 0 0 4 0 0 ) 3 、电泳槽( 北京六一仪器厂，d y c z 2 4 d 型和d y y - i i l 3 3 a 型) 4 、紫外分光光度计( 美国优尼科，u 讥2 8 0 0 ) 9 5 、高速台式离心机( 上海医用分析仪器厂，t g l 1 6 g ) 二、实验方法 ( 一) 检材的处理 1 、分别将新鲜植物( 葱，玉米，辣椒，大豆，茄子，水稻，槐树) 叶片用蒸 馏水清洗三次滤纸吸干后置于室温干燥( 平均2 5 ) 和潮湿环境( 密封塑料袋内) 及阳光照射环境中，分别于第3 d 和第8 d 天提取d n a 进行分析。 2 、将农药( 8 0 敌敌畏乳油的1 0 0 0 倍稀释液) 喷洒在自然生长状态的槐树 叶片表面后，连续一周每天采集沾有农药的植物叶片提取d n a 进行分析。 ( 二) 模板d n a 的制备 1 、根据实验内容所需裁取适量检材( 见表1 ) 剪碎后放入1 5 m le p p e n d o r f 管( 置于冰盒上) 中，用玻璃棒在将其研碎。 表1 ，实验样品的取材量 检材种类检材用量 叶片 根 花 直径l c m 圆形检材及其1 2 、1 4 、1 8 的检材 长度l e m 条段( 直径约0 5 e m ) 直径l e n a 圆形检材 2 、加入6 5 c 预热的d n a 提取液5 0 0 r t l 和2 1 3 一巯基乙醇s o f a ，6 5 c 水浴3 0 m i n ， 每隔5 m i n 混匀一次。 3 、加入等体积氯仿异戊醇( 体积比2 4 ：1 ) ，轻轻混匀，1 2 0 0 0 r m i n 离心5 m i n ， 吸上层至1 5 m le p p e n d o r f 管中，加入1 1 0 体积的d n a 消化液，6 5 ( 2 消化3 0 m i n ， 间隔5 m i n 混匀一次。 4 、加入等体积氯仿异戊醇( 体积比2 4 ：1 ) ，轻轻混匀，1 2 0 0 0 r m i n 离心5 m i n ， 吸上层移至另一1 5 m le p p e n d o r f 管中，加入1 0 m g m lr n a s ea2 m ，3 7 ( 2 保温 3 0 m i n 。 5 、加入等体积氯仿异戊醇( 体积比2 4 ：1 ) ，轻轻混匀，1 2 0 0 0 r r a i n 离心5 m i n ， 吸上层移至另一1 5 m le p p e n d o r f 管中，重复抽提两次。 6 、加入1 1 0 体积3 m o l l 醋酸钠( p h 5 2 ) 和2 倍体积冷无水乙醇，充分混匀 1 0 沉淀d n a ，1 2 0 0 0 r m i n 离心1 0 m i n 后，弃上清。 7 、沉淀的d n a 用7 0 冷乙醇洗三次，室温干燥后溶于1 5 0 1 t lt e ( 1 0 m m o l l t r i s h c i ，l m m o l le d t a ，p h 8 0 ) 中，4 保存备用。 ( 三) p c r 扩增 1 、反应体系 总体积为2 0 1 x l ，引物2 m ( 5 1 a m o l l ) ，1 0 x l ap c rb u f f e ri i ( m g + p l u s ) 2 1 x l ， d n t p1 2 i - t l ( 2 5 r e t o o l l ) ，o 5 ul ar a qd n a 聚合酶，模板d n a 2 i - t l ( 3 0 一- 7 5 n g ) ， 加去离子水至2 0 山。 2 、循环条件 采用t o u c h d o w n 策略以增加p c r 反应的特异性和便利性【3 】。9 4 。c 预变性5 m i n ； 9 4 。c 变性3 0 s ，5 8 c 退火4 5 s ，7 2 延伸3 m i n ，共7 个循环( 每个循环降低退火温 度1 ) ；9 4 c 变性3 0 s ，5 2 退火4 5 s ，7 2 延伸3 m i n ，共2 8 个循环；7 2 延伸 5 m i n ，4 c 保存。 ( 四) 扩增产物检测 1 、电泳分离 ( 1 ) 凝胶制备用lx t b e 配制t = 5 、c ：3 3 的非变性聚丙烯酰胺凝胶( 1 4 c m 1 1 5 c m xl m m ) 。 ( 2 ) 加样电泳取p c r 扩增产物2 1 x l 与2 m 体积的上样缓冲液( o 2 5 溴酚蓝， 0 2 5 - - 甲苯青) 混合后，加入凝胶样品槽中，电泳缓冲液为1 t b e ，电压2 2 0 v ， 电泳2h 。 2 、银染显色 ( 1 ) 固定将凝胶剥离至容器中，用1 0 冰醋酸固定3 0 m i n ，去除固定液后， 用蒸馏水冲洗凝胶3 次( 1 0 m i n 以内) 。 ( 2 ) 染色将0 1 硝酸银2 0 0 m l ( 含1 7 0 1 x l 甲醛) 倒入容器中，染色3 0 m i n ， 蒸馏水快速冲洗凝胶1 次( 2 0 s 以内) 。 ( 3 ) 显色将3 n a e c 0 3 2 0 0 m l ( 含0 0 5 甲醛，2 o n a 2 s 2 0 3 ) 倒入容器中，轻 轻摇晃，至谱带显示清晰，用固定液终止显色，蒸馏水洗涤一次，贴于滤纸上晾 干保存。 三、数据统计分析 统计标记资料时，为确保准确性与可靠性，选取清晰可辨的扩增产物电泳谱 带用于数据统计分析。强电泳谱带及可重复检出的弱电泳谱带记为”1 ”，不能重复 检出的弱电泳谱带及无扩增产物检出的记为”0 ”，计算其扩增带总数和特异带总 数，并将0 ，1 矩阵图输入计算机，数据采用n t s y s 软件处理，计算d i c e 相似系 数，对同一种属不同品种间进行u p g m a 聚类分析。 实验结果 一、i s s r - p c r 检测植物种属差异的结果 1 、不同种类植物i s s r - p c r 分析结果 本研究采用引物u b c 8 2 4 分别对葱、玉米、辣椒、大豆、茄子、水稻、槐树 共7 类植物提取d n a 进行扩增，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离结合银染显 谱结果显示，不同种类植物d n a 扩增产物主要分布在3 0 0 b p - ，3 0 0 0 b p 之间；每种 植物不同长度扩增产物的电泳谱带着色存在强度差异，多含有1 - - - , 3 条着色较强的 电泳谱带( 蓝色箭头所示) 及多条着色较浅的电泳谱带；不同种类植物d n a 扩增 产物可见多条片段长度相同的电泳谱带，但各种植物均含有不同于其他植物的扩 增产物电泳谱带，依此可以区分被检的7 类植物( 图1 ) 。茄子检出的扩增片段数 目最多，共可见1 l 条电泳谱带，且各扩增产物片段长度差异也最大；葱检出的扩 增产物片段数目最少，只可见6 条电泳谱带；大豆和槐树都检出了7 条扩增产物 的电泳谱带，其中大豆的扩增产物片段长度差异最小；玉米检出了8 条扩增产物 的电泳谱带；辣椒和水稻各检出9 条扩增产物的电泳谱带。 1 2 。j 图1 ，不同种类植物i s s r p c r 分析p a g e 图谱 1 ；葱，2 ：玉米，3 ：辣椒，4 ：大豆，5 ：茄子，6 ：水稻，7 ：槐树，n ：阴 性对照，m ：d n a 分子量标准物 2 、不同品种水稻i s s r - p c r 分析结果 应用引物u b c 8 3 5 对沈农2 6 5 、辽粳2 9 4 、辽星1 、r 9 3 1 1 和日本晴共5 个不 同品种水稻提取d n a 进行扩增。扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离银染显谱结 果如图2 所示。在片段长度为3 0 0 b p 3 0 0 0 b p 的区域内检出了2 8 条泳动度不同 的电泳谱带，其中2 条为被检品种所共有其余2 6 条扩增产物电泳谱带在水稻不 同品种间的分布不同( 约占所有可检出电泳谱带的9 29 ) ，根据检出的扩增产物 数目和，或片段长度不同，可以区分水稻的5 个不同品种。 图2 ，不同品种水稻i s s r - p c r 分析p a g e 图谱 1 ：沈农2 6 5 ，2 ：辽粳2 9 4 ，3 ：辽星1 ，4 ：1 1 9 3 1 1 5 ：日本晴，n ：阴性对 照，m ：d n a 分子量标准物 二、i s s r - p c r 检测植物种属稳定性的结果 1 、同株植物相同器官i s s r - p c r 分析结果 在相同p c r 扩增条件下用引物u b c 8 2 4 对采自同一槐树的多个叶片、相同 取材量提取的d n a 进行扩增，扩增产物聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果见图3 。不 同样品p c r 扩增产物的电泳谱型高度相似，仅有个别弱带存在微细差异。 芦百真嚣昔f 鼻芦芦芦胃目茸驾 ou u0 一 掣，。+ 图3 ，槐树叶片i s s r - p c r 分析p a g e 图谱 1 7 为同株槐树的不同叶片检材，r ：重复 2 、同种植物不同植株i s s r p c r 分析结果 本研究采用引物u b c 8 2 4 对大豆、槐树、辣椒、玉米、茄子5 种植物不同植 株来源d n a 进行扩增，每种植物各选一份检材作为已知对照，其余检材扩增产物 标号后打乱顺序与己知不同种类植物扩增产物同步电泳检测结果见图4 。1 号与8 号，2 号与6 号，3 号与7 号，4 号与1 0 号，5 号与9 号样品扩增产物电泳谱带的 数量及长度一致，即同种植物( 相同品种) 获得了相同的扩增产物电泳谱型。 葛罢曼 _ - - 酗 图4 ，同种不同植株i s s r - p c r 分析物p a g e 图谱 1 ：大豆，2 ：槐叶，3 ：辣椒，4 ：玉米，5 ：茄子，6 1 0 ：盲侧检材编号 3 、同种植物不同器官i s s r - p c r 分析结果 采用引物u b c 8 2 4 对玉米的根、叶和花提取的d n a 在相同扩增条件下进行 扩增，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果如图5 所示。玉米不同器官( 根、 叶、花) d n a 扩增产物在1 0 0 0 b p 3 0 0 0 b p 区域