（材料学专业论文）环境敏感性微凝胶对牛血清蛋白的吸附研究.pdf

摘要 环境敏感性水凝胶是高分子凝胶的一种，它能够感应外界环境的变化并因此 而发生相应的物理化学性质的变化。这些外界因素包括温度、离子强度、p h 值、 溶剂以及光、电、磁、压强等。近几年来，随着高分子科学与生物医药的交叉研 究的兴起，由聚酰胺及其衍生物形成的环境敏感微凝胶因其具有一定的大小、交 链结构、组成和生物相容性而最为引人注目，被应用于诸如生物活性标记、免疫 隔离细胞移植、基因治疗和药物定位缓释等。 为了考察离子型微凝胶与蛋白质之间的相互作用机理以及蛋白质在微凝胶 上的吸附脱附，本研究采用间歇无皂乳液聚合法进行n 异丙基丙烯酰胺 ( n i p a m ) 与丙烯酸( a a c ) 的无规共聚物p ( n i p a m c o a a c ) 的制备。在合 理设计的基础上，通过调节a a c 单体含量、交联剂n n 亚甲基双丙烯酰胺 ( m b a a m ) 用量及加料方式，制备不同温度、p h 响应的核壳型p ( n i p a m c o a a c ) 微凝胶粒子，以利于蛋白质在其上的负载。 实验发现，所制备微凝胶粒子大小均一，单分散，直径约8 0 0 n m ，粒子表面 羧基量随a a c 加料量的增加而增加，且该微凝胶同时具有温度及p h 敏感性。p ( n i p a m c o a a c ) 微凝胶的较低临界共溶温度( l c s t ) 的大小与微凝胶聚合物 中a a c 及m b a a m 的含量有关。a a c 或m b a a m 含量的增大都使微凝胶的l c s t 增大，这主要是由于聚合物中m a c 及交联剂m b a a m 的亲水性所致。而交联剂 用量的增加同时增加了微凝胶网络中交联点密度，降低了网络尺寸，减少了对水 的滞留能力，所以会使微凝胶的溶胀度变小，表现为透光率区间范围减小。此外， 微凝胶的p h 敏感性随聚合物中a a c 含量的增加而显著提高，不含a a c 的 p n i p a m 几乎不具有p h 敏感性。 p ( n 1 p a m - c o a a c ) 微凝胶对牛血清蛋白( b s a ) 的吸附量受环境p h 值及 盐浓度影响显著。低p h 值及碱性条件下，微凝胶对牛血清蛋白( b s a ) 的吸附 量较低，而p h 3 5 时，吸附量较大。这是由于在微凝胶与b s a 之间静电、疏水 及氢键共同作用的结果。外加盐会破坏微凝胶粒子与b s a 间的静电相互作用， 因而微凝胶对b s a 的吸附量随离子强度的增加而降低。蛋白质脱附实验中发现， p ( n 1 p a m c o a a c ) 微凝胶对蛋白质的释放具有p h 可调控性。酸性条件下( p h 4 ) 达到饱和吸附的微凝胶，当改变环境p h 值为碱性( p h 7 4 ) 时，微凝胶释放其 所吸附蛋白质，释放量最高达1 0 0 。a a c 含量高的微凝胶比较低a a c 含量的 微凝胶对蛋白质的释放率高。 负载b s a 蛋白质的p ( n i p a m c o a a c ) 微凝胶粒子表面亲水性降低，疏水 性提高；而表面粒子的疏水亲水性直接影响微凝胶溶液的l c s t ，使负载b s a 后的微凝胶溶液的l c s t 有所降低。由于表面吸附的b s a 的疏水桥联作用，使 微凝胶粒子发生聚并，微凝胶溶液透光率降低：同时b s a 的覆盖对微凝胶的溶 胀性能有一定屏蔽作用，使微凝胶的温敏性减弱。 关键词：异丙基丙烯酰胺：丙烯酸；微凝胶；蛋白质；控制释放；环境敏 感性 a b s t r a c t m i c r o g e li sak i n do fp o l y m e rc o l l o i ds u s p e n s i o nw i t hp a r t i c l ed i a m e t e rf r o m 1 n mt ol u m e n v i r o m e n t a ls e n s i t i v eh y d r o g e l sc a r lr e s p o n dt ot h ee x t e r n a ls t i m u l i s u c ha s t e m p e r a t u r e ，p h ，i o n i cs t r e n g t h ，e l e c t r i c f i e l d ，o rs p e c i f i ca n a l y t e c o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t s i na d d i t i o n ，h y d r o g e l s a r ea l s o b i o c o m p a t i b i l i t y ， b i o d e g r a d a t i o nm a dl o wt o x i c i t y t h e s et m i q u eq u a l i t i e sm a k et h e mh a v eb e e nu s e d p r i m a r i l yi nt h eb i o m e d i c a la p p l i c a t i o n ss u c h a so n o f fs w i t c h e sf o rm o d u l a t e d v a r i o u s d r u g s ，p e p t i d e s a n d p r o t e i n s d e l i v e r y a n d t i s s u e e n g i n e e r i n g p o l y ( n - i s o p r o p y l a c r y l a m i d e ) ( p n i p a m ) i saw e l ls t u d i e dm i c r o g e lw h i c hu n d e r g o sa t e m p e r a t u r ei n d u c e dp h a s e t r a n s i t i o nw i t hal o w e rc r i t i c a ls o l u t i o nt e m p e r a t u r e ( l c s t ) a t 3 2 。c t h ei n t r o d u c t i o no fi o n i cm o n o m e r st on - i s o p r o p y l a c r y l a m i d em i p a m ) i n b i o m e d i c a lr e s e a r c hi so fg r e a ti n t e r e s td u et ot h es i m i l a r i t i e si nt h ec h e m i c a l f u n c t i o n a l i t yo f p r o t e i na n dm i c r o g e l i nt h i sw o r k ，ag r o u po fc h a r g e dc r o s s l i n k e dp h - t e m p e r a t u r es e n s i t i v e p o l y ( n - i s o p r o p y l a c r y l a m i d e - c o - a c r y l i ca c i d ) ( p t w i p a m c o - a a c ) ) m i c r o g e l sw e r e s y n t h e s i z e db ys u r f a c t a n t f r e ee m u l s i o np o l y m e r i z a t i o no fn i p a ma n da a c a f m i m a g e si n d i c a t e dt h em i c r o g e lp a r t i c l e sw e r em o n o d i s p e r s e da n dt h ed i a m e t e ro ft h e d r i e dm i c r o g e ll a t e xp a r t i c l e sw a sa b o u t8 0 0 n m t h es u r f a c e - c o o ho fm i c r o g e l p a r t i c l e si n c r e a s e dw i t ht h ea m o u n to fa a c t h ep ha n dt e m p e r a t u r es e n s i t i v i t yo f m i c r o g e l sw e r ec h a r a c t e r i z e db y t h et r a n s m i t t a n c eo fm i c r o g e l s u s p e n s i o n sa s f u n c t i o no ft e m p e r a t u r ea n dp h t h el c s to fm i c r o g e ls o l u t i o nw a si n f l u e n c e db y t h ec o n t e n to fa a ca n dm b a a mi n m i c r o g e lp o l y m e rs i g n i f i c a n t l y l c s to f m i c r o g e li n c r e a s e da st h ec o n t e n to fa a ca n dm b a a mi n c r e a s e sd u et o t h e i r h y d r o p h i l i cp r o p e r t i e s b e s i d e s ，t h e r ew a sl i t t l ec h a n g eo ft r a n s m i t t a n c ew i t ht h e i n c r e a s eo fp hv a l u ef o rt h ep u r ep n i p a mm i c r o g e l h o w e v e r , a f l e ri n c o r p o r a t i o n a a ci nt h ep n i p a m ，t h ep ( n i p a m c o a a c ) m i c r o g e lb e c a m ep hs e n s i t i v i ei n a d d i t i o n ，w i t ha a ca m o u n ti nt h ec o p o l y m e ri n c r e a s i n g ，s u c h p h s e n s i t i v i t y e n h a n c e d t h ea m o u n to f b o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) a d s o r p t i o no nm i c r o g e lp a r t i c l e s w a ss t r o n g l yi n f l u e n c e db yt h ee n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n s i tw a sf o u n dt h a th i g hi o n i c s t r e n g t hl e a d e dt ol o wb s aa d s o r p t i o nd u et ot h ed e c r e a s eo fe l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n b e t w e e nm i c r o g e la n db s ap r o t e i n m o r e o v e r , t h ea m o u n to fb s a a d s o r p t i o nw a s d r a s t i c a l l yi m p a c t e db yp hv a l u eo fm e d i u m t h em a ) 【i m u ma b s o r p t i o nw a so b s e r v e d a tp h3 - 5 ，w h i l el o wp hv a l u ea n db a s i cc o n d i t i o n sb o t hi n d u c e dt h er a t h e rl o w a b s o r p t i o n i nt h ee x p e r i m e n to fb s ad e s o r p t i o n i tw a sf o u n dt h a tt h ea d s o r b e db s a p r o t e i nc o u l db ec o n t r o l l e dr e l e a s e df r o mp ( n i p a m c o - a a c ) m i c r o g e lb ya d j u s t i n g p hv a l u eo ft h es u s p e n s i o n f u r t h e r m o r e ，i tw a sf o u n dt h a tt h ep r o p e r t i e so fo r i g i n a lm i c r o g e lp a r t i c l e s w o u n db ec h a n g e da f t e rt h e yl o a d e dp r o t e i n b s al o a d e do nm i c r o g e lp a r t i c l e sw o u n d m a k ep a r t i c l es u r f a c em o r eh y d r o p h o b i c ，w h i c hl e a dt ot h el c s to fb s al o a d e d m i c r o g e ls u s p e n s i o n sa tp h 5s h i f t e dt oal o w e rt e m p e r a t u r e a tt h es a m et i m e ， m i c r o g e lp a r t i c l el o a d i n gb s a w a si n c l i n e dt oa g g r e g a t i o nd u et ob r i d g ec o n n e c t i o n o fb s aa n dm i c r o g e l o nt h eo t h e rh a n d ，t h es w e l l a b i l i t yo fp ( n i p a m - c o - a a c ) m i c r o g e lm a y b el i m i t e db yt h eu p t a k eo f p r o t e i no nt h es u r f a c eo f m i c r o g e lp a r t i c l e s ， w h i c hc a u s e dt h ef a i m n e s so f t h et e m p e r a t u r e s e n s i t i v i t yo f m i c r o g e l k e y w o r d s ：n - i s o p r o p y l a c r y l a m i d e ；a c r y l i ca c i d ；m i c r o g e l ；p r o t e i n ；c o n t r o l l e d r e l e a s e ；e n v i r o n m e n t a ls e n s i t i v i t y 鼙梦7 茗7 8 3 1 8 9 郑重声明 本人的学镜论文是在导髑指导下独立撰写著完成的，学位论文没有剽窃、抄 袭等违反学术道德、学术规范的侵权行为，否则，本人愿意承担由此产生的一切 法律责任和法律后果，特此郑重声明。 学僚论文作者( 签名) ：李。致由f 磁肄6 嚣s 磊 郏蛾夫学鞭圭擘挝论文绪论 绪论 环境敏感性水凝胶在相当广的程度上对诸如温度或p h 值等的变化所引起的 刺激有不同程度的应答，是人们从1 9 8 5 年以来最为感兴趣的课题。 迄今为止研 究的最为普遍的环境敏感凝胶为聚n 异丙基丙烯酰胺( p n i p a m ) 体系，由于其 较低临界溶液温度( l c s t ) 在3 2 。c 左右，并且具有良好的生物相容性、生物降 解性、低毒性及其物理化学敏感性，可控制药物释放，因此受到人们的广泛重视。 为了扩大p n i p a m 的应用范围，人们将一些功能性单体与之共聚，形成一些新的 凝胶体系。近年来，研究者聚焦于对温度n p h 敏感的n 异丙基丙烯酰胺( n i p a m ) 及丙烯酸( a a c ) 的共聚物p ( n i p a m c o a a c ) 凝胶的研究。 p ( n i p a m c o a a c ) 的溶胀性能与p n i p a m 有显著差异。引入离子型单体 不仅会增加l c s t ，而且会影响体积相转变的机理，此外，生物大分子在离子型 凝胶上的负载是一极其复杂的过程，其负载机理及负载量不仅与生物大分子自身 链构象有关，还与凝胶性能如凝胶组成、电荷密度、交联度和单体质量分数有关， 并且环境条件如p h 、温度、离子强度也强烈影响吸附行为。此外，由于蛋白质 是一种两性高分子物质，具有特定的天然构象，并且其天然构象极易受外界环境 刺激而发生变化i l 。j 。那么如果将蛋白质负载在水凝胶上，蛋白质受刺激后的响 应变化有可能会带动整个水凝胶性能的变化，如l c s t 、体积、尺寸等。而目前 对于负载生物分子水凝胶的研究多集中于考察被负载生物分子在分析、医学诊断 和制药方面的应用，而忽略了负载生物分子后对水凝胶自身性能变化影响的研 究。鉴于上述存在的问题，本研究选择带有电荷的交联型p ( n i p a m c o a a e ) 微凝胶为载体，考察牛血清蛋白( b s a ) 在微凝胶上的负载释放对环境刺激的 响应机制，探讨b s a 蛋白质与微凝胶之间的相互作用原理，为蛋白质类药物的 开发提供新的途径。并由此可望制备新型蛋白质等改性的p n i p a m 温度- p h 环境 敏感微凝胶，进一步拓展环境敏感微凝胶在医疗方面的应用。课题研究内容包括： 1 、环境敏感微凝胶的制备：采用无皂乳液聚合法合理设计核壳结构形态的 a a c 改性p n i p a m 微粒子形态。通过控制共聚单体n i p a m 、a a c 和交联剂n n ， 亚甲双丙烯酰胺( m b a a m ) 的加入量和加入方式，调节水凝胶的尺寸、交联度 等，以得到粒子壳层聚合物交联度相对较高的适合吸附和保护蛋白质的结构不均 郑 l 大学硕士学位论文绪论 一p h 响应型水凝胶微粒子。 2 、将b s a 蛋白质与微凝胶在不同培养时间、不同蛋白质初始浓度、不同 p h 值及盐浓度条件下混合培养，使之充分吸附于微凝胶上。通过超速离心除去 未被吸附的蛋白质，利用紫外分光光度计测定吸附于微凝胶之上的蛋白质的量， 确定温度、p h 、离子强度等因素对负载于微凝胶上蛋白质量的影响，并探讨蛋 白质与微凝胶的相互作用机理。 3 、探索被吸附于微凝胶上的b s a 蛋白质的脱附条件，寻求蛋白质释放的化 学开关，为蛋白质控释药物的开发研究提供依据。此外，考察负载蛋白质后对微 凝胶性能的影响，以拓展b s a 微凝胶在生化、医学方面的应用。 郑州大学硕士学位论文 第一章 第一章文献综述 凝胶及凝胶现象在大自然中普遍存在，生物体的大部分由含水的柔软的凝胶 状物质组成。但直到9 0 年代k e l l e r t 4 才在一篇综述中为广义上凝胶作了一个较为 全面和准确的定义，即在水中能够溶胀并保持大量水分而又不能溶解的交联聚合 物，亲水的小分子能够在其中扩散。t a n a k a 等【目首次报道了温度敏感性水凝胶， 该类水凝胶在某一温度附近会发生从溶胀的软的透明状态到消溶胀的不透明状 态的变化，且该过程可逆，如图1 1 所示，这一温度称为该水凝胶最低临界共溶 温度( l o w e s tc i t i c a ls o l u t i o nt e m p e r a t u r e ，l c s t ) ，或体积相变温度( v o h u n ep h a s e t r a n s i t i o n t e m p e r a t u r e ，v p t t ) ，或浊点( c l o u d p o i n t ，c p ) 【6 j 。水凝胶的l c s t 是 表征这类温敏材料的重要物理量1 7 】。不仅温度可以引起这些变化，而且p h 值、 溶剂组成、盐浓度、光场、力场、电场等也可导致这种变化，而对这些环境的应 答除了水凝胶溶胀体积有突跃性变化之外，凝胶的其它性质，如相互作用参数、 模量、折射率、介电常数、光学各向异性等也会同时发生突跃性变化，这些性质 的变化往往都具有可逆性。具有上述性质的水凝胶统称为环境敏感性水凝胶 ( e n v i r o n m e n t a ls e n s i t i v eh y d r o g e l ) 8 1o 环境感应性凝胶多数为含o h 、c o o h 、 一c o n h 2 、s 0 3 h 的亲水性凝胶，如聚羧酸类、聚乙烯醇、聚酰胺类等 9 , 1 0 1 。此类 凝胶对环境的响应过程中其溶胀行为显著变化的特点引起研究者们的广泛重视， 使之应用于工业上进行分离、污染物的除去、反应速率和温度的控制等过程以及 生物医药和生物技术等诸多领域。这类智能性凝胶是近年来在生物、制药等领域 中与分子印迹技术和固定化酶并列的新型功能高分子】。 图1 1 温敏性水凝胶相转变过程示意图 f i g 1 1s c h e m a t i ci l l u s t r a t i o no f v o l u m ep h a s et r a n s i t i o no f t e m p e r a t u r e - s e n s i t i v em i e r o g e l 郑媸天学颈士学键论文第一赣 1 1n i p a m 类水凝胶 1 1 1p n i p a m 温敏水凝胶 迄今为止研究的最为普遍的环境敏感性水凝胶为n 一异丙基丙烯酰胺 ( n - i s o p r o p y l a c r y l a m i d e ，n i p a m ) 的交联均聚物p n i p a m ( p o l y ( n - i s o p r o p y l a c r y l a m i d e ) ) ，或其同系物( 见图1 2 ) 合成的聚合物【1 2 】。对p n i p a m 的研究始于19 5 6 年。s c a r p a 笔； 1 3 】人于l9 6 7 年首次观察到了线型的p n i p a m 水溶液 具有低相转变温度的热敏现象，1 9 7 8 年t a n a k 等【5 】则发现了p n i p a m 水凝胶有热敏 性。此后对p n i p a m 的研究无论是从理论还是应用方面都引起了人们的极大兴 趣，9 0 年代以来这方面的研究越来越多。 乞 阐 图1 2 温敏性凝胶的合成单体 f i g 1 2m o n o m e r se m p l o y e di nt e m p e r a t u r e - s e n s i t i v eh y d r o g e is y n t h e s i s p n i p a m 是一种温敏性凝胶，它的l c s t 在3 2 。c 附近，一般研究者认为 p n i p a m 的温敏性与其分子内一定比例的亲水基团c o n h 和疏水基团 - c h ( c h 3 ) 2 ，以及它们的分子内、分子间的相互作用有关。环境温度在l c s t 以下， p n i p a m 凝胶大分子与水之间由于氢键及范德华力作用，大分子链周围的水分子 姗 弋 郑州大学硕士学位论文 第一章 会形成有序化程度较高的溶剂化壳层，使高分子表现为一种伸展的线团结构，聚 合物吸水，表现为体积膨胀；随着温度上升至l c s t ，聚合物分子链与水相互作 用发生变化，部分氢键被破坏，链柔顺性提高，疏水性增强，聚合物链处于收缩 构象，表现为体积收缩，从而产生温敏性。 对于聚丙烯酰胺系列的温敏水凝胶，其溶胀一收缩行为主要受酰胺基团的亲 水一疏水性能的影晌。此类酰胺单体中，酰胺基团n 原子上烷基取代基的体积越 大，取代基的数目越多，所得聚合物凝胶的相转变温度l c s t 越低。此外在对 p n i p a m 凝胶的进一步研究发现，合成方法、合成条件等也会影n n n i p a m 水凝胶 的性质 14 】。g e h r k e 等发现水凝胶的溶胀平衡程度、剪切模量、有效交联密度及透 明度等性能均受到合成条件如引发剂和浓度、温度、聚合时间等的影响【”】：翟 茂林等采用辐射技术合成了p n i p a m 水凝胶，发现通过控制辐射剂量、辐射剂量 率、单体浓度等因素可合成所需交联密度的水凝胶，并发现辐射剂量与合成凝胶 的扩散系数直接相关【1 6 l 。 1 1 2 改性p n i p a m 水凝胶 通过掩n i p a m 与其它单体共聚或将p n i p a m 攘棱到其它基艇上，可以激变据 转交湿艘和机械力学性麓，甚至与其它功能性单体共聚，可以铡戒具有箕它特殊 敏感性能的材料，比如p h 、光、聪力等敏感性材料。为了进一步拓展p n l p a m 的 应用镁城，对p n i p a m 懿改性磅究壹是东凝羧礤究的热点之一。强前磷究较多 的改整p n i p a m 凝胶可大致分为两类：( 1 ) 通过调节聚合物静架中的亲水或疏水 组分去调节聚合物凝胶的l c s t ，得到特定相变温度的水凝胶；( 2 ) 将n i p a m 与 功能单侮共聚锝戮疑蠢其它敏感馕的水凝胶。 第一类改性p n i p a m 水凝狡班“共聚物为主，n i p a m 与萁宅单体共聚爨褥水凝 胶的性质会随共聚单体的种类和酉己比的不同而变化。 t a k e i 等l 1 分别搬n i p a m 与蘸承性毂甲基嚣爝酸丁酯( b m a ) 农亲水性的n ，n 二甲基丙烯酰胺( d l v l a a m ) 共聚，发现当增) j i i b m a 或降低d m a a m 的比例时，聚 合物的l c s t 会降低。y u 等【i8 】合成了含少量阴离子丙烯酸钠( s a ) 或阳离子氯化甲 基嚣爝虢蔼基三甲基胺( m a p t a c ) 共聚单体或嚣者混合物斡n i p a m 共聚农凝胶， 同样发现改性后豹水凝胶的l c s t 德与共聚单髂的类型和台鬃有关，并且发现即 郑髑大学顿学斑论支第一章 使仅加入0 5 m 0 1 的共聚单体，得到的水凝胶在溶胀状态下的溶胀比明显高于均 聚水凝胶，而在高温下收缁后的共聚水凝胶又远低予收缩后的均聚水凝胶的溶胀 院。张先歪等 潮在较衰瀑震下( 4 s ) 翱蕊快速暹敏聚8 心异秀墓嚣簿簸胺c o 霹辩 酰胺) 水凝胶，并比较不同亲水单体( 丙烯酰胺) 含爨的聚合物凝股l c s t 的变化 情况。结果发现，这种水凝胶在室温的平衡溶胀率较大，随着丙烯酰胺含量的增 鸯簦，瘩凝黢瓣l c s t 隧之逐澎增燕。褰费藤等 2 0 l 含成褥强n i p a m - 奄n 羟泽基嚣烯 蹴胺( n h m p a ) 的共聚物水凝胶，研究发现n h m p a 的加入不仅不改变p n i p a m 的温敏性，而且可有效调节其l c s t 值。 第二类p n i p a m 改性水凝胶的研究主要集中在向p h 敏感性拓展研究方面 2 l 2 2 。当聚合物组分中含有易水解或离子化的酸碱基团( 如羧基或氨基) 时，得 到的聚合物水凝胶具有p h 敏感性。1 9 7 8 年t a n a k a ；测定陈化后聚丙烯酰胺在不同 p h 值下溶胀比的实验，此后学术界才真正开始了对p h 敏感性凝胶的研究【5 j 。 最为典型的p h 敏感改i 生p n i p a m 凝胶是n i p a m 和n 烯酸( a a c ) 的无规共 聚物形成的p ( n i p a m c o a a c ) 水凝胶。它在酸性( p h l o ) 条件下，羧基以未离 解的酸的形式存在，在凝胶内高分子链中形成氢键，使整个高分子链相互缠绕凝 胶收缩，所以在2 5 4 5 c ，随着凝胶中羧基含量的增加，凝胶的溶胀百分比降低： 而在弱碱性( p h 7 4 ) 时，羧基以阴离子形式存在，相互之间存在静电排斥作用， 高分子链也过分伸展与水充分接触，接近自由高分子链的伸展状态，即使当溶液 温度高于p n i p a m 的l c s t ( 3 2 。c ) 时，这种静电作用也大于凝胶p n i p a m 骨架的消 溶胀作用，因此凝胶仍呈溶胀状态2 3 i 。 研究表明，p ( n i p a m c o a a c ) 无规共聚物的组成影响水凝胶的性能。b o k i a s a 等【2 4 j 发现p ( n i p a m c o a a c ) 共聚物凝胶的流变形为、l c s t 、疏水亲水性都强 烈依赖于n i p a m 的含量。p h 3 时，随着n i p a m 含量的增加，p ( n i p a m c o a a c ) 的亲水性降低，而疏水性增强。k a r l 等较为全面的考察了电荷密度对p ( n i p a m c o a a c ) 微凝胶体积相转变的影响。他们认为p ( n i p a m c o a a c ) 微 凝胶的溶胀行为是由微凝胶粒子中n i p a m 的疏水作用及a a c 中羧基的静电排斥 二者的竞争平衡所决定。并且发现这种微凝胶随聚合物中a a c 含量的增加，出现 了不同于常规温敏凝胶的两阶段体积相转变，该现象是由于聚合物链中的氢键作 用所致。 6 郑州大学硕士学位论文 第一章 具有p h 敏感性的改性p n i p a m 水凝胶可通过多种方式制备得到。如b e l t r a n 等【2 6 1 把n 1 p a m 与可形成负离子的丙烯酸钠( s a ) 共聚交联制备出的p ( n i p a m c o s a ) 水凝胶随着溶液p h 值的增加，体积相转变温度升高，相转变 的温度区间也更宽。刘郁杨等【2 7 1 用顺丁烯二酸酐对1 3 ，环糊精进行改性，用改性 物做反应单体与n i p a m 在水相中通过氧化还原自由基引发聚合，合成具有p h 及温度敏感性共聚水凝胶。h o f f m a n 等f 2 8 1 将n i p a m 接枝到a a c 上合成了具有温 度和p h 值双重敏感特性的水凝胶。该水凝胶的侧链对温度敏感，而主链部分则 对p h 值敏感。他们还发现n i p a m 和a a c 的接枝共聚物与相应的无规共聚物对 温度和p h 值的敏感性能明显不同，接枝共聚物在p h 4 0 和p h 7 4 时的l c s t 与 其中a a c 的含量无关，而无规共聚物的l c s t 则随共聚物中a a c 含量的增加而 迅速升高。p a a c p n i p a m 互穿聚合物网络水凝胶也具有温度及p h 敏感性，它 在弱碱性条件下的溶胀率远大于酸性条件下的溶胀率。在酸性条件7 ：( p i l l 4 ， i = 0 1 ) ，随着温度的提高，凝胶的溶胀率也随之上升，属于“热胀型”水凝胶： 而在弱碱性条件下( p h 7 4 ，i = 0 1 ) ，当温度在p n i p a m 的l c s t ( 3 2 ) 以下时， 其溶胀率随温度的上升而上升，当温度达到l c s t 时，其溶胀率突然下降，并随 着温度的上升而下降t 2 2 1 。 上述研究表明，合成方法、水凝胶组成及结构等因素对凝胶性能都有很大影 响。由于温度和p h 值是生理、生物和化学系统中的两个重要因素，所以温度及 p h 双重敏感水凝胶作为一种新型的高分子材料正日益受到关注，且对生物大分 子与水凝胶相互作用机制的研究亦日趋重要【2 9 】。 1 2 生物大分子在水凝胶上的负载 1 9 9 2 ；g ，k a w a g u c h i 等1 3 0 】首次报道了生物大分子和p n i p a m 水凝胶之间的相 互作用，从而将水凝胶的研究进一步与生物化学、医学等领域交叉起来，翻开了 该研究领域新的一页。 1 2 1 生物大分子在水凝胶上的负载方式 1 2 1 1 包埋法 郑州大学硕士学位论文 第一章 包埋法 3 1 】是将生物分子包埋在水凝胶的格子里，通过外界条件的变化，使 这些生物分子向周围环境泄露扩散( 如图1 3 所示) 。包埋法可用于聚合水凝胶和 接枝水凝胶对生物分子的固定化。与其他方法比较，包埋法的优点在于过程简单， 许多生物分子可用此法进行固定化。尽管微环境有可能会对固定化分子的生物活 性有所影响，但一般来说，包埋法不引起所固定化分子结构的变化，通常用这个 方法固定的生物分于仍能保持很高的活性。 l 岭_ 甜 酗硼i 刚 圜昙雾 圜 o 图1 3 包埋法负载生物大分子 f 蟾1 3b i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l ee m b e d d e di nt h en e t w o r ko fh y d r o g e l 当变联聚合永凝胶的聚合反藏发生在舍有生物分子的承溶液中时，生物分子 可以被包埋。聚合反j 搬既可以用化学法也可以用辐射法引发。辐射法可使聚合反 应在较低温度下进行，因此包埋的生物分子能保持较高的活力。对于这类水凝胶 其交联度要控鞠适警，虽然交联魔离可瑷把生物分子紧密毽趣，但却隈制了底物 和产物的扩散。此外单体的种类对被固定生物分子的活性也柯影响，因为不同的 功能豳产生不同的微环境，这会g l 超被固定化黥生物分子或酶鹁活力的升嵩或降 低。 1 2 1 2 共价键会法 共徐键合法将生物大分子固定在凝胶表露上( 如图1 4 ) 。 圈1 4 拭价键合法负载生物酶 f i g 。1 。4e n z y m eb o n d e do nt h es u r f a c eo fh y d r o g e l 有三种方法可用于将生物分子通过共价键键合到水凝胶中去。第一种方法怒将水 8 一圜一 郑州大学硕士学位论文 第一章 凝胶表面预活化，然后再与生物分子上的功能基团反应以达到固定化的目的；第 二种方法是利用偶联试剂将生物分子和水凝胶连接起来；第三种方法则是预活化 将被固定化的生物分子，然后再固定到水凝胶上去。 与其他固定化方法比较，共价键合法有许多优点。如在测定酶的活力以及改 变介质组成时都不必担心发生酶的脱落。当共价键在生物分子的非活性部位键合 时，被固定的分子仍能保持较高的活力。这种方法的缺点则是固定化过程是不可 逆的。此外，在固定化过程中也会引起生物分子的失活 1 2 , 3 1 】。 1 2 1 3 吸附法 吸附法是通过分子间作用力使生物大分子从溶液中转移到凝胶粒子表面的 过程( 如图1 ，5 所示) 。 图1 5 吸附法负载蛋白质分子 f 培1 5p r o t e i na d s o r b e do f tt h es u r f a c eo fm i c r o g e lp o l y m e r 产生吸附效应的作用力有范德华力、静电作用以及在蛋白质及酶与基质结合时存 在的疏水力、空间位阻和静电力掣3 2 q “。一般认为凝胶吸附蛋白质类大分子是 基于三种机理：疏水作用、静电作用和氢键。 k a w a g u c h i 等 3 0 , 3 5 1 发现低p h 及4 0 条件下p n i p a m 凝胶对蛋白质的吸附量最 大，当将温度降至2 5 。c 时，凝胶实现对蛋白质的脱附。这可能是凝胶中异丙基与 蛋白质的疏水作用所致。张克胜等m ”1 在交联聚乙烯醇水凝胶对胆红素的吸附研 究结果表明，交联聚乙烯醇水凝胶对胆红素有一定的吸附作用，这种作用依赖于 氢键作用并通过扩散过程实现。在其后对含胍基交联聚乙烯醇水凝胶对胆红素吸 附性能的研究中发现，质子化的此凝胶吸附剂对胆红素的吸附通过强的静电和氢 键作用进行，而未经质子化的吸附剂本身不带电荷，主要通过氢键作用吸附胆红 素。e l a i s s a r i 等1 38 j 认为当环境温度高于p n i p a m 凝胶的l c s t 时，疏水作用主导 p s p n i p a m 凝胶对人血清蛋白( h b a ) 的吸附，而p h 并l l 盐浓度对p n i p a m p s 凝 胶对h a s q x ) 附量的影响结果表明，凝胶和蛋白质问的静电作用在吸附过程中起很 郑州大学硕士学位论文 第一章 大作用。t a n i g u c h i t ”1 将抗体负载在阳离子型氨基功能化的核壳p n i p a m p s 凝胶 粒子上，进一步比较了疏水与静电作用在吸附过程中的主导地位。他认为，较高 温度下p n i p a m p s 凝胶对抗体的高吸附量是由于p n i p a m 的疏水链与抗体之阳j 的疏水相互作用以及p n i p a m 壳层电荷密度增加而引起静电吸引作用的增强；而 吸附量受环境p h 值及盐浓度的强烈影响表明，静电作用在p n i p a m p s 凝胶对抗 体的吸附过程中其主导作用。 以上三种负载方式中，菇价键合法避免了被固定化生物分子的泄露和脱落， 而包埋法或吸附法负载生物分子的水凝胶在适当条件下可进行脱附，因此被广泛 用于药物释放研究体系中。 1 2 2n i p a m 类水凝胶负载蛋白质及其控制释放 与疏水性聚合物相比，水凝胶与所负载的生物大分子之间的相互作用力要弱 德多，阂北药物的生物活性能保持较长时间。此外，水凝胶良好的生物降解性、 低毒性及对温度、p h 等的刺激敏感性，使其广泛瘸子生物大分子控释癸药物的 载体。n i p a m 凝胶中的酰胺键使藤较其它凝胶与蛋白质有更好的相容性；而此 类凝胶鹣滠敏特性馒逛环境温度农凝胶l c s t 瞵近上势或下降时，凝胶表瓣静孑l 灏变小绒交大，遣藏承凝胶内外分子扩散途径豹“关”或“开”，这使n i p a m 水凝胶在蛋白质控制释放类药物中的应用研究a e 常广泛。例如，可将这类水凝胶 作为生物感知触头、缓释开关等皮翅子药物输送体系( d r u gd e l i v e r ys y s t e m ，d d s ) 中。蹴如包埋有胰岛素的水凝胶w 通过体内糖的升降自动蛾调节胰岛豢的释放 ( 如图1 6 ( a ) 所示) ，图1 6 ( b ) 为利用水凝胶的激发温敏性自控赫物的输送和释放。 早期瓣药甥控释怒将p n i p a m 永凝胶在低滠下放入药物溶滚中溶胀以吸辫 药物，然后在高温时收缩排斥水和释放药物。这种模式的缺点是溶胀时萄物也扩 散，收缩时释放药物又太快，不能达到所希望的缓释、长效和零级释放的鼹求。 当聚合物中弓l 入疏水鳃分之爱，p n t p a m 改性承凝胶便其鸯舞一魏释药模式：当 环境滠发升到l c s t 以上时，永凝胶表面形或个薄而致磷的皮层，阻止凝胶内 部的水和药物向外释放，此时水凝胶处于“荚”的状态；当濑度低于l c s t 时， 皮层溶麟滇失，拳凝获处于“开”豹状态，内部瓣药携殴自嬲扩数斡方式趣终侠 速释放，此即药物控释的“开一关”模式。h o f f m a n 等人台成了p n i p a m 殿其与 1 0 郑州丈学硕士学缎论文第一蟹 甲基丙烯酸酯( m a a c ) 的共聚物凝胶p f n i p a m - c o m a a c ) ，利用此模式研究了 v b l 2 和肌红鬣自的控释，结果表明，这种模式较好地满足了药物控释的要求n ：莉n c o s e ( a ) ( b ) 图1 6 以环境敏感性凝胶为载体的自控药物的输送和释放，( a ) ：葡萄糖敏感性凝胶控制 释放胰岛素；( b ) ：温敏性凝胶对药物的控制释放 f i g 1 6 e n v i r o n m e n t a ls e n s i t i v eh y d r o g e la sac a r r i e r o f s e l f - c o n t r o l l e dr e l e a s e o f d r u g s ( a ) ：c o n t r o l l e dr e l e a s eo f i n s u l i nb yg l u c o s e - s e n s i t i v eh y d r o g e l ，( b ) ：c o n t r o l l e dr e l e a s eo f d r u gb yt e m p e r a t u r e - s e n s i t i v eh y d r o g e l 若采用p h 敏感改性p n i p a m 水凝胶材料负载蛋白质，凝胶在酸性环境中由于 氢键的作用使水凝胶处于收缩状态，保护所负载的蛋白质不渗出而降解；在碱性 条件下，水凝胶可完全溶解或通过溶胀作用使蛋白质释放。刘锋等1 4 0 1 9 木瓜酶 为模型蛋白质，将其吸附在p ( n i p a m c o a a c ) 凝胶上，在不同条件下比较了 木瓜酶的生物活性。结果发现，当凝胶中羧基含量较高时，酶的保留活力较高。 在3 7 。c 年n p h 7 4 条件下，在一个较短的时间内吸附在凝胶中的大部分木瓜酶可以