（食品科学专业论文）白花败酱（Patrinia+villosa+Juss）多糖的研究.pdf

西南大学2 0 0 7 屑硕十学位论文摘要 白花败酱( p a t r i n i av i l l o s aj u s s ) 多糖的研究 食品科学专业硕士研究生程俊文 指导教师阚建全教授 朱加进副教授 摘要 白花败酱( p a t r m 缸v i l l o s a l u s s ) 属败酱科多年生草本植物，营养丰富，具有很高的食用和药 用价值。本文以白花败酱为原料，利用多糖分离纯化技术、仪器分析技术对白花败酱多糖的 提取、分离纯化、纯度鉴定、理化性质、抗氧化活性等方面进行了较为系统的研究，得到如 下结论： ( 1 ) 通过单因素实验及正交实验对白花败酱水溶性多糖提取工艺条件进行优化，发现浸提 温度对白花败酱中水溶性多糖得率有显著性影响白花败酱水溶性多糖热水提取的最佳工艺 参数为料液比1 ：3 0 。温度1 0 0 ，浸提时间6 h 在此工艺条件下水溶性粗多糖得率为1 4 0 3 。 ( 2 ) 采用碱液提取白花败酱水溶性多糖提取后残渣中的碱溶性多糖，通过单因素实验及正 交实验对其提取工艺条件进行优化，发现碱浓度对白花败酱碱溶性粗多糖得率有极显著性影 响。白花败酱碱溶性多糖的最佳提取条件为n a o h 浓度0 g m o l l ，提取时间铀，料液比1 ：3 5 。 在此工艺条件下碱溶性多糖的得率为8 5 3 ( 3 ) 白花败酱水溶性多糖经热水浸提，s e v a g 法脱蛋白，透析，乙醇沉淀，d e a e - - 纤维 素及s e p h a d e xg - 1 0 0 分离纯化，得到两种多糖p v i s - i h f r 和p v p s i 脚i 。经高效液相色 谱仪分析证明p v p s i h - f r 和p v p s i l f f 为纯品。其得率分别为0 2 2 7 和0 6 3 4 ( 干重) 经定性化学反应鉴定表明p v p s i - h - f r 、p v p s 1 山f r 不含蛋白质、核酸。为非淀粉类纯粹多 糖，其重均分子量分别为1 5 3 4 6 1 7 和2 6 0 8 5 6 p v p s i l f r 完全酸水解后经气相色谱分析确 定其至少由i 广鼠李塘、【广阿拉伯糖、d 甘露糖、d 葡萄糖、d 半乳糖五种单糖组成。 ( 4 ) 对多糖p v p s i 拼r 的体外抗氧化能力进行了初探分别采用f r a p 法测定其总抗 氧化能力，普鲁士兰法测定其还原能力，并测定其对a b t s 4 自由基和羟基自由基的清除效果 结果显示p v p s i 山f r 的总抗氧化活性相当于v c 总抗氧化活性的4 7 4 ；随着p v l 略i i ，f f 浓度的增大，其还原能力也依次增强；浓度为0 3 7 5 m g m l 的p v p s i 山f f 对a b t s + 咱由基 的清除能力相当于1 1 7 3 m g k g 的t r o l o x ；当p v p s i l - f r 溶液浓度为6m g m l 时，其对羟基 西南大学2 0 0 7 届硕士学位论文摘要 自由基的清除率为5 9 7 7 ，表明f v p s i - l - f r 具有一定的清除自由基能力。 本实验对白花败酱多糖的分析研究能够为该多糖的进一步开发利用提供一定的理论依 据，为白花败酱保健食品和药物的开发提供了良好基础。 关键词：白花败酱多糖分离纯化理化性质 西南大学2 0 0 7 届硕士学位论文a b s t r a c t s t u d i e so np o l y s a c c h a r i d e sf r o mp a t r i n i av i l l o s aj u s s f o o ds c i e n c em a s t e r ：j u n w e nc h e n g a d v i s o r s ：p r o lj i a n q u a nk a n a 。p r o f j i a j i nz h u a b s t r a c t p a t r i n i av i l l o s aj u s sw h i c hr a n k si nt h eg e n u so fp a t r i n i a ，h a sa b u n d a n tn u t r i t i o na n dg r e a t e d i b l ea n do f f i c i n a lv a l u e o nt h eb a s e so fr e s e a r c hp a p e r si n v e s t i g a t i o n , t h ea d v a n c e si ni s o l a t i o n ， p u r i f i c a t i o n ，b i o a c t i v ef u n c t i o n , s t r u c t u r ed e t e r m i n a t i o n ，a n dt h ep o l y s a c c h a r i d er e s e a r c hs i t u a t i o n a n dp m s p e c tj no u rc o u n t r yw e r er e v i e w e d t h ea u t h o rc o n d u c t e das e r i e so fs t u d yo np a t r i n i av i l l o s a p o l y s a c c h a r i d e s ，w h i c hw e r ei s o l a t e da n dp u r i f i e df r o mp a t r i n i aw m o s a , a n dt h e i rp h s i c o - c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c sa n dc h e m i c a i s t m c t m ew c d e t e r m i n e dw i t hp o l y s a c c h a r i d e si s o l a t i o na n d p u r i f i c a t i o nt e c h n i q u e ，i n s t n n n e n ta n a l y s i st e c h n i q u ei nt h i sp a p e r , a n dt h e i ra n t i o x i d a t i u na c t i v i t y w e r ei n v e s t i g a t e dw i t hm e d i c a la n a l y s i st e c h n i q u e t h ef o l l o w i n gr e s u l t sw f l ea c h i e v e d ( 1 ) s e v e r a lf a c t o r st h a ta f f e c t i n gt h ee x t r a c t i o np r o c e s sw c 埠s t u d i e dt h r o u g hs i n g l ef a c t o ra n d o r t h o g o n a le x p e r i m e n t s i th a df o u n dt h a tt e m p e r a t u r ew a sas i g n i f i c a n tf a c t o ri n f l u e n c i n gt h e e x t r a c t i o nr a t eo ft h ew a t e r - s o l u b l ep o l y s a c c h a r i d e s t h eo p t i m a le x t r a c t i n gc o n d i t i o n so fw a t e r s o l u b l ep o l y s a c c h a r i d e sf r o mp a t r i n a v t u o s aw e i e f o l l o w s ：t h ea d d i n gr a t i oo f w a t e rw a s1 ：3 0 t h e t e m p e r a t u r eo fe x t r a c t i o nw a s1 0 0 ，t h et i m eo fe x t r a c t i o nw a s6h o u r s i nt h i sc o n d i t i o n ，t h e e x t r a c t m gr a t i oo f w a t e rs o l u b l ep o l y s a c c h a r i d e sf r o mp a l r i n i a v i l l o s aw a s1 4 0 3 ( 2 ) t h er e s i d u eo f w a t e rs o l u b l ep o l y s a c c h a r i d e sf r o mp a t r i n i a v i l l o s aw a se x t r a c t e db ya l k a l i s e v e r a lf a c t o r st h a t a f f e c t i n gt h ee x t r a c t i o np r o c e s sw e r es m d i e dt h r o u g hs i n g l ef a v o ra n d o f t h o g o u s le x p e r i m e n t s i th a df o u n dt h a tt h ec o n c e n t t a t i n no fn a o hw u sav e r ys i g n i f i c a n tf a c t o r i n f l u e n c i n gt h ee x t r a c t i o n r a t eo ft h ea l k a l i - s o l u b l e p o l y s a c c h a r l d e s t h ao p t i m a le x t r a c t i n g c o n d i t i o n so fa l k a l i - s o l u b l ep o l y s a c c h a r i d e sf r o mp a t r i n l a v i l l o s aw e r ea sf o l l o w s ：t h ea d d i n gr a t i oo f a l k a l iw u1 ：3 5 ，t h ec o n c e n t r a t i o no fn a o hw u s0 9 m o 【lt h et i m eo fe x t r a c t i o nw a s5h o u r ht h i s c o n d i t i o n ，t h ee x t r a c t i n g r a t i o o f a l k a l i - s o l u b l e p o l y s a c c h a r i d e s f r o m p a t r i n i a v i l l o s a w a s8 5 3 。 ( 3 ) t w op o l y s a c c h a r i d e sn a m e dp v p s - i - h - f ra n dp v p s i l f fw c i s o l a t e df r o mp a t r i n i a v i l l o s aw i t hw a t e re x t r a c t i o n a l c o h o ls e d i m e n t s e v a gd c p r o t e i n ，d e a e - 5 2c o l u m na n ds e p h a d e x g - 1 0 0c o l u m n t h e k p u r i t y w a s i d e n t i f i e d b y h p l c w i t h ar a t e o f o 2 2 7 a n d0 6 3 4 ( d r y w e i g h t ) t h e i ra v e r a g em o l e c u l a rw e i g h ta 1 5 3 4 6 1 7a n d2 6 0 8 5 6r e s p e c t i v e l y p v p s i 山f ri sc o m p o s e d h i 西南大学2 0 0 7 届硕+ 学位论文a b s t r a c t o ff i v ek i n d so fm o n o s a c c h a r i d e sa tl e a s t , w h i c hc o n t a i n sl - r h a n m o s e ，l - a r a b i n o s e ，d - m a n n o s e ， d o n c o a n dd g a l a c t o ( 4 ) t h e nv t r oa n t i o x i d a n tc a p a c i t yo fp v p s i l - f rw a ss t u d i e db y m ea s s a ym e t h o d s ， i n c l u d i n gt h ef e r r i cr e d u c i n ga h i l i t y ( f r a p ) ，r e d u c i n gp o w e l , s c a v e n g i n ga b t s + 。a n dh y d r o x y l r a d i c a l o 田r e s u l t ss h o w e dt h a tt h et o t a la n f i o x i d a n ta c t i v i t yo fp v p s - i l - f rw a se q u a lt o 4 7 4 t h a to fv c ；r e d u c i n gp o w e ro fp v p s i - l - f ri n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s e dc o n c e n t r a t i o no f p v p s i l - f t t h ea b t s + s c a v e n g i n ga c t i v i t yo f0 3 7 5m g m lp v p s i - l f fw a se q u a l e dt ot h a t o f1 1 7 3m g k gt r o l o x t h es c a v e n g i n ga c t i v i t yo f o ho fp v p s i - l - f ra tt h ec o n c e n t r a t i o no f6 m g m l w a s5 9 7 7 。w h i c hi n d i c a t e dt h a tp v p s - i l - f rh a da ne f f e c to fs c a v e n g i n ge f f e c to n - o h t h ea n a l y s i sa b o u tp o l y s a c c h a r i d e sf r o mp a t r i n i av i l l o s aj u s s c o u l dp r o v i d eat h e o r e t i c a l f o u n d a t i o nf o rf u l l h c i d e v e l o p m e n ta n du t i l i z a t i o n k e y w o r d s ：p a t r i n i a1 , i u o s a 1 u s sp o l y s a c e h a r i d e s i s o l a t i o n p u r i f i c a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特j l i i j ) j l 以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者：穆後叉 签字日期： 唧年6 月6 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：白尔保密， 口保密期限至年月止) 学位论文作者签名：程彼炙 筝烹日期：硼年6 月6 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 戮：雾茏扩日签字日期：勿矽夕年占月汐日 邮编： 西南大学2 0 0 7 届硕十学位论文 第1 章 文献综述 第1 章文献综述 随着疾病谱的变化和健康观念的改变，在提倡回归自然的大潮中，世界各国人民对中医 药倍加关注，对优质中药材的需求日益扩大。我国具有丰富的动植物资源，中草药已有几千 年的历史，是我国历代医家和人民群众防病的主要武器。运用现代科学技术对天然产物的活 性成分进行研究，包括分离、纯化、结构测定、结构与功能的研究是促进人类健康的必然要 求，是新世纪天然产物特别是天然药物研究与开发的趋势。具有生物活性多糖的研究是其重 要组成部分。 本章综述了白花败酱的研究现状、国内外多糖研究进展并简要介绍了本课题的研究意义 和研究内容 1 1 白花败酱的研究现状 1 1 1 白花败酱的食用价值 白花败酱( p a t r i n i av i l l o s aj u s s ) ，又俗称苦菜，苦斋、鹿肠等，为败酱科败酱属多年生草 本植物，广泛分布于全国各地，主产于四川、湖南、江西、福建、浙江等省，常生长在山坡、 路旁、林缘草地等处。在空气潮湿、土质肥沃疏松的环境下，生长尤佳在浙江省永嘉县， 白花败酱已实现大规模人工栽培。 白花败酱营养价值很高，据分析：每1 0 0 9 鲜嫩茎叶中含v c 4 3 9 0 m g 、9 胡萝h 素5 1 8 4 m g 、维生素b 2 0 5 5 0 8 5 m g ，其中v c 的含量远高于一般的蔬菜和水果每1 0 0 9 - 干品含有1 7 种氨基酸，总量达1 4 9 9 6 9 。含还原糖8 o g ，总糖1 3 1 9 、粗纤维1 0 3 9 、灰分2 4 5 9 所含氨基酸 中，人体必需氨基酸占氨基酸总量的3 9 1 ，其中赖氨酸、苏氨酸分别含6 9 0 7 m g 和3 9 5 2 m g ， 此外作为脑组织代谢中的首要氨基酸“谷氨酸”的含量高j 盘2 6 6 3 9 ”。 白花败酱可鲜品食用或制成千品鲜品食用方法：( 1 ) 鲜炒：把刚采摘回来的新鲜幼嫩白 花败酱洗净后直接炒食，此菜味较苦，但清热解毒效果较佳；或将白花败酱用水焯并放在冷 水中浸泡半天至一天去苦味后。捞出切细，加点细肉或蛋炒食，味美色绿，十分可口( 2 ) 煮 汤：将白花败酱鲜品加入己煮七成熟的排骨汤或猪大肠汤中一同煮熟，即可食用，此菜汤色 淡绿，有一种特殊的酱香味，苦中带甜、味道鲜美深受欢迎。干品的加工方法：可直接把 白花败酱鲜品晒干贮藏，也可将鲜品用水焯后捞出摊开，晒干后收藏。食用时一般用于煮汤 1 1 2 白花败酱的药用价值及保健功能 白花败酱入药始载于神农本草经，以后，历代本草均将其收入其根茎、根及全草 均可入药，性味苦、辛、凉，具清热利湿、解毒排脓、活血化瘀、清心安神等功效，常用于 治疗阑尾炎、痢疾、肝炎、扁桃体炎、痈肿疮毒等症。现代医学研究证明：白花败酱的根茎 和根含多种三萜类皂甙( 败酱甙等) 和环烯醚萜及含有以败酱烯和异败酱烯为主成分的挥发油； 此外，还含有内酯、香豆素、黄酮类及微量的生物碱；具有镇静、镇痛、抗菌、抗病毒、抗 l 西南大学2 0 0 7 届硕士学位论文第1 章文献综述 肿瘤、保肝利胆、止血和增强免疫力等多方面的药理作用。有报道说：白花败酱具有促进肝 细胞再生、改善肝功能、增强抑菌和抑病毒等作用，主要表现在其果枝浸膏有促进肝细胞再 生及抑制肝细胞变性作用，而作为败酱甙甙元的的齐墩果酸被认为是坑肝炎的强活性成分。 这些都为将白花败酱用于治疗急性黄胆型肝炎提供了科学依据。陈燕萍 2 1 ( 2 0 0 5 ) 研究了白花 败酱草水提取液对小鼠中枢神经系统的抑制作用，结果表明白花败酱革水提取液对小鼠自发 活动有明显的抑制作用。朱加进等p 】研究发现：不但白花败酱茎叶有很强的抗便秘作用，而且 白花败酱浸出物也有较强的抗便秘作用。此外，白花败酱对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、 伤寒杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌、链球菌和变形杆菌等亦有抑制作用【1 1 1 1 3 白花败酱的组成成分研究 关于白花败酱的化学成分，日本学者曾从日本产的植物中得到三个环烯醚萜类化合物： 番木别甙o o g a n i n ，i ) ，莫诺甙( m o r r o n i s i d e , i i ) 和白花败酱甙( 、，i l l o s i d c ，) 1 4 l 。徐成俊等【4 1 ( 1 9 8 4 ) 从江西产的白花败酱中分得肌醇，1 9 8 5 年又从白花败酱的稀醇提取物中分离得到四种成分： 棕榈酸、齐墩果酸、白花败酱醇( v i l l o s o l ，i v ) 和白花败酱醇甙( v i l l o s o l s i d e ，v ) ，并证明后两者的 立体结构。白花败酱醇为白花败酱醇甙的甙元网 1 1 3 1 皂苷类 徐洁昕等【6 l 采用乙醇浓度9 5 、溶剂用量3 2 倍( 2 0 倍、1 2 倍) 、提取时间7 h ( 4 h 、3h ) 提取两次，得到白花败酱中总皂苷( 以齐墩果酸计) 含量为0 6 0 8 1 1 3 2 黄酮类 徐洁昕等t n ( 2 0 0 4 ) ：采用四种方法( 水提法、有机溶剂提取法、索式抽提法、超声波法) ，分 别提取白花败酱不同部位( 根、茎、叶、全草) 的总黄酮，以紫外分光光度法测定其含量，确定 最佳提取方法为索式有机溶剂提取法，白花败酱不同部位的总黄酮含量变化规律为；叶 全草 根 茎。索式提取法得到的叶中总黄酮含量高达5 7 4 m g g ，全草中为4 3 3 m g g ，证明了白花败 酱中含有较多的黄酮化合物，为白花败酱具有较多的药理作用提供了科学依据 i n a d a , a k i r a 等q 1 9 9 3 ) a 白花败酱种子( 包括少量果皮) 中分离到一种黄酮醇甙 ( f l a v o v i l l o s i d e ) ，其结构为3 旬矗山毗哺鼠李基- ( 1 3 ) - a l - h l t 喃鼠李基- ( 1 6 ) - e - d 毗喃半乳 糖基槲皮素此外，还分离出5 种已知化合物：山奈酚3 旬- b 鼠李三糖甙、3 岳羟基- 1 2 - 烯- 2 8 - 油酸2 3 硫酸钠盐、3 8 羟基1 2 - 烯- 2 8 油酸、硫化败酱甙i 和硫化败酱甙 j i n y o n g p c n g 【”( 2 5 ) 报道了采用高速逆流色谱从白花败酱中分离得到了两种黄酮碳甙：异 牡荆甙( i s o v i t e x i n ) o 异荭草i 式( i s e o r i e n t i n ) 。 1 1 3 3 挥发性成分 朱加进等【l 川采用固相微萃取一气质联用方法鉴定了白花败酱挥发性成分中的4 1 种化合 物主要包括戊酸乙酯，顺- 3 己烯基异戊酸，苯乙烯，3 甲基丁酸乙酯等 2 西南大学2 0 0 7 届硕士学位论文第1 章文献综述 1 2 多糖研究的概述 近年来，随着免疫物质、生物膜以及多种生物活性物质的研究进展表明，糖类在生物体内 的功能不限于提供能量和参与结构，同时还具有多种多样的生物学功能，在生命活动中参与了 细胞的各种活动，因此，各国学者从各种生物材料中寻找与提取具有一定生理活性的多糖成分 的研究十分活跃，从而使多糖类的研究有了空前迅速发展的趋势。随着对多糖活性的深入了解， 以及人们对各种天然药品、天然食品的推崇。多糖以其无毒、无副作用，被当今世界所重视。 目前对活性多糖的研究对象包括植物类、动物类、真菌类、细菌、地衣、藻类，花粉等， 研究方法涉及各种化学方法及仪器分析方法，研究范围涉及多糖的分离纯化，结构分析、理 化性质，免疫学、药效学、毒理学及治疗应用等方面。 1 2 1 活性多糖的来源和分布 多糖广泛存在于动物细胞膜、植物和微生物细胞壁中，是一类天然高分子化合物，它是 醛糖或酮糖通过苷键连接在一起的多聚物，是构成生命的四大基本物质之一根据来源，可 以将多糖分为五类：1 ) 植物多糖：如南瓜多糖、构祀多糖等；2 ) 藻类多糖：如螺旋藻多糖、海带多糖 等；3 ) 真菌类多糖：如香菇多糖、灰树花多糖等；4 ) 动物类多糖：如肝磷脂、硫酸软骨素b 等；5 ) 细 菌类多糖：如肺炎球菌荚膜多糖、流感杆菌荚膜多糖等( 赵振峰，2 0 0 2 ) 。以上五类多糖研究最 早的是细菌中的荚膜多糖，在医药上主要用于疫苗尔后，真菌多糖的研究开始广泛与深入， 尤以香菇多糖研究的最为透彻。近年来的研究表明，从天然产物中分离出的3 0 0 多种多糖类 化合物中，植物多糖，尤其是中药中提取的水溶性多糖最为重要( 肖崇厚，1 9 8 7 ) 。目前正在开 发的植物多糖有人参多糖、构祀多糖、魔芋多糖、天冬多糖、板兰根多糖、女贞子多糖、茶 叶多塘、紫菜多糖等数十余种。植物多糖越来越受到人们的青睐，开发前景十分广阔。 1 2 2 多糖的提取 首先要根据多糖的存在形式及提取部位不同，决定在提取之前是否作预处理对植物根、 茎、叶、花、果及种子中多糖，含脂高的应先脱脂，含色素的需进行脱色处理；脱脂后的残 渣或不需要脱脂的原料常用水作溶剂来提取多糖，此外也可用碱性水液，氯化钠水液、1 醋 酸、l 苯酚作提取溶剂，或用水、3 的碱溶液、1 0 的碱溶液依次提取1 1 ”，还有使用双酶浸 提、复合酶浸提法等，所得的多糖提取液有的可直接过滤或者用离心法除去不溶物。多塘的 提纯常用的是“水溶醇沉法”，用乙醇沉淀是一种从溶液中定量回收多糖的简单方法，由于 不同性质或不同分子量的多糖，沉淀所需的乙醇浓度不同，因此可以用于样品中不同多糖组 分的分级分离。一般提取应避免在强酸、碱溶液中进行，否则极易造成多塘中糖苷键断裂及 构象变化。 1 2 3 多糖的分离 多糖分离常用的方法是溶剂抽提和乙醇沉淀。不同的多糖提取所用溶剂不同，大多数多 3 西南大学2 0 0 7 届硕士学位论文 第1 章文献综述 糖可采用一定温度的水或稀碱溶液提取。要尽量避免酸性条件，因这会引起多糖中糖苷键断 裂。而有些生物材料，在分离多糖前，还需进行脱脂或脱色处理。分离沉淀后获得的多糖提 取物中，常会有无机盐、醇不溶的低分子有机物，大分子蛋白质等杂质多糖脱蛋白常用的 方法有s e v a g 法、三氯乙酸法。 而除去小分子物质常用d e a e - 纤维素层析、s e p h a d e x 凝胶过滤、季铵盐沉淀、盐析、亲 和层析、超滤和电泳等方法在获得单一多糖组分后，必须对其纯度进行鉴定。目前常用于 纯度鉴定的方法有凝胶过滤法、高压电泳法、超离心法、旋光测定法、毛细管电泳法等 1 2 3 1 除蛋白质 多糖中的游离蛋白质可用蛋白沉淀剂如三氯乙酸、鞣酸等除去少量蛋 白则用s e v a g 法除去。 1 s e v a g 法根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点，用氯仿一戊醇( 或正丁醇) 5 ：1 或4 ：1 ，混合物剧烈振摇2 0 到3 0 r a i n ，蛋白质与氯仿戊醇( 或正丁醇) 生成絮凝物而分离， 离心，分去水层和溶剂层交接处的变性蛋白质。此种方法在避免多糖降解上有较好的效果，但 效率不高，如能配合加入一些蛋白质水解酶，再用s e v a g 法，效果更佳。 2 三氟三氯乙烷法按多糖溶液：三氟三氯乙烷1 ：1 加入，在低温下搅拌1 0m i n 左右， 离心得上层水层，水层继续用上述方法处理几次，邸得无蛋白质的多糖溶液。此法效率高， 但溶剂沸点较低，易挥发，不宜大量应用“2 1 。 3 三氯乙酸法在多糖溶液中滴加3 的三氯乙酸，直至溶液不再继续混浊为止，在5 1 0 放置过夜，离心除去沉淀，即得无蛋白质的多糖溶液。此法会引起某些多糖的降解。 以上三种方法均不适合于糖肽，因糖肽也会象蛋白质那样沉淀出来。近年来也有报道用 链霉菌蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶及胰蛋白酶等处理多糖粗品，经透析后能得到基本无 蛋白质及小分子杂质的多糖。 1 2 3 2 除色素常见的脱色方法有：双氧水脱色法和活性炭脱色法，由于双氧水脱色方法是直 接氧化提取液中的色素，并未脱除。因此，氧化后的色索仍然作为杂质残留在提取液内，并 不能保证其最后品质而活性炭脱色，色素便被分离出来。从而提高了粗多糖的纯度。因而 是一种较可取的脱色方法。对于植物来源的多糖，可能含有酚型化合物而颜色较深，这类色 素大多呈负性离子，不能用活性炭吸附剂脱色，但可用弱碱性树脂、d e a e 纤维素或d u o l i t e j k 7 来吸附色素；若糖与色素是结合的，易被d e a e 纤维素吸附，不能被水洗脱，这类色素 可进行氧化脱色：以浓氨水( 或n a o h 液) 调至p h 8 0 左右。5 0 c 以下滴加h 2 0 2 至浅黄色， 保温2 h 。 1 2 3 3 除低聚糖等小分子杂质去离子是为以后进一步纯化及色谱分析作准备，最古老的去离 子方法是透析法。必需选择一种规格适宜的透析膜以免样品损失，透析方法不仅能去盐也可 以除去各种小分子物质。使用柱离子交换法如用s e p h a d e xg 0 2 5 可以达到去离子的作用，本 法比较简单，但是增大了溶液的体积，影响了多糖的沉淀结果。 4 西南大学2 0 0 7 届硕士学位论文第1 章文献综述 1 2 4 多糖的纯化方法 一般多耱为混合物，因而需要对多糖进行分级分离，分级分离的方法有多种，其中利用 多糖在乙醇中的溶解度不同，是一最为常用的简单而有效的分级分离方法。根据多糖阴离子 电荷密度的不同，可利用季铵络合物的生成、离子交换色谱和电泳进行分级分离。根据分子 量大小的不同。用凝胶色谱、超滤等技术进行分级分离也是工业生产常用的方法。作为多糖 制品，多糖纯化方法很多，可根据具体情况选用。现分述如下【1 3 1 ： 1 2 4 1 分部沉淀法根据不同浓度的低级醇或酮中具有不同的多糖溶解度的性质，逐次按比例 由小到大加入这些醇或酮( 常用的是甲酵、乙醇和丙酮) 分部沉淀。s , g i u r a 等采用此法将采 绒革盖菌多糖分为两部分，一为在o 5 乙醇中沉淀出来的，另。为在5 2 0 乙醇中沉淀 出来的。这种方法适宜于分离各种溶解度相差较大的多糖。 1 2 4 2 盐析法根据不同多糖在不同盐浓度中具有不同溶解度的性质，加入不同盐析剂使之逐 步析出。常用的盐析剂有n a c i 、k c l 、t l r d 4 ) 2 s o , 、c 麓3 c o o k 等，其中以( n h 4 ) 2 s o 最佳。 这种方法实质上是分部沉淀法的一种。 1 2 4 3 冻融分级法利用温度不同，溶解度不同而分级，分子量大或水溶性差的，低温易析出 1 2 4 4 金属络合物法根据不同多糖能与c u b 、c a ，、p b “、b a b 等易形成不溶性络合物而沉 淀的性质来进行分离。常用的络合物有菲林溶液、氯化铜、氢氧化钡和醋酸铅等。得到的络 合物沉淀经水充分洗涤后，用5 无机酸乙醇液或硫化氢分解m e i e r 曾用不同浓度( 0 0 3 0 2 t o o l l ) 的氢氧化钡沉淀b - 0 - 4 ) 4 ) 甘露糖及半乳聚耱。 1 2 4 5 季铵盐沉淀法根据长链季铵盐能与酸性多糖成盐，形成水不溶性多糖化合物的特性。 以分离酸性及中性多糖。常用的季铵盐是十六烷基溴代三甲基铵( c t a b ) 和十六烷基吡啶 ( c p c ) 。实验中必须控制多糖混合液的p h 小于9 及无硼砂存在。 1 2 4 6 超滤分级法不同的超过滤膜具有允许不同分子量和形状的物质通过的性质，因此多糖 溶液通过各种已知的超过滤膜就能达到分离目的。 1 2 4 7 柱层析法 1 凝胶柱层析法它是根据多塘分子的大小和形状不同而达到分离的目的。常用的凝胶有 葡聚塘凝胶( s e p h a d e x ) ，琼脂糖凝胶( s e p h a r o s e ) 及d e a e - - s e p h a d e x 。这是多糖分离中 最常用的方法。 2 纤维素柱层析常用不同浓度乙醇水溶液由高到低进行洗脱，将各种多塘分离开来。 3 纤维素阴离子交换柱层析此法适用于分离各种酸性、中性多糖和粘多糖。常用的交换 剂为d e a e - - 纤维索和e c t e o l a - - 纤维素。 4 亲和层析分级法可以把a 、b 型分开。用凝集索( 一般是蛋白质和糖蛋白) 作亲和色 5 两南大学2 0 0 7 届硕士学位论文第1 章文献综述 谱来分离多糖。 1 2 4 8 离子交换分级法利用极性不同与吸附牢度不同，用不同溶剂洗脱，达到分离多糖的目 的。常用的交换剂有d e a e - 纤维素。 1 2 4 9 制备性区域电泳法不同多糖在电场的作用下按其分子大小，形状及其所带电荷的不同 而达到分离，载体通常是玻璃粉。这种方法分离效果较好，但只适宜于实验室小规模应用。 1 2 5 多糖的纯度鉴定 多糖的纯度标准不能用通常化合物的纯度标准来衡量，因为即便是多糖纯品，其微观也 是不均一的，它的纯度只代表相似链长的平均配布，因此通常所说的多糖纯品实质是一定分 子量范围的均一组分。最好的纯度标准是建立多项指标，每一项指标测定一种不同的特性。 测定多糖纯度的方法有功能团分析、比旋度、水解后糖组分分析、纸色谱和高效液相色谱、 高压电泳、超离心分析法等通常在纯化的各个阶段应测定其灰分、含氮量、功能团( - c o o h 、 - n h 2 、- c l i o ) 的摩尔比、比旋度、粘度、水解后各种单糖的含量。一般说来，反复精制到这 些数值不再变动，方能断定该多糖较纯粹 1 4 1 电泳( 醋酸薄膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、玻 璃纤维纸电泳等) 所检查的带，一般均宽。层析则以各种凝胶的柱层析较好，必须得单一对称 狭窄的峰，高效液相层析配以适合糖分析柱，则效果更好。现将几种方法分述如下【卅： 1 2 5 i 旋光测定法如果不同浓度低级醇得到的多糖沉淀的比旋度相同，则证明该多糖为均一 组分 1 2 5 2 超离心法将多糖溶液进行密度梯度超离心，待转速达到6 0 0 0 0 r r a i n 以上后，间隔照相， 如果得到的是单一峰，则说明该多糖是单一组分。实验用此法，须有分析用带照相设备的超 速离心机 1 2 5 3 高压电泳法不同的多糖与硼砂形成具有不同电荷的复合物，在电场作用下迁移率不 同，电泳结果如呈单一色斑，则表示该多糖为均一组分该法灵敏度不高。 1 2 5 4 凝胶层析法多糖经凝胶层析得一对称峰，则证明该多糖为单一组分。 1 2 5 5 高压液相色谱法德国等常用高压液相法来检测多糖纯度，结果可靠目前多采用高效 凝胶液相层析来检测多糖的纯度此法准确度高 1 2 6 多糖含量的测定 一般来说，多塘的定量检测方法可分为二大类，一类是直接测定多糖本身，如高效毛细 管电泳法、高效液相色谱法和酶法。另一类是利用组成多糖的单糖的性质进行测定，其中利 用单糖缩合反应而建立的方法最多。这些方法简单、快速，无需多糖纯品和高级仪器，因而被 广泛采用。 6 西南大学2 0 0 7 届硕士学位论文第1 章 文献综述 1 2 6 1 比色法目前使用的比色法有咔唑硫酸、葸酮硫酸、苯酚硫酸法其原理为多糖 水解生成单糖，单糖可与强酸共热产生糠醛或糠醛衍生物，然后通过显色剂缩合成有色络合 物，比色定量，间接求出多糖的含量 1 2 6 2 滴定法滴定法有斐林氏滴定法，间接碘量滴定法。斐林氏滴定法虽然快速，但需在沸 腾状态下滴定，温度、滴定速度等影响较大，而且不能捧除还原糖的干扰 1 2 6 3 气相色谱法气相色谱法可定性、定量分析多糖的组分及含量，常采用衍生物法以增加 其挥发性一般是将多糖酸水解物或甲醇解( 用盐酸一甲醇) 物，用三甲基硅烷基化f r i s ) 或三 氟乙酰化o v a ) 转化为硅烷化产物或二酰化产物进行气相层析分析。但乙酰化之前，糖先用 k b i - h 或n a b i - h 还原成开链的糖醇化合物较好多糖用甲醇解方式把半缩醛甲基化，形成甲基 糖甙后再t m s 化，异构物减少，有利于分辨。常以甘露醇或肌醇为内标，用已知的各种单 糖作标准。 1 2 6 4 高效液相色谱法高效液相色谱法选用t s k 、s w 凝胶排斥色谱柱为分离柱，样品经 简单预处理，在示差折光检测器中进行检测，以不同分子量的标准右旋糖酐作标准，同时测 定样品中多糖的分子量分布情况及其含量，该方法较其他多糖测定法具有快速、简便、准确 等优点，是目前较为行之有效的测定方法 1 2 7 多糖的分子量测定 多糖的分子量测定最常用的是凝胶过滤法。对于粘度大的多糖，可采用粘度法求分子量。 亦有用蒸汽压渗透法，此法用于一些寡糖的分子量测定是很有利的，但它最大的缺点是测定 的结果是数均分子量，而由糖复合物( 特别是糖蛋白) 得到的寡糖在多数情况下是不均一的，因 此不能精确地了解某一糖链混合物中各个组分的分子量。此外还有超离心法、光散射法，玻 璃纤维纸电泳、聚丙酰胺凝胶电泳等方法测定分子量，粘度法及超滤法估计分子量。利用不 可方法测定多糖分子量可以从不同角度对多糖分子量进行确证，同时也是对多糖纯度的考察 多糖分子量的测定没有一种绝对的方法，其分子量只代表相似链长的平均配布而不是确切的 分子大小往往用不同的方法会得到不同的分子量。多糖测定的方法简介如下： 1 2 7 1 渗透压法利用膜渗透压计( d o 仪) 可以测定分子量范围在1 万5 0 万之间的多糖 分子量，此法不需用标准品，但要找到合适的半透膜，且测定比较费时。 1 2 7 2 蒸汽压法利用蒸汽压计( v p o 仪) ，可测定分子量范围在5 0 0 1 0 0 0 0 之间的多塘 分子量。方法简单、快速，但必须选用标准品 1 2 7 3 光散射法利用光散射分子量测定仪测定多糖分子量，此法不用标准品。 1 2 7 4 高压液相色谱法用高效液相色谱仪来测定多糖分子量，用已知分子量样品作标准，选 用特定的凝胶作填料。 7 西南大学2 0 0 7 届硕士学f ) = 论文 第1 章文献综述 1 2 7 5 凝胶过滤法将充分膨胀好的s e p h a d e xg - 2 0 0 、g 1 5 0 或g - 7 5 湿法装柱，用一定离子 强度的氯化钠水溶液进行平衡，然后将各种不同的已知分子量的多糖分别相继上柱，同一离 子强度的氯化纳水溶液洗脱，分步收集，苯酚硫酸法监测，分别求得洗脱体积v e ，然后再 将兰葡聚糖( m w 2 0 0 万) 上同一条柱，求出柱的空体积v o ，根据v e v o 与l o g m 之间存在着 线性关系，可绘制标准曲线。最后。将待测样品按上述不变的条件上柱，求得待测多糖的v c 。 通过标准曲线上的v e n o ，查得待测多糖的分子量对数，便可求出样品多糖的m1 1 6 1 。 1 2 8 多糖的结构 1 2 8 1 多糖的结构分类 多糖的结构是其生物活性的基础，认识和了解多糖的结构有助于更好地利用和开发多糖。 作为一类生物大分子糖的结构分类，沿用了对蛋白质和核酸的分析方法，单糖是糖类的组成 单元，单糖之间脱水形成糖苷键，并以糖苷键线性或分枝连接成寡糖和多糖。 1 2 8 1 1 一级结构多糖的一级结构包括糖基的组成、糖基排列顺序、相邻糖基的连接方式， 异头物构型以及糖链有无分支、分支的位置与长短等与蛋白质和核酸相比，塘的一级结构 非常复杂。 1 2 8 1 2 二级结构多糖的二级结构指多糖骨架链间以氢键结合所形成的各种聚合体，只关系 到多糖分子中主链的构象，不涉及侧链的空间摊布”在多糖链中，糖环的几何形状几乎是 硬性的，各个单糖残基绕糖苷键旋转而相对定位，可决定多糖的整体构象。通常糖菅键有两 个可旋转的主链二面角：巾m 1 - c l 旬l - c 糖配基) ，v ( c 1 4 3 1 c 糖配基h 糖配基) ，两个单糖若 为1 6 连接。则还有第三个可旋转的二面角( o d ：6 c 5 旬5 ) ，解决寡糖构象的关键在于确定 巾、v 、的取值。但是，它们的取值受相邻糖环之间的空间阻碍和相邻糖残基间的非共价 键相互作用的严格限制。 1 2 8 1 3 兰级和四级结构多糖链一级结构的重复顺序，由于糖单位的羟基、羧基、氨基以及 硫酸基之间的非共价相互作用，导致有序的二级结构空间有规则而粗大的构象，即是多糖链 的三级结构【“多