（环境科学专业论文）菲降解菌的分离、鉴定及降解特性研究.pdf

菲降解菌的分离、鉴定及降解特性研究 的胡敏酸。 相对于菲的单基质培养，本文还研究了菌株在多种共基质存在条件下，分别 在无机培养基和土壤环境中对菲、荧葸及芘的降解特征，结果发现，在无机培养 基和土壤环境中菌株均可以菲或荧蒽为唯一碳源和能源而充分生长，三种p a h s 组分作为共基质时，其降解过程主要表现为抑制作用，组分之间的共代谢不明显。 另一方面，t w e e n 8 0 的添加可在m m 培养基中微弱提高菌株对荧葸和芘的降解 率，并可大大促进菌株的生长，使培养液p h 明显下降；在土壤环境中则可大大 提高芘的降解率，说明表面活性剂在土壤环境中发挥的作用更为明显。富里酸 ( h a ) 的加入在无机培养基中可一定程度上提高菌株对菲的降解率，并可促进 菌株生长，但在土壤环境中则对p a h s 的降解表现出明显的抑制作用，尤其是当 有乙酸存在时p a h s 基本上不能被降解，同时土壤微生物碳有大幅度的增加，说 明d o m 组分被菌株作为碳源和能源利用，从而形成与菌株对p a h s 降解过程的 强有力竞争。 关键词：多环芳烃；菲；降解；产脂固氮螺菌；溶解性有机物；共基质 菲降解菌的分离、鉴定及降解特性研究 p h 7w a sp r o p i t i o u st og r 0 、矶ho ft h es t r a 氓w h e ni tg r o w e ds u 伍c i e m l ym i i l i t i a l p h 5 o ，a 1 1 dr a t i oo f g 佃呵e f 梵c t e df i a i l l t l y a a d d i l l gs 耐h c t a n tt w e e n - 8 0c a ni 1 1 c r e a s ei t s g r o 吼h 伊e a t l xa n dt h e r ew a sp o s i t i v ec o n e l a t i o nb e t w e e nt w e e n - 8 0c o n c e n t r a t i o n a n d0 dv a l u e d i s s 0 1 v e do r g a m cm a t t e r s ( d o m ) w e r ec 印a b l eo fi i l c r e a s e m g 莎。叭h o fs t r a i l l h o w e v e r d i f | f e r e n tc o l l c e n t r a t i o n so fd o mh a dd i 舵r e n te 腩c t s ，w h i c h a c e t i ca c i dw i t h5 0 m la f f e c t e dm o s ti 1 1 t e n s i c e l yw h e nh u m i ca c i dw i t hl0 m l a 伍戈t e dl e a s t a tt h ee n d ，t h i sp a p e rs t u d i e dt h ed e g r a d a t i o n gc h a r a c t 耐s t i c so fs t r 咖t 0 p h e n a n t h r e n e ，n u o r e s c e n c ea n dp y r e n e i nm mm e d i u ma n ds o i l s a m p l e s ， w i t h p f 豁e n c eo fs e v e r a lc o s u l b s t r a t e s t h er e s u n ss h o w e dt h a t ，s t r a i l lw 邪a b l et og r o ww e l l o ns o l ec 锄b o no fp h e n a 州j i l l e n eo ff l u o r e s c e n c ei nm mm e d i 啪a n ds o i ls a i n p l e s w h e nt 1 1 r e ep a h s 印p e a r e da sc o s b u b s t r t a t e s ，l ed e 笋a d a t i o nw a sc o n t r 0 1 e d ，a n d c 0 - m e t a b o l i s mb e t w e e nc o m p o n e n t si sn o to b v i o u s 0 i nt h eo t h e rh a n d ，a d d i t i o no f t l w e e l 】一8 0c o u l di i l c r e a s ef l u o r e s c e n c e - d e g r a d m gr a t ea n dp y r e n e d e 伊a d i n gr a t e f a 洫l y ，c a u s e dd r o po fp hi 1 1m mm e d i u i t l w h e n 证c r e a s ep y r e n e - d e 黟a d 通gr a t e 删l yms o i ls a m p l e s 1 1 1 i sm e a n e dt h a ts u r f a c t 觚tw a sm o r ee 髓c t i v ei i ls o i l e n 讥r o n l t l e n t h u n l i ca c i d ( h a ) c o u l ei 1 1 c r e a s e dp h e n a n t l r e n e d e g r a d i n gr a t ea r l d 粤o 、聃ho f s t r a i l li i lm mm e d i u n l ，b u ti tr e s t r a i n e dd e 蓼a d a t i o no fp a h si i ls o i ls a m p l e ， e s p e c i a l l yw h e nt h e r ew a sa c e t i ca c i di i ls o i l a tt h es 撇et i i i l e ，1 1 1 i c r o b i a lb i o m a s s c 缸b o n 讥c r e a s e da b u n d a n t l y ，w h i c hm e a n e dt h a td o mw e r eu s e da sc 打b o ns 0 u r c 懿 觚de n e r g ys o u r c c s ，c a u s i i l gs t r o i 培c o 瑚p e t i t i o nt od e g ，a d a t i o no fi ! a h s k e yw o r d s ：p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c 砌) o n s ( n 蛾s ) ；p h e n a n t l 们n e ；d e 黟a d a t i o n g ； 却删砌历助鳜删朋；弛s 0 1 v e do r g a n i cm a t t e r s ( d o m ) ；c o s u b s t l 缸e v i 论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指 导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引 用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或 撰写过的作品成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：i 勃蚴弥 日期：瑚年月，口日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规 定，即：学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定 机构送交论文的电子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢 利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室 被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索， 可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。 学位论文作者签名：撇潞导师签名：孝砀 日期：瑚年月l 日日期：盯年6 月p 日 论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指 导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引 用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或 撰写过的作品成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：i 勃蚴弥 日期：瑚年月，口日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规 定，即：学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定 机构送交论文的电子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢 利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室 被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索， 可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。 学位论文作者签名：撇潞导师签名：孝砀 日期：瑚年月l 日日期：盯年6 月p 日 菲降解菌的分离、鉴定及降解特性研究 第一章绪论 l 环境中p a h s 的来源、毒性及污染现状 多环芳烃( p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a f b o n s ，p a h s ) 是由两个或两个以上的 苯环以线形、弯接或簇聚的方式构成的化合物，是一个庞大的家族。p a h s 按其 理化性质可分为两类：一类为2 3 个苯环的低分子量的芳烃，如萘、芴、菲和葸 等，这些化合物易挥发，对水生生物有一定毒性；另一类为4 7 个苯环的高分子 量芳烃，如芘、荧蒽、苯并 a 】芘、晕苯等，这些化合物大都是些无色或淡黄色的 结晶，个别具深色，熔点及沸点较高，蒸汽压很小，不易挥发，一般具有荧光， 在光和氧的作用下很快分解变质，具有致癌、致畸、致突变作用【l 】 p a h s 在环境中分布广泛，是一类疏水性有机化合物，具有较高的辛醇水分 配系数，易于分配到环境疏水性有机物中，能很快进入到土壤和沉积环境中，并 且随着苯环数量的增多，脂溶性增强；有较高的生物富集因子( b c f ) ，在生物 体脂类中易于富集浓缩，在环境中存在的时间延长，遗传毒性增高。由于p a h s 具有致癌、致突变和致畸性【2 1 ，并极易在环境中累积且通过食物链传递在动、植 物体内逐级富集，对人类健康和生态环境具有很大危害性【3 】。1 9 7 9 年美国环保局 ( u se p a ) 将1 6 种p a h s 列入优先检测污染物【4 1 ，要求他们的总量不得高于 0 2 烬l 【5 1 。为修复已被弹嫩s 污染的土壤及沉积环境，需要对p ! a h s 的降解特性 进行深入研究。 目前p a h s 作为持久性有机污染物，因具有以下特征而被各国关注：( 1 ) p a h s 具有极强的“三致效应。人和动物癌症病变有7 0 乡扣9 0 是环境中化学物质引 起的，而p a h s 则是环境中致癌化学物质中最大的一类；( 2 ) p ! a h s 对微生物的 生长有强抑制作用。p a h s 因水溶性差及其稳定的环状结构而不易被生物利用， 它们对细胞的破坏作用抑制普通微生物的生长；( 3 ) p a h s 经紫外照射后毒性更 大( 光毒效应) 。p a h s 吸收紫外光能后，被激发成单线态及三线态分子，被激发 分子的能量可以通过不同途径损失，其中一部分被激发的p a h s 分子将能量传递 给氧，从而产生反应能力极强的单线态氧，破坏生物膜。 菲降解菌的分离、鉴定及降解特性研究 表1 一l1 6 种u se p a 优控p a h s 的理化性质 i j a b l e l - 1p h y s i c o - c ：h e m i c a lp r o p e r t i e so fs i x t e e np r i o r i t yu s p a h s 中文英文英文 ， 环分子沸点致癌 名称 名称简写 1 9k w 数 量 ( )性 萘n 印e n e n 印3 2 坳2 7 謦 苊烯a c e n 印h t h y e n e a c e4 o o31 5 22 7 5 鬓罂 苊 a c e l l l l a p h t h y l e l l ea c y 3 9 23l5 42 7 9致癌 芴 f l u o r e i l ef 1 u4 1 831 6 62 9 8致癌 菲p h e n a m h r e m p h e4 5 731 7 83 4 0 1 葸a n t l l r a c e n ea n t4 5 431 7 83 4 1致癌 荧蒽 f l u o r 觚t h e n ef l a5 2 242 0 2 3 8 4 蓁磊 芘 p y r e n ep y r 5 1 842 0 23 9 4致癌 苯并 a 】葸z 宝：芝是 b 砚5 9 42 2 84 3 8 菱磊 屈呻s e n em 5 8 542 2 8 4 4 8 马警 苯鬻仗f 勰脚5 s o 52 5 2 4 8 t 警 苯鬻琢f 凛b k f 6 m52 5 2 4 8 1 繁 苯并【a 】芘譬：尘1 b 0 6 0 452 5 25 0 0 蔓冀 ? 驾蔷川硪詈嚣棚姗6 劢62 萎誊 j - c d l 比p w e n e 玖_ 7 苗 二镒8 鬻筌b 姒6 乃52 7 8 升华萋霪 1 1 环境中p a h s 的来源 环境中多环芳烃( p a h s ) 的来源很复杂，一般可分为人为源和天然源。化石 燃料在高温下的不完全燃烧( 燃烧源) 、有机质( 如石油等物质) 等在地球化学 作用下缓慢氧化( 石油源) 以及成岩过程都能向环境中释放p ：a h s ，甚至连生物 正常的新陈代谢过程都有可能产生p ：a h s ，其中高等植物和微生物的合成、火山 活动是产生p a h s 背景值的主要因子。 土壤中的p a h s 一般是有机物被生物分解及燃料燃烧时热分解而成，通过大 2 菲降解菌的分离、鉴定及降解特性研究 气干湿沉降、地表径流入渗、农用污水污泥、地下蓄油装备的渗漏等途径进入土 壤环境。 1 2p ：a h s 在环境中的迁移转化 多环芳烃在环境中大多数是以吸附态和乳化态形式存在，一旦进入环境，便 受到各种自然界固有过程的影响，发生变迁。它们不断通过复杂的物理迁移、化 学及生物转化反应，在大气、水体、土壤、生物体等系统中不断变化改变它们的 分布状况。处在不同状态、不同系统中的多环芳烃则表现出不同的变化行为。多 环芳烃进入大气后，可通过化学反应，扩散与稀释，降尘、降雨、降雪等过程进 入土壤及水体中，使其浓度减少。在土壤和沉积物环境中，大多数p a h s 因较强 的疏水性趋向于分配到土壤或沉积物颗粒上去，并与天然有机物发生相互作用， 迁移与扩散能力很低。但土壤一旦遭到严重的污染，在与上覆水体发生相互频繁 的交换作用时，被污染的土壤环境还将成为水体再次污染的潜在来源。p a h s 通 过挥发和光解扩散到气相当中，又经过大气干湿沉降、地表径流等途径返回土壤 环境，尤其是在高气温、强光照的环境条件中，如萘等低环的p a h s 的挥发和光 解更为明显和快速，在土壤、大气、水体的三相循环中很容易造成对土壤环境的 二次污染。 土壤作为多环芳烃的主要载体，包含了自然界中几乎所有的微生物种类，所 以生物降解是多环芳烃在环境中降解的有效和相对快速的方式。微生物降解有机 物是在各种酶的催化下获得生长繁殖所需的能量。在多环芳烃等诱导，在微生物 分泌的单加氧酶或双加氧酶的催化作用下，把氧加到苯环上，形成c o 键，再 经过加氢、脱水等作用使c c 键断裂，苯环数减少。不同的途径有不一样的中 间产物，邻苯二酚是常见的中间产物，具体的化合物依赖于羟基组的位置，有正、 对或其他。 微生物降解多环芳烃一般有两种方式：一种是以多环芳烃为唯一碳源和能 源；另一种是将多环芳烃与其他有机质进行共代谢。很多研究表明微生物降解难 易度取决于多环芳烃化学结构的复杂性和降解酶的适应程度。另外，影响微生物 降解多环芳烃的因素还有温度、盐度、p h 、通气状况、营养盐和多环芳烃浓度 等。 1 3 我国p a h s 污染现状 菲降解菌的分离、鉴定及降解特性研究 代开始逐渐上升，2 0 世纪5 0 年代达到第一个高峰值，但在2 0 实际6 0 7 0 年代有 所降低，8 0 年代后急剧上升并于9 0 年代达到最高值。许姗姗【1 8 1 根据国内p a h s 的主要来源和相关排放因子和相关排放活动的统计资料，估算1 9 9 9 年p a h s 的 全国排放量，研究求得1 9 9 9 年1 6 种p a h s 的全国排放总量约为9 7 9 9t ，其中7 种致癌性p a h s 排放总量约为2 0 0 0 t 。 2 国内外p a h s 生物降解与修复研究现状 2 1 国外研究进展 自从2 0 世纪6 0 年代发现土壤微生物对p a h s 降解作用以来，p a h s 的生物 降解和生物修复研究进行了4 0 余年，世界各国在治理p a h s 污染方面投入了大 量人力和资金。研究主要集中在高效p a h s 降解菌株筛选，微生物降解p a h s 作 用效果，p a h s 的微生物降解机理，植物一微生物联合修复以及p a h s 污染土壤 生物修复的因素调控等方面。p a h s 降解菌的筛选一直是国内外生物降解p a h s 的一个重要方面，目前已报道分离得到许多可降解p a h s 的细菌2 0 1 ，其中可降 鼹藻桷奄a l c n l i g e n e sd e n i t r 派c 口凇，m y c o b 口c t e n u m 印，p s e 谢o m o 孔口s 弘t i 妇，p p m l c m o b i t i s ，pv e s i c u l n n s ，pc e p n c i 口， p ：t e s t o s t e ， o m ，r h o d o c o c c l l s s p ， c o r ) m e b n c l e r 主m mv e n 口l e ，b 8 c i t l t 堪c e r e t 岱，m 0 r c e l l 口s p ，s l 托p t o m y c e ss p ，b r i o s p 和c 弦肠f 唧 记埘s p 。l9 7 6 年鼬y o h a r a 和c o w o r k e r s 【2 1 】报道分离得到一株菲降 解菌株以来，相继报道了许多可降解菲的菌株，包括：么册聊d 刀口ss p ，彳蛔姆，l 嚣 ，n e t i s ，ad e m t r 讥c 岱，a n h m b a c t e rp o l y c h m m o g e 醒s ，b 叫e r i 7 l c k as p ， m i c m c o c c t l ss p ，m ，c o b n c t e 订u ms p ，p s e l l d o m o 船sp u n d a ，pp 口t l c i m o b i l i s ， 只，i 砒c c 淞印，所6 ，幻s p ，n | d c 4 趔如s p ，j 砌阳6 口c 绍疗“ms p ，脚幻，砂c 嚣s p 和肋c f 胍s p 【2 2 t2 3 1 。随着研究的深入细菌降解三环以上p a h s 的研究发展快速， 降解四环p a h s 的研究也取得一定进展，j u h a s z 等【2 3 】在液体基础培养基中测定了 & 绷d f p d 朋伽础朋口的础f 玩s 加觑烈10 0 0 3 降解荧蒽的能力及共代谢芘、苯 并葸等效果。据b a s t i a e n s 掣2 4 1 报道，如果在无机盐培养基中加入足够的有机养 分，9 5 以上的荧葸可以被肘如d 施c 纶一“棚s p 降解，且一些放线菌如 坳6 口c 幼似朋s p ，g 口砌刀口s p 和r d 如c d c c 淞s p 能分别以荧葸、芘和屈为唯一 碳源和能源从多种p a h s 污染的土壤中筛选得到。苯并芘是一种五环的p a h s ， 在煤焦油中含量大，虽然苯并芘在各种环境中都有检测到，但到目前为止能以苯 s 菲降解菌的分离、鉴定及降解特性研究 于表面活性剂可以提高p a h s 在土壤、水中的溶解度，使其容易进入微生物形成 的降解系统【3 6 1 ，所以，使用产生生物表面活性剂的菌株能够达到满意的修复效果 【3 刀 o 2 2 我国研究进展 我国p a h s 生物降解的研究与应用开展较晚，2 0 世纪8 0 年代以来，随着环 境问题日益凸显，生物降解研究相继展开，我国一大批科学家如孙铁衍、闵航、 骆永明、李培军、刘双江、邵宗泽、盛下放、袁红莉、宋玉芳等著名学者，投入 到了p a h s 污染生物修复领域，分离筛选了一批高效降解p a h s 的菌株，夏颖、 张志杰等人曾相继报道，并在降解能力、影响条件使用效果，基因克隆、酶学特 性、生物表面活性剂等方面进行了系统研究【3 8 4 1 1 。 2 0 世纪7 0 年代研究人员开始尝试利用微生物修复p a h s 污染的土壤，8 0 年代确认微生物修复p a h s 污染具有良好前景，并首先用于石油污染环境的修复。 2 0 世纪9 0 年代至2 1 世纪初，p a h s 微生物修复的研究全面展开，微生物修复对 菌株特性的要求、影响生物降解的生物、物理化学因素、最佳生存条件与调节( 营 养物质、氧气以及电子受体) ，形成一套较为成熟的生物修复理论。 3 菲的结构及其生物降解 3 1 菲的结构 菲( p h e i l a n t l l r e m ，p h e ) 由三个苯环连接而成( 如图1 1 所示) ，在p a h s 中属于较简单的一类低分子量p a h s 。菲具有典型的多环芳烃结构湾区( b a y r e g i o n ) 和k 区( kr e g i o n ) ，这两种结构是多环芳烃具有可致癌性的特征结构【4 2 1 。 湾区 k 区 图1 1 菲的结构 f i g 1 1t h e s t m c t u 】eo f p h e n a n t h r e n e 因其独特的化学结构，菲成为p a h s 研究中的模式化合物【4 3 1 ，许多科学家以 菲为模式化合物来研究p a h s 的毒性、降解路径、机制，以及影响p ：a h s 生物利 7 菲降解菌的分离、鉴定及降解特性研究 的降解路径。事实上，一个菌株并不一定仅仅含有一种菲降解途径，它可能同时 拥有两条甚至两条以上的菲代谢路径。g o y a l 等人【4 9 1 在c d m 口掰d 刀鲫幼娜纪加耐 g z 3 9 菌株中发现含有至少两条不同的菲降解路径。而m o o d y 等人5 0 1 在 嬲唧忉c 删朋s p p y r - 1 中甚至发现了三条降解菲路径，如图l - 3 所示。 3 2 2 细菌对菲的厌氧降解 由于p a h s 降解的最初步骤都是芳香环在双加氧酶的作用下形成二元醇产 物，以氧为电子受体，因此很长时间以来人们认为p a h s 的降解必须在有氧参与 的情况下才能进行，直到1 9 世纪8 0 年代b a u 既j e 【5 1 1 等人报道了细菌在无氧条 件下对p a h s 的降解，人们才认识到好氧降解并非是自然界中唯一的p a h s 降解 途径。 相对于有氧降解来说，p a h s 的无氧降解进程较慢，其降解途径目前还不十 分清楚。可以厌氧降解p a h s 的细菌相对较少，大多集中在紫细菌( m 纪d 6 口c 纪砌) 这个类群。研究表明，在反硝化的条件下，p a h s 可以以硝酸盐作为电子受体发 生无氧降解。在硫酸盐还原环境中，p a h s 的微生物降解仍然存在，以硫酸盐作 为电子受体，可以降解萘、菲、荧葸等5 2 1 。z h a i l g 和y o n g 将一产硫菌群应用于 萘、菲的厌氧代谢研究，提出了羧基化可能是该系统代谢的第一步反应【5 3 1 。 3 3 菲细菌降解中的酶系 细菌对菲的降解实际上是一系列酶促反应，见图1 5 。菲降解酶系一般具有 两个特点：( 1 ) 诱导性，在许多菲降解菌株中都发现了相关降解酶具有诱导性， 需由菲或它的代谢产物诱导才能表现出明显的酶活；( 2 ) 广泛的底物特异性，如 恶臭假单胞菌c 风e “如，l d ，z 船删蒯矗) o u s 8 2 【5 4 1 ，萘和菲可以被同一种双加氧酶所 氧化，而且该萘诱导的细胞除了氧化萘和菲以外，还可将葸、联苯、硫芴、苯并 苊、芴、苯甲酸苯脂、二苯甲烷等多种芳香烃氧化为酚类，说明其初始分解酶对 具有大疏水性置换基团的苯环有广泛的底物特异性。 一般认为单加氧酶和双加氧酶是微生物降解p a h s 的关键酶s 4 1 。菲与大多 数芳香烃物质降解一样，在降解过程中要经历一次或数次的开环过程。菲的降解 过程中有一些比较关键的酶，这些关键酶主要的功能即催化芳香环开环。菲降解 中的开环酶主要属于两大类【5 5 5 6 1 ，分别是芳香环羟基化双加氧酶和芳香环断裂 双加氧酶。 9 菲降解菌的分离、鉴定及降解特性研究 a l 麟硝酸罗 a 2 l 图1 2 菲的邻苯二甲酸代谢途径( a 1 ) 与水杨酸代谢途径( a 2 ) f 远1 2t h e ? 一p h t h a h t ea n ds a l i c y l a t er o u t so f p h e n 枷h e n cd e 影i d a t i o n i i lb a c t 萌c 1 0 菲降解菌的分离、鉴定及降解特性研究 菲 羟基化双加氧酶 顺3 ，4 _ 二氢二二羟菲 顺3 ，4 二氢二羟基菲脱氢酶 3 ，4 一羟基菲 3 ，4 羟基菲双加氧酶 2 一羟基一2 h 苯芘 h 色原烯一2 一羧酸盐 2 一羟基2 h 苯芘【h 】色原烯- 2 - 羧酸盐异构酶 c i s 一4 一( 1 h y d r o x y n a p h t h 一2 一y 1 ) 一2 一c x o b u t 一3 一e n o a t e 水合醛酶 丙酮酸盐和1 羟2 萘甲醛 1 羟一2 萘甲醛脱氢酶 1 羟基2 萘甲醛( 盐) 1 羟基2 萘甲醛( 盐) 1 ，2 双加氧酶l l 一羟基- 2 - 萘甲醛( 盐) 羟化酶 反2 一羧基苯甲酮酸 反2 羧基苯甲酮酸水合醛缩酶 2 羧基苯甲醛 2 一羧基苯甲醛脱氢酶 d 邻苯二甲酸 口邻苯二甲酸双加氧酶 原儿茶酸 原儿茶酸_ 4 ，5 双加氧酶 4 羧基2 羟基粘康酸半醛 ! ：三：三翌兰i 1 _ ：三毳萘氧化酶 2 羟基色烯2 羧酸盐 2 羟基一色烯2 羧酸盐异构酶 2 羟基亚卞基丙酮酸盐 i2 一羟基亚卞基丙酮酸盐缩醛酶 水杨醛l l 水杨醛醛缩醛酶 主1 水杨酸 l 1 j l 水杨酸羟化酶 主1 邻苯二二酚l 广一 l 邻苯二酚2 ，3 双加氧酶 2 羟基粘康酸半醛 t c ar 1 1c 0 2 + h 2 0 图1 5 菲降解中的催化酶系 f 噜1 5e m ：) ，i i l es y s t e m sm v o l v e di i lp h e n a n t h r e n ed e 伊a d a t i o n 菲降解菌的分离、鉴定及降解特性研究 4 影响菲生物降解的因素 4 1 生物可利用性( b i o a v a i l a b i l i t y ) 通常认为低水平的生物可利用性( 如污染物由固相向水相的缓慢释放) 是导 致其缓慢降解的个重要因素，这主要是因为菲的憎水、亲脂特性给它的生物降 解带来了传质限制的问题【5 8 1 。迄今为止，人们发现只有溶于水相的那一部分才能 为胞内代谢所利用【5 9 1 。 通过共溶剂或表面活性剂的添加，可以减少或消除这方面的限制。例如， v 0 蛐g 等【6 0 】针对低水溶性的萘和菲研究了四种非离子表面活性剂对其生物处 理过程的影响，表明这些物质的添加增加了萘、菲的溶解速率，并由此提高了降 解菌的生长速率。考虑到许多表面活性剂在被应用后，或为微生物所降解，或本 身对细胞有毒性而不能很好地发挥作用，微生物自身所产的表面活性剂引起了人 们的兴趣。d e z i e l 等【6 l 】将筛选的一株土壤a e “如，z 伽鲫菌在含萘和菲的环境中生 长，发现该菌产糖脂类表面活性剂并使萘和菲在水相中的浓度增加。 4 2 溶解性有机物( d o m ) 溶解性有机质( d i s s o l v e dor g ：枷cm a t t e r ，d o m ) 主要是指能够溶解于水、 酸或碱溶液中的有机物，如天然水中的有机质、土壤溶液中的有机质、土壤中能 被水、酸或碱等浸提的有机质。尽管土壤d o m 的含量很低，通常不超过百分之 几，如在土壤溶液、湿地土壤溶液和森林土壤剖面淋滤水中d o m 含量通常在 o 8 0 m g i 之间【6 2 1 。但由于它在土壤中普遍存在，而且其分子量较小，水溶性很 强，因此被认为是陆地生态系统和水生生态系统中的一种重要的、活跃的化学组 分【6 3 】，不仅可以影响污染物( 重金属、p a h s 、农药等) 的迁移能力啤t6 5 】和c 、 n 和p 等营养元素的生物有效性【6 6 1 ，而且还是矿物风化【6 7 】、成土过型6 胡以及微 生物的生长代谢、土壤有机质分解和转化过程的重要影响因素【6 9 1 。国外于2 0 世 纪7 0 年代提出d o m 这一概念，并已展开对土壤中d o m 提取方法、来源、组 成和机构、生物有效性，以及d o m 的环境意义等方面的研究探索【7 0 1 。 4 2 1 土壤d o m 的基本概念 土壤溶液中含有结构不同、分子量各异、数量变化不定的d o m ，其中只有 很小一部分低分子量的物质可以用化学方法鉴别【7 l 】，如有机酸、糖类以及氨基酸 1 4 菲降解菌的分离、鉴定及降解特性研究 等；大部分d o m 是具有高分子量的络合物质，即溶解性的腐殖质。d o m 通常 可定义为可以通过0 4 5 岬孔径滤膜的大小和结构不同的有机分子的连续统一体 【7 2 1 。d o m 是由很多有机化合物组成的复杂的混合物，它包括土壤溶解有机碳 ( d o c ) 、溶解有机氮( d o n ) 、溶解有机磷( d o p ) 和溶解有机硫( d o s ) 等， 其中以d o c 为主。 4 2 2 土壤d o m 的组成 多数研究者在研究d o m 时，实际操作中还不可能对所有d o m 组分进行逐 一分离和测定，往往只能根据它们的某些特性，将其分成不同组分，然后分别加 以研究。d o m 组分可根据元素和官能团、特殊化合物和化学基团、分子量、疏 水性亲水性、酸碱性质等分类原则进行划分，采用的结构分析方法也愈加多样 化，主要包括红外光谱( i r ) 、核磁共振光谱( m v 吸) 等。l ，e e l l l l e 一7 3 】及其合作 者们按化合物的极性和电荷特性，于1 9 7 6 年率先采用x a d 树脂和阴、阳离子 交换树脂，将水中的d o m 分离为6 个组分：( 1 ) 亲水的酸性有机质( h p i a ) ， 包括低分子量的及高羧基碳质量比( c o o h ：c 质量) 的腐殖质和非腐殖质，如 羧酸等：( 2 ) 亲水的中性有机质( h p i n ) ，包括单糖、醇和非腐殖质结合的多糖 等；( 3 ) 亲水的碱性物质( h p i b ) ，包括蛋白质等；( 4 ) 疏水的酸性有机质( h p o a ) ， 大致与土壤中的富里酸和胡敏酸相似；( 5 ) 疏水的中性有机质( h p o n ) ，主要 包括碳水化合物，如长链脂肪酸、烷基醇和带有少量功能团的腐殖质等；( 6 ) 疏 水的碱性有机质( h p o b ) ，有芳香族胺类等。 4 2 3 土壤d o m 对菲降解的影响 作为土壤有机质中最活跃的组分，d o m 虽然只占土壤有机质的很少一部分， 它与土壤有机质的其它组分之间可以在一定条件下相互转化，始终处于动态平衡 之中。并且，d o m 作为环境中重要的天然配位体和吸着载体，将土壤的矿物质、 有机质与生物成分联系在一起，如作为微生物的底物、通过物理化学作用改变金 属与外源性化合物的环境行为、稳定土壤胶体和团聚体、促进温室气体的排放以 及调节土壤养分流失、指示土壤质量等具有重要的生态环境意义 x 菲降解菌的分离、鉴定及降解特性研究 表1 2 土壤d o m 的一般组成【7 4 7 5 】 t a b l e1 - 2t h ec o m m o nc o m p o s i t i o no fd o mms o i l 4 2 3 1 土壤d o m 对菲吸附的影响 大量的研究发现，在环境中若有表面活性剂存在，则能促进p ! a h s 在水中的 溶解，增加其在环境中的移动性。d o m 作为一种天然络合剂和吸附载体，对菲 在环境中的活化、迁移、转化和最终归宿有较大的影响。 占新华【7 6 】等研究d o m 对菲的表观溶解度和正辛醇水分配系数的影响，发 现菲的表观溶解度随着外加d o m 浓度的增加而增大，它们之间存在着明显的线 性关系，同时d o m 可降低菲的正辛醇水溶液分配系数，d o m 具有表面活性剂 特性。吴文铸【7 7 】等研究发现，d o m 能明显降低菲在土壤中的吸附，土壤对菲的 吸附量与d o m 浓度之间呈极显著负直线相关关系，农业土壤中d o m 能明显活 化土壤中的p a h s ，增强其在土壤中的移动性。王艮梅【7 8 】等研究d o m 及表面活 性剂t w e e n - 8 0 对污染土壤中菲、芘解吸行为的影响，发现d o m 能增加土壤中 菲、芘的解吸率，随着体系中t w e e n - 8 0 浓度的增加，土戮霎薹。丝妻霉沥锺谚 坩浮锎淌。裂职薹濞鳃蔺强兰逦篓錾囊篓媾瓣鲋 霞蓁耄量孥耄l 蓥陶碓蓁羹灞，鳍新 荫繇髓酾髋骅锚硝葭 分子生物学研究中的报告基因 x 菲降解菌的分离、鉴定及降解特性研究 内加入氧原子完成的，这也可以说明底物对微生物内普遍存在的加氧酶的诱导作 用，就是p a h s 共代谢降解过程的一部分。b o u c h e z 【8 4 】等发现一株风p “如聊d 刀船s p 不能以荧葸为唯一碳源生长，但却能在菲存在时共代谢它。w = i l l i 锄【8 5 】在实验中 观察到b e 玎e n c 舫口不能以苯并葸作为碳源和能源生长，但该菌在有联苯、水杨 酸作为诱导底物生长后可以氧化苯并葸，水杨酸的存在还能提高a p “如m d 九口j 砒n c i b 9 8 1 6 降解荧葸和苯并芘的能力。 多种共存基质可引起菲降解率的提高，表现出增大效应。如t i e l l i i l 和 f r i t z c h e 【8 6 】以添加了表面活性剂的培养基培养一株芘降解菌坳6 以c 胞一“聊s p ， 发现菲存在时芘的降解得到了增加，而表面活性剂不存在时，增大效应却不发生， 这一现象被归因于菌株在表面活性剂和菲存在时的生长增加。 5p a h s 的生物修复( b i o 心m e d i a t i o n ) 虽然p a h s 在环境中可通过多种途径得以去除，包括挥发、光解、化学氧化、 土壤颗粒吸收和浸滤作用等，生物修复技术因其经济性和二次污染少等特点成为 处理该类污染物的主要方法。p a h s 在环境中的生物降解通常受许多潜在控制因 素如氧气分压、p a h s 的生物有效性、营养状况以及其他环境条件等限制。 5 1 影响土壤中础m s 降解的环境因素 5 1 1 水分 水分是土壤中生物最基本的生活物质和影响土壤状况的重要因素。土壤水分 条件对p a h s 类污染物降解的影响主要来自以下几个方面：( 1 ) 改变土壤氧气状 况，从而影响土壤的微生物区系，如淹水条件下土壤中的微生物主要以厌气性微 生物为主【8 7 】；( 2 ) 影响土壤的氧化还原电位，从而影响养分和重金属的生物有效 性。研究表明【8 8 ，8 9 1 ，土壤中还原条件促进苯并【a 】芘修复效果的增加，原因是， 土壤含水量的增大有利于土壤结构的破碎使土壤暴露表面积增大，污染物更易从 土壤基质上解吸，促进污染物的迁移和生物有效性的增大；( 3 ) 影响p a h s 的生 物有效性，如有研究表明，在泥浆反应器中水土比的增加可在一定范围内增加菲 的矿化率【9 0 1 。 菲降解菌的分离、鉴定及降解特性研究 5 1 2 营养条件 土壤养分状况是受到研究者重视的可改善修复效果的重要因素之一。通常认 为添加n 、p 等营养元素、添加其他碳源以调节c 小比等手段可在一定程度上促 进p 蛆s 的降解。然而，加入n 、p 养分对p a h s 污染土壤的修复效果在不同研 究者之间并不一致。在某些情况下，加入大量n 、p 可有效增加p a h s 的降解【9 1 1 ， 而在某些情况下却没有效果【9 2 1 。 造成这种差异的原因之一是不同土壤的肥力存在差异，因此加入肥料处理也 是增强p a h s 修复效果的手段之一；土壤的微生物区系的差异可能是影响外来养 分对土壤中p a h s 降解产生差异的另一原因，即使在相同的营养条件下，不同的 p a h s 降解微生物受到的激发作用并不一致，导致修复效果存在差异；第三个原 因，这种修复效果的差异也有可能是由不同p a h s 组分在土壤中分布和结合状态 的差异所引起的；原因之四，可能与加入养分的性质，如亲脂性、存在状态等有 关。 5 1 3 其它条件 影响p a h s 微生物修复效果的环境因素还包括土壤本身的理化性质( 如粒径 组成、孔隙度、p h 、有机质含量等) 、微生物活性、环境温度等。n 钮s 在土壤 环境中的降解是一个复杂的过程，受多种因素的共同作用，要达到最佳的修复效 果，必须通过控制以上各种条件使土壤中微生物活性达到最大、代谢最活跃从而 最有利于m s 降解。一些研究表明，温度为2 4 3 0 、湿度为3 0 - 9 0 、p h 为 7 m 7 8 、氧气含量为1 0 4 0 f 9 3 】、c ：n ：p 为1 0 0 ：l o ：1 【9 4 】时，最有利于m s 的微生物降解。 5 2 提高p a h s 修复效果的强化措施 由于污染土壤中p a h s 与土壤基质结合紧密，因此进行p a h s 污染土壤的生 物修复时必须首先考虑增加p a h s 的移动性和生物有效性。 提高p a h s 修复效果的强化措施包括：( 1 ) 控制土壤环境水分含量、氧气状 况、温度、湿度等培养环境条件；( 2 ) 添加碳源、n 、p 等营养元素，以及添加 某些微量元素，调节土壤养分状况达到最佳；( 3 ) 添加有机溶剂或表面活性剂， 促进w m s 向液相迁移；( 4 ) 分离和接种高效降解菌，如合适的基因工程菌，并 营造条件使其成为优势菌；( 5 ) 微生物与植物联合修复，利用两者对p a h s 的共 1 9 菲降解菌的分离、鉴定及降解特性研究 同作用增大p a h s 的去除效率。 6 研究意义与创新点 p a h s 对生态环境以及生物、人体健康均具有很大的潜在危害，因此，探讨 环境中p a h s 的来源、分布和污染状态，并进一步研究有针对性的污染控制手段 和修复技术对当前全球性环境保护具有重要意义。 目前国内外的对p a h s 的微生物降解的研究主要集中对低环组分( 如萘、菲 等) 的降解菌分离、降解效果研究、降解机理、土壤微生物修复与植物修复等， 某个纯菌株对单一鼢m s 组分的降解研究是最为深入的方面。但土壤中的土著微 生物在自然情况下对p a h s 降解的研究鲜见报道，其群落结构在受p a h s 污染胁 迫下有什么样的变化? 哪些种类的微生物更容易适应受p a h s 污染的土壤环境? 这些方面的研究可为进一步探讨土壤环境中p a h s 的降解机理、过程和影响条件， 以及分析分离的降解菌在土壤环境中的存活条件等提供参考。 土壤d o m 虽然含量相对较低，但由于其天然的表面活性剂及吸附载体性质， 越来越引起研究人员的关注。目前国内外对土壤d o m 的研究集中在组成结构分 析、对有机污染物的性质及吸附解吸行为的影响等方面，它对p a h s 微生物降解 方面的影响则少见报道。d o m 所具有的特殊性质是否能通过促进p a h s 向水相 中的分布从而增大p a h s 的降解率? 另一方面，由于d o m 的生物有效性高于 p a h s ，当两者于土壤环境中共存时，微生物一般优先选择容易利用的d o m 作为 碳源，这样是否就形成了对以菲作为唯一碳源的微生物降解过程的竞争，引起其 降解过程的延迟甚至不发生? 或者，在土壤中多种鼢h s 组分存在时，d o m 有 无可能与各n 蛆s 组分作为共同碳源为微生物利用，通过共代谢途径增大p a h s 的生物有效性? 这些方面缺乏实际的研究工作证实，可作为研究p a h s 降解与 d o m 关系的一个方向。 菲降解菌的分离、鉴定及降解特性研究 h 弛ng e r i i l a n y ) ；环己：j 皖( c y c l o h e x a n e ，h p l c ，l a b s c a n ，i r e l a n d ) ； 六甲基苯( h e x a n l e t h v i b e i l z e n e ，9 9 5 ，c1 4 1 9 4 4 0 0 ，d r e h r e n s t o r 断g m l ) h g 黝n v ) ；甲醇( 分析纯，广州化学试剂厂) 。 柱层层析硅胶( 型号：粗孔，z c x ，粒度：1 0 0 - 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