（分析化学专业论文）石油污染土壤中多环芳烃类物质的分析及降解研究.pdf

东北大学硕士学位论文摘要 石油污染土壤中多环芳烃类物质的分析及降解研究 摘要 本文以1 6 种多环芳烃( 其中有1 5 种是美国国国家环保局优选污染物) 为检 测对象，建立了一套分析土壤中多环芳烃的前处理方法和气相色谱质谱联用 ( g c m s ) 分析方法。并利用酵母菌，采用生物反应器技术对模拟长期风化的石 油污染土壤进行了降解。 本实验以1 ：1 的正己烷和二氯甲烷的混合溶液作为溶剂对石油污染土壤进行 索式提取。样品通过层析柱时，用1 6m l 正己烷淋洗脂肪烃组分，1 8 m l l ：1 的正 己烷和二氯甲烷的混合溶液淋洗多环芳烃组分。利用h e w l e t t 。p a c k a r d6 8 9 0 g c 一5 9 7 1m s d 对多环芳烃进行分析，采用的色谱柱是h p 5 一m s ( 6 0 m o2 5 m m o 2 5 9 m ) 。对多环芳烃在g c m s 上的色谱条件进行了优化：进样口温度：3 0 0 。c ； 检测器温度：3 2 0 c ；进样量：l g l ；载气：氦气；载气流量：1 m l m i n ，溶剂延 迟1 0 m i n 。程序升温：初温为5 0 ( 恒温l m i n ) ，以1 5 r a i n 升温速率升至1 7 0 ( 恒温2 m i n ) ，以8 m i n 升至2 2 0 ，再以3 r a i n 升温速率升至3 0 0 ( 恒 温9 m i n ) 。在最佳测定条件下，1 6 种多环芳烃回收率均能达到7 2 以上，相对标 准偏差为4 2 7 5 。 进行微生物降解实验时，对酵母菌降解石油污染土壤的最佳操作条件进行了 优化：含水率为5 0 ，p h 值为7 ，营养盐投放比例c ：n ：p = 1 0 0 ：5 ：i ，酵母菌投加 量1 4 0 0 0r p m 离心所得菌体，温度为2 8 。c ，不用额外供氧，不需添加表面活性 剂。在最佳条件下，利用酵母菌降解石油污染土壤，3 0 天以后原油去除率为 3 8 7 8 。用g c m s 分析测定后，结果表明：石油中的脂肪烃降解速率很快，在 1 0 天内从c 1 3 c 3 1 的正构烷烃均能得到有效降解；2 3 环的多环芳烃降解效果明显， 其中p h e n a n t h e r e n e 的浓度由起始o 2 7 4 2 m g g 经3 0 天生物降解后降到o 0 1 9 2 m g g 以下。 由于样品中4 环的多环芳烃很少，因此无法判断酵母菌对其降解能力；对多 环芳烃的降解顺序是从低环到高环。 关键词多环芳烃g c m s 生物反应器酵母菌 i i 东北大学硕f ：学位论文 a b s t r a c t s t u d i e so n a n a l y s i s a n d d e g r a d a t i o n o fp a h s i no i lc o n t a m i n a t e ds o i l a b s t r a c t i nt h i ss t u d y ，as e to fa n a l y t i cm e t h o do np o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ( p a h s ) i ns o i l sw a se s t a b l i s h e db yu s eo fg a sc h r o m a t o g r a p h - m a s ss p e c t r u m ( g o - m s ) t h e r e a r et o t a l l y16p a h sw e r ed e t e c t e di nt h ep r e s e n ta r t i c l e ( a m o n gt h e m15c o m p o u n d s a r et h ep r i o r i t yp o l l u t i o n si d e n t i f i e db yt h eu se n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o na g e n c y ) w e a l s ou s ey e a s tt ot r e a t m e n tt h es i m u l a t i v es o i l sc o n t a m i n a t e db yj i d o n gc r u d eo i li na b i o r e a c t o r o i li nc o n t a m i n a t e ds o i lw a se x t r a c t e db y5 0 h e x a n ei nd i c h l o r o m e t h a n e ( v v ) u s i n gs o x h l e ta p p a r a t u s a f t e rs a m p l e w a st r a n s f e r r e do n t ot h ec o l u m n ，h e x a n e ( 1 6 m l ) w a su s e dt ue l u t e a l i p h a t i ch y d r o c a r b o n s ，a n d 18 m lo f5 0 h e x a n ei n d i c h l o r o m e t h a n e ( v v ) w a s u s e dt oe l u t ea r o m a t i c h y d r o c a r b o n s p a h s w e r e a n a l y z e d w i t hah e w l e t tp a c k a r d6 8 9 0g a s c h r o m a t o g r a p hc o u p l e dt o ah e w l e t t p a c k a r d5 9 7 3m a s ss e l e c t i v ed e t e c t o r t h ec o l u m nw a sah p - 5 m s6 0 m o 2 5 m mw i m af i l mt h i c k n e s so fo 2 5 9 m t h eo p t i m u mo p e r a t i n gc o n d i t i o n sw e r ea c q u i r e d ：t h e i n j e c t o ra n d d e t e c t o rt e m p e r a t u r e sw e r e3 0 0 。ca n d3 2 0 c ，r e s p e c t i v e l y , u s i n gs p l i t l e s s i n j e c t i o no f 1l a l h e l i u mw a se m p l o y e da sc a r r i e rg a sa tac o n s t a n tf l o wo f1 0 m lm i n a n das o l v e n td e l a yo f1 0m i nw a su s e d t h et e m p e r a t u r ep r o g r a mw a s ：i n i t i a l5 0 。c ， h e l d1m i n ，r a t e1 5 c m i n 1t o1 7 0 4 c ，h e l d2m i n ，c a r e8 。c r a i n t o2 2 0 * c ，a n da g a i n r a t e3 。cm i n - 1t o3 0 0 c ，h e l d9m i n o no p t i m u mo p e r a t i n gc o n d i t i o n s ，1 6p a h s s t a n d a r ds a m p l er e c o v e r yr a t e sw e r em o r et h a n7 2 ，a n dr e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n s r a n g e df r o m 4 2 - 7 5 t h e o p t i m u mo p e r a t e c o n d i t i o no f t h eb i o - d e g r a d a t i o ne x p e r i m e n t ：w a t e rr a t i o ，5 0 ；p hv a l u e ，7 ；n u t r i t i o nr a t i o ，c ：n ：p = 1 0 0 ：5 ：i ；i n o c u l a t i o na m o u n t ，1 w e t t h a l l u s c e n t r i f u g e da t4 0 0 0r p m ；t e m p e r a t u r e ，2 8 ；n o e x t r ao x y g e na n ds u r f a c t a n t sn e e d e d d e g r a d a t i o n w a sc o n d u c t e da tt h eo p t i m u m o p e r a t ec o n d i t i o n s ，3 8 7 8 o f t h ec r u d eo i l i nt h es o i lw a sr e m o v e dw i t h i n3 0d a y s a n a l y z e db yg c m s ds h o w st h a ta l i p h a t i c h y d r o c a r b o ni nt h ec r u d eo i li sm o s tr e a d i l yt ob er e m o v e d ，t h e yc a n a l lb ed e g r a d e da t t h e r a n g e f r o mc 1 3 c 3 1 t h e2 - 3 t i n g e d a r o m a t i c h y d r o c a r b o n s w a se f f i c i e n t l y n l 东北人学硕i 学位论文a b s t r a c t d e g r a d e d ，b u tw ea r en o ts u r ea b o u tt h ed e g r a d a t i o no f4r i n g e dp a h sf o rt h e r ea r e l i t t l eo f t h e mi nt h ej i d o n gc r u d eo i l t h e r ei s0 1 4 4 6 9 lp h e n a n t h r e n ei nt h ej i d o n g c r u d eo i l ，w h i c hc o u l d n tb ed e t e c t e da f t e rt h e3 0d a y st r e a t m e n t k e y w o r d s p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ，g c - m s ，b i o r e a c t o r ，y e a s t 声明 本人声明所呈交的学位论文是在导师的指导下完成的。 论文中取得的研究成果除加以标注和致谢的地方外，不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得 其他学位而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 本人签名：自料 日期：c z 即拳2 i o 东北火学硕十学位论文第一章前高 第一章前言 1 1 石油及石油污染简介 1 1 1 石油简介 石油，又称原油，是现代社会赖以生存和发展的“血液”。可以说它的作用无 处不在，维系着人们生活的方方面面，对经济、政治、军事和人民生活有着极大 的影响，被誉为“黑色的金子”。 石油的产生机理相对较为复杂，一般认为，远古时代的植物经过地球物理作 用后被埋藏在地表以下，这些被埋藏的植物经过长时期的物理、化学、生物作用 后形成现今所谓的石油。 石油是以碳氢化合物为主混合而成的具有特殊气味的、有色的可燃性油质液 体。原油的颜色非常丰富：红、金黄、墨绿、黑、褐红、甚至透明。原油的成份 主要有：油质( 这是其主要成分) 、胶质( 一种粘性的半固体物质) 、沥青质( 暗 褐色或黑色脆性固体物质) 、碳质( 一种非碳氢化合物) 。石油的性质因产地而异， 密度为0 8 1 o 克厘米3 ，粘度范围很宽，凝固点差别很大( 3 0 6 0 。c ) ，沸点范 围为常温到5 0 0 。c 以上，可溶于多种有机溶剂，不溶于水，但可与水形成乳状 液。组成石油的化学元素主要是碳( 8 3 8 7 ) 、氢( 1 1 1 4 ) ，其余为硫( o 0 6 - o 8 ) 、氮( 0 0 2 - 1 7 ) 、氧( o 0 8 1 8 2 ) 及微量金属元素( 镍、钒、铁 等) 。由碳和氢化合形成的烃类构成石油的主要组成部分，约占9 5 9 9 。不同 产地的石油中，各种烃类的结构和所占比例相差很大，但主要属于烷烃、环烷烃、 芳香烃三类。通常以烷烃为主的石油称为石蜡基石油：以环烷烃、芳香烃为主的 称环烃基石油；介于二者之间的称中间基石油。 1 1 2 石油污染 当前就全世界而言，石油在能源消费结构中占第一位，因此它的巨大消耗 不可避免地会对人类赖以生存的环境造成破坏。目前，石油污染已经受到世界各 国的普遍关注，它主要是指石油在开采、炼制、贮藏、运输和使用过程中，石油 及各种石油制品由人为或非人为原因进入环境而造成的污染。主要表现在对水域 ( 包括地表水和地下水) 、大气和土壤这三种介质的污染。 本课题着重研究石油对土壤的污染及其分析。通常，石油对土壤的污染不象 东北大学硕士学位论文第一章前言 海上石油泄漏或是大气质量明显下降那样容易直接被人们察觉。它相对于水域和 大气污染来讲，具有隐蔽性和信息反馈的滞后性。土壤污染表现在：破坏土壤的 团粒结构，使土壤板结，堵塞土壤空隙，直接导致土壤生产力下降甚至荒芜；土 壤中的污染物质可以通过挥发进入大气，对大气造成污染；被雨水不断冲刷和淋 滤，转移到地表水和地下水等各种水域中，对水域造成污染。而且由于土壤自净 速率较慢，污染物质大部分都将迁移到水体中，形成对地表水和地下水的长期污 染源，对人类生产和生活产生巨大的危害和影响，因此土壤污染必须引起人们的 高度重视。 目前，我国土壤的石油污染主要是由以下几个原因造成的【。 ( 1 ) 油田生产过程中的污染 石油在开采过程中常会发生钻井和配套工程运行过程中的落地油和含油泥浆 的污染。这些污染物在自然界中的降解非常缓慢，除了少数挥发以外，大部分会 积累下来。这类污染的特点是污染强度大，污染点分散，面积小。 ( 2 ) 储存和运输过程中的污染 油类产品在运输和储运时常常会发生小量泄漏问题。这类污染一般集中在运 输路线附近和储油罐周围。这类污染的特点是除了个别事故区域外，污染强度不 是很大，大多数污染分散。 ( 3 ) 石油加工过程中的污染 这类污染主要集中在石油冶炼化工企业场地和周围。加工过程产生的污染不 仅包括生产过程中原料和产品跑、冒、滴、漏所造成的污染，还包括生产过程中 产生的废弃物不恰当处置所造成的污染。这类污染的特点是污染物残油中难挥发， 难降解成分含量高。 ( 4 ) 污灌区域的石油污染 一些地区由于长期直接接受含油废水的灌溉，污染物质在土壤中常年积累。 这种污染比其他几种污染浓度相对较低，但因为它污染区域面积大，因此造成的 污染效应很明显。 ( 5 ) 事故性污染 事故性污染主要指由于一些突发性事故导致的石油污染。这部分污染的特点 是污染浓度较大，污染物质中挥发性成分较多，污染面积较小。 在上述几个导致污染的情况中，石油工业的污染物现在和历史上的超标排放 是我国目前石油污染最严重的致因。尽管近十几年来，石油工业对环境保护加大 了投入，努力控制了污染物的排放，但是残留在土层中的石油污染物质还是没有 得到很好的治理。 东北大学删l 。学位论文第一章前苦 由于石油中烃类占石油总重的9 5 一9 9 ，因此通常所指的石油污染物多指烃 类物质，对其进行有效治理和研究是处理石油污染的主要任务。其中多环芳烃是 一类典型的三致( 致癌、致突变、致畸) 化合物，相对于脂肪烃和环烷烃来讲毒 性大且难以治理，长期以来是人们研究的热点，也是本课题研究的重点。 1 2 多环芳烃概述 多环芳烃( p o l y c y c l i c a r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ，简记为p a h s ) 是指2 个或2 个以 上的苯环稠和在一起的一类化合物。它们在环境中普遍存在，目前已发现3 0 0 0 0 多种( 包括s 、n 、o 及其烷基同系物) 1 2 ，是最早为人们所认识到的具有致癌变 的有机化合物。多环芳烃具有疏水性、蒸气压小及辛醇水分配系数高的特点【3 1 。 因此，p a h s 进入海洋环境中后容易分配到生物体和沉积物中，通过食物链进入 人体，对人类健康和生态环境造成潜在危害。美国国家环保局( e p a ) 已将芴、 萘、葸、苯并( a ) 芘( b a p ) 等1 6 种p a h s 列为优先控制污染物，欧洲则把荧蒽、 b a p 等6 种p a h s 作为目标p a h s ，我国水体6 8 种优先控制污染物中，p a h s 有7 种。全世界每年有近4 3 0 0 0 吨p a h s 进入大气圈，2 3 0 0 0 0 吨p a h s 进入水环境。 其中最具代表性的三致化合物b a p 每年进入大气的量为5 0 0 0 吨左右，进入水环 境的有7 0 0 吨之多f 4 】。因此必须对多环芳烃类物质进行有效控制和治理。 1 2 1 多环芳烃的来源 多环芳烃的形成可分为人为和天然两种。自然界中一些生物如细菌、藻类等 可以合成p a h s ，火山活动及森林火灾也可以产生p a h s ，但这些自然过程产生的 p a h s 量少，构成环境中多环芳烃的天然本底，可以通过自净作用去除。而人类 活动，如石油、煤炭、木材等含碳氢化合物的不完全燃烧、石油炼制中废物排放、 海上石油开发和石油运输中的溢漏等是环境中p a h s 的高浓度污染的主要来源。 1 2 2 多环芳烃在环境中的分布 目前人们已在多种环境介质中检出了p a h s ，包括空气、水、土壤、沉积物、 石油、焦油类和食品等 弱。 1 2 2 1 大气中的p a h s 有机物不完全燃烧产生的p a h s 有1 5 0 多种，他们主要吸附在烟尘颗粒物上， 随着颗粒物的飘动发散在环境各处。经研究测定多环芳烃中9 5 是吸附在 c 1 0 _ c 2 4 或更长的直链烷烃 小于c 1 0 的支链烷烃 c 1 0 c 2 4 或更长的支链烷烃 单环芳烃 多环芳烃 杂环芳烃【3 “。多环芳烃中环的多少与环的排列都影晌p a h s 在环境中的稳定性，其稳定性的排列是环形 角形 线形。生物可降解性则与此相 东北人学硕士学位论文第一章前言 反，且p a h s 的溶解度和挥发性均随环数的增加而减少【3 6 】。 1 3 2 2 污染土壤微生物生态结构与降解作用 污染物在土壤中净化的主要贡献者是具有降解该污染物能力的微生物。降解 者的存在又与污染物的存在密切相关。a t l a s ”】曾报道降解烃类的微生物在土壤和 水环境中到处可见，但在一般情况下，降解烃类的微生物只占微生物群落总数的 l ，而当有石油污染物存在时，降解者的比例可增加到1 0 。他在步里塔尼岸漏 油事故发生时发现，漏油后大约1 5 h 就有大量降解烃类的微生物繁殖，一天之内 这种微生物群落就增加了几个数量级。可见降解污染物的微生物首先对该物质产 生适应性，产生诱导酶( 或降解质粒) ，进而形成降解功能，利用该物质为碳源和 能源进行生长繁殖，形成新的生态结构。 g r o s s e r 3 8 j 认为，用经过培养并重复使用的土壤进行生物降解时，污染物的降 解速率最快。有人将特别适用某一场地的微生物用于由同类污染物污染的异地土 壤处理。v e c c h i o le ”】用此种方法使石油污染土壤中的烃去除率提高2 2 。但在此 条件下，要特别注意微生物对新处理场地的特殊生态环境的适应性。研究中对生 物工程菌的应用亦有报道，对它们在环境中的归宿及影响受到极大关注，对其适 应适用状态要严格控制1 4 。 应用降解微生物的成功取决于微生物在不同污染生态系统中的存活与性能。 生长限制因子主要包括与其它微生物的竞争，微生物的死亡，场地条件及其它被 降解的基质。从污染土壤中分离出来的室内培养的微生物，在自然环境中能否存 活并保持良好的活性对应用于实际能否成功极其重要1 4 ”。 许多细菌、真菌、藻类都可以降解多环芳烃，酵母菌就是其中的一种。酵母 菌既具有细菌的特点，如以单细胞形式存在，生长繁殖快，能形成较好的絮体， 可适用于多种不同的生物反应器；同时酵母菌又具有丝状真菌的特点，细胞较大， 代谢旺盛，对c o d 的去除速率较快，耐酸、耐高渗透压、耐高浓度的有机底物 等。本实验即是把从石油污染土壤中筛选出来的1 3 株酵母菌作为降解微生物，利 用生物反应器法对石油污染士壤进行处理。 1 3 2 3 影响生物降解的环境因子 控制土壤环境条件能提高有机污染物生物降解的效果。获取降解的最佳条件 是每个处理工程的重要影响因子，也是人们在污染土壤生物修复技术研究中必需 解决的关键问题。a n d r e w c h l 2 3 认为生物修复技术应用于被污染的土壤的治理， 通常就是对环境速率限制因子的消除从而使生物对任何可降解的污染物都具有 东北大学硕1 学位论文第一章前言 最大的降解速率。通常有以下几种影响因素4 2 】1 4 3 】。 ( 1 ) 土壤酸碱度 同大多数微生物相同，能降解石油类物质的土壤微生物生长繁殖的适宜p h 值为6 - 8 ，最优p h 值为7 7 5 左右。 ( 2 ) 土壤温度 生物反应符合一般的化学反应速率的规律，即温度越高反应速率越快。考虑 到充分发挥生物酶的降解活性和石油类污染物的溶解度和挥发特性，一般认为石 油类物质适宜的降解温度为1 5 - 3 0 。 ( 3 ) 土壤湿度 有机物必须为水溶态时才能被微生物体所利用，所以石油类生物降解需要水。 同时，过高的土壤湿度对降解过程也不利。大量实践表明，使土壤湿度保持在 5 0 8 0 可达到好的降解效果。 ( 4 ) 营养物质【4 5 】 氮、磷等营养盐是微生物生长所必需的元素，当营养盐缺乏时会限制微生物 的生长。但是过度投加营养盐对土壤不利，会使土壤的透气性和渗透性下降。因 此必须合理添加营养盐的数量和比例。其中最重要的比例关系是质量比 m ( c ) ：m ( n ) ：m ( p ) 。大量的研究表明，这个比例接近1 0 0 ：5 ：l 时对石油类物质的 降解比较合适。 ( 5 ) 氧源 细菌类、真菌类降解脂肪烃、环芳烃、芳烃的第一步是利用氧化酶氧化底物。 这一步必须存在分子氧，好氧条件是微生物氧化烃类的必须条件。在土壤中，特 别是石油污染浓度较高时，氧的供应就成为生物降解的控制因素。 ( 6 ) 表面活性剂f 4 7 】 多环芳烃的憎水性强，易吸附在土壤或底泥中的天然有机物上，其游离在水 相中的部分很少，生物可利用性低。表面活性剂通过降低介质表面和界面张力， 提高p a h s 在水相中的溶解度，促进多环芳烃从固相转移到水相，促进其生物利 用。但与此同时，表面活性剂对微生物也有毒害作用。微生物在生长过程中，自 身能分泌某些活性物质，促进p a h s 的降解，这种由生物产生的天然表面活性剂 称为生物表面活性剂。由于生物表面活性剂具有比合成表面活性剂更低的临界胶 束浓度，对淡水、海洋和地球生态系统的毒性要低得多，能够快速而又完全地被 生物降解。 ( 7 ) 微生物的接种 将从土壤中分离出来的对烃类有很强分解能力的降解菌制成干燥菌种，或者 东北大学硕十学位论文 第一章前言 利用遗传工程方法，使微生物的遗传基因发生变异，以得到降解能力强的基因工 程菌，在需要时向污染土壤接种。接种所受影响因素很多，例如，对烃类的适应 性要强，遗传稳定性要好，休眠后仍有活力，使用时能快速增殖并对当地菌种有 一定竞争力等4 引。 由于影响生物修复技术处理石油污染的因素很多，因此有必要对各种环境因 素进行优化，以期达到较好的处理效果。 1 4 本课题研究内容及创新点 本课题研究内容：建立了利用g c 。m s 分析石油污染土壤中多环芳烃的分析 方法，并利用酵母菌采用生物反应器技术对石油污染土壤进行处理，研究在降解 过程中多环芳烃的变化情况。 创新点在于： ( 1 ) 本研究样品的前处理参考的是美国公共卫生协会标准方法。针对本实验 中处理的原油的特点对标准方法作了部分改进。改进后的方法虽不具备普遍的适 用性，但对本分析而言，不但能达到标准方法的回收率，而且可以得到更好的精 密度。 ( 2 ) 建立了利用g c m s 法分析石油污染土壤中多环芳烃的分析方法。 ( 3 ) 对酵母菌降解原油污染土壤的影响因素进行了相关实验和探讨，在拟定 的最佳处理条件下采用生物反应器技术对石油污染土壤进行降解，研究原油中 p a h s 的变化情况。 东北人学硕 学位论文 第二章实验部分 2 1 仪器和试剂 1 仪器 第二章实验部分 ( 1 ) h e w l e t t - p a c k a r d6 8 9 0g c 一5 9 7 1m s d ( 2 ) 色谱柱：h p 5 一m s ( 6 0 m x o 2 5 r a m o 2 5 9 m ) ( 3 ) h p 化学工作站 ( 4 ) 混凝试验搅拌器j t y 一6 ( 唐山大昌化工有限公司) ( 5 ) 多功能食品加工机( 伊莱克斯) ( 6 ) 电子天平( 奥豪斯国际贸易有限公司) ( 7 ) 旋转蒸发仪r 系列( 上海申生科技有限公司) ( 8 ) 循环水式多用真空泵s h b i i i ( 郑州长城科工贸有限公司) ( 9 ) 水浴锅 ( 1 0 ) 索氏提取装置 ( 1 1 ) 色谱柱( 9 0 0 x4 l _ m mi d 底端带有玻璃棉) ( 1 2 ) 层析柱( 2 0 0 1 0 5 _ m mi d 底端带有玻璃棉) ( 1 3 ) 马沸炉 ( 1 4 ) 洁净工作台( 哈东联) ( 1 5 ) 手提式压力蒸汽消毒器( 江阴滨江医疗设备厂) ( 1 6 ) 生化培养箱( h p s 一2 8 0 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司制造) ( 1 7 ) 离心机t d l - 5 ( 上海安亭科学仪器厂制造) ( 1 8 ) e g 冰箱( 海尔b c d 2 6 5 ) ( 1 9 ) 空气浴振荡器( h i q - c 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司) 2 试剂 ( 1 ) 甲醇( 色谱级，f i s h e r 公司) ( 2 ) 正己烷( 色谱级，f i s h e r 公司) ( 3 ) - - - 氯甲烷( 色谱级，f i s h e r 公司) f 4 ) 丙酮( 色谱级，f i s h e r 公司) ( 5 ) 1 6 种多环芳烃( s u p e l c o ) 东北大学硕十学位论文第二章实验部分 ( 6 1 硅胶( 7 5 1 5 0 p m ，孑l 径1 5 0 a ，粒度1 2 c m 3 g ，活化面积3 2 0 m z g ) ( 7 1 无水硫酸镁( 分析纯) ( 8 ) 无水硫酸钠( 分析纯) ( 9 ) 二氯甲烷( 分析纯) f 1 0 1 f 己烷( 分析纯) f 1 1 1 t w e e n 8 0 ( 表面活性剂) ( 1 2 ) 硫酸铵( 分析纯) ( 1 3 ) 磷酸二氢钾( 分析纯) ( 1 4 ) 磷酸氢二钾( 分析纯) ( 1 5 ) 尿素( 分析纯) ( 1 6 ) 葡萄糖( 分析纯) ( 1 7 ) 酵母粉( 生化试剂) ( 1 8 ) 琼脂( 生化试剂) 2 2 石油污染土壤重量法提取技术 样品的前处理是整个分析过程的瓶颈，它直接影响分析结果和分析时间，因 此科学的样品前处理方法是获得正确结果的前提。 2 2 1 标准方法 本文所研究的对象石油污染土壤，属于固体沉积物类样品，它的前处理 本文参考的是美国公共卫生协会( a m e r i c a n p u b l i ch e a l t ha s s o c i a t i o n ，简称a p h a ) 标准方法5 5 2 0 e ，该标准方法如下：首先称取含有所测样品的湿泥2 0 + 0 5 9 于 1 5 0 m l 的烧杯中，用盐酸酸化样品至p h - 2 或是更小( 通常o 3 m l 浓盐酸就足够 了) 。加入2 5 9 m g s 0 4 h 2 0 搅拌均匀并将粘在烧杯壁上的样品也刮净。待样品固 化1 5 3 0 m i n 后，将样品转移至研钵中充分研磨。将研磨后的粉术转移至用滤纸做 的纸筒中，并用溶剂浸泡过的滤纸将烧杯和研钵上残留的样品也一同转移至纸筒 中。然后将样品进行索式提取，以2 0 次d 时的速率提取4 小时。如果所得样品 溶液混浊或有悬浮物，可将该溶液过滤至预先已经称重的瓶子里。然后将溶液中 的溶剂蒸发并吹干后，称量提取物的重量【4 9 】。 这种方法有很强的适用性，但操作起来也存在以下几个问题。( 1 ) 对于实验 研究来说，取样存在局限性，很难保证所取样品有很好的代表性。( 2 ) 操作比较 麻烦，而且在样品转移过程中容易造成损失。因此鉴于本研究中处理的原油的特 点，本文在标准方法的基础上作了部分改进。 1 4 东北人学侦f 学位论文第二章实验韶分 2 2 2 改进方法 实验所用土壤来自于长期没有施肥的果园，将该土壤在空气中风化数天后， 过2 毫米筛，密封保存。原油来自冀东油田，经过2 3 0 。c 蒸馏塔蒸馏。 具体步骤：首先称量生物反应器( 3 0 0 m l 烧杯) 净重w p 克，然后投放反应 物。试验结束后向反应器中加盐酸酸化破乳至样品p h i 2 。用脱脂棉蘸少量正己 烷将搅拌头上的油泥转移干净，然后于6 0 水浴中加热约7 - 8 个小时，当样品呈 现粘稠状时从水浴锅中取出。若将样品完全蒸千会使组分丢失，回收率降低 1 1 ，3 7 。在反应器中加入约1 5 克的无水m g s 0 4 ，保证样品完全干燥，再放入干 燥器内2 小时左右，取出后称量其总重w q 克。将干燥后的样品放入干粉机中打 碎至粉状。准确称量约1 0 克的粉状样品w o 克用纸简包好，索氏提取约5 小时( 水 域温度设在8 2 5 c ，用5 0 m l l ：1 的正己烷和二氯甲烷的混合溶液做溶剂) ，用5 0 m l 平底烧瓶盛装萃取组分。待体系温度下降至室温时，取下平底烧瓶。准备7 5 l t m 的砂心漏斗，上面平铺层无水n a 2 s o 一，将所得的萃取液过滤，并将平底烧瓶 和砂心漏斗用正己烷淋洗干净，滤液转移到预先称重的1 0 0 m l 梨形瓶中( 质量为 w r n 克) ，。将盛装滤液的梨形瓶放在旋转蒸发仪上蒸发( 水浴温度为4 0 ，压 力在0 ，0 8 m p a 左右) ，当液体蒸发至l m l 左右时将梨形瓶取下，余下的溶剂用柔 和的氮气吹干，放在干燥器内干燥半小时之后准确称重( 质量为w n 克) 。回收率 计算方法如下： w q - w p $ w 。 w n ，1 i h 1 0 0 1 0 0 将相同质量和配比的样品各1 0 0 克，放入3 个生物反应器中进行测定，每个 反应器中取两个样品，测得结果见表2 1 ： 表2 1 石油污染土壤中石油回收率 t e b l e2 1 r e c o v e r yr a t eo fo i ii nc o n t a m i n a t e ds o i l 反应器样品标号 回收率平均值箱相对标准偏差( n = 6 ) l1429 他 似 勰 加 s j s j 叭 昭 舡 舵 眦 弛 j a b u 东北大学硕j 二学位论文第_ ：- 二章实验部分 可以看出不但每个反应器中的两组数据有较好的平行性，而且三个反应器的 结果也体现了很好的重现性。 改进的方法与原方法的不同之处在于：( 1 ) 它是将样品全部进行处理，而不 是部分，避免了取样的局限性。( 2 ) 进行索式提取时是取部分样品，而不是全部， 避免了不能全部转移样品带来的误差。但是改进的方法具有适用的局限性，是 仅适用于小规模反应器，二是仅限于不易挥发的待测组分。这两个限制因素对所 进行的研究不会造成影响，因为本研究中生物反应器中的样品总重仅为1 0 0 克， 且原油在处理之前已经在2 3 0 。c 蒸馏过，挥发性组分大部分已经不存在了。因此 采用改进方法进行样品前处理可以得到更可靠的数据。 2 3 柱层析法处理石油提取物 2 3 1 硅胶的处理 将2 0 0 - 3 0 0 克硅胶放在9 0 0 4 1 i r t mi d 的色谱柱中，分别用各2 5 0 m l 的丙酮、 正己烷和二氯甲烷( 均为色谱级) 进行淋洗。然后将其放在通风厨里过夜，再于 4 0 5 04 c 完全蒸干。将烘干后的硅胶放在蒸发皿里，用铝箔轻轻盖上，于1 8 0 。c 下 活化2 0 小时 5 0 l 。 2 3 2 层析柱的填装 分别用甲醇、正己烷、二氯甲烷( 均为色谱级) 淋洗层析柱( 2 0 0 x1 0 5m m i d 底端带有玻璃棉) ，晾干后用干装法装入3 克活化硅胶并敲实，再在硅胶上面 放入约o 5 c m 厚的无水n a 2 s 0 4 。用2 0 m l 正己烷( 色谱级) 淋洗色谱柱并将废液 倒掉，保证不让无水n a z s 0 4 暴露于空气中。 2 3 3 多环芳烃标样的层析处理 将l m g l 的多环芳烃标样1 0 0 m l 与5 o o 克土混合均匀，采用改进的前处理 方法，得到用n 2 吹干的样品。将其用正己烷( 色谱级) 溶解后全部转移至处理过 的层析柱中，用1 8 m l l ：l 正己烷和二氯甲烷( 均为色谱级) 混合溶剂淋洗，所得 溶液旋转蒸发并用n 2 吹干后，用正己烷( 色谱级) 定容至0 4 m l ，用于g c m s 分析测定。 2 3 4 石油提取样品的层析处理 用正己烷( 色谱级) 溶解重量法得到的用n 2 吹干的样品，使其密度为 末北大学硕十学位论文第二章实验部分 1 0 0 m g m l ，取0 2 m l 样品通过层析柱，并用3 m l 正己烷( 色谱级) 将样品转移 完全，流出的废液倒掉。用1 6 m l 正己烷( 色谱级) 淋洗脂肪烃，用1 8 r o l l ：1 f 己烷和二氯甲烷( 均为色谱级) 的混合溶液淋洗多环芳烃，将得到的溶液分别 旋转蒸发并用n 2 吹干后用正己烷( 色谱级) 溶解。脂肪烃组分定容至6 0 m l ，多 环芳烃组分定容至5 m l 。 2 4g c m s 法测定多环芳烃的色谱条件 色谱柱( h p 5 型) ：6 0 m 0 2 5 m m 毛细管柱，内涂0 2 5 p m 厚的5 的 p h e n y l m e t h y l p o l y s i l o x a n e 。 载气：氦气( 纯度 9 9 9 9 9 ) ，载气流量：1 0 m l m i n 。 进样口温度：3 0 0 。c ，检测器温度：3 2 0 。c ，电子能量：7 0 e v ，电子倍增电压： 1 9 7 6 v ，进样量：1 u l ，不分流进样。 程序升温条件：初温为5 0 。c ( 恒温l m i n ) ，以1 5 。c m i n 升温速率升至1 7 0 。c ( 恒温2 m i n ) ，再以3 。c r a i n 升温速率升至3 0 0 。c ( 恒温9 m i n ) 。 2 5 酵母菌的培养方法 1 配制培养基 k h 2 p 0 4 0 1 m g s 0 4 0 0 5 州h 0 2 s 0 4 0 0 5 葡萄糖 2 酵母粉o 0 5 用去离子水按照以上比例配制培养基，用氢氧化钾溶液调节p h 值，使 p h = 6 0 。将配制好的培养基分装在1 3 个3 0 0 m l 的三角瓶中，瓶口用封口膜封好， 放在蒸汽消毒器中灭菌( 1 1 5 c ，3 0 m i n ) 。 2 酵母菌的接种与培养 在洁净工作台中将1 3 株酵母菌分别接种到已灭菌的培养基中，用封口膜把瓶 口封好放在空气浴振荡器中培养4 8 小时( 温度2 8 c ，转速1 5 0 转分) 。培养结 束后将其混合均匀，放在离心机中离心1 0 分钟( 4 0 0 0 转，分) 待用。 东北大学硕：t 学位论文第二辛实验部分 2 6 生物反应器处理石油污染土壤方法 1 添料投加方法 首先称量生物反应器( 3 0 0 m l 烧杯) 净重，然后投加反应物共1 0 0 0 克，使 其含水率为5 0 ，古油量、含菌量均为1 0 0 ，营养盐配比为c ：n ：p = 1 0 0 ：5 ：1 ，酵 母粉含量0 1 0 。 2 运行条件 湿度控制在2 8 c ，搅拌器转速控制在2 0 0 转分。每天称量生物反应器的重 量两次，控制含水率，并将粘在烧杯壁上的样品刮下去，保证其与酵母菌和水的 充分接触。 东北大学硕十学位论文 第三章g c - m s 法测定多环芳烃 第三章g c m s 法测定多环芳烃 一个混合物能否为色谱柱所分离，取决于固定相与混合物中各组分分子间的 相互作用的大小是否有区别。但在色谱分离过程中各种操作因素的选择是否合适， 对于实现分离的可能性也有很大影响。因此一定要创造适宜的条件，使分离达到 分析和检测的最佳效果。 本论文预分析的多环芳烃有1 6 种，其中有1 5 种是e p a 优选污染物。它们的 结构式见附表。 3 1 色谱条件的选择 本论文研究的是石油样品，其组分极其复杂，难以分析。因此选择合适的色 谱柱尤为重要，它是影响分离的主要因素。本实验采用的是弱极性毛细管色谱柱： 6 0 m x0 2 5 r a m ，内涂0 2 5 1 t i n 厚的5 的p h e n y l - m e t h y l p o l y s i l o x a n e ，相对于填充 柱来讲，它能达到更好的分离效果，且具有分析快速的特点，是目前国际上普遍 使用的色谱柱。 此外，柱温和载气流量也是影响分离的主要因素。通过实验发现，改变载气 流量对分离效果影响不大，因此本实验主要探讨了柱温对分离的影响。 3 1 1 柱温的影响 柱温是一个重要的操作变数，直接影响分离效果和分析速率。提高柱温使各 组分的挥发性靠拢，不利于分离，所以从分离的角度考虑，宜采用较低的柱温。 但柱温太低，被测组分在两相中的扩散速率大为减少，分配不能迅速达到平衡， 峰形变宽，柱效下降，并延长了分柝时问。选择的原则是：在使最难分离的组分 能尽可能好的分离的前提下，尽可能采取较低的柱温，但以保留时间适宜，峰形 不脱尾为度。 在分离沸点范围比较宽的样品时，为了使被测组分都能得到较好的分离，宜 采用程序升温，即柱温按预定的加热速率，随时间作线性或非线性的增加。在较 低的初始温度，沸点较低的组分，即最早流出的峰可以得到良好的分离。随柱温 增加，较高沸点的组分也能较快地流出，并和低沸点组分一样也能得至分离良好 的尖峰。 1 9 东北大学 匣士学位论文 第三章g c - m s 法测定多环芳烃 首先是对初始温度的选择，当初始柱温从5 0 。c 升高到1 0 0 。c 时，发现随着初 始温度的升高，第一个组分的峰形逐渐变宽，拖尾逐渐加重，且响应值明显变低， 因此选择仪器允许的最低初始温度5 0 。 首先运行升温程序l 【5 1 1 1 5 2 l ：初温为5 0 。c ，( 恒温l m i n ) ，以3 0 m i n 升温速率 升至1 7 0 。c ( 恒温2 m i n ) ，再以8 c m i n 升温速率升至3 0 0 ( 恒温l g m i n ) ，得到 总离予流图( t i c ) ，见图3 1 ： 时闻衄m 圈3 1 升温程序1 的总离子流图 f i g 3 1 t i co f t e m p c m t t a - el h o g r a ml 由图3 1 可以发现组分3 和组分4 分离得不太好，分析可能是升温速率过快， 使这两个峰不能得到很好的分离。因此将1 7 0 ( 2 以前的升温速率减慢，从3 0 * c m i n 降低到1 5 * c m i n ，其它保持不变。 降低升温速率后组分3 和组分4 的分离得到了一定程度的改善，但还是不能 彻底分离。因此，继续减慢1 7 0 1 2 以前的升温速率，从1 5 c r a i n 降低到1 0 1 2 m i n 。 将两张t i c 拟合在一起，得到图3 2 ： 时问“i n 图3 21 0 c r a i na n d1 5 c r a i n 升温速率对比图 f i g 3 2 c o m p a r i s o n o f t e m p e r a t u r e i n c r e a s i n g r a t e1 0 * c m i na n d1 5 m i n 东北太学硕士学位论文第三章g c - m s 法测定多环芳烃 结果显示，组分3 和组分4 的分离情况没有显著改变。因此将升温速率继续 减慢至5 。c m i