（应用化学专业论文）有机小分子与蛋白质的相互作用及其能量转移的分析应用.pdf

济南大学硕十学f 寸论文 摘要 研究药物与生物大分子的相互作用对寻找药物的靶分子、新型药物设计、药 物的药理和毒理的研究等方面都有重要的参考价值。 本文以分子光谱为研究手段，对药物与生物大分子的相互作用、新型若丹宁 衍生物与生物大分子的相互作用以及食品中抗生素的检测进行研究，并在研究中 发现了一对荧光给体和荧光受体组成的新的荧光探针，结合能量转移技术实现对 食品中抗生素的高灵敏的监测；利用量子化学手段模拟蛋白质的主要荧光基团色 氨酸与若丹宁衍生物的相互作用，发现理论计算与实验结果基本吻合。 本文内容主要分为以下几部分： 1 本文利用量子化学限制的h a t r e e f o r c k ( r h f ) 从头算方法，使用g a u s s i a n 9 8 程序，以3 2 1 g 幸基组，对实验室合成的五种新型若丹宁衍生物进行构型优化，通 过对其前线轨道能和总能量的分析，预测这五种若丹宁衍生物的荧光性能；采用 了h y p e r c h e m7 0 模拟在2 9 8k 和3 0 8k 两个温度下蛋白质的主要荧光基团色氨 酸与五种若丹宁衍生物的相互作用情况，并对五种若丹宁衍生物的水溶性进行模 拟实验。 2 利用分子光谱( 荧光、紫外可见光谱) 研究药物与蛋白质的相互作用。以牛 血清白蛋白为研究主体，以养殖业上常用的抗生素氟苯尼考( f f ) 、四环素( t c ) 、 氯霉素( c a p ) 、阿莫西林( a x ) 为研究客体，利用荧光猝灭理论和非辐射能量转 移理论，研究药物对牛血清白蛋白的猝灭机理，求出两者的结合常数、结合数及 结合距离；利用热力学方程，讨论二者的作用力类型；同时利用已知结合位置的 标记药物为探针，确定药物分子在牛血清白蛋白上的结合位置。 3 采用分子光谱较系统地研究3 种含磺酸基的若丹宁系列衍生物和3 种含甲 氧基的若丹宁系列衍生物分别与牛血清白蛋白之间的相互作用和能量转移机制， 包括猝灭常数、结合常数和结合数、热力学参数、结合距离等。 4 基于第二部分抗生素与蛋白质的相互作用及第三部分若丹宁衍生物与蛋白 质之间有效的能量转移，建立能量转移荧光猝灭测定养殖业上四种常用的抗生素一 氟苯尼考、四环素、氯霉素、阿莫西林的新方法。该方法简便、快速，具有较 高的灵敏度和较好的选择性。 i 有机小分f0 蛋n 质的相瓦作用及其能爷转移的分析应用 关键词：若丹宁；能量转移；牛血清白蛋白；抗生素；相互作用 i l 济南大学顶十学俺论文 a b s t r a c t t h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nd r u g sa n db i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e sh a si m p o r t a n t r e f e r e n c ev a l u e ，i ti su s e f u lt os e a r c ht a r g e td r u g s ，d e s i g nn e wd r u g ，r e s e a r c hd r u g p h a r m a c o l o g ya n dt o x i c o l o g y i nt h i sp a p e r ，i n t e r a c t i o nb e t w e e nd r u g sa n db i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e s ，i n t e r a c t i o n a m o n gn e wt y p e so fr h o d a n i n ed e r i v a t i v e sa n db i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e sw e r es t y d i e d d e t e c t i o n so fa n t i b i o t i c si nf o o dw e r er e s e a r c h e db ym e a n so fm o l e c u l a rs p e c t r o s c o p y ap a i ro fn e wf l u o r e s c e n tp r o b ec o m p o s e do ff l u o r e s c e n td o n o ra n df l u o r e s c e n t a c c e p t o rw a sf o u n d t h en e wd e t e r m i n a t i o nm e t h o d so fa n t i b i o t i c s i nf o o da r e e s t a b l i s h e db a s e do ne n e r g yt r a n s f e rt e c h n o l o g y b ym e a n so fq u a n t u mc h e m i s t r y ，t h e i n t e r a c t i o nb e t w e e nt h em a i ng r o u po fb o v i n es e r u ma l b u m i n - t r y p t o p h a na n dr h o d a n i n e w a ss i m u l a t e d ，t h er e s u l t so ft h e o r e t i c a lc a l c u l a t i o n sa n de x p e r i m e n t a lr e s u l t sw e r e f o u n dt ob ec o n s i s t e n t t h ep a p e rc o n s i s t so ft h ef o l l o w i n gp a r t s ： ( 1 ) t h ec o n s t r u c t i n gp a r a m e t e ro ff i v en e wt y p e so fr h o d a n i n ed e r i v a t i v e sw e r e o p t i m i z e db yt h eh a t r e e f o r c k ( r h f ) o fg a s s i a n 一9 8 ，w h i c hw a sl i m i t e db yq u a n t u m c h e m i s t r yb a s e do n3 - 21g 宰a n de n e r g y ，d i s t r i b u t i o no fc h a r g ew e r ec a l c u l a t e d t h e f r o n tl i n eo fm o l e c u l eo r b i t se n e r g yo fo p t i m i z e dc o n s t r u c t i o nw e r ea l s oc a l c u l a t e d t h e f l u o r e s c e n c ep r o p e r t i e so ft h e s ef i v er e a g e n t sw e r ef o r e c a s t e db ya n a l y z i n gt h e i rf r o n t l i n eo fm o l e c u l eo r b i t se n e r g ya n dt o t a le n e r g y i n t e r a c t i o nb e t w e e nt h em a i ng r o u po f b o v i n es e r u ma l b u m i n t r y p t o p h a na n dr h o d a n i n ea tt e m p e r a t u r eo f2 9 8ka n d3 0 8k w e r es i m u l a t e db ym e a n so fh y p e r c h e m7 0 ，w a t e r - s o l u b l ee x p e r i m e n to ff i v e r h o d a n i n e sw e r ec a r r i e do u t ( 2 ) t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nd r u g sa n dp r o t e i n sw a ss t u d i e db ym o l e c u l a r s p e c t r o s c o p y ( f l u o r e s c e n c e u v - v i s i b l es p e c t r u m ) t h em e c h a n i s mo fi n t e r a c t i o n b e t w e e nb o v i n es e r u ma l b u m i na n df l o r f e n i c o l ( f f ) ，t e t r a c y c l i n e ( t c ) ，c hl o r a m p h e n i c o l ( c a p ) ，a m o x i c i l l i n ( a x ) u s e di na q u a c u l t u r ew a ss t u d i e db yf l u o r i m e t r i cm e t h o d t h e b i n d i n gr a t i o ，a n dt h eb i n d i n gc o n s t a n t su n d e rd i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s ，t h ed i s t a n c e m b e t w e e nt h eb i n d i n gl o c a t i o na n dt r y p t o p h a nr e s i d u ew e r es t u d i e d f u r t h e r m o r e ，t h e t h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r sw e r em e a s u r e d t h eb i n d i n gl o c a t i o no fa n t i b i o t i c si nb s a w a ss t u d i e d ( 3 ) t h ei n t e r a c t i o na n de n e r g yt r a n s f e rm e c h a n i s mb e t w e e nr h o d a n i n ed e r i v a t i v e s w i t hb o v i n es e r u ma l b u m i nw e r e s t u d i e d ，i n c l u d i n gq u e n c h i n gc o n s t a n t ，b i n d i n g c o n s t a n t s ，b i n d i n gr a t i o ，t h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r sa n dt h eb i n d i n gd i s t a n c e ( 4 ) t h ed e t e r m i n a t i o nm e t h o d so ff l o r f e n i c o l ，t e t r a c y c l i n e ，c h l o r a m p h e n i c o la n d a m o x i c i l l i nu s e di na q u a c u l t u r ew e r ee s t a b l i s h e d ，b a s e do nt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e n a n t i b i o t i c sa n dp r o t e i ni nt h es e c o n dp a r ta n dt h ee f f e c t i v ee n e r g yt r a n s f e rb e t w e e n r h o d a n i n ed e r i v a t i o na n da n t i b i o t i c si nt h et h i r dp a r t t h em e t h o di ss i m p l e ，r a p i d ，a n d s h o w e dh i g hs e n s i t i v i t ya n dg o o ds e l e c t i v i t y k e y w o r d s ：r h o d a n i n e ；e n e r g yt r a n s f e r ；b o v i n es e r u ma l b u m i n ；a n t i b i o t i c s ；i n t e r a c t i o n i v 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的 研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人 完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：艇 e l 期：2 1 1 塑! 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解济南大学有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借鉴；本人授权济南大学可以将学位论文 的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：觚 导师签名： 济南大学硕f j 学位论文 第一章前言 1 1 小分子与蛋白质的相互作用研究 2 l 世纪是生命科学飞速发展的时代，生物大分子负责生命体的生命活动，生 物大分子之间以及小分子与生物大分子的相互作用构成了生命活动的基础。蛋白 质是生物体的结构和功能物质，是生物最重要的基本组成成分之一，生命的起源 和生物的进化都与蛋白质的发展密不可分。蛋白质与生物体的营养、免疫、新陈 代谢、生命的起源和进化等都息息相关。近年来兴起的蛋白质组学揭示了蛋白质 的结构和功能，这对阐明生命在不同状态下的活动规律及发展变化机制，为重大 疾病的预防提供了依据。蛋白质组学的研究主要促进了分子医学的发展，如寻找 药物的靶分子，研究药物的作用机理等，因此以蛋白质为作用靶，研究小分子与 蛋白质的相互作用日益受到重视，这对阐明药物在人体内的运输及药理作用，提 高药物发现的成功率都具有重要意义。 1 1 1 蛋白质的结构与光谱性质 生命活动涉及到许许多多种物质的参与、相互作用和转化，其中最重要、最 基本的物质当属核酸与蛋白质等生物大分子【l 】。蛋白质在体内不仅含量大，而且种 类繁多，生物体就是靠种类繁多的蛋白质来完成其生物功能的。血清白蛋白( s a ) 是血浆中含量最丰富的蛋白质，容易较大量、高纯度地制备，为研究蛋白质的理 化性质、生物学功能、体内代谢、临床应用及遗传变异等方面提供了极好的蛋白 质样品。 1 1 1 1 血清白蛋白的结构 蛋白质分子有不同的结构层次：一级结构，二级结构，超二级结构，结构域， 三级结构，四级结构。 蛋白质的一级结构是指肽链中的氨基酸序列。一级结构决定高级结构，决定 蛋白质的生物学功能。到7 0 年代末人们才对牛血清白蛋白( b s a ) 、人血清白蛋白 ( h s a ) 、鼠血清白蛋白( r s a ) 的氨基酸序列基本弄清楚。 b s a 是由5 8 2 个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质。其氨基酸序列与h s a 非常 类似。b s a 肽链也含有3 5 个半胱氨基酸残基，仅3 4 位上有一个硫基，其余都为 l 二硫键，二硫键中有8 对组成交叉二硫键，只有接近n 端的是一个单个二硫键。 b s a 在1 3 4 及2 1 2 位上都含有一个色氨酸残基( t r p ) 。 蛋白质二级结构是指多肽链骨架中靠氢键维持的局部的有规则的构象，如瑾 螺旋、3 1 0 - 螺旋、兀螺旋、p 折叠、p 转角以及三股螺旋等，还包括无规则卷曲以 及非氢键维系的规则结构和侧链的构象。血清白蛋白氨基酸残基中约4 8 t 4 y u 为 a 螺旋，1 5 为p 折叠，其余卷曲回折成球状分子。 b s a 的三维晶体结构有三个类似的结构域【l 】：i ，i i ，i i i 。每个结构域又含有 两个亚结构域：a b 和c ，以槽口相对的方式形成圆筒状结构，每个亚结构域又分 为三个螺旋( x 、y 、z ) ，几乎所有疏水性氨基酸都包埋圆筒腔内部，构成疏水性腔。 每个结构域本身都是紧密装配的，但结构域之间的关系相当松懈，形成裂缝。 蛋白质的三级结构是指多肽链借助各种次级键在三维空间中沿多个方向进行 卷曲、折叠，盘绕成紧密的近似球状结构的构象，是在二级结构基础上的肽链再 折叠。 蛋白质的四级结构是指寡聚蛋白中亚基的种类、数目、空间排布以及亚基间 的相互作用。 1 1 1 2 血清白蛋白的光谱性质 ( 1 ) 紫外光谱 血清白蛋白能够吸收紫外光。由于色氨酸t r p 、酪氨酸t y r 残基对光的吸收， 大多数蛋白质在2 8 0n m 附近有一个吸收峰。苯丙氨酸p h e 残基的吸收峰在2 5 7n m 附近。肽键在2 2 5n m 附近有一较强的吸收峰。在2 8 0n m 处，血清白蛋白溶液的 光吸收与其含量成正比，可用作定量分析【2 】o ( 2 ) 荧光光谱 血清白蛋白分子中的色氨酸t r p 、酪氨酸t y r 和苯丙氨酸p h e 残基能吸收紫外 光，并且能发射荧光，所以血清白蛋白具有天然荧光【3 1 。由于t r p 、t y r 和p h e 的 r 基团不同，三者的荧光光谱也不同。其荧光峰位分别是3 4 8n m 、3 0 3n m 和2 8 2n m 。 t r p 的荧光强度最大，p h e 的荧光强度很小。血清白蛋白的内源荧光主要是t r p 和 t y r 残基所发射的。 荧光光谱法可以研究血清白蛋白分子的构象变化，研究t r p 或t y r 残基的微环 境以及研究血清白蛋白的变性等f 4 1 。现在，常用荧光探针技术( 外源荧光法) 来测定 2 济南大学硕士学f 节论文 血清白蛋白的含量或进行构象等方面的研究，这种技术比利片j 蛋白质的内源荧光 有更高的灵敏度。 ( 3 ) 圆二色谱法 血清白蛋白的圆二色谱分为远紫外区( 1 8 5 2 4 5r i m ) 和近紫外区( 2 4 5 - 3 2 0n m ) 。 远紫外区是肽键的吸收峰范围，反映了主链构象。在远紫外区，一般天然蛋白质 的c d 光谱包含一个正峰( 19 0n m 左右) 和一个负槽( 2 0 5 2 3 5n m ) 。其中，负槽的形 状与主链形状密切相关。般的说，铲螺旋给出2 0 9n m 和2 2 2n m 左右的两个负 槽，称为双槽曲线；时吁叠给出2 1 5n m 的负槽。研究血清白蛋白的主链构象用远 紫外c d 谢5 1 。由远紫外c d 谱可以推算出血清白蛋白分子中铲螺旋、p 折叠以及 无规则卷曲的含量。近紫外区主要与侧链生色基团有关。二硫键在2 5 0 2 6 0n m 有 一个峰：t r p 、t y p 和p h e 三个侧链的峰在2 3 0 - 3 1 0n m 之间。 ( 4 ) 激光拉曼光谱 激光拉曼光谱能够显示血清白蛋白分子中肽键的特征性振动谱带、主链骨架 的振动谱带以及侧链的振动谱带。许多谱带相互重叠，给谱带的解析带来困难。 其中能够解释比较清楚的，要算是肽键的特征性振动谱带。由于肽键( 酰胺键) 的环 境是血清白蛋白主链构象的主要反映，因此，可以利用肽键的特征性振动谱带作 为指标，来推断血清白蛋白主链构象【6 】。用激光拉曼光谱法，已经能够对血清白蛋 白分子中的三种二级结构( 铲螺旋、p 折叠以及无规则卷曲) 作出确切的分析。但是， 要对血清白蛋白的所有谱带都做出解释，还需深入研究。 在上述几种光谱方法中，荧光光谱法有着广泛的应用。荧光发射峰位置、荧 光偏振、能量转移、荧光寿命等指标可以对荧光生色团的结构及其所处的微环境 提供有用的信息。蛋白质内源荧光可用于定量分析或结构研究。利用荧光探针技 术不仅可以提高荧光测定的灵敏度，而且可以获得更丰富的结构和反应机理方面 的信息，据此可以判断它们之间相互作用力的类型、强弱、结合数、结合常数、 结合区域、给体和受体间的距离等信息。 1 1 2 小分子与蛋白质相互作用的主要研究方法 药物小分子与作为靶分子的生物大分子发生作用后，可以引起生物体内一系 列的物理和化学变化，从而能够使药物完成在体内的转运、吸收和分布，产生作 用。通过对小分子与蛋白质的作用状态以及相互作用后导致的后果可以设计出选 3 择性高，作用强，毒副作用小的靶向药物【7 引。 因此通过对生物大分子与小分子相互作用的研究对于指导药物设计与合成， 深入了解生物大分子的结构和功能，探索超分子体系的化学本质具有重要的意义。 目前对小分子与生物大分子的相互作用研究仍是国内外的热点课题，所采用的研 究手段也越来越多，并且通过各种方法的优势互补，研究也呈现出全方位、立体 性的发展趋势，进一步提供了更为丰富的研究数据和有价值的科研成果。目前所 采用的研究手段主要有光谱法0 1 、质谱法【l l 12 1 、核磁共捌1 3 ，14 1 、光散射技术【1 5 1 6 】 等，另外光学椭偏成像技术【1 7 ，1 8 1 、压电传感器【1 9 ，2 0 】以及生物芯片等新技术也被引 入到生物大分子的研究之中，进一步加深了对机理的研究。 近十几年，光谱法被广泛应用于蛋白质与药物的结合研究，掀起了小分子与 生物大分子研究的一个高潮。光谱法主要包括荧光分光光度法、紫外可见分光光 度法、红外光谱法、圆二色谱法、拉曼光谱法等。其中荧光光谱法凭借其简便、 快速、仪器价廉、灵敏度高以及能够提供丰富的研究信息等优点，引起越来越多 的重视与广泛应用。 1 2 养殖业常用抗生素检测方法 1 2 1 氯霉素类抗生素测定研究进展 氯霉素类抗生素( c h l o r a m p h e n i c o l s ，简称c a p s ) 包括氯霉素及其衍生物，是一 类广谱抗生素，能抑制细菌蛋白质的合成，对革兰氏阴性菌的抑制作用较强，对 各种立克氏体、原虫及部分病毒也有一定的抑制作用，因此常用于动物各种传染 性疾病的治疗，曾在动物性食品中得到广泛应用，同时也带来了动物性食品中氯 霉素残留的严重问题。氯霉素类抗生素主要有氯霉素( c h l o r a m p h e n i c 0 1 ) 、琥珀氯霉 素( c h l o r a m p h e n i c a ls u c c i n a t e ) 、棕榈氯霉素( c h l o r a m p h e n i c o lp a l m i t a t e ) 、甲砜霉 素( t h i a m p h n i c o l ，t a p ) 、氟苯尼考( f l o r f e n i c o l ，f f ) 和乙酰氯霉素( c e t a f e n i c 0 1 ) 。 氯霉素存在严重的毒副作用，能抑制人体骨髓造血功能，引起人类的再生障 碍性贫血、粒状白细胞缺乏症、新生儿、早产儿灰色综合症等疾病，低浓度的药 物残留还会诱发致病菌的耐药性，因此动物食品中的氯霉素残留对人类的健康构 成了巨大威胁【2 i t2 2 1 。许多国家严格禁止将氯霉素用于食品动物( 特别是蛋鸡和奶 牛) 。美国已严格规定不允许在家禽饲养中使用氯霉素，出售的家禽必须作氯霉素 4 济南大学硕+ 学f 矗论文 残留的检测，同样欧共体也严格规定肉中的氯霉素残留量不过o 1n g g 。我国农 业部已禁止在食品源性动物中使用氯霉素【2 3 】。无论是内销还是出口的水产品、畜 禽产品氯霉素都是必检项目。氟苯尼考也称氟甲砜霉素，是一种兽医专用氯霉素 类广谱抗生素，19 8 0 年在美国获得专利，上世纪九十年代初上市。上市十五年来， 氟苯尼考广泛用于治疗猪、牛、禽及水产养殖动物的细菌性疾病【2 4 1 。氟苯尼考属 兽用新药，不作为人类用药，已知的副作用主要为对动物具有胚胎毒性。所以动 物性食品中氯霉素类抗生素的残留量分析，近年来得到国内外食品分析工作者的 关注，并致力于检测氯霉素残留的快速、准确、灵敏度高的方法。 氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考都有很强的紫外吸收，因此可直接用高效液相 色谱紫外法测定。大多数方法中都有用c 1 8 柱，但也可用c 8 分析柱【2 5 i 。德国 r u s s e i l 2 6 】首先报道了液相色谱法检测氯霉素残留。用乙腈和硫酸钠提取肌肉组织中 的氯霉素，用正己烷去除脂类物质，乙腈相浓缩后进行液相色谱分析。检测限为l 腭k g 一，回收率为9 8 。色谱条件：n u c l e o s i l1 0 - n 0 2 色谱柱，紫外检测器2 5 4n m ， 流动相为二异丙醚甲醇( 8 5 ：1 5 ，v ：v ) 。彭莉，岳秀英【2 刀报道了用高效液相色谱法 ( h p l c ) 检测牛奶中氯霉素的残留量，采用乙酸乙酯提取牛奶中残留的氯霉素，用 正烷氯仿溶解残渣，以乙腈磷酸氢二钠作为流动相，用高效液相色谱仪紫外检测 器在2 7 8n m 检测。平均回收率9 4 8 ，变异系数 0 9 9 ) ，以测量的3 倍标准偏差计算方法的检出限分别为0 0 4 1 峙g - 1 。杨挺f 5 l 】 等建立了一种高效液相色谱法测定水产品中土霉素、四环素、去甲基金霉素、金 霉素、脱氧土霉素的分析方法。样品用5 0 高氯酸溶液提取，上清液用o a s i s h l b 固相萃取柱净化，用紫外检测器于3 5 5r i m 测定。土霉素、四环素、去甲基金霉素 检测限为o o lm g k g - 1 ，金霉素、脱氧土霉素检出限为0 0 2m g k g 1 。5 种药物的回 收率在7 4 8 8 9 3 之间，相对标准偏差为3 9 5 9 9 5 。吕海涛【5 2 】等利用高效 液相色谱，发展了一种快速、灵敏、同时测定土霉素、强力霉素、四环素和金霉 素的方法。在反相c 1 8 柱上进行梯度洗脱分离，流动相由甲醇和乙酸钠缓冲溶液 组成( 内含e d t a 氯化钙，p h8 10 ) ，紫外检测波长为3 8 6n m 。四环素类药物的质 量浓度在8 - 4 0 0 0 烬l 一范内呈线性关系，回收率为9 5 1 0 2 ，相对标准偏差为 1 2 一3 6 ，检出限分别为6 、1 3 、6 和7p g l 。 1 2 2 3 化学发光法 在碱性介质中，钴( i i ) h 2 0 2 体系能催化氧化四环素，四环素在1 1 0 0p m o l l 。1 范围遵循比尔定律，体系的灵敏度高，若以氨水作介质，则铜( i i ) h 2 0 2 。过硫酸盐 体系也能与四环素产生化学发光现象5 3 1 ，也可在碱性介质中降解，然后在铜氨络 离子催化下用h 2 0 2 氧化，并用增效剂溴化十六烷基三甲基铵( c t m a b ) 增强化学发 光信号【5 4 1 ，四环素的线性范围为2 x 1 0 7 8 x l o m o l l 一，将流通电解池里的溴化钾 氧化为溴单质并在铂电极上析出后，与h 2 0 2 发生微弱的化学发光反应，当加入四 环素类物质时，发光信号大大增强且与其含量成正比，线性范围：四环素， 3 0 x 1 0 - s - 5 0 x 1 0 5 9 m l 一，土霉素，2 0 x 1 0 - 7 - 2 4 x 1 0 5 9 - m l ，金霉素，1 0 x 1 0 - 7 - 5 0 x 1 0 5 g - m l 。 8 济南大学硕士学位论文 1 2 3p 内酰胺类抗生素测定研究进展 p 内酰胺类抗生素是含有p 内酰胺环的一大类抗生素，以青霉素类、头孢菌素 类为典型代表，此外还包括非典型p 内酰胺类抗生素如青霉烯类、碳青霉烯类、 氧青霉烯类及单环p 一内酰胺类等。 p 内酰胺类抗生素的作用机制是抑制细胞壁的合成，实践证明它是一类抗菌谱 广、抗菌活性强、疗效高、毒性低的抗生素，由于该类抗生素与其它抗生素相比 毒性小一些，已成为临床上应用量最大，范围最广的抗生素，在抗感染药中占据 主要地位。自1 9 2 9 年发现青霉素以来，已有1 0 0 余种d 内酰胺类抗生素上市，为 人类战胜各种细菌感染性疾病作出了极大的贡献。 目前用于p 内酰胺类抗生素的测定方法主要有： 1 2 3 1 分光光度法 分光光度法以方法简单、仪器低廉、分析精度高、重现性好、线性范围宽等 优点，广泛应用于3 - 内酰胺类抗生素的分析检测。如赵丽瑞【5 5 】利用铜与阿莫西林 形成络合物而采用分光光度法测定了阿莫西林，段亚丽【矧等采用萃取分光光度法 测定了药物制剂及尿样中阿莫西林的含量。但是该方法检测限低，灵敏度和选择 性不高，不能满足更低检测范围内药物的控制与分析测定。 1 2 3 2 化学发光法 化学发光分析法使用仪器设备简单，可测线性范围宽，用于p 内酰胺类药物 的测定具有灵敏度高，分析速度快，易实现自动化等优点【5 7 1 ，优于紫外可见分光 光度法等一般的分析测定技术。但是化学发光分析法往往选择性较差，这限制了 该方法的广泛应用。阿莫西林在硫酸溶液中的降解产物会与c e ( i v ) 反应产生化学 发光，但强度不高，此时加入增敏剂罗丹明6 g ，化学发光信号增强，结合流动注 射技术，阿莫西林在o o l - 2 0 0 鹏m l 。1 范围内与发光信号成正比，其检出限为8 n g m l - 1o 头孢氨苄在增效剂罗丹明6 g 存在情况下，与c e ( ) 反应产生化学发光【5 8 1 ， 其检出限为6 0 x l o g - m l 。在酸性介质中，十二烷基苯磺酸钠与高锰酸钾和头孢 哌酮钠形成了三元的化学发光体系，并在o o l x l o 6 - 1 5 x 1 0 击g - m l 。范围遵循比尔定 律，用于尿样测定检出限为3 9 x 1 0 。9g - m l 一。 9 1 2 3 3 毛细管电泳法 毛细管电泳分析( c e ) 技术是最近十几年来发展最为迅速的现代分析技术。 它具有高灵敏度，紫外检测器的检测限可达1 0 - 1 3 1 0 。1 5m o l ，而激光诱导荧光检测 器可达1 0 - 1 9 _ 1 0 。2 1t o o l ；检测速度快，一般分析不会超过3 0m i n ，有的甚至几分钟； 样品少，只需n l ( 1 0 。9l ) 级的进样量；成本低，只需少量流动相和价格低廉的毛细 管；模式多等优点。f l u t e r 【6 0 1 等采用c z e 模式分离了猪血样品中的阿莫西林，先用 c 1 8 柱固体萃取进行了预处理，缓冲体系采用2 0m m o l l 。1p h 为9 0 的四硼酸钠进 行分析。p k o w a l s k i 【6 1 1 等采用c z e 模式直接检测血清中的哌拉西林，回收率达到1 0 0 。 1 2 3 4 荧光分析法 荧光分析法用于测定具有荧光基团的物质，适用范围较窄，但具有灵敏度高、 专属性强的特点。h e f n a w ym 【6 2 1 等利用荧光胺与药物反应对头孢克洛、头孢羟氨苄、 头孢氨苄和头孢拉定进行了分析测定。杨梅【6 3 】等先后研究了头孢拉定水溶液的 荧光光谱，发现在不同酸、碱降解的情况下头孢拉定仍然具有较强的荧光性质， 由此建立了酸、碱降解荧光分析法，最大激发波长3 4 5n m ，最大发射波长4 2 2n m 。 该法有助于头孢拉定的临床药理研究。酸降解荧光分析已应用于血清和尿样中头 孢拉定的测定。 1 2 3 5 基于微生物的检测方法 其测定原理基于抗生素对微生物的生理机能、代谢的抑制作检测用，因而与 临床应用的要求一致，但其测定时间长且结果误差较大【6 4 1 。如t t c 法、戴尔沃检 钡1 ( d e l v o t e s ts p ) 法、b y 法等。 1 3 荧光能量转移的研究进展 在分子发光光谱研究中，常规的荧光分析法只利用了荧光激发和发射这一信 息；现代荧光分析则利用现代科学的最新成就，深入发掘了分子发光光谱的各种 特征信息，并利用这些信息和参数，建立起三维荧光、同步荧光、荧光偏振、时 间分辨荧光、相分辨荧光、荧光探针、荧光免疫、荧光传感器和荧光能量转移等 新技术和方法。在灵敏度和选择性方面都有很大的突破，成为现代分析化学重要 l o 济南大学硕十学位论文 发展方向之一。 荧光共振能量转移f f r e t ) 分析法由于其仪器简单、灵敏度高、所需样品量少、 分析速度快等优点，与色谱分离手段相结合，它已成为一种有效的痕量及超痕量分 析技术。所谓f r e t 是指电子激发能在适当的能量给予体( d ) 和能量接受体( a ) 对之 间的传递，传递距离最大可达7 1 0a m 。1 9 4 8 年，f 6 s t e d 6 5 1 对于这种实验现象提出了 偶极偶极相互作用发生能量转移理论。1 9 6 7 年，s t r y e r & h a u g l a n d l 6 6 1 提出能量转移 可以作为光学尺，用来测量1 0 - 6 0a m 之间的距离。f r e t 因其对距离的敏感性， 广泛地被用于生物大分子结构、性质、反应机理以及定量分析等方面的研究。因此， 能量转移荧光分析非常适合于对环境、生物医学科学和临床化学等方面复杂、低含 量组分的分析，也是基因工程中的一种新手段。 以下主要从能量转移的理论及应用两个方面进行了总结，最后展望能量转移 技术在今后的发展前景。 1 3 1f 6 s t e r 能量转移理论 荧光共振能量转移是能量给体分子( d o n o o 和受体分子( a c c e p t o r ) 偶极- 偶极相 互作用的结果。给予体分子被激发后，当接受体分子与给予体分子相距一定距离( 一 般为2 - 5n m ) ，且给予体和接受体的基态及第一电子激发态的振动能级间的能量差 相互适应时，或者说d 的发射光谱与a 的吸收光谱能有效重叠，处于激发态的给 予体将把一部分或全部能量转移给接受体，使接受体被激发，整个能量转换过程 中，不涉及光子的发射和重新吸收。如果接受体的量子产率为零，则发生能量转 移荧光熄灭；如果接受体也是一种荧光发射体，则呈现出接受体的荧光，并造成 次级荧光光谱的红移m 。能量转移效率由下式决定： p 6 e ：兰 臂+ ，。 其中，是给体d 与受体a 之间的距离；硒：e 为5 0 时d a 之间的距离。 凰与光谱重叠因子、d 与a 之间介质的折射指数、偶极一偶极相互的定向因子及d 的荧光量子产率等有关。所以，能量转移效率既与染料本身的性质有关，又与染 料间的距离有关。当染料混合体系确定后，凰为定值，染料间的距离越小，转移 效率越高。根据这一理论，通过实验测得e ，就可求出，获得关于分子结构的信 息1 6 8 6 9 1 。 有机小分子t j 蛋r i 赝的丰【l j f 作川及其能量转移的分析应用 1 3 2 荧光能量转移技术在生物方面的应用 1 3 2 1 研究蛋白的结构和溶液中蛋白蛋白的相互作用 f r e t 其最为经典和广泛的应用之一就是测量蛋白结构中两个位点的位置和 在液体中它们的聚集及其拓扑结构，f r e t 作为“光谱尺”的用途已经在这方面 得到广泛的应用。蛋白质包含有内源性荧光团( 例如色氨酸和酪氨酸) ，并且它们可 以与外来的荧光团发生共价性结合( 常具有专一性) 。在蛋白质活性部位微环境的研 究中，f r e t 技术可以轻松地分析生物大分子三维结构及特定位点间的距离。f r e t 也常用于确定蛋白质分子内部特定位点之间的距离，或是直接用来测量分子的大 小。采用稀土荧光探针后由于它的长激发寿命易于与生物的背景荧光区分开来， 以稀土螯合物标记蛋白质成为研究蛋白质构象的一种新途径。王守业等人提出以 铽( i i i ) 及铕( 1 1 1 ) 作为能量受体标记蛋白，由于能量的转移而使蛋白的内源荧光得到 猝灭，当底物与蛋白质结合只改变蛋白质的构象却不影响铽( i i i ) 、铕( i i i ) 在蛋白质 中的结合部位时，则可通过对比蛋白质结合前后能量供受体间距离的改变观察其 构象变化【7 0 j 。 1 3 2 2 研究核酸和核酸与蛋白的结合体 核酸之间、核酸与蛋白之间的相互作用，利用结晶学和核磁共振技术对转录 复合体结构的研究已取得一定的进展。然而，除f r e t 之外，少有技术能够直接 研究蛋白复合体形成的动力学。f r e t 技术用常规荧光仪就可以灵敏、快速的测定 核酸杂交。核酸杂交技术与f r e t 相结合，可用于突变检测、同源性分析和核酸 定量分析等方面。其中选用芘作为能量供受体经m a s u k o 等人验证，结果严格服从 f 6 r s t e r 方程，很可能得到广泛的开发应用。f r e t 还被运用到核酸结构研究、核酸 调控、核酸降解、寡核苷酸从核糖体上释放的研究等许多方面，通过在核酸的不 同部位标记能量供受体对，能量转移的效率会因核酸结构的改变而改变，从而获 得与分子构象相关的信息。例如a s k o k 等人用s p f r e t 技术检测了d n a 发夹结构 变性的动力学过程【7 。以常规的荧光检测仪就可以测定f r e t 的变化，它已具有 和放射性探针同样的灵敏度，在核酸杂交中可以测定1 0 0g l 体积中1 0 。1 8m o l 数量 级的反应，却避免了操作的繁琐和危险性，应用前景十分广阔。f r e t 具有灵敏度 高、选择性好、方法简便等优点，也可用于核酸的定量分析。d n a 在室温下具有 较弱的内源荧光，不能用荧光法直接对d n a 进行测剧7 2 j 。近来，人们发现许多 1 2 济南大学硕十学f 节论文 有机荧光小分子试剂可做为d n a 测定的荧光探针，定量测定它的原理是d n a 对这些荧光体系荧光强度的影响【7 3 1 。用于d n a 分析测定的荧光分析法便发展起 来，特别是近几年，这一方法发展很快，提出很多新的、成熟的荧光体系用于d n a 的定量分析。 1 3 2 3 免疫分析的应用 荧光能量转移分析最早是由u n m a n 等人提出。常用的实验方法有两种：竞争 法和夹心法。 竞争法中，包括一个以能量给体标记的抗原( a g ) 及受体标记的抗体( a b ) 。二者 特异性的结合使d 、a 基团靠近，从而发生能量转移。溶液中游离分子间距离大 到对这一转移毫无贡献。当标记试剂与一未知样品混合时，引起样品抗原与标记 抗原对有限量标记抗体结合位点的竞争，使得部分标记抗原不能再与标记抗体结 合而发生能量转移，引起给体( 标记抗原) 总荧光强度成比例的增加，即样品浓度与 给体荧光强度成正比【7 4 1 。 夹心法原理类似，只是d 与a 标记于同一抗原的两个不同抗体，通过形成免 疫复合物引起d 、a 靠近而导致d 荧光猝灭。 免疫分析应用的例子很多，u l l m a n 等分别用两种方法以荧光素和四甲基罗 丹明为d 和a ，对咖啡及其抗体间的反应进行了研究。l i m 硎等以f r e t 方法测定 了人血浆中n m o i 级白蛋白，其结果与电免疫分析法所得结果符合良好。 1 3 2 4 荧光能量转移p h 传感器 v i n i t am i s m l 7 7 1 等人将吖啶黄作为能量给予体，罗丹明6 g 作为能量接受体，在 水溶液中将此体系作为p h 传感器，研究证明该体系能够应用于p h 在1 4 1 2 的很 宽范围内，精确度达到o 0 1p h 。还有人将杂氧花青作为给予体，双十八烷基二硫 代氨基甲酸盐作为接受体，固定在单分子层l b 膜上，作为基于荧光能量转移的 金属离子荧光光纤传感器【7 8 】。 1 3 2 5 荧光能量转移显微镜方法 随着数字成像技术的实用性和联用商业化的计算机硬件和软件的发展，人们 对荧光能量转移显微镜方法的关注迅速增加。运用荧光能量转移显微镜方法能够 快速、容易对位于图象中1 0 6 个点的荧光进行同时测量。在过去的几年中，不断 增加的相关文章证明了荧光能量转移显微镜方法在生物工艺方面应用的持续发 展。在一篇关于荧光显微镜的文章中，收录了关于荧光能量转移显微镜的简短的 1 3 有$ j l 4 , 分r l j 蛋门质的村 幻：作用及j e 能昂：转移的分析应用 调查。 1 3 3 荧光能量转移技术在化学分析方面的应用 荧光能量转移技术在生物技术方面获得了广泛的应用，解决了许多重大的难 题，受到了人们的广泛关注。近些年来，许多分析化学家试图将这一新的分子光 谱技术用于解决化学分析方面的问题，取得了一些可喜的进展，丰富了分析化学 领域的研究手段，为这一新技术的应用开辟了新的领域。 荧光能量转移技术比应用单一染料的分光光度法灵敏度高，与常规的荧光光 度法和共振瑞利散射法相比受到瑞利光散射的影响更小，具有良好的重现性和稳 定性，目前已经广泛应用于痕量有机物、无机离子等的分析测定，显示了良好的 效果。 有研究证明通过氰脲酰氯将荧光胺( 供给体) 和铬黑t ( 接受体) 分别固定在聚 乙烯醇的两个羟基上，用它作为试剂。在氨缓冲液中，由于铬黑t 的吸收光谱与 荧光胺的荧光光谱重叠度小，不发生荧光能量转移，溶液呈现荧光；加入镁离子 后，镁同铬黑t 形成络合物，发生能量转移，导致荧光熄灭，其程度与镁离子浓 度成正比。此方法将灵敏度提高了1 0 倍以上。还有报道研究在表面活性剂存在下， p a r 吖啶黄荧光能量转移体系通过f e ( i i ) 与体系中p a r 络合，导致