（环境工程专业论文）甲磺隆对根际微生物生态的影响及其降解规律研究.pdf

致谢 本论文是在恩师沈东升副教授的悉心指导下完成的。从论文的选题、实验方 案设计及实施、论文撰写与修改等方面都倾注了导师无数的心血。恩师严谨的治 学态度、j | 博的专业知识、勤勉的敬业精神和孜孜不倦的教诲，令我受益匪浅， 终生难忘。思师无论在学业上还是生活上都给予了我无微不至的关r 怀。在此，谨 向思师致以崇高的敬意，表达我最诚挚的谢意! 在论文完成过程中，得到了郑平教授、徐向阳教授、俞秀娥副教授、胡宝兰 老师等的精心指导和帮助。在此向他们表示衷心的感谢! 特别感谢张建英副教授在三年来对我学习和生活上的关怀! 非常感谢本实验室何若、刘宏远、贺永华、王君琴、刘新交等研究生给予了 积极的配合和协助他们营造了愉快和谐的、积极向上的实验室氛围和学习环境， 使我的论文得以顺利完成此外，还要感谢项硕、谭盈盈、柯强、李勇先、丁伟 林、王薇以及我的室友孙萍、傅小伟等同学的热心帮助。 最后感谢我的家人，是他们在精神上与物质上鼓励与支持我完成了三年的学 业。 感谢所有关心与帮助我的人们! 方程冉 2 0 0 3 年5 月于杭州 摘要 本文研究了除草剂甲磺隆对根际土壤微生物各类群数量和酶活性影响，并讨 论了不同处理土壤中甲磺隆的降解规律。试验结果分述如下： i ，甲磺隆的胁迫在一定程度上改变了根际微生物生态； - ( ( 1 ) 小麦根系的发展能在一定程度上提高细菌对甲磺隆的降解作用( 解毒作 用) 和耐受能力； ( 2 ) 根际真菌对甲磺隆有很强的耐受能力或降解能力，是甲磺隆胁迫下的优 势菌种，可为我c n 用植物和微生物联合修复受甲磺隆污染的土壤提供理论依 据： ( 3 ) 土壤放线菌是甲磺隆胁迫下的劣势菌，可以用它来作为甲磺隆除草剂残 留污染土壤生态环境效应的评价指标； ( 4 )甲磺隆的胁迫、驯化以及作物根系生长的协同作用，共同促进了芳香旅 化合物分解菌的生长和繁殖以及芳香族化合物的降解； ( 5 ) 甲磺隆的加入对固氮菌数量影响较大：小麦根系分泌物并非是根际固 氮菌能量的重要来源； ( 6 ) 随着小麦生长期的延长，甲磺隆对土壤中的亚硝化细菌产生明显的抑制 作用。同时，小麦根系旺盛生长，更有利于土壤反硝化作用，反硝化菌数量明显 增加。 ( 7 ) 硫化菌数量相对较少，且随小麦生长期的延长逐渐减少。反硫化菌对甲 、 磺隆毒性较敏感，而小麦根系在一定程度上缓冲了甲磺隆的抑制作用；户 2 、甲磺隆的胁迫对小麦根际酶活性有一定的影响： ， ( ( 8 ) 一般情况下根际土壤中的过氧化氢酶，多酚氧化酶的活性均要大于非根 际土壤，说明植物根系对二者的活眭起到了刺激作用。 ( 9 ) 甲磺隆能对根际土壤中的过氧化氢酶，多酚氧化酶和脱氢酶的活性起到 一定的抑制作用。 对于非根际土壤，甲磺隆能明显的抑制其中的过氧化氢酶、多酚氧化酶 活性。 ( 】) 在根际与非根际土壤中脱氢酶的活性变化差异不明显。上 弓不同处理土壤对甲磺隆的降解存在明显差异 2 ) 小麦根际由于含有丰富的微生物，甲磺隆在小麦根际土壤中的降解明显 快f 非根际土壤，植物根系与微生物的协同作用可较为有效地促进甲磺隆的降 解，受甲磺隆污染的土壤可通过小麦等作物种植而得到较快修复。 ( 1 根际土壤中所含有的耐受或降解甲磺隆的微生物对低浓度甲磺隆具有更 好的降解能力，而对高浓度甲磺隆降解能力不大。 ( 1 4 ) 受甲磺隆驯化的根际土比未经驯化的普通根际土对甲磺隆具有更高的降 解能力；在根系的协同作用下，受甲磺隆污染的土壤能被耐受或降解甲磺隆的优 势微生物所修复。 ( 1 5 ) 甲磺隆在土壤中的降解符合指数降解规律，即土壤中剩余甲磺隆浓度的 对数与小麦生长时间呈线性负相关；不同处理土壤中甲磺隆降解的半衰期范围为 1 7 ，7 q ；9 d ，其中最短的是初始甲磺隆浓度为5 】) ) g k g 的驯化根际土壤，最长的 是仞始浓度为2 m g k g 的驯化非根际土。1 1 l 关健词：甲磺蘸微生物垂基酶彩根谅王磊降影 第一部分文献综述 第一章磺酰脲类除草剂研究进展 磺酰脲类除草剂是近二十年来开发出的高效除草剂，由于其活性高、用量少、 毒性低、对人畜安全等特点，自7 0 年代末问世以来，受到世界各地农业部门和 农药界的欢迎。但随着磺酰脲类除草剂的不断开发和广泛应用，导致某些残留期 长的品种施用后对当茬及后茬轮种作物造成一定药害，引起人们的极大关注 ( m e r s i ee ta l ，1 9 8 5 ；w a l k e re ta l ，1 9 8 9 ：b r o w n ，1 9 9 0 ：f r i e s e ne ta l ， 1 9 9 1 ；曹坳程等，1 9 9 2 ：j u n n i l ae ta l ，1 9 9 4 ；s t o r k 1 9 9 5 ：蔡立，1 9 9 5 ： 陈祖义等，1 9 9 6 ；i s m a i le ta l ，1 9 9 7 ；张金林等，1 9 9 7 ；苏少泉，1 9 9 8 ：b 1 a c k e ta l ，1 9 9 9 ；陈锡岭等，2 0 0 0 ；冯维卓等，2 0 0 0 ；赵建庄，2 0 0 1 ) 。因此，了解 磺酰脲类除草剂的性质以及它们在土壤中的物理化学行为对合理用药，防止作 物受害，保护土壤和环境都是非常必要的。 1 1 磺酰脲类除草剂的性质 磺酰脲类除草荆由芳环、磺酰脲桥及杂环三部分组成。通常该类除草剂的蒸 气压较低，太多数在1 x 1 0 “”毫米汞柱高以下，熔点范围为1 4 1 c - 2 5 0 。c ，p h 5 时的水溶解度为2 9 - 2 6 0 m g l ，p k a 值为3 3 1 5 0 一般用量为2 3 0 克公顷 ( i l a y 1 9 9 0 ) 。 自1 9 8 2 年由美国杜邦公司注册登记的第一个品种一绿磺隆问世以来，现已 丌发出了一系列用途各异的高效新品种主要有用于防治麦田杂草的绿磺隆、甲 磺隆、苯磺隆、噻磺隆、醚苯磺隆、磺胺磺隆、氟啶嘧磺隆、磺酰磺隆、碘甲磺 隆钠盐、氟酮磺隆、丙氧磺隆、乙氧嘧磺隆、环丙嘧磺隆、氯吡嘧磺隆和n c 一3 3 0 等；用于水稻田的主要有苄嘧磺隆、毗嘧磺隆、醚磺隆、氯吡嘧磺隆、乙氧嘧磺 隆、坏丙嘧磺隆、四唑嘧磺隆及咪唑磺隆：用于玉米田的主要有氟嘧磺隆、烟嘧 磺隆、玉嘧磺隆、三氟丙磺隆、氯吡嘧磺隆和噻磺隆：用于大豆田的主要有氯嘧 磺隆、噻磺隆、环氧嘧磺隆；用于油菜田的和甜菜田的主要有胺苯磺隆和氟胺磺 隆陌个：用于甘蔗田的有氯吡嘧磺隆和乙氧嘧磺隆：用于草坪的主要有磺胺磺隆、 环丙嘧磺隆和嘧啶磺隆。目前已有3 0 多个品种商品化，是当今除草剂的重要种 类( 王作斌，2 0 0 1 ：刘长令，2 0 0 0 ，2 0 0 1 l 磺酰脲类除草剂一般不抑制种子的萌发，子叶能正常开放，但对幼苗的根和 枝芽有很强的抑制作用。该类除草剂的作用方式主要是通过抑制杂草的乙酰乳酸 合成酶( a l s ，也叫乙酰羟基合成酶( a h a s ) ) 的活性，阻止侧链上的氨基酸一缬 氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的合成来干扰细胞分裂，造成杂草生长停止而死亡( 苏 少泉1 9 9 0 ；黄明智，1 9 9 7 ) 。 1 2 磺酰脲类除草剂在土壤中的物理化学行为 1 2 1 在土壤中的吸附 磺酰脲类除草剂是在土壤中吸附作用小、淋溶性较强的一类化合物。它们对 植物的毒性与粘粒含量无明显相关性，这说明它们与土壤粘粒的亲合性很小。而 土壤有机质、无定形铁铝氧化物及其水化物对磺酰脲类除草剂有一定的吸附作 用，其中发生的作用机理可能有氢键、离子交换、电荷转移、配体交换、疏水分 配、偶一偶极等( s h e a ，1 9 8 6 ：b o g g a a r de ta l ，1 9 8 8 ；u k r a i n c z y ke t a 1 1 9 9 6 ：w a l k e re ta l ，1 9 9 8 ) 。 土壤p h 值对吸附作用的影响很大，p h 值上升，溶解度提高，吸附作用下降； 在碱性条件下，解吸附作用增强。随p h 值增高，其对植物的毒性增强。这是因 为在酸性条件下中性态的磺酰脲类除草剂易通过氢键、疏水分配等作用被土壤腐 殖质所吸附，而在碱性条件下以水溶性强的阴离子状态存在的除草剂分子不易被 带负电荷的土壤组成所吸附( t h i r u n a r a y a n a ne ta l ，1 9 8 5 ：o p p o n ge ta l ， 1 9 9 2 a ；仇宏伟，2 0 0 0 ) 。 温度对吸附有一定的影响。一般情况下，随温度升高被吸附的除草剂分子 和趋向于吸附物表面的除草剂分子动能增加、静电吸引减弱。导致吸附减少。但 这种影响受土壤酸碱度限制。在p h 很低的条件下温度对吸附的影响很小。例 如绿磺隆是p k a 为3 8 的弱酸，虽然其水悬液的p h 是4 2 ，但胶体表面的p h 可 4 能更低，因而在p h 4 2 时，吸附作用最强；当p h 达7 。8 时，吸附量下降3 0 倍。 当洲低于3 8 时大部分药剂呈分子态，由于有机质带净阴电荷，所以绿磺隆分 子能被弱物理力所吸附或通过氢键被吸附( t h i r u n a r a y a n a ne ta 1 1 9 8 5 ) 。 1 2 2 在土壤中的迁移 除草剂在土壤中的迁移与吸附过程密切相关，因此对吸附过程有影响的土壤 性质和环境因素同样对其迁移过程产生影响。除草剂在垂直方向的移动尤为重 要，它往往决定了土壤中除草剂生物活性的发挥、持效期的长短、对后茬作物危 害的程度，还决定着对环境的污染状况等。 磺酰脲类除草剂的迁移受土壤含水量的影响最大。随着降雨强度和土壤含水 量增加，迁移程度加大。甲磺隆在降雨量为l l o m m 的土壤中，可向下移动5 0 c m 。 而在降雨量仅为4 5 m m 的土壤中，甲磺隆只分布于o l o c m 的表土层( 苏少泉， t 9 9 0 ) 。陈祖义等( 1 9 9 4 ) 采用土壤薄层层析法对绿黄隆在多种土壤中的移动性 进行了研究，发现绿黄隆迁移作用较强，其移动生随p h 值增大而增强，甚至导 致除草剂分子从植物根系分布区向外迁移，从一定程度上缓解了土壤p h 增大而 不利于绿磺隆降解的负面影响。磺酰脲类除草剂在壤中的移动性还与土壤有机质 含量有关，土壤有机质含量越高，醚苯磺隆淋溶性越差( o p p o n g e ta l ，1 9 9 2 a ) 。 1 2 3 在土壤中的降解 在土壤中，磺酰脲类除草剂主要通过化学水解和微生物降解两种途径降解。 1 2 3 1 化学水解 化学水解是磺酰脲类除草剂在土壤中的重要降解反应，它是由酸催化的非酶 促反应。除草剂分子水解后变成无活性的氨磺酸和氨基杂环化合物。一般情况下， 提高温度和含水量都可以加速磺酰脲类除草剂的化学水解作用，从而加快其在土 壤中的降解( j a m e se l ；a l ，1 9 9 5 ；姚东瑞，1 9 9 8 ) 。绿磺隆的降解产物是2 一氯 苯磺酰胺和2 一氨基一4 一甲氧基一6 一甲基一l ，3 ，5 一三氮苯。甲磺隆与绿磺隆的化学 结构非常相似，在酸性水溶液中甲磺隆的化学水解包括脲桥的水解和甲氨基的水 解两条途径，水溶液p h 值降低可显著增强其活性( 孙丙耀，1 9 9 6 ) 。 1 2 3 2 微生物降解 土壤微生物不但可以使水解产物完全降解为c o ：和其它低分子量化合物。而 且在磺酰脲类除草剂的降解中有重要作用，这种生物降解作用在碱性土壤中则更 为明显。j o s h i ( 1 9 8 5 ) 等的研究表明，对绿磺隆分解起重要作用的微生物主要是 放线菌浅灰链霉菌( s t r e p t o m y c e s g r i s e o l u s ) 、真菌黑曲霉( a s p e r g i h u s n i g e r ) 和青霉( ? e n i c i l l i u ms p ) 三种，其中黑曲霉和青霉能催化磺酰脲桥的水解， 产e 相应的磺酰胺和杂环。同时众多研究证明灭菌土壤中磺酰脲类除草剂的降 解速度要比未灭菌土壤中慢( 0 p p o n g e ta l ，1 9 9 2 b ；周旭辉，2 0 0 0 ) 。业已证明， 土壤微生物也对醚苯磺隆的降解起作用，微生物降解是醚苯磺隆在土壤中消失的 主要原因。 磺酰脲类除草剂主要通过酸催化的水解作用及微生物的代谢而降解，因而凡 能影响水解速率和微生物活动的因素均能影响它们在土壤中的降解。影响因素主 要包括：土壤温度，含水量、p h 值及有机质含量等。微生物对磺酰脲类除草剂 的降解速率随温度升高而提高，t h i r u n a r a y a n a n ( 1 9 8 5 ) 报道，绿磺隆在土壤p h 为7 7 ，土壤含水量为田间持水量的7 5 时，温度升高，降解速率加快半衰期 缩短。当土温为1 0 和4 0 。c 时，半衰期分别是2 2 9 和6 2 5 天。含水量对降解的 影响依土壤类型和土壤温度等的不同而变化。如土壤含水量从1 0 增加到3 0 ， 绿磺隆的降解半衰期从3 6 周减少到0 9 周( 姚东瑞1 9 9 8 ) 。但a n d e r s o n 在一 项研究中发现，增加土壤中水分会降低绿磺隆的降解速率，这可能是由于土壤水 分含量过高抑制了好氧微生物的活性。但在砂壤土中，水分含量增加，降解速度 不受影响。p h 值与降解速率之间存在明显的负相关，一般情况下，酸性土壤比 碱性土壤利于降解。酸性土壤条件既利于由酸催化的化学水解，也促进了土壤微 生物的活动。绿磺隆在p h 为5 6 和7 5 的粉砂粘壤土中的半衰期分别是1 3 和 7 0 d ( f r e d r i c k s o ne ta l ，1 9 8 6 ) 。有机质对降解速率的影响主要是土壤含水量、 土壤类型等因素的作用下，通过改变土壤酸碱度而实现的。小麦杆加入砂性壤土， 不利于绿磺隆的降解反而增加其滞留性，这主要是由于加入麦秆可使土壤 d h 从6 1 上升到7 2 ( a n d e r s o n 1 9 8 5 ) 。 6 1 - 2 4 在土壤中的残留 磺酰脲类除草剂在土壤中的吸附、迁移和降解三者之间存在一定的互为制约 的关系，三者综合作用的结果直接影响着其残留及其对后茬作物安全性的影响。 在寒冷、干燥地区，或在高p h 的土壤中，磺酰脲类除草剂降解较慢，容易造成 土壤残留。在这种情况下，通过灌溉土壤增加土壤湿度、翻地晒田提高土壤温度、 以及施加有机肥或土壤改良剂等降低土壤p h 值等措施都可咀加速土壤除草剂结 合戏留物的降解。 汪海珍( 2 0 0 2 ) 和周旭辉( 2 0 0 0 ) 对甲磺隆在土壤中的结合残留作了系统的分 析。结果发现”c 一甲磺隆的残留量与降解时间之间的关系符台一级反应动力学指 数方程：土壤p h 与甲磺隆“c 一残留物的降解半衰期、残留量及可提取态残留量 呈罹著的正相关而与结合态残留量呈显著负相关；土壤微生物活f 生越强，甲磺 隆降解速率越快，但结合态残留量也越高；土壤中各腐殖质组分和粘粒的含量也 影响甲磺隆在土壤中的降解速率和存在形态。实验还得出：土壤中c 一甲磺隆结 合残留为松结态腐殖质 稳结态和紧结态腐殖质；”c 一甲磺隆结合态在土壤腐殖物 质中的分布是：富里酸 胡敏素 胡敏酸。 综合以上分析，以往学者对磺酰脲类除草剂如甲磺隆的研究均在本土土壤中 进行，而实际农业生产中该类除草剂的使用环境为有作物种植的田问土壤，势 必受到种植作物即植物根系的影响。因此了解磺酰脲类除草剂性质及其在根际 土壤中的物理化学行为及更深入地研究该类除草剂的环境行为具有重要的实际 意义，可为用植物和微生物来修复受磺酰脲类除草剂污染的土壤提供理论依据。 第二章根际微域环境的研究进展 根际微域环境的研究是目前土壤学中最活跃和最敏感的研究领域。根际土壤 由于其物理、化学、生物学性质之间的相互作用、相互制约，如根际p h 变化将 影响微生物定殖、养分有效性、根系分泌物等，因此根际环境是一个独特的动态 的、复杂的微型生态系统它是水分、养分、有益与有害微生物、有机与无机污 染物进入根系乃至植物的门户。又是根沉积作用的场所( n y e ，1 9 8 5 ；k e i t he ta l ， 1 9 8 6 ：w a l t o ne ta l ，1 9 9 0 ；朱兆良等，1 9 9 2 ；陈怀满等，1 9 9 6 ：d a u g h n e ye ta l ， 1 9 9 8 ；陶澍等，2 0 0 1 ) 。因此根际环境不仅对探讨土壤一微生物一植物根系三者 相互作用的理论很有意义而且，随着农业生产的发展也越来越显示出根际的 物理、化学和生物环境与作物的生长发育、抗逆性和生产力的直接关系。根际微 域环境的研究内容非常广泛：有根分泌物的研究、根际微生物的研究、根际的养 分分布研究、根一土界面显微特征的研究、根际p h 状况的研究等等，本文着重介 绍根分泌物及根际微生物两方面的研究现状和进展。 2 1 根分泌物 2 1 1 根分泌物的定义及其产生途径 植物在整个生长期间进行着活跃的新陈代谢活动，根系不仅从环境中摄取养 分和水分，同时也不断地向生长介质中分泌大量的低分子有机化合物，如糖类、 有机酸、氨基酸、酚类化合物等。学术界迄今对根分泌物尚无确切的定义。有人 认为：根分泌物就是根系渗出物、分泌物、植物粘液、胶质和裂解物，它们来自 于根系的直接分泌或微生物的作用；也可以是根系健康组织有机物的释放或衰老 表面细胞和细胞内含物的分解( r o v i r ae ta l ，1 9 7 9 ；h a l ee ta l ，1 9 8 l ；l i l j e r o t h e ta l ，1 9 9 0 ) ：另有人认为：根分泌物就是根系分泌的可溶性物质( i n g r i d k r a f f c z y k e ta l ，1 9 8 4 ) ：也有人根据根分泌物为根际细菌呼吸提供底物的原理， 用根系反硝化过程中产生的n o ：量来定义根分泌物( h a l l e rs t o l p ，1 9 8 5 ) 。因 此根分泌物到底是什么包括哪些物质，有待进一步研究确认。 根分泌物的产生有两条基本途径，即植物生理的代谢途径和非代谢途径。代 谢途径产生的分泌物又可分为初生代谢和次生代谢产生的分泌物。初生代谢是指 由于植物根系生活在植物一土壤一微生物等界面环境的特殊微生态系统中，在植 物代谢过程中有部分物质以根分泌物形式释放到根际土壤中，其释放强度与根的 生长、细胞膜的选择透性、植物代谢、根系部位及植物品种属性等有关。小麦根 系分泌物的释放与根生长有关，一旦根系停止生长，几乎无分泌物产生 ( z p r i k r y l e ta l ，1 9 8 0 ) ；当细胞膜完整受损，有机质便从活体中大量释放； 白天光合作用强植物代谢旺盛，根分泌量要比晚上多；根尖是根分泌的主要场 所，顶端区域是根分泌作用的主要位点，侧根也可分泌较多的物质，根毛分泌部 分物质；植物品种属性不同，其根系分泌强度也不同：植物不同发育时期，根系 分泌物的量也不同。次生代谢是相对初生代谢而言它的产物不直接参与植物的 生长、发育和繁殖，而是用于不良环境的适应。如在缺磷胁迫条件下，白羽扇豆 柠檬酸和油菜有机酸的分泌量增加( h o f f l a n de ta 1 1 9 8 9 ：l il j e r o t he ta l ， 1 9 9 0 ) ，这有利于土壤中难溶性磷化合物的溶解从而达到克服或缓解磷素胁迫 的目的。非代谢途径产生的分泌物，是指不受代谢调控的，主要来自于植物根残 体的分解或衰老根表皮细胞分解及细胞内含物的释放。 2 1 2 影响根分泌物的环境因素 根分泌物受到多种环境因素的影响： ( 1 ) 上壤温度 在适合植物生长的温度范围内大多数植物的分泌作用一般随温度的升高而 加强，但也有些植物在低温条件下释放更多的分泌物。如三叶草分泌生物素和尼 克酸数量在较高温度下有所增加；5 一i o c 是草莓分泌氨基酸最适宜的温度：3 7 时，棉花菜豆根分泌物增加，豌豆却减少：玉米和黄瓜经“冷处理”后，根分 泌物大量增加。 ( 2 ) i 二壤湿度 一般情况下，土壤先干旱后湿润有利于植物根分泌物的增加。e l r o y ( 1 9 8 6 ) 在无菌培养条件下进行试验，大豆、小麦或番茄在砂土或砂壤土中生长，先使其 干旱，然后再浇水，根系分泌量较一直保持在湿润条件下的高。这主要是由于在 萎蔫条件下，导致体内氨基酸平衡的破坏，使之向根外扩散。 ( 3 ) 养分胁迫 小麦、水稻在缺f e 胁迫下根分泌一种非蛋自质氨基酸麦根酸。这种物 质- i 丁活化土壤中的难溶性铁和其它会属元素对这些离子进入植物体内起载体作 用。c a 胁迫有利于花生糖类的分泌，从而引起花生果英腐烂病的增加。z n 胁迫 导敛小麦、大麦、玉米、番茄、苹果等根系氨基酸、糖类化合物、酚类化合物分 泌的明显增加( t r e e b y 1 9 8 9 ) 。 ( 4 ) 根际微生物代谢 根际微生物代谢活动的产物，对根系的分泌作用既有刺激作用，也有一定的 制约作用。根系分泌物与根际微生物的关系将在后文“根际微生物”中具体阐述。 除以上这些因素之外，土壤空气、光照等因素也对植物根分泌物产生影响。 如c o ! 倍增有利于单株水稻根系甲酸、乙酸的分泌及分泌物总量的增加( 王大力 等。1 9 9 9 ) 。 2 1 3 根分泌物在根际环境的作用 根分泌物对根际微域环境的改善起到了非常重要的作用。植物生长过程中的 大部分光合作用产物将被转移到根部，并进而被分泌到根际中，这些分泌物作为 微，_ l 三物的能源和碳源而产生微生物根际效应，从而对污染物的发生( 如c 乩) 、循 环( 如硝化和反硝化) 和归宿( 如有机毒物的共代谢降解) 均产生了重要影响。 妁l t o n 报道根系分泌物( 如糖类、有机酸类、氨基酸类等) 可在根系有机毒物微 生物降解时起共代谢或协同作用( w a l t o ne ta l ，1 9 9 0 ) ：h s u 证实根际中“c 标 记( i - - - 嚷农和对硫磷的。0 ：释放速度明显高于非裉际士( h s u e ta l ，2 _ 9 7 9 ) ： n e w m a n 报道多种作物的根际都能提高t c e ( 三氯乙烯) 的降解( n e w m a n ，1 9 9 9 ) ： b a n k s 对牛毛草根际苯并芘的动态研究表明种植作物土壤中苯并芘的矿化和挥 发作用大于未种植作物的土壤且植株根际能促进高吸附、难降解苯并芘在土壤 中的降解( b a n k se ta l ，1 9 9 9 ) ：根系分泌物也可与重金属形成配位化合物，使 其活化( 如氨基酸可大大提高铁的有效性) ，且还原性的分泌物还可与变价重金属 发生氧化还原反应，根系分泌物可能还存在某些表面活性剂类的物质，从而增强 吸附态有机污染物的溶解和降解( 戴树桂等，m 9 9 ：微生物的根际效应和分泌物 n 中的酶也使得根际中的各种酶活性均高于非根系，从而有助于推动各种生化反 应，如m a l l i c k 等报道根系分泌物对根际特种微生物存在趋化作用( m a l l i c ke t a 1 1 9 9 9 ) 。 2 2 根际微生物 根际是植物、土壤和微生物三者之间相互影响较深刻的地区，是土壤微生物 活动的一个特殊生态环境。根际微生物的代谢作用，直接促进或抑制根的营养吸 收和生长也影响根际土壤中的物质转化。早在1 9 世纪末期，就有根际微生物 区系的研究。迄今，根际微生物的研究几乎已有1 0 0 多年的历史。 2 2 1 根际微生物对土壤环境的影响 根际土壤微生物对土壤环境及植物的生长有较大影响：微生物分解土壤中 的有机物，为植物提供n h 。+ 、n 0 ，等无机养料：微生物产生的碳酸气、有机酸 使难溶性的无机养料溶解：随着微生物的呼吸，土壤中的氧分压降低；微生 物吸收土壤中的n h 。+ 、n 0 。和其它无机养料进行增殖，使土壤中无机养料浓度减 少：微生物产生维生素、植物生长激素等促进植物生长。 自7 0 年代以来，众多学者对水稻、小麦、玉米、高粱、甘蔗和棉花等进行 了根际微生物联合固氮研究得出非豆科作物固氮已是当今生物固氮研究的新方 向( 陈廷伟，1 9 8 9 ：z a h e r aa b b a s se ta l ，1 9 9 3 ；谢建治等，1 9 9 9 , 方萍等，2 0 0 0 ) 。 2 2 2 土壤微生态对根际微生物的影响 2 2 2 1 土壤环境物质与能量对根际微生物生长的影响 土壤根际微生物参与多种反应过程如矿化一同化、氧化还原等，是植物养 分转化、有机碳代谢及污染降解的驱动力，是土壤活性大小的标志。土壤微生物 c 含量变幅较大，与土壤有机质含量呈正相关，一般为土壤有机碳的2 一5 ，土 壤微生物n 一般占土壤全n 的1 一5 ，与土壤水解性氮含量比较吻合，土壤经培 养释放的矿化氨5 5 一7 7 来自土壤微生物量。土壤微生物p 通常占全p 量的 2 d 一2 3 3 ，占有机磷的5 一4 7 ，高于土壤可提取的有效磷( 何振立，1 9 9 7 ) 。 对多数土壤而言，异养微生物占主导地位，维持其生命活动需要消耗一定的能量。 微生物对有机碳的利用率愈高，维持相同微生物量所需的能源就愈少，说明土壤 环境有利于土壤微生物的生长。故能源不足是限制土壤微生物生长与活性的主要 因素。耕作土壤因作物和秸秆被取走，其微生物能源就更为缺乏。重金属超过一 定浓度对土壤微生物活性和数量均有明显影响。除重金属外农药如杀虫剂、杀 菌剂和除草剂等对土壤硝化作用、呼吸作用和固氮作用均产生暂时或永久性的影 响。故土壤中物质与能量的供给及土壤污染防止与治理对维持土壤微生态活力具 有瞳要作用。 2 2 2 2 根系对根际微生物生长的影响 根系为土壤微生物提供大量的营养和能源物质，因而根际微生物不仅数量 远高于非根际土壤，而且其代谢活动也比非根际微生物高。在小麦的生长过程中， 随根分泌物的增加，根际环境中反硝化细菌数明显增加，说明根分泌物的增加， 为恨际土壤中反硝化细菌的发育创造了良好的生态环境；同时根分泌物还能刺激 反硝化细菌的代谢活动( 李振高等，1 9 9 3 ，1 9 9 5 ) 。 根系分泌物的细小变化均会导致根际微生物区系的极大差异。植物对根病的 抗性与根际微生物的多样性( 包括其数量、种类、优势种、颉抗菌) 有一定相关性， 如棉花黄萎病感病品种其根际线虫数量显著多于抗病品种，抗瘸品种根际真菌和 放线菌数量又多于感病品种仅细菌无明显规律性( 李洪连等，1 9 9 8 ) 。胡峰( 1 9 9 8 ) 认为小麦根际与非根际细菌、真菌和原生动物数量均为抽穗期最高，线虫则为成 熟期最高。研究证明，不同基因型小麦根际效应不同。抗病与感病品种根际微生 物数量、种类的差异主要与不同品种、不同时期根系分泌物有关。 由于植物根部不同部分分泌作用强度不同，因而，根系为根际微生物的尘态 分m 提供先决条件。大多数情况下根系分泌物对根际微生物的作用是松散的、非 特异性的，主要促进革兰氏阴性无芽孢杆菌在根际的聚集。如水稻根系埋入土中 带根基茎段2 5 c m 处固氮菌最多，根基以下3 c m 根段次之，3 c m 以下根段最少 ( 英文英等1 9 8 5 ) 。 2 2 2 3 土壤理化性质对土壤病菌生长的影响 土传病害致病菌主要以菌丝体、卵孢子在土壤和病残体中越冬，故土壤因子 对病菌生长及侵染的影响自然成为侵染规律的核心问题。禾谷镰刀菌( f u s a r i u m g r d m i n e a r u m ) 和瓜果腐霉菌( 一t h i u ma p h a n i d e r m a t u n ) 是玉米茎腐病的优势致 病菌。研究认为土壤温度、湿度、酸碱度和土质等因子对病菌在土壤中生长及对 寄：e 侵染有明显影响，禾谷镰刀菌喜欢中性土壤和低湿环境，不耐高温，在土壤 中，蔓长较好：瓜果腐霉菌喜欢中性壤和高湿环境，能耐壤高温。在砂土或粘 土中生长较好。病菌对玉米幼苗的侵染受土壤温度、特别是湿度的影响，腐霉菌 在高湿条件下致病力强，发病重：土质对发病也有明显影响，通常砂土地发病较 重( 宋佐衡，1 9 9 5 ) 。 2 2 3 根际微生物研究的新趋势根际促生菌 近年来，生物有机肥的生产与应用，促进了根际土壤微生物积极活动，肥力 提高，从而使农作物获得增产。在根际微生物韵研究方面已预视一个新的发展趋 势，对根际促生菌( p a n tg r o w t h p r o m o t i n gr h i z o b a c t e r i a ，p g p r ) 的研究， 已成为研究的热点。 该技术体系主要是利用三类不同的微生物，以及它们与植物的关系来达到其 功用。一是促进植物生长的根际微生物，包括解磷、固氮微生物；二是降解农药 豉留和有机物污染物的根际微生物；三是预防和控制流行性病菌对植物侵染的微 生物。这三类不同的微生物的系统应用，可以减少化肥的使用减少抗病菌农药 的使用，提高作物抗药性，在短期内降解和清除土壤中农药残留，修复壤生态 环境，恢复地力，减少作业成本提高产品的产量和质量( 陈晓斌等，2 0 0 0 ：黄 晓东，2 0 0 2 ：胡春江等，2 0 0 2 ) 。 2 2 2 1 促进植物生长的根际微生物 植物根际促生细菌是通过以下几个方面的功能来促进植物生长发育。一是溶 解：匕壤中植物不可利用的磷：土壤中存有大量的磷，但大部的磷属不溶性磷。植 物不可以利用。植物根际促生微生物可生产有机酸，溶解土壤中不溶磷加速土 壤中无效磷的有效化，从而增加土壤中磷对作物的供应。二是固氮：植物根际促 生微生物可像植物根瘤菌一样，利用空气中的分子氮转化为有机氮，供自身和植 物使用。尽管其效率常常低于植物根瘤菌，但在很大程度上改善了作物的氮营养， 使作物增产。三是溶解并摄取土壤中铁：根际促生微生物可产生并释放小分子的 嗜铁素( s i d e r o p h o r e ，小分子蛋白) ，来结合土壤中不溶铁。四是产生和释放促 进植物生长的激素：根际促生微生物可产生并释放多种促进植物生长的激素如 赤霉素和细胞分裂素，促进植物生长发育，特别是刺激其根系的生长发育。五是 利用并降解植物体内的植物生长抑制剂乙烯：乙烯是已知的植物生长抑制和植物 衰老促进剂。根际促生细菌可利用并降解植物产生的乙烯，用作营养和能源。该 项利用根际微生物促进植物生长技术是将植物一根际促生菌系统结合，根据具体 作物和土壤条件选取适当微生物组合，形成有针对性的土壤促生生物体系，可减 少农药和化肥的使用提高作物抗药性，提高肥效，从而达到高产而减少投入的 目的。 2 2 2 2 降解残留农药和有机污染物的根际微生物 很多农药的残留，可在土壤中长期存留并积累。由于这些物质的毒性和抗分 解性，消除其污染极其困难。往往需要筛选和驯化特殊的微生物菌种来降解和清 除这些污染物利用微生物的特殊的同化和降解特性，改变污染物的化学结构 降解为无毒化合物。从而使污染的土壤恢复到对作物不受影响的程度。目前已筛 选出一些对不同有机物有特殊吸收并同化能力的微生物菌种。这些微生物菌种根 掘其功能可以分为两类：一类是同化和代谢苯和萘芳香族有机物的微生物菌种 另一类是同化和代谢氯代苯和萘有机物的微生物菌种。植物与微生物的结合为微 生物提供了高效的有机能源促使微生物群体形成和发展，形成高效代谢和同化 的z - 态群体。植物根系在代谢过程中向周围土壤分泌大量的有机酸等碳水化合物 可作为微生物繁殖的优质营养来源，从而促进土壤解毒微生物的活动使更多的 污染物被降解。土壤中的有毒污染物的减少，又进一步改善了植物根系环境，使 植物更好地生长，反过来又能为解毒微生物提供更多的营养，促进微生物以更高 的速率降解污染物。适当的植物一微生物组合，可使植物微生物互为促进，相 得益彰。 2 2 2 3 预防和控制流行性病茵对植物侵染的微生物 发展生物防治方法利用真菌和根际促生细菌来预防和控制流行病害，成本 低，效果好，而且不污染食品和环境。根际促生细菌对土壤中的病菌有很强的抑 制作用，在一定程度上预防和控制病菌对作物侵染。这些微生物通过生产抗生 素占有和控制土壤中作物必需的微量元素诱发作物的系统性抵抗机制对 空i - 自j 和营养的竞争分泌细胞溶解酶等几种方式来预防和控制病菌对作物侵染。 4 该项利用微生物来预防和控制病菌对植物的侵染技术是根据植物的特点与其主 要的流行病害来选择根际促生菌和植物抗生菌进行系统结合形成有针对性的 植物与微生物体系，可以减少农药的使用，提高作物抗病性，从而达到高产、优 质的目的。 综上所述，根际微域环境中植物一土壤一微生物系统是当今研究的热点，本 研究着重将土壤有机毒物一植物一微生物系统结合，形成有针对性的根际土壤解 毒生物体系从而达到高效、快速清除土壤农药污染的目的。 第三章农药的微生物降解 在生态系统中，微生物对农药的降解起着重要作用。农药微生物降解的研究 始f4 0 年代在农药降解菌的富集分离、农药微生物降解的途径、农药降解酶 咀及农药微生物降解的基因操作方面取得了重要进展。了解生态系统中降解农药 的微生物分布状况、掌握农药微生物降解的规律，有助于预测和控制农药的污染， 并进一步为生物修复受农药污染的土壤环境提供基础和前提。 3 1 农药降解微生物 环境中农药的生物降解虽然与植物、土壤微型动物、藻类等有一定的关系， 但墙主要的降解者是细菌和真菌。由于农药分子的特殊性，一些微生物在降解农 药污染物时，需要比降解一般污染物更为复杂的过程，有时一种微生物只完成其 中的某一个过程，需要多种微生物的共同作用才能完全降解( 夏北成，2 0 0 2 ) 。 能降解农药污染物质的微生物种类很多，大量的研究还在积极地开展，已经 证实了能降解各种有机农药的微生物如表3 1 ( 王焕校，2 0 0 0 ) 。 表3 - 1 部分有机农药的部分微生物降解者 t a b l e3 - ls o m ed e g r a d a t i o nm i c r o b e so fs o m eo r g a n i cp e s t i c i d e s 微生物( 属)农药 无色杆菌属 气杆菌属 十壤杆苗属 产碱杆苗属 交链孢属 1 y 杆菌属 曲霉属 芽孢杆茸属 拟杆菌属 氯苯胺灵、2 4 一d 、d d t 、2 4 ，5 - t d d t 、异狄氏剂、甲氧d d t 氯苯胺灵、d d t 、茅草枯、毒莠定、三氯乙酸 茅草枯、三氯乙酸、抑芽丹 茅草枯 茅草枯、2 ，4 一d 、二嗪农、草藻灭、毒莠定、西玛津 莠去律、毒莠定、扑草净、硒草挣、西玛津、敌百虫、2 ，4 - d 、利谷隆 删d d 、d d t 、茅草枯、利谷隆、毒莠定、灭草隆、三氯乙酸 氟乐灵 葡萄孢霉属 头孢霉属 枝孢霉属 棒状杆菌属 黄杆菌属 镰孢霉属 毛霉属 链孢霉属 诺 氏菌属 假单胞茵属 酵母属 链霉茁属 毒莠定 莠去津、扑草净、西草净 莠去津、扑草净、西草净 茅草枯、2 ，4 - d 、d d t 、地乐粉、二硝基粉、百草枯 茅草枯、2 ，4 - d 、氯苯胺灵、毒莠定、马来酰肼、三氯乙酸 艾氏剂、莠去津、d d t 、西玛律、敌百虫、五氯硝基苯 d d t 、五氯硝基苯 地茂散 茅草枯、2 ，4 - d 、丁酸、五氯硝基苯、毒莠定、丙烯醇、三氯乙酸 丙烯醇、茅草枯、2 ，4 一d 、氯苯胺灵、d d t 、敌敌畏、灭草隆、异狄氏剂、 地乐粉、二嗪农、二硝基酚、西玛津、五氯酚钡 克菌丹、毒莠定 茅草桔、二嗪农、五氯硝基苯、西玛津 农药降解菌的获得主要是从土壤、水体或污泥等污染环境中直接分离筛选或 经富集培养获得。农药降解菌的富集培养方法主要有：瓶培养即液体富集培养法 ( b a t c hc l i l t u r eo rl i q u i de n r i c h m e n tc u l t u r e ) 、土壤环流法( s o l lp e r c o l a t i o n o fs o ilp e r f u s i o n ) 、连续流动培养法( c o n t i n u o u sf l o wm e t h o d ) ( h u s t o ne ta 1 1 9 81 ；虞云龙，1 9 9 6 ) 。农药降解菌的富集现象在土壤中也普遍存在。一种土壤 长期使用某一农药可使得该农药降解菌逐渐富集，以后再施入该农药时其分解大 大加快，从而导致药效有所降低。此外，通过基因工程的手段来获得高效降解菌 已成为当前的研究热点。其主要途径为筛选带有突变质粒的菌株以及降解基因构 建杂种质粒并使其在合适的寄主中表达( 虞云龙，1 9 9 5 1 9 9 6 ) ：通过基因工程构 建高效和多功能降解菌。突出的例子如k e l l o g g 等通过几种降解质粒的相互作用 筛选出一种质粒突变菌株可以以2 4 ，5 - t 为唯一碳源生长( k e l l o g g ，1 9 8 1 ) ， 而垌常规的连续培养法却一直未能分离到可利用2 ，4 ，5 一t 为唯一碳源的降解菌 株。但是构建农药降解工程菌的研究还面临不少问题，由于担心这类工程菌对环 境会有意想不到的影响，因此要想进入实用阶段必须十分谨慎，同时对降解微生 物类群及降解质粒的遗传问题还需更深入的研究。 3 2 农药微生物降解的途径 农药与其他的有机污染物质一样，微生物的降解代谢方式主要有酶促方式和 非酶促方式，而酶促方式则是微生物降解的主要形式。 微生物通过酶系中的特殊酶对农药分子的特殊毒性基团进行代谢使其失去 毒性。在此过种中，微生物将农药分子当作自身所需的碳源物质，并在代谢过程 中获得自身生长所需的能量。因此，酶促方式的代谢就是解毒代谢。这是微生物 抵御不良环境，避免受农药杀伤的一种抗性机制，是微生物种群的生态适应的表 现。这种分解代谢常常是在农药污染物浓度较高的情况下进行的。酶促反应的另 一种情况是在一些广谱酶的作用下进行水解代谢或者共代谢或者仅以农药分子 作为电子的供体或电子受体，这时微生物对农药的降解代谢不是其生长代谢的主 要代谢过程，微生物细胞的生长主要从其他代谢过程获得碳源和能量。当环境中 农药浓度较低时，这种代谢方式是主要的方式。非酶促反应方式是生物降解的辅 助方式，如通过产生辅助因子促进其它反应的进行，或者改变p h 而促进反应进 行，或者是微生物的其他代谢产物作为农药分子降解的电子受体或者电子供体。 总之，非酶促反应只是伴随酶促反应发生的过程。 由于农药的生物降解受到环境条件和降解微生物种类的影响，因而目前还难 以预见每一类农药的生物代谢途径，而只能总结出一些大概的反应过程。比如已 知道许多真菌转化某种农药往往先从羟基化开始，但这种羟基化可能发生在芳环 的不同位置或在侧链上，而且在各种真菌之间又各不相同( b o l l a g ，1 9 8 2 ；z h e n g e ta l ，1 9 8 9 ) 。 微生物对农药的降解途径与一般有机物的降解途径类似，如氧化、还原、水 解和合成等生物降解的主要形式都能够代谢降解农药分子，不同的途径适用于不 同的农药( 夏北成，2 0 0 2 ；孙福来，2 0 0 2 ) 。 氧化反应是酶促生物降解的最重要的反应，且在不同的酶的作用下可以发生 不同的氧化反应，如一氧化、脱羧基、苯环开裂、杂环氧化、甲基( 或烃基) 氧化、 羟基化等。各种生物体内的氧化反应与还原反应都会与同一个酶的氧化与还原的 过程同时发生，如细胞色素氧化酶的氧化态转化为还原态时就会使一个基质分 子被氧化。 水解是有机大分子降解的最基本反应，且水解酶多为广谱酶，在很多情况下 都能发生水解反应。大多数农药分子被水解后其毒性会大大降低。有些农药虽 作用于标靶生物但不能起到很好的作用，多数情况是由于农药进入标靶生物体内 发生了迅速的水解反应，有时抗性的形成也就是诱导产生了一种水解酶。 3 3 农药降解酶 农药在土壤中的降解既可以直接在土壤微生物作用下发生各种生物降解反 应但也可以在没有土壤微生物直接参与的情况下进行，因为土壤中含有大量微 生物的胞外酶，而且这些胞外酶的种类很多，如水解酶、氧化酶、脱氢酶、转移 酶、酯酶、淀移酶。实际上土壤所包含的这些酶就使得土壤具有了生物活性土 壤中的许多反应都是在这些酶的参与下进行。 降解酶往往比产生这类酶的微生物菌体更能忍受异常环境条件，如对硫磷水 解酶可耐受高达1 0 的盐浓度1 的溶剂浓度和5 0 的温度，而产生这种酶的假 单胞菌在这种条件下是不能生长的( m u n n e c k e ，1 9 7 9 ，1 9 8 0 ) 。在有些条件下，酶 的降解效果远胜于微生物本身，特别是对低浓度农药，降解菌只能利用其它碳源 而不能有效地利用农药为碳源( a l e x a n d e r ，1 9 8 5 ) 。 利用降解酶净化土壤中的农药污染研究相对较复杂。由于降解酶在土壤中易 受到非生物变性、土壤吸附等作用失活，难以保持长时间的降解活性因此能否 实际应用取决于其稳定性。通过生物工程对农药降解酶基因进行克隆与高效表达 来获取降解酶是行之有效的办法。农药降解酶基因的克隆与表达可以构建降解谱 广、降解彻底的工程菌，为微生物降解农药开辟新途径：也可将降解酶基因转入 易于繁殖的宿主中获得高表达提高酶产率，同时认清农药微生物降解的生化机 制。 基于以上分析。借鉴农药微生物降解的成功经验，为探讨土壤中甲磺隆的降 解觇律，本研究拟从根际土壤与非根际土壤以及受甲磺隆驯化的土壤与未经驯化 土壤对甲磺隆降解速率的比较，提出磺酰脲类除草剂的快速降解对策和受污染土 壤的生物技术。 9 第二部分试验研究 第四章甲磺隆胁迫下根际微生物生态的动态变化 4 1 引言 甲磺隆是当前商品化磺酰腮类除草剂中活性最高的个品种。它为白色结晶 固体，是一类弱酸性的除草剂，p k a 为3 3 ，熔点为1 6 3 1 6 6 。c 在水溶解度随 p h 值升高而加大( 苏少泉，1 9 9 0 ) 。目前，我国通常用于麦类，水稻玉米等作 物的阔叶杂草的防治。然而甲磺隆除草剂对杂草防治的同时，均会不可避免地 进入土壤由于这类除草剂具有很高的活性和很强的选择性，土壤中极少量的残 留即可对后茬作物的正常生长带来很大影响。 甲磺隆除草剂在土壤中主要是通过化学水解和微生物降解两种途径来降解 的。目前国内