（食品科学专业论文）豆豉纤溶酶产生菌的筛选、培养及微生态制剂的研究.pdf

0 之 关于硕士学位论文使用授权的说明 论文题目：亘夔红鎏匿亡生萱笪箍造! 蛰差壁筮生查剑型笪硒塞 本学位论文作者完全了解大连轻工业学院有关保留、使用学位论 文的规定，大连轻工业学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论 文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文 的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 是否保密( 乡、) ，保密期至渺( 3 年夕月1 日为止。 。 学生签名：銎：! 蛩 导师签名：益垄壹二 i o 叼年铲月厂日 摘要 摘要 本文以从豆豉中得到产纤溶酶活性较高的菌株并将其保存为目的，利用纤维蛋白平 板筛选和纤溶活性测定相结合的方法进行菌株筛选，通过生理生化特征分析和1 6 s r d n a 扩增及序列测定的方法进行菌种鉴定，选用单因素试验和正交试验相结合的方法 进行产酶条件的优化，采用真空冷冻干燥的方法将菌株制成微生态制剂。 通过筛选得到两株纤溶活性较高的菌株，分别是纤溶活性为3 7 2 3 i u m l 的3 号菌 株和纤溶活性为2 8 7 7 i u m l 的9 号菌株。对3 号菌株和9 号菌株进行形态、生理、生 化鉴定，初步鉴定3 号菌株和9 号菌株为枯草芽孢杆菌。再将3 号菌株进行1 6 sr d n a 扩增及序列测定，进一步确定3 号菌株为枯草芽孢杆菌。 通过对3 号菌株培养基的优化，确定最佳碳源为大米粉，最佳氮源为酵母膏，最佳 碳氮比为l ：l ，且碳源和氮源的浓度分别为2 。通过对离子组成和培养基的正交试验， 确定最佳培养基配方为大米粉2 ，大豆粉2 ，酵母膏0 8 9 6 ，麸皮0 7 5 ，k 2 h p 0 40 4 ， k h 2 p 0 40 3 ，c a c i ：0 0 2 ，m g s 0 40 0 7 。 通过对发酵工艺条件优化，确定3 号菌株的最佳发酵条件：初始p n 值为7 5 ，发 酵时间为7 2 h ，接种量为4 ，摇瓶装液量为3 0 m l ( 2 5 0 m l 摇瓶) ，培养温度为3 4 ， 摇床转速为1 8 0 r m i n 。按照确定的培养基配方和发酵工艺条件对3 号菌株进行发酵培养， 测定4 2 0 n m 处的o d 值、p h 值和纤溶活性，确定菌体生长和产酶过程并不是同步的， 菌体产酶的过程要滞后于菌体的生长过程。 通过耐受性试验，确定3 号菌株对高温、酸碱和胆汁均有一定的耐受性，具有制备 微生态制剂的可行性。3 号菌株经真空冷冻干燥制成菌粉，确定最佳单因素保护剂为甘 油6 ，其添加量为保护剂：菌液= 1 ：2 ( 体积比) 。通过正交试验确定最佳保护剂配方为 甘油6 ，麦芽糖8 ，脱脂乳1 5 ，蔗糖8 。将冻干菌粉分别在常温、冷藏( 4 c ) 和冻 藏( - 2 0 ) 条件下贮存，最终确定冷藏( 4 。c ) 状态下保存菌粉的效果最好，经过六个 月的保存期后，其活菌存活率可达4 7 7 6 。 关键词：豆豉，纤溶酶，筛选，菌种鉴定，产酶条件，微生态制剂 a b s t r a c t a b s tr a c t t h i ss t u d yi st og e tas t r a i nw i t ht h eh i g h l ya c t i v i t yo ft h ee n z y m ef r o mf e r m e n t e d s o y b e a na n ds t o r ei t ，t h es t r a i nw a ss c r e e n e db yu s i n gf i b r i np l a t ea n df i b r i n o l y t i ca c t i v i t y a s s a ya n di t sm o r p h o l o g y , p h y s i o l o g y , b i o c h e m i s t r ya n d16 sr d n af o rs t r a i ni d e n t i f i c a t i o n w e a et e s t e d t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sa n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t sf o rp r o d u c i n ge n z y m ea n d f r e e z e - d r y i n go f t h es t r a i nw e r es t u d i e d t w os t r a i n sw i t ht h eh i g ha c t i v i t yo ft h ee n z y m ea reo b t a i n e db ys c r e e n i n g t h ee n z y m a - t i ca c t i v i t yo f n o 3a n dn o 9i s3 7 2 3a n d2 8 7 7 i u m lr e s p e c t i v e l y t h e yw r ec h a r a c t e r i z e d i n i t i a l l ya sb a c i l l u ss u b t i l i sb yt e s t i n gi t sm o r p h o l o g y , p h y s i o l o g y ，a n db i o c h e m i s t r y n o 3 w a sc h a r a c t e r i z e di n i t i a l l ya sb a c i l l u ss u b t i l i sb y16 sr d n a t h ec o n d i t i o n so f n o 3f o rp r o d u c i n ge n z y m ew e r eo p t i m i z e d t h ec a r b o ns o u s ei sr i c e p o w d e ra n dn i t r o g e ns o u r c ei sy e a s te x t r a c t t h ep r o p o r t i o no fc a r b o ns o u r c ea n dn i t r o g e n s o u r c ei s1 ：l ，a n dc o n c e n t r a t i o ni s2 ，r e s p e c t i v e l y t h eo p t i m u mm e d i u mf o rp r o d u c i n ge 1 1 - z y m ew a so b t a i n e da c c o r d i n gt oo n h o g o n a le x p e r i m e n t sa n di t sf o r m u l a r yi sd e f a t e dr i c e p o w d e r2 ，s o y b e a np o w d e r2 ，y e a s te x t r a c t0 8 ，m a i z es t a r e0 7 5 9 6 , k 2 i - i p 0 40 4 ，k h 2 p 0 4 0 3 c a c l 20 0 2 ，m g s 0 40 0 7 t h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so f n o 3w e t ed e t e r m i n e d t h er e s u l t ss h o wa s f o l l o w s ：p i - i7 5 ，7 2 h , t h ev a c c i n a t i o no f q u a n t i t yi s4 t h ei n s t a l l i n go f l i q u i dv o l u m ei s3 0 m l 2 5 0 m l ，3 4 ，t h er o t a t i n gs p e e do f o s c i l l a t o ri s1 8 0 r m i n n o 3w a si n c u b a t e du n d e r t h e s ec o n d i t i o n sw i t hm e a s u r i n go d a 2 0 ，p ha n dt h ee n z y m a t i ca c t i v i t y t h eg r o w t ho fs t r a i n a n dp r o d u c i n ge n z y m ea r en o ta tt h es a m et i m e t h et i m eo fp r o d u c i n ge n z y m ei sl o n g e rt h a n g r o w t ho f s t r a i n t h i sp a p e rs t u d i e dt h et o l e r a n c eo f n o 3 s o m es t r a i n so f n o 3c a ns t i l ll i v ea f t e rk e e p i n gs o m et i m eu n d e rh i g ht e m p e r a t u r e ，a c i d ，a l k a l io rb i l er e g a r d l e s so fi t ss p o r e o rv e g e t a t i v e f o r m n o 3w a sp r e p a r e df o rp o w d e rb yf r e e z e - d r y i n g t h eo p t i m u ms i n g l ef a c t o rc r y o p r o t e - c t a n ti sg l y c e r i n e6 c r y o p r o t e c t a n t ：s o l u t i o ne q u a lt o1 ：2 ( v o l u m ep e r c e n t ) t h eo p t i m u m c r y o p r o t e c t a n ti so b t a i n e da c c o r d i n gt oo r t h o g o n a le x p e r i m e n t sa n d i t sf o r m u l a r yi sd e f a t e d g l y c e r i n e6 m a l t o s e8 ，n o n f a td r i e dm i l k15 9 6 , s u c r o s e8 t h el i v i n gb a c i l l u si nt h ef r e e z e a b s t r a c t d r i e dp o w d e rb e c o m el e s sw h e ni ti sk e p tu n d e rr o o mt e m p e r a t u r e ，r e f r i g e r a t i o na n df i c e z i n g t h el i v i n gb a c i l l u si st h em a x i m u mw h e ni ti sk e p ti nr e f r i g e r a t i o n t h el i v a b i l i t yo f n o 3i s 4 7 7 6 a f t e rs i xm o m h k e yw o r d s ：f e r m e n t e ds o y b e a n ，fib rin oiy tice n z y m e ，s c r e e n ，s t r ain i d e n t i f i c a t i o n ，e n z y m ep r o d u c t i o nc o n d i t i o n s 。m i o r o e o o i o g i c a ip h a r m a c e u t i o s m 目录 目录 第一章绪论1 1 1 豆豉简介1 1 1 1 豆豉的营养学特性l 1 i 2 豆豉保健功能成分研究存在问题及研究展望2 1 2 豆豉纤溶酶简介3 1 2 1 豆豉纤溶酶的发现3 1 2 2 豆豉纤溶酶产生菌筛选的研究4 1 2 3 豆豉纤溶酶产酶条件的研究5 1 2 3 1 固态发酵5 1 2 3 2 液态发酵5 1 2 4 豆豉纤溶酶基因工程的研究6 1 2 5 豆豉纤溶酶纤溶活性的测定方法7 i 2 5 i 琼脂糖一纤维蛋白平板法7 1 2 5 2 纤维蛋白块溶解时间法( c l t 法) 7 1 2 5 3 血清板法7 1 2 5 4 肽底物法7 1 2 5 5 酶联免疫吸附法( e l i s a ) 8 l2 6 豆豉纤溶酶溶栓作用的研究8 1 2 7 豆豉纤溶酶的应用前景8 1 3 微生态制剂9 i 3 1 定义及分类9 1 3 2 作用机理9 i 3 3 选用菌种的基本要求1 0 i 3 4 生产工艺1 0 1 3 5 发展历史及应用现状1 0 1 3 6 微生态制剂的发展方向i l 1 4 本课题研究的意义和主要内容i l 目录 1 4 1 本课题研究的意义1 1 1 4 2 本课题研究的主要内容1 2 第二章实验材料与方法1 3 2 1 实验材料1 3 2 1 - l 材料1 3 2 1 2 试剂与药品1 3 2 1 3 仪器和设备1 5 2 1 4 培养基1 6 2 2 实验方法1 6 2 2 1 纤维蛋白平板的制备及其酶活的测定1 6 2 2 2 豆豉纤溶酶产生菌的筛选1 7 2 2 2 1 培养方法1 7 2 2 2 2 菌种的筛选1 7 2 2 3 纤溶酶产生菌的分类鉴定1 7 2 2 3 1 革兰氏染色1 7 2 2 3 2 鞭毛染色1 8 2 2 3 3 芽孢染色1 8 2 2 3 4 荚膜染色1 9 2 2 3 5 过氧化氢酶的测定1 9 2 2 3 6 甲基乙酰甲醇试验( v p 试验) 1 9 2 2 3 7 甲基红试验( m r 试验) 1 9 2 2 3 8 吲哚试验1 9 2 2 3 9 淀粉水解2 0 2 2 3 1 0 酪素水解2 0 2 2 3 1 l 明胶水解2 0 2 2 3 1 2 硝酸盐还原试验2 l 2 2 3 1 3 柠檬酸盐或丙酸盐的利用2 l 2 2 3 1 4 在p h 5 7 营养肉汤上的生长2 1 2 2 3 1 5 糖发酵试验2 2 2 2 3 1 61 6 sr d n a 扩增及序列测定2 2 2 2 4 培养基的优化2 2 v 目录 2 2 4 1 培养方法2 2 2 2 4 2 不同碳源对产酶的影响2 3 2 2 4 3 不同氮源对产酶的影响2 3 2 2 4 4 不同碳氮比对产酶的影响2 3 2 2 4 5 离子组成对产酶的影响2 3 2 2 4 6 正交试验优化培养基组成2 3 2 2 5 发酵工艺条件的优化2 4 2 2 5 1 培养基初始p h 对产酶的影响2 4 2 2 5 2 发酵时间对产酶的影响2 4 2 2 5 3 接种量对产酶的影响2 4 2 2 5 4 摇瓶装液量对产酶的影响2 4 2 2 5 5 培养温度对产酶的影响2 4 2 2 5 6 摇床转速对产酶的影响2 4 2 2 6 发酵参数的测定2 4 2 2 7 筛选菌株对特殊环境因素耐受性的研究2 5 2 2 7 1 培养方法2 5 2 2 7 2 耐高温试验2 5 2 2 7 3 耐酸、碱试验2 5 2 2 7 4 耐胆汁试验2 5 2 2 8 冻于保存菌株的研究2 6 2 2 8 1 单因素保护剂对冻干菌株存活率的影响2 6 2 2 8 2 正交试验优化保护剂2 6 2 2 8 3 贮存温度、储藏时间对冻干菌粉中活菌数的影响2 7 第三章实验结果与讨论2 8 3 1 尿激酶标准曲线2 8 3 2 豆豉纤溶酶产生菌的筛选2 9 3 3 菌种鉴定3 0 3 3 1 菌体形态3 0 3 3 2 菌落培养特征3 1 3 3 3 生理生化特征3 l 3 3 41 6 sr d n a 扩增及序列测定3 3 目录 3 3 4 11 6 sr d n 基因的扩增产物3 3 3 3 4 2 序列比对分析3 4 3 43 号菌株培养基的优化3 7 3 4 1 不同碳源对产酶的影响3 7 3 4 2 不同氮源对产酶的影响3 8 3 4 3 不同碳氮比对产酶的影响3 8 3 4 4 不同离子组成对产酶影响4 0 3 4 5 优化培养基配方4 1 3 53 号菌株发酵工艺条件的优化4 3 3 5 1 培养基初始p h 对产酶的影响4 3 3 5 2 发酵时间对产酶的影响4 4 3 5 3 接种量对产酶的影响4 4 3 5 4 摇瓶装液量对产酶的影响4 5 3 5 5 培养温度对产酶的影响4 6 3 5 6 摇床转速对产酶的影响4 6 3 63 号菌株发酵参数的测定4 7 3 73 号菌株对特殊环境因素耐受性的研究4 8 3 7 13 号菌株对高温的耐受性4 8 3 7 23 号菌株对酸、碱的耐受性5 0 3 7 33 号菌株对胆汁的耐受性5 l 3 8 冻干保存3 号菌株的研究5 l 3 8 1 单因素保护剂对存活率的影响5 1 3 8 2 正交试验优化保护剂配方5 3 3 8 3 贮存温度、储藏时间对冻干菌粉中活菌数的影响5 4 第四章结论5 6 参考文献5 8 致谢6 3 附录参与科研工作及论文发表6 4 第一章绪论 1 1 豆豉简介 第一章绪论 豆豉是我国古老的大豆发酵制品之一，药食兼用。在漫长的历史长河中，对我国人 民的饮食文化和医疗保健，发挥着重大作用。其独特的酿造工艺是我国先民在古代科学 技术方面的伟大成就n 1 。豆豉不仅好吃，有药用价值，而且它的营养价值也是非常的高。 豆豉含有多种氨基酸、维生素b ，和麸酸钠等一类物质，能使很多种菜肴增加美味。因为 大豆的蛋白质含量很高，普遍在4 0 左右，这种价廉物美的豆制品显然可以弥补蛋白质 摄取不足的问题，而且经常食用豆豉还可以帮助消化，具有延缓衰老、增强脑力、降低 血压和预防脑血栓形成等功效堙1 。 1 1 1 豆豉的营养学特性 大豆蛋白质含有人体不能合成而必须从食物摄取的8 种必需氨基酸，除蛋氨酸外， 大豆蛋白中含量均较多、较平衡，特别是赖氨酸含量高；大豆脂肪含不饱和脂肪酸占8 0 以上。大豆脂肪中含有人体所必需的亚油酸平均达5 0 8 ，亚麻酸平均为6 8 ；尤其是 大豆不含胆固醇；大豆中还有1 8 - - - 3 2 的磷脂，具有多种保健功能h 1 。豆豉在发酵过 程中微生物中的蛋白酶使原料大豆的蛋白质部分水解，故发酵成熟时，可使水溶性氮的 含量提高，并使大豆的硬度下降。大豆中含有的胰蛋白酶抑制剂可以抑制小肠中胰蛋白 酶的活力。大豆含有5 的纤维素，这些纤维素使蛋白质不易与消化酶接触，整粒大豆食 用时，其蛋白质消化率仅为6 0 l 右。在豆豉的加工过程中破坏了胰蛋白酶抑制物；纤 维酶使纤维素水解生成单糖蛋白酶容易与蛋白质接触水解产生一系列的中间产物，如多 肽、氨基酸等，这些低分子量的蛋白食入后，可以不再经过消化直接为肠粘膜吸收，这 对消化力减退和患有消化功能障碍的病人是十分有利的。豆豉与原料熟化豆相比，其维 生素b ，的含量有明显提高；维生素a 、e 的含量基本不变。大豆的矿物质含量丰富，但 是大都以植酸盐的形式存在，植酸盐是肌醇磷酸酯的钾、钙、镁复盐。大豆中7 0 - - 8 0 的磷不易为人体利用，约有6 0 9 域排出体外；钙与植酸结合形成不溶性钙，约有7 0 , - - - 8 0 不被人体吸收残留在粪便中；铁与植酸盐结合形成不溶性铁，使大豆中铁的吸收率仅为 7 ；植酸还能与锌结合形成不溶性盐而使利用率下降。在豆豉加工过程中，由于微生物 第一章绪论 分泌的活性植酸酶能使植酸水解生成肌醇和磷酸盐，植酸可减少1 5 2 0 ，因而，矿物 质的可溶性可增加2 3 倍，利用率可增加3 0 一- , 5 0 b 3 。现将豆豉的营养成分列于下表。 表1 - 1 新鲜豆豉的维生素和矿物质含量 亿i b 1 11 1 塘c o n t e n to f f i t a m i na n dm i n i mm a t t c r o f 舭s hb l a c kc u r db e a m 营养素 每1 0 0 9 含量美国r d a1 0 0 9 豆豉中的量占r d a 的百分数 va(iu)42 5 0 0 01 vm(rag)028 1 51 9 v b ：( n a g ) 0 6 5 1 7 2 8 烟酸( m g ) 2 5 22 01 3 泛酸( m g ) 0 5 2 1 0 7 vbll(pg)830 2 0 0 04 2 叶酸( 峙) 1 0 04 0 02 5 v m ：( i i g ) 3 93 03 0 生物素( 肛g ) 5 3 3 0 0 1 8 钙( n a g ) 1 4 21 0 0 01 4 磷( t a g ) 2 4 01 0 0 0 2 4 铁( n a g ) 51 82 8 1 1 2 豆豉保健功能成分研究存在问题及研究展望 豆豉营养价值极高，制作及食用豆豉在我国已有上千年历史，现在己普及到朝鲜、 日本及东南亚等国家，对亚洲人饮食生活和健康，起到很重要作用。国外豆豉研究以日 本n a t t o 、印尼t e m p e 研究较为深入，他们不仅研究工艺的改进，近十余年主要研究这类 发酵食品保健功能，日本现已利用纳豆进行深加工为胶囊，开发成保健品。欧、美等国 学者对大豆发酵食品营养价值和保健功能的研究兴趣也越来越浓。但n a g o 及t e m p e 与国 内毛霉、曲霉型豆豉是完全不同两类产品，而且前两类食品有很强地方嗜好性，不适合 大多数中国居民口味。迄今为止，对中国传统发酵食品豆豉功能性的报道鲜有所见。 国内对豆豉的研究主要集中在优良菌种选育和传统工艺改造。从1 9 9 7 年以来，西南 农业大学石轶松h 1 等对豆豉类黑精的形成机理及理化功能性质进行研究；陈留记婿1 等对 2 第一章绪论 豆豉褐变机理进行探讨，为解决豆豉速成低盐化生产工艺奠定基础；西南农业大学杜木 英哺川等曾对豆豉生产过程中生化机理进行系统研究，为采用纯种发酵大规模生产豆豉 提供可行工艺技术。国内对豆豉保健功能研究仅限于丹贝异黄酮阻叫u 、豆豉类黑精n 2 1 、 豆豉多糖n 3 1 等有限几篇文献，豆豉其他保健功能成分研究尚在起步阶段。尽管豆豉起源 于我国，然而我国对豆豉的研究还不够深入，应进一步研究各种功能性成分在发酵过程 中变化；运用保健食品研究新技术、新方法，对豆豉特殊功能成分进行分离、提取及保 健功能研究，揭示药食兼用的豆豉生理活性物质，明确其保健功能成分；深入研究豆豉 活性成分结构、作用机理及其加工稳定性等，从而进一步挖掘我国丰富的食疗宝库，生 产出具有中国特色的豆豉保健食品，使此传统食品走向世界。 1 2 豆豉纤溶酶简介 1 2 1 豆豉纤溶酶的发现 微生物是溶栓药物的重要来源。除早期发现的p 一溶血链球菌( s t r e p t o c o c c u s h e m o l y t i c u s ) 产生的链激酶( s t r e p t o k i n a s e ，s k ) 和金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) 产生的葡激酶( s t a p h y l o k i n a s e ，s a k ) 外，近年来又成功筛选到许多产生纤溶活性物质 的菌株，如放线菌( a c t i n o m y c e st h e r m o v u l g a r i s ) n 副、链霉菌( s t r e p t o m y c e ss py 4 0 5 1 5 1 、 s t r e p t o m y c e sm e g a s p o r u ss t r a i ns d 5 m 1 ) 、黄青霉菌( p e n i c i l l u mc h r y s o g e n u m ) c 1 7 镰孢 菌( f u s a r i u m p a l l i d o r o s e u m ) n 引、尖镰孢菌( f u s a r i u mo x y s p o r u m ) n9 | 、旋孢霉菌 ( c o c h l i o b o l u sl u n a t u s ) 昭们以及海藻( c o d i u md i v a r i e a t u m 【2 “、c o d i u ml a t u m 1 ) 等。 1 9 8 7 年日本学者须见洋行从日本传统发酵食品纳豆中提取出一种具有纤溶性质的酶，并 定名为纳豆激酶( n a t t o k i n a s e ，以下简称n k ) ，之后发现n k 具有安全性好，作用迅速持 久，成本低且注射与口服均有效等优点，可以弥补现有溶栓药物的缺陷，具有开发为新 型溶血栓药物的极大可能性而引起医药界与食品界的广泛关注2 刭。纳豆激酶是由发酵 纳豆的枯草芽孢杆菌分泌产生的丝氨酸蛋白酶，目前已发现了多株纳豆枯草杆菌， 1 9 9 2 年n a d a n m r a 等测定了纳豆激酶的基因序列，氨基酸排列次序也得以阐明，为从基因 工程角度提高纳豆激酶的产量和活性提供了可能啪1 。国内主要进行了纳豆杆菌液体发酵 条件、纳豆激酶的纯化等基本工作，有关基因水平的研究仅是近几年的事，尚未有大的 突破。受纳豆激酶研究的启发近十几年来科技人员又相继从根霉、链霉以及昆虫等材料 中发现有纤溶活性的蛋白质，为开发新型高效溶栓药物奠定了基础。1 9 9 6 年韩国的k i m 3 第一章绪论 等也从韩国传统食品豆酱中分离到产纤溶活性的蛋白酶乜7 j ，1 9 9 9 年前后阎家麒等从豆豉 中分离到一株枯草芽孢杆菌，发酵产物中含有高活性纤溶酶，与纳豆激酶有相似之处， 但作用方式又有所不同，未能确定此菌株是否为纳豆杆菌嘲1 。几乎同时，董明盛等从豆 豉等材料中分离到产纤溶酶菌种n k - 5 ，经确定与纳豆菌同为芽孢杆菌属枯草杆菌群。 在营养琼脂平板上菌落灰白色，表面粗糙有皱折，边缘不规则，无光泽，不透明，在肉 汤中生长不混浊，表面形成菌膜，厌氧不生长，为革兰氏阳性菌，由于未在分子水平进 行研究，根据产酶特性初步认定为纳豆杆菌群啪瑚1 。最初国内研究者认为豆豉纤溶酶产 生菌与纳豆杆菌同为枯草杆菌群。在自然进化过程中又发生一定变异b 川。然而最近彭勇 等以豆豉为材料分离到高产纤溶酶菌种d c - 2 和d c - 4 ，对其进行基因和分子水平研究。 结果表明，d c - 2 菌产纤溶酶基因与日本纳豆激酶基因n a t 在核苷酸序列上有9 3 4 同源 性，而氨基酸序列同源性则达9 4 5 基因大小一致，成熟肽均为2 7 5 个氨基酸，可以认为 是同一菌群。然而对d c - 4 研究表明该菌为解淀粉芽孢杆菌，与纳豆激酶基因同源性在 核苷酸序列上仅8 0 ，氨基酸序列同源性为8 6 5 ，与纳豆激酶不同，但酶的生化性质和 生物学功能相似，命名为豆豉溶栓酶口2 一引。由此看来，豆豉纤溶酶产生菌并非一种，来 源不同菌种在特性上有一定差异，有的菌种可以认为与纳豆杆菌同属一个菌群，变异较 小。但有的则不能认为是同菌群，值得进一步深入挖掘研究。 1 2 2 豆豉纤溶酶产生菌筛选的研究 目前，从豆豉中筛选出的产豆豉溶栓酶的菌株分别有枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i i l i s ) 和解淀粉芽孢杆菌( b a c i l l u sa m y l o l i q u e f a c i e n s ) 。河南绿十字生物工程研究所的阎家麒等 从自制豆豉中筛选出一株在发酵产物中产生高纤溶活性蛋白酶的枯草芽孢杆菌。接种到 5 l 发酵液中，得到的豆豉溶栓酶总活力为1 5 5 1 0 6 尿激酶单位( u k ) 2 8 o 南京农业大 学董明盛等从豆豉中分离得到产纤溶酶的高活力枯草芽孢杆菌，在优化条件下，发酵液 酶活达6 8 3 3 那m l 疆引。中国科学院韩润林等从豆豉中分离到一株枯草杆菌( h l 一9 8 6 ) ， 具有较高的溶栓酶( t h r o m b o l y t i ce n z y m e ，t e ) 活性，精制后比活达到了9 8 0 0 u m g ，活性 回收率为6 3 8 曙制。四川大学的彭勇等从豆豉中筛选到一株纤溶活性高达5 2 0 i u m l 和 具有良好体外溶栓效果的细菌菌株，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌，此为国内外首次口副。向 梅，吴思方等在从全国收集的2 1 个豆豉产品中分离到3 6 9 株革兰氏阳性芽孢杆菌，对 其进行产纤溶酶活性筛选，得到l 株高产纤溶酶菌株h g d l 0 7 。其溶圈面积达6 7 0 2 m m ，与国内文献报道的溶圈面积比较( 该文按a s t r u p 纤维蛋白平板法测定为7 2 8 m m 2 ) ， 4 第一章绪论 属于高产菌株m 1 。江南大学齐海萍等在普通培养基中添加血纤维蛋白作为初筛平板，通 过液态发酵的方法对纤溶酶产生菌进行复筛，结果从1 2 个产生地的豆豉中筛选出产纤 溶酶活力较高的菌株，酶活达到1 2 3 0 1 2 5 6 删m l 3 。 1 2 3 豆豉纤溶酶产酶条件的研究 现有的豆豉纤溶酶生产使用了固态发酵和液态发酵两种方法。其中，固态发酵操作 简单、周期短、成本低；液态发酵则易于控制和改变各种培养条件，且酶的产率较高， 质量较好，产品回收率较高。根据各文献报道，豆豉纤溶酶的活性大小与出发菌株及发 酵过程有密切关系。为此，除了选择性能优良的产酶菌株以外，还必须满足细胞生长繁 殖和发酵产酶的各种工艺条件，并要根据发酵过程的变化进行优化控制。 1 2 3 1 固态发酵 固态发酵是在煮熟的大豆上接种枯草杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) ，经培养后提取纤溶酶。 目前有两种方法，一是采用传统的中国豆豉生产方法制作豆豉，然后来提取酶乜引。二是 参照日本纳豆生产工艺协引，工艺流程如下： 流水浸泡 精选大豆一泡大豆 1 4 h 发酵大豆 保持成熟 5 。c ，保存l d 蒸煮接种发酵 煮大豆 1 3 0 ，5 5 m i n 3 8 ，湿度8 5 9 6 ，l l h 成熟的豆豉一提取纤溶酶 固态发酵工艺：江南大学的齐海萍等将菌体培养液喷在煮熟的大豆上，以其为底物 进行固态发酵生产溶栓酶。研究得出：最佳发酵时间2 8 h ，麦芽糖质量分数2 9 6 、n a c i 质 量分数0 1 9 6 、c d + 0 2 m g k g 、m 窖+ 0 3 m g k g ，最高酶活力可达n 1 e 5 6 i g g 。根据所选 枯草芽孢杆菌的菌丝生长特征，将发酵时隔水式恒温箱湿度控制在8 0 - 8 5 ，箱内温度 为3 7 0 5 4 c 。菌株入室时的品温不能低于4 0 啪3 。 1 2 3 2 液态发酵 液态发酵工艺：南京农业大学董明胜等通过实验，确定了液体发酵的最佳产酶培养 基，其质量分数为：豆粕粉2 0 、麸皮2 o 、玉米淀粉0 5 9 6 、k 2 h p 0 40 4 9 6 、m g s 0 4 5 第一章绪论 0 0 5 9 6 、c a c l 20 0 2 、p h7 0 。发酵培养基3 0 儿盛于2 5 0 n 1 l 三角瓶中， 置振荡器中3 7 。c ，1 2 0 f f m i n 振荡培养7 2 h ，纤溶酶活性达6 8 3 3 i u m l 嘲 物工程研究所的阎家麒等选用的发酵培养基质量分数为：麦芽糖2 o 豆浆3 0 o 、酵母浸膏0 2 、k i - 1 2 p 0 40 1 、k 2 h p 0 40 3 9 6 、m g s 0 4 5 h 2 00 0 5 9 6 、 c a c l 2 2 h 2 00 0 2 9 6 ，去离子水加至1 0 0 m l ，p h7 0 。在8 l 发酵罐中装5 l 培养基，接种 子液1 0 0 m l ，温度自动控制在3 0 0 2 。c ，p h7 0 ，搅拌转速8 0 0 r m i n ，通气量5 l m i n ， 发酵时间7 6 h 。最后得到纯酶比活达3 1 0 2 0 u k m g 啪1 。中科院韩润林等采用的培养基组成 为：酵母浸膏2 、麦芽糖0 2 9 6 、n a i - 1 2 p 0 40 7 、n a c l0 5 9 6 。在培养基1 0 0 m l 中接种 l m l ( 含芽孢1 0 9 个) ，3 0 ，摇床转速为1 6 0 r m i n ，发酵2 4 h ，离心除菌后得到酶活力为 6 1 0 i u m l 的发酵液b 引。湖北工学院吴思方等对从豆豉中筛选出的一株枯草芽孢杆菌 h g d l 0 7 进行液态产酶发酵条件研究，得到最适培养基配方，其质量分数为：大豆粉4 、 大米粉2 、c a c l 20 0 4 9 6 、m g s 0 40 0 7 9 6 、k 2 h p 0 40 4 、k h z p 0 40 2 ；最佳发酵条 件：初始p h7 0 ，发酵时间7 2 h ，温度3 2 ，摇床转速1 8 0 r m i n ，装液量2 0 m l ( 2 5 0 m l 三 角瓶) ，接种量6 。酶活可达到3 6 4 3 删m l 1 。 1 2 4 豆豉纤溶酶基因工程的研究 近几年来，对豆豉纤溶酶的报道主要集中在该酶的分离纯化和生化性质研究，而四 川大学彭勇等首先涉及了豆豉纤溶酶的基因工程研究。进行基因工程的研究，一方面可 以通过基因定点突变技术有目的地改造豆豉纤溶酶基因，从而提高d f e 的热稳定性和酶 活力；另一方面可以通过构建高表达载体，优化表达系统来提高d f e 基因的表达水平， 从而利用基因工程菌生产d i c e 。 四川大学彭勇等通过对自行筛选的解淀粉芽孢杆菌d c - 4 豆豉纤溶酶的酶学性质和 n 一端序列测定表明，豆豉纤溶酶是一种丝氨酸蛋白酶。他们将含有以解淀粉芽孢杆菌 d c - 4 总d n a 为模板进行p c r 反应所得到的重组质粒p e t - n d e 的阳性克隆进行双向测 序。结果表明，豆豉纤溶酶成熟肽编码区含有8 2 5 b p ，编码2 7 5 个氨基酸残基，推算其分 子量为2 7 7 1 0 3 ，与从该菌株发酵液中纯化的d f e 分子量( 2 8 k d ) 一致。 进一步在n c b i 中，对d f e 成熟肽编码区序列进行同源性分析，结果表明：豆豉纤溶 酶基因与来源于b a c i l l u s s u b t i l i s k 一5 4 的丝氨酸蛋白酶同源性最高( 9 7 8 ) ；而与纳豆激 酶的核苷酸的同源性仅有8 0 o ，与氨基酸的同源性仅为8 6 5 。这些结果从分子水平上 证明了d f e 与纳豆激酶不是同一种酶。另外虽然d f e 与芽孢杆菌属丝氨酸蛋白酶的同源 - 6 第一章绪论 性差别很大，但因为它们同属于丝氨酸蛋白酶，所以具有相同的活性中心，并且活性中 心附近的区域均有很高的同源性。 豆豉纤溶酶的融合表达采用的方法是将豆豉纤溶酶成熟肽编码区片段克隆到大肠 杆菌载体p e t 1 5 b 中，转化到大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) q b 进行高效表达。表达产物主要以包 涵体形式存在于大肠杆菌中，不易被宿主菌的蛋白酶水解。结果显示：当利用i p t g 诱导 表达，可获得大量的豆豉纤溶酶融合蛋白，表达量高达菌体可溶性蛋白的4 0 嘞1 。 1 2 5 豆豉纤溶酶纤溶活性的测定方法 目前测定纤溶酶活性的方法有以下5 种。 1 2 5 1 琼脂糖一纤维蛋白平板法 这是a s t r u p ( 1 9 5 2 年) 发表的方法啪1 ，先制备纤维蛋白平板，然后用微量注射器将粗 酶液和标准尿激酶液滴于平板上，3 7 。c 恒温放置1 8 h ，测其溶解圈直径，以其乘积( m m 2 ) 表示酶活或计算出相当于尿激酶活力的单位数( 定义为聊。此法较为简便易行，所以常 被采用。但由于完全是表观值，受恒温时间影响较大，因此对恒温时间控制是非常重要 的。 1 2 5 2 纤维蛋白块溶解时间法( c l t 法) 从纤维蛋白形成开始计时，随着反应液浑浊，有气泡上升到液面，到气泡冒出停止 时，作为纤维蛋白溶解时间( c l t ) 。此法迅速快捷，有较大的分辨率，更适于粗酶的活 性测定。但随着灵敏度的提高，溶解时间的判断也更加困难。除非有新型、方便的计时 装置，否则同时测定多个样品是较困难的h 副。 1 2 5 3 血清板法 将血清板制成微型纤维平板，然后在每个孔内加入不同浓度的豆豉纤溶酶，反应开 始后4 h 内，每3 0 m i n 测定一次o d 6 5 5 ，纤维形成初始，在6 5 5 n m 处的吸光度最大，随 着纤溶酶的加入，使纤维溶解，从而吸光度下降。吸光度的减少同纤溶酶的浓度成线性 关系。此法可以同时测定多个样品，而且4 h 内可对酶活