（食品科学专业论文）花生粕蛋白的提取及性质研究.pdf

摘要 花生粕蛋白的提取及性质研究 学科、专业：工学、食品科学 硕士研究生姓名：高云中 指导教师：张晖教授 摘要 入学时间：2 0 0 7 年9 月1 日 答辩时间：2 0 0 9 年6 月1 3 日 授予学位时间：2 0 0 9 年6 月2 5 日 本论文系统的研究了高温花生粕蛋白的生产工艺，包括花生分离蛋白的提取以及浓缩蛋 白的制备，并对花生蛋白的功能性质进行较为全面的研究，以期为深度开发和利用高温花生 粕资源提供更加有效的途径，实现花生加工业副产物的有效增值。 通过预实验选取粒径范围为2 0 岬5 0 p r o 的高温花生粕粉为原料，确定的最佳碱提工艺参 数为：p h 值9 5 ，温度6 0 ，料液比1 ：1 2 ，反应时间为2 h 。在此工艺条件下，花生分离蛋白 的提取效率为4 6 5 1 ，纯度为8 9 4 3 。将得到的花生分离蛋白经过进一步醇洗，其中7 5 的 黄酮被脱除。醇洗后花生分离蛋白的色泽明显改善，蛋白纯度和体外消化率都有一定的提高。 醇洗后花生分离蛋白二级结构中0 c 螺旋和p 折叠结构明显增加，而p 转角和无规卷曲结构减 少，二级结构变得更加有序。 以粒径范围为5 0 9 m 1 0 0 n 的高温花生粕粉为原料，采用复合酶解结合醇洗的方法制备 花生浓缩蛋白。实验确定花生浓缩蛋白的最佳制备工艺为：糖化酶复合酸性纤维素酶( 使用 量分别为3 0 0u g 和2 5 0u g ) ，料液比为1 ：1 0 ，p h 为4 5 ，温度为5 5 ，反应2 h ，3 0 0 0r m i n 离心3 0m i n ，弃去上清液，残渣继续醇洗，醇洗工艺为乙醇浓度为7 5 ，料液比为l ：1 1 ， 醇洗温度为5 5 ，醇洗2 5 h ，3 0 0 0r m i n 离心3 0m i n ，弃去上清液，残渣干燥后得花生浓缩 蛋白。此条件下得到的花生浓缩蛋白纯度为6 5 0 5 ，与原料中4 2 蛋白含量相比提高了2 3 。 此工艺下产品的得率为6 1 3 。 将提取的花生浓缩蛋白添加到香肠中替代部分大豆浓缩蛋白。当花生浓缩蛋白的替代比 例为6 0 时，香肠的质构特性和感官性质达到最佳，并优于未添加花生浓缩蛋白的香肠。 关键词：高温花生粕；花生蛋白；超微粉碎；醇洗；功能性质；二级结构 a b s t r a c t s t u d yo i le x t r a c t i o na n dp r o p e r t i e so fp e a n u tm e a l p r o t e i n s u b j e c t ，s p e c i a l t y ：e n g i n e e r i n g ，f o o ds c i e n c e t i m eo fe n r o l l m e n t ：01 0 9 2 0 0 7 m a s t e rg r a d u a t es t u d e n t ：y u n z h o n gg a ot i m eo fo r a ld e f e n s e ：13 0 6 2 0 0 9 f a c u l t ya d v i s e r ：h u iz h a n gp roftimeo f c o n f e r r i n gd e g r e e ：2 6 0 6 2 0 0 9 a b s t r a c t t h ep r o t e i np r o d u c t i o np r e p a r e df r o mh i g h - t e m p e r a t u r ep e a n u tm e a l ( h t p m ) w a si n t r o d u c e d s y s t e m a t i c a l l yi nt h i sp a p e ri n c l u d i n ge x t r a c t i o no fp e a n u tp r o t e i ni s o l a t e ( p p i ) a n dp r o c e s so f p e a n u tp r o t e i nc o n c e n t r a t e ( p p c ) a n di t sf u n c t i o n a lp r o p e r t i e sw e r ea l s os t u d i e dc o m p r e h e n s i v e l ys o a st op r o v i d ee f f e c t i v ea p p r o a c h e sf o rp ma p p l i c a t i o na n dd e v e l o ph i g hv a l u e a d d e dp r o d u c t sf o r h u m a nc o n s u m p t i o n h t p mo f2 0 p m 一5 0 p r nw a sd e t e r m i n e da sr a wm a t e r i a lb yp r e l i m i n a r yt e s t p p iw a se x t r a c t e d b ya l k a l i n ee x t r a c t i o na n da c i dp r e c i p i t a t i o n a c c o r d i n gt ot h es i n g l ef a c t o ra n do r t h o g o n a lt e s t ，t h e o p t i m u me x t r a c t i o nc o n d i t i o n sw e r ed e t e r m i n e d ：p h9 5 ，t e m p e r a t u r e6 0 ，s o l i d s o l v e n tr a t i o 1 ：1 2 ，r e a c t i o nt i m e2 h ，u n d e rw h i c hi t sp r o t e i ne x t r a c t i o nr a t er e a c h e d4 6 5 1 a n dp u r i t yr e a c h e d 8 9 4 3 t h ef u r t h e rp r o c e s so fa l c o h o lw a s h i n gr e m o v e d7 5 f l a v o n o i d so fp p ia n ds i g n i f i c a n t l y i m p r o v e dt h ec o l o rw h o s el i g h t n e s si n c r e a s e d5 4 a n dc o l o rv a l u e sd e c r e a s e d2 0 t h e r ew e r e m o r ea h e l i c a la n d1 3 - s h e e ts t r u c t u r e sa n df e w e ri ；- t u r n sa n dr a n d o mc o i ls t r u c t u r e sa f t e ra c o h o l w a s h i n g s ot h es e c o n d a r ys t r u c t u r eo fp p ib e c a m em o r et i g h t l yf o l d e d t a k i n gh t p mo f5 0 b i n 。l0 0 1 a ma sr a wm a t e r i a lt op r e p a r ep e a n u tp r o t e i nc o n c e n t r a t e ( p p c ) b ym i x e de n z y m a t i cm e t h o dc o m b i n e dw i t l la l c o h o lw a s h i n g a m o n gs e v e r a lc o m m o ne n z y m e s ， c e l l u l a s ea n dg l u c o a m y l a s ew a ss e l e c t e da st h eo p t i m u mc o m b i n a t i o na n di t se n z y m o l y s i s t e c h n o l o g yw a sd e t e r m i n e d t h r o u g hb o x - b e n h n k e nc e n t e rc o m p o s i t ed e s i g na n dr e s p o n s es u r f a c e m e t h o d o l o g y , t h eo p t i m u ma c o h o lw a s h i n gc o n d i t i o n sw e r eo b t a i n e d c o m b i n e dm i x e de n z y m a t i c h y d r o l y s i sw i ma l c o h o lw a s h i n gp r o c e s sw h o s eo p t i m u me x t r a c t i o np r o c e s so fp p cw a sf i g u r e do u t ： s o l i d s o l v e n tr a t i o1 ：1 0 ，c e l l u l a s ea d d i t i o n2 5 0u g ，g l u c o a m y l a s ea d d i t i o n3 0 0u g ，p h 4 5 ， t e m p e r a t u r e5 5 ，e n z y m o h y d r o l y s i st i m e2 h a l c o h o lw a s h i n gp r o c e s sw a sc a r r i e do u ta f t e rt h e c e n t r i f u g a t i o n 诵t l l i t s o p t i m i z et e c h n o l o g y ：t e m p e r a t u r e5 5 。c ，a l c o h o l c o n c e n t r a t i o n7 5 ， s o l i d s o l v e n tr a t i ol ：l1 ( v w ) ，a l c o h o lw a s h i n gt i m e2 5 h u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s ，t h ep u r i t yo f p r o t e i nc o u l dr e a c h6 5 0 5 ，i n c r e a s i n gb y2 3 c o m p a r e dw i t l lt h er a wm a t e r i a la n di t se x t r a c t i o n r a t ew a s6 1 3 p e a n u tp r o t e i nc o n c e n t r a t e ( p p c ) w a sa d d e dt os a u s a g e st or e p l a c ep a r to fs o y b e a np r o t e i n c o n c e n t r a t e ( s p c ) e x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tw h e n t h ea d d i t i o no fp p cw a s6 0 o ft o t a lv e g e t a b l e p r o t e i n ，b o t ht e x t u r ea n ds e n s o r yq u a l i t i e so fs a u s a g e sw e r eb e t t e rt h a nt h o s ew i t hn op p c k e y w o r d s ：h i g h - - t e m p e r a t u r ep e a n u tm e a l ；p e a n u tp r o t e i n ；s u p e rm i c r o m i l l i n g ；a l c o h o lw a s h i n g ； f u n c t i o n a lp r o p e r t i e s ；s e c o n d a r ys t r u c t u r e ； i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 渺罗年6 月捆 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：蚪导师签名： 日期：枷尹年月枷 l 引言 1 1 高温花生粕的研究现状 1 引言 在我国，每年5 0 6 0 的花生都用来榨油，花生经过榨油后的副产品花生粕养分 含量很高，其中含有丰富的蛋白质资源以及一些不溶性的花生纤维成分，具有很高的利用价 值i l j 。花生粕中粗蛋白质含量为4 0 5 0 ，代谢能含量超过大豆饼粕，达到1 2 5 5 僮，是 饼粕饲料中可利用能量水平最高者，但赖氨酸和蛋氨酸含量不足。花生粕中的花生蛋白几乎 包括人体必需的八种氨基酸，属于完全蛋白，其中谷氨酸、天冬氨酸较高，有丰富的营养价 值，在植物蛋白质中仅次于大豆蛋白质，但它却比大豆蛋白更易吸收，而且花生中含有的抗 营养因子比大豆更少。另外，花生蛋白可溶性蛋白质和氮溶指数高，不论添加到动物性食品 或是植物性食品中，都能起到改善食品品质、强化食品营养的作用。花生蛋白作为一种病员 食品，对帮助糖尿病、高血压病、动脉硬化症和肠胃病患者恢复健康均有一定的效果【2 1 。 花生粕根据制油工艺的不同可分为高温花生粕和低温花生粕两种。目前国内外主要利用 低温花生粕进行花生蛋白的提取及花生多肽的研究，而对高温花生粕的研究较少，这主要是 因为低度变性和中度变性花生粕中的蛋白质属不完全变性蛋白质，易于提取和利用，所以低 度变性和中度变性花生粕在食品方面的开发利用很广泛。然而，在我国由于对于花生蛋白的 开发利用起步较晚，花生行业的大部分产品都处于初级加工阶段，花生深加工产业极为薄弱， 大部分花生企业采用的传统榨油方法是机械压榨法和有机溶剂浸出法，这样产生大量的高变 性脱脂花生粕。对这部分蛋白资源的利用受生产技术条件限制，国内主要应用于饲料或作为 酿造食品原料等浅层次上，在采用高新技术对高变性脱脂花生粕进行综合利用和深加工方面， 显得较为薄弱，这就使我国的花生资源的巨大潜能在经济效益和社会效益上未能得以发挥。 虽然花生在提油过程中经高温热榨后，蛋白质受热变性并与其他物质发生复杂的反应，难以 进一步开发和利用，但经过科技工作者的努力，近年来我国在花生蛋白的提取及制备技术及 其利用方面取得了一定的进展，进行高温花生粕的综合利用成为可能。现在我国花生制油业 每年约有上百万吨的高温花生粕，具有很大的开发和研究利用价值【3 l ，其研究前景十分广阔。 1 2 蛋白热变性研究 高温花生粕在生产过程中受到高热作用，蛋白变性严重，分析热处理对蛋白结构及性质 的影响对于蛋白质的提取十分重要。王章存1 4 等人采用高效液相色谱( h p l c ) 和s e p h a r o s ec l - 4 b 凝胶柱色谱研究了热变性后米蛋白与糖相结合的情况。通过对热变性前后蛋白与糖的洗 脱曲线( 如图1 1 ) 可以得出，热变性蛋白的每个主要洗脱峰的总糖蛋白面积比( 中峰0 6 5 ， 后峰0 3 9 ) 均高于天然未变性的蛋白的总糖蛋白面积比( 中峰0 3 8 ，后峰0 3 1 ) ，这说明高温 热处理使蛋白质结合更多的糖类物质，而且结合非常紧密，形成了难溶的聚集化合物，其后 的红外对照分析也证实了这一结论。同时，王辉等人先后对热变性对小麦籽粒蛋白质【5 】、鸡 蛋蛋白和牛血清白蛋白【6 1 、大豆分离蛋白【7 】等结构及性质的影响进行研究，结果发现，高温热 江南大学硕士学位论文 处理能使蛋白的内部结构发生重大的改变，物质之间相互联结，作用力增强。而这些都阻碍 了蛋白质的溶出及其他非蛋白质的洗脱，使高变性蛋白质的利用变得十分困难。因此，对于 高温花生粕蛋白的提取及制备不能采用用于低变性花生粕的常规的方法，摸索出一条新的、 行之有效的制备工艺势在必行。 垦仉 皿 啊0 萋 萤 襄罱 1 - 1 a 未变性卜1 b 热变性后 图1 - 1 热变性前后米蛋白中蛋白质与糖的洗脱曲线 f i g 1 - 1e f f e c t so f h e a to ns u g a r - p r o t e i ne l u t i n gc u r v eo fr i c ep r o t e i n 1 3 花生蛋白及其制品的制备 萋 馨 确 1 3 1 花生蛋白粉 脱脂花生蛋白粉是一种重要的植物蛋白资源。它含有大量的蛋白质和多种营养成分，气 味清香，而大豆蛋白粉豆腥味较浓、色泽深，往往影响到食品的风味和外观，因而脱脂花生 蛋白粉以其特有的优越性在食品工业中被广泛使用。利用其凝胶性、吸油性、吸水性、乳化 性，可用于香肠、午餐肉、火腿等肉类制品和奶油制品加工中；利用其组织性可用于人造肉 类制品的生产嘲8 。花生蛋白粉的常用制备方法有五种，分别为低温预榨一浸出法 9 1 、水剂法【1 0 】、 膜分离技术【l l 】、水酶法【1 2 , 1 3 1 和冷榨法【1 4 , 1 5 】。 1 3 2 花生浓缩蛋白 花生浓缩蛋白是从脱脂花生粕中除去低分子可溶性非蛋白成分，主要包括可溶性糖、灰 分和各种其它成分等，制得的花生蛋白制品。早期国内进行花生浓缩蛋白提取的方法主要为 水剂法，虽然其具有不采用挥发性易燃溶剂的优点，但其工艺本身仍存在不少缺点，从而制 约了水剂法的推广应用【1 6 1 。目前花生浓缩蛋白的制备方法主要包括酸沉淀制备法、乙醇洗涤 制备法、酸沉淀和醇沉淀相结合制备法和己烷含水乙醇混合溶剂制备法。四种浓缩蛋白的制 取工艺尽管不同，但产品得率都相差不大【1 7 1 。此外国外开始探求用超滤法生产浓缩蛋白。酸 浸提法制得的浓缩蛋白虽然具有较好的功能特性，但蛋白质的得率较低，污水排放造成的环 境污染较为严重，综合效益差。超滤法制备的产品功能特性好，蛋白质得率较高，不足之处 在于产品无法干燥处理【1 8 】。醇法大豆浓缩蛋白的特点在于：产品的风味、色泽好、蛋白质得 率高；生产过程中无污水排放，避免了环境污染，而且更有利于对产品进行综合利用。 2 l 引言 1 3 3 花生分离蛋白 花生分离蛋白是花生蛋白中非常重要的一类，由于其蛋白纯度高( 9 0 ) ，营养全面， 含有人体必需的8 种氨基酸，具有色泽浅，风味淡雅，抗营养因子含量低等特点，可作为一种 极具开发潜力的蛋白基料和牛乳等动物奶类的替代品。花生分离蛋白优良的功能特性使其在 食品、化工和医药等领域中的应用潜力巨大【1 6 1 。虽然花生分离蛋白提取方面的研究起步相对 较晚，但是近几年的研究表明这种途径是切实可行的，并且具有良好的推广前景。花生分离 蛋白的制备方法主要包括碱溶酸沉法【1 9 】和超滤膜法【2 0 1 ，其中采用碱溶酸沉法进行花生分离蛋 白的制备研究较多，也较为全面。 1 4 花生蛋白的改性研究 植物蛋白的功能特性是指能对食品质量产生影响的某些物理、化学性质。主要包括吸水 性、湿润性、膨胀性、粘着性、分散性、溶解度、黏度、胶凝性、乳化性、起泡性等1 2 1 , 2 2 1 。 这些功能特性不仅与蛋白质的氨基酸组成、分子大小及结构形态等固有属性有关，而且还和 其它与蛋白质相互作用的食物组分，如：水、离子、脂肪等及所处的环境如温度、p h 值、电 离强度等有关。花生蛋白改性方法主要有物理改性、化学改性、酶改性掣2 3 1 。 物理改性主要是利用加热、机械作用、微波、声波等等方式改变蛋白质高级结构和分子 间的聚集方式，实际上物理改性就是在控制条件下的蛋白质的定向变性 2 4 1 ，如热变性【2 5 1 、高 压处理【2 6 】、高速剪切1 2 7 】等等。物理改性方法由于具有无毒，可接受性高的特点，更接近于食 品工业。超微粉碎是物理改性中常用的一类方法，它可使不同原料的颗粒大小发生改变，使 其减小为微米级甚至纳米级微粒，导致表面积和孔隙率的增加，使超微粉体具有独特的物理 化学性能，能够更广泛的应用到各种领域【2 ”6 j 。 花生蛋白的化学改性是指蛋白质分子结构的改变，其缺点在于它在对蛋白改性之余，同 时也带来一些不容人们忽视的营养和毒理上的危害；另外，化学试剂的残留也不适于食用， 对人畜等生物体有毒害作用。所以在进行花生蛋白质化学改性时要注意选取合适的、具有食 用安全性的改性试剂。 蛋白质分子在酶催化下有控制性的水解，将蛋白质分子中肽键打开，一般不会导致营养 损失，也不会产生毒理上的问题。但酶法改性对蛋白的肽键或多或少存在水解，从而降低了 蛋白质的功能性。 1 5 研究意义及内容 1 5 1 研究意义 我国“十一五发展目标明确提出2 0 0 5 - 2 0 1 0 年，我国花生加工业主要由数量的增长转 变为质量的提高，产品品种和经济效益同步增长，提高深加工转化率和利用率；进一步优化 产业结构和产品结构，着重提高生产技术水平和产品的科技含量【3 7 1 。本课题以高温花生饼粕 为主要原料，系统性研究了高温花生粕蛋白的制备、性质分析及其应用。论文的主要研究内 容主要分为两个部分，第一部分为高温花生粕分离蛋白的提取及性质研究；第二部分为高温 江南大学硕士学位论文 花生粕浓缩蛋白的制备及应用研究。 目前，高纯度花生蛋白的制备技术并不成熟，极大地限制了花生蛋白的应用范围。作为 一种经典的分离蛋白质的方法，碱提酸沉法可以用于高纯度花生蛋白的制取1 37 1 ，但对于高温 花生粕其提取率偏低以及所得蛋白的综合性质较差的问题一直得不到有效的解决，本部分研 究则主要注重这两方面的问题提出解决方案。据研究【3 8 】，不同粉碎粒度的粕粉原料对蛋白的 提取效率有显著影响，为了更好的利用高温花生粕，实验之前将原料进行超微粉碎处理，得 到不同粒径范围的超微粉体，通过分析不同粒径范围的粕粉对蛋白的提取效率的影响选择适 宜的原料粉碎粒度，同时通过对传统碱提工艺进行优化，使花生分离蛋白的提取效率有了较 大的提高。而在提取工艺的末期，采用醇洗对所得到的花生分离蛋白进行了进一步处理，使 分离蛋白的理化性质得到有效的改善，同时分析了醇洗对花生分离蛋白性质及结构的影响。 本部分研究结果不仅可为高温花生粕中花生蛋白的合理有效利用奠定基础，而且可为高变性 植物蛋白的提取分离技术提供有价值的参考数据。 花生浓缩蛋白是指蛋白纯度达到6 0 7 0 以上的花生蛋白，可作为食品添加剂及粮食强 化剂广泛应用于食品及饲料工业。花生粕中含有4 0 左右的花生蛋白，高温压榨后其内部结 构变得更加复杂，使得花生浓缩蛋白制备工艺中蛋白纯度的提高变得十分困难。因此，如何 提高高温花生粕中蛋白的纯度、制备花生浓缩蛋白并将其有效利用一直是油脂企业研究的热 点。试验证明，醇洗是一种去除糖类，提高蛋白的纯度的有效手段【3 9 1 ，但乙醇对高温花生粕 和低温花生粕中糖的萃取率不同。对于高温花生粕，在生产过程尤其是浸出湿粕的高温脱溶 过程中，花生粕受长时间的高温作用使得其中部分还原糖和蛋白质发生美拉德反应，这部分 糖难以被乙醇浸洗出来而留在粕粉中，从而使高温花生粕醇洗浓缩蛋白的蛋白质含量相对降 低。而在低温花生粕中，大部分的糖能够被乙醇浸提出来，从而大大提高了低温花生粕醇洗 浓缩蛋白的蛋白质含量。因此，鉴于单一的醇洗很难使高温花生粕蛋白的纯度达到浓缩蛋白 的要求，本文将酶解工艺与醇洗相结合，先通过酶解工艺去除高温花生粕中的部分杂质，再 采用醇洗手段进一步提高花生蛋白的纯度，改善浓缩蛋白的理化性质和功能性质，最终使产 品达到应用要求。通过对花生浓缩蛋白制备工艺的经济可行性研究表明，该工艺具有较好的 市场可行性。同时，将所得浓缩蛋白添加到香肠中替代部分大豆蛋白，分析不同的花生蛋白 替代比例对香肠品质的影响，为实现花生蛋白的在肉制品中应用提供实验依据。 1 5 2 主要研究内容 本论文的具体研究内容如下： 1 、花生分离蛋白提取工艺的优化研究； 2 、醇洗对花生分离蛋白的性质及结构的影响； 3 、花生浓缩蛋白的制各及性质研究； 4 、花生蛋白应用于香肠的研究。 4 2 实验材料与方法 2 1 主要材料与试剂 2 实验材料与方法 主要材料：高温花生粕山东鲁花花生油有限公司提供；大豆色拉油上海嘉里食品工 业有限公司提供；中温淀粉酶( 酶活：3 0 0 0u g ) 、高温淀粉酶( 酶活：2 万u 儋) 无锡杰能 科生物工程有限公司提供：糖化酶( 酶活：5 万u 儋) 、酸性纤维素酶( 酶活：4 万u g ) 黑 龙江肇东酶制剂公司提供；花生蛋白粉( 蛋白5 0 ) 山东高蓝山集团公司提供；猪肉( 肥 肉、瘦肉) 、食品级香辛料无锡大润发超市购得；大豆浓缩蛋白南宁庞搏生物科技有限 公司提供；马铃薯淀粉青岛正天食品有限公司提供； 主要试剂：硫酸铜，硫酸钾，氢氧化钠，硼酸，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，盐酸，硫酸、 复合磷酸盐、亚硝酸钠等，均为分析纯。 2 2 主要仪器 5 4 1 5 r 冷冻离心机，e p p e n d o r f d e l t a 3 2 0 型p h 计 j j 1 精密定时电动搅拌器 t g l 1 6 b 高速离心机 7 2 2 型光栅分光光度计 c r 4 0 0 色彩色差计 s h b i i i 型循环水式多用真空泵 w f zu v - 210 0 型紫外可见分光光度计 l g j 1 0 型冷冻干燥机 f l u k of a 2 5 型均质机 h t - 5 0 0 多功能超微粉碎机 盯高精密超微粉体分级机 a b 2 0 4 - n 型分析天平 k d n 0 8 消化炉，k d n 2 c 定氮仪 傅立叶变换红外光谱仪 m a s t e r s i z e 2 0 0 0 激光粒径测定仪 s l 3 0 0 多功能搅拌机 l g j 1 0 型冷冻干燥机 t a - x t 2 i 质构仪 h s 3 0 a 型液压灌肠机 z b 一2 0 型斩拌机 a 1 0 0 1 型电动绞肉机 美国 上海分析仪器三厂 江苏金坛市荣华仪器制造有限公司 上海安亭科学仪器厂 无锡科达智能仪器厂 日本k o n i c a m i n o u a 公司 郑州市上街华科仪器厂 尤尼柯( 上海) 仪器有限公司 北京四环科学仪器厂 上海弗鲁克流体机械制造有限公司 郑州华通机械厂 绵阳高新区巨子超微科技有限公司 梅特勒一托利多仪器( 上海) 有限公司 上海听瑞仪器仪表有限公司 n i c o l e tn e x u $ 4 7 0 ，美国 英国马尔文仪器公司 上海国生实业有限公司； 北京四环科学仪器厂 英国s m s 公司 沈阳市第三量具厂 河北省大厂县华映食品机械有限公司 济南金普源炊事机械有限公司 江南大学硕士学位论文 2 3 实验方法 2 3 1 原料基本成分测定 水分测定电b 5 0 0 9 3 2 0 0 3 ； 粗脂肪含量的测定g b 5 0 0 9 6 2 0 0 3 ； 粗蛋白的测定电b 5 0 0 9 5 2 0 0 3 ； 灰分的测定g b 5 0 0 9 4 2 0 0 3 ； 膳食纤维的测定a o a c 9 9 1 4 3 ； 淀粉的测定参照g b 5 0 0 9 9 2 0 0 3 。 2 3 2 原料超微粉碎处理 原料超微粉碎处理：将已粗粉碎的高温花生粕移至超微粉碎机中，不添加任何抗结剂、 助磨剂，对其进行不同程度的干法粉碎，得到不同粒径范围的超微粉体。 粉体粒径测定：取适量的粉体置于激光粒度仪的容器内，采用蒸馏水作为分散剂，用超 声波对粉体进行分散，测定粉体的粒径及其粒径分布。其中，d ( o 5 ) 表示在粒径累积分布曲线 上5 0 颗粒的直径小于或等于此值，又称为颗粒的平均粒径。 将原料分别进行不同强度的超微粉碎处理，得到不同粒径范围的花生粕粉体，并按平均 粒径，即d ( o 5 ) 的大小范围将其分为五类： 2 0 0 1 m a 、1 0 0 1 x m 2 0 0 p r o 、5 0 1 a m 一1 0 0 1 x m 、2 0 1 x m 一 5 0 1 a m 、 2 0 1 a m 。 2 3 3 花生分离蛋白的提取及性质研究 2 3 3 1 原料最佳粒径范围的选择 取五种不同粒径范围的超微粉体各5 0g 于五个已编号的锥形瓶中，分别加入5 0 0m l 水， 调节p h 至9 0 ，在5 0 恒温水浴中反应2 h 后，3 0 0 0r m i n 离心1 5 m i n ，收集上清液，弃去沉淀。 调节上清液的p h 至4 5 ，静置2 0 m i n 后将其全部转移至离心杯中，3 0 0 0 r m i n 离。1 , 2 0 m i n ，沉淀 干燥后分别测定其蛋白纯度，并计算蛋白的提取效率。以所得蛋白的提取效率高低为指标， 确定进行花生分离蛋白提取的原料最佳粒径范围。 2 3 3 2 花生分离蛋白提取工艺 花生粕粉超微粉碎处理加入一定比例的水用1 0 m o l ln a o h 溶液调节提取 液p h 至碱性- 保持溶液p h 不变，一定温度下反应一段时间一室温下，3 0 0 0 r m i n 离心 3 0 m i n 沉淀重复提取一次( 方法和条件不变) 合并上清液，沉淀弃去用1 0 m o l l h c i 溶液边搅拌边调节溶液p h 至4 5 _ 静置2 0 m i n - - - * 室温下，3 0 0 0 r m i n 离，0 3 0 m i n - - - - 收 集沉淀叶用p h 为上述值的去离子水反复洗涤3 4 次，每次1 0 0 m l 一用少量去离子水分 散沉淀，并调节p h 至7 o _ 干燥得花生分离蛋白产品 2 3 3 3 正交优化碱溶酸沉工艺 在选择最佳粒径范围的原料粕粉之后，对影响碱溶酸沉制备花生分离蛋白的各个主要因 6 ! 兰竺塑型皇查鲨 素分别进行单因素试验，根据单因素试验结果进行正交试验设计，通过对正交实验数据的处 理分析得出最佳提取工艺条件。 2 3 。3 4 乙醇洗涤花生分离蛋白 将实验提取得到的花生分离蛋白进行进一步醇洗处理。这是由于超微粉碎处理虽然能提 高蛋白的提取效率，但同时处理过程中的高热与高剪切力会导致产品蛋白的色泽变暗，可接 受性差，而且传统碱溶酸沉法得到的花生分离蛋白中多含有一定量的醇溶性的糖类( 蔗糖、水 苏糖等) 、色素、灰分及醇溶性蛋白质等。这些物质大部分均会对分离蛋白产品的纯度、颜色 和营养产生不利的影响，因此在加工过程中都需要除去。乙醇洗涤是去除这些物质最为有效 且简易的方法。 醇洗工艺：将花生分离蛋白冻干后再用4 预冷的5 0 的乙醇洗涤。按1 ：5 ( w ：v ) 的比例 添加5 0 的乙醇，搅拌2 0 m i n ，40 c 下3 0 0 0r m i n 离心分离，固相冷冻干燥。 2 3 3 5 花生分离蛋白性质的测定 花生蛋白的氮溶指数( n s i ) 、吸水性和吸油性、起泡性及泡沫稳定性、乳化活性及乳化 稳定性、均参照文献 4 0 l 进行。 花生蛋白的色泽、体外消化率的测定参照文献4 0 】进行，凝胶性的测定方法参照文献【4 。 2 3 3 6 花生蛋白红外分析 f t - i r 谱测定条件：将样品置于干燥器内用p 2 0 5 充分干燥后，分别取样品各l m g ，与1 0 0 m g 溴化钾研磨混匀压片测定红外光谱。扫描次数：3 2 次，分辨率：4 c m 。 谱图处理【4 2 j ：用o m ni c 数据处理软件自动进行水汽和二氧化碳校正，差减背景谱图， 限制分析的谱带范围( 酰胺i 带用1 6 0 0 - - 1 7 0 0 c m 1 ) ，然后用s y s t a t 的p e a k f i t 4 1 2 软件将差减后 的谱图在谱带范围内进行两点基线矫正，s a v i t s k - g o l a y 函数平滑，做二阶导数谱并同时采用 g a u s s * l o r 峰形进行拟合。当确定了各子峰与不同二级结构的对应关系后，根据其积分面积 计算各种二级结构的相对百分含量。 2 3 3 7 花生蛋白氨基酸组成分析及评分 将样品置于水解管中，加入6 m o l l 的盐酸溶液，真空封口。在1 1 0 下水解2 4 h ，冷却后 定容、过滤和蒸干，再加入0 0 2m o l l 的盐酸溶液在空气中放置3 0m i n ，采用8 3 5 5 0 氨基酸自 动分析仪( 日本h i t a c h i 公司) 测蛋白质的氨基酸含量。 花生蛋白的化学评分( c s ) 和氨基酸评分( a a s ) 分别按照下列公式进行【4 3 j ： c s = 待评分蛋白质氨基酸含量( m g g n ) 鸡蛋蛋白质中同种氨基酸含量( m g g n ) a a s = 待评分蛋白质氨基酸含量( m g g n ) f a o 评分模式氨基酸含量( m g g n ) 2 3 4 花生浓缩蛋白的制备及性质研究 2 3 4 1 原料最佳粒径范围的选择 取五种不同粒径范围的超微粉体各5 0 9 于五个已编号的锥形瓶中，分别加入5 0 0 m l 水，调 节p h 至4 5 ，各加入0 2 9 的糖化酶，在5 0 恒温水浴中振荡反应2 h 后，3 0 0 0 r m i n 离。i ) , 1 5 m i n ， 弃上清液。沉淀转移至锥形瓶中，各加入4 0 0 m l8 0 的乙醇溶液，5 0 恒温水浴中反应2 h ， 3 0 0 0 r r a i n 离一t , 2 0 m i n ，沉淀干燥后分别测定其蛋白纯度值。以所得蛋白的纯度高低为指标， 7 江雨大学坝士学位论文 选择进行花生浓缩蛋白制备的原料最佳粒径范围。 2 3 4 2 花生浓缩蛋白的制备工艺流程 取高温花生粕超微粉碎处理加入一定比例的水用1 0m o g lh c l 溶液( n a o h 溶液) 调节提取液p h _ 加入一定量的复合酶一保持溶液p h 不变，一定温度下反应一段 时间- 室温下，3 0 0 0r m i n 离, 0 3 0m i n - - - 弃去上清液，沉淀中加入一定比例、一定浓度的 乙醇溶液一定温度下反应一段时间室温下，3 0 0 0r m i n 离心3 0m i r 卜收集沉淀用 少量去离子水分散沉淀，并调节p h 至7 o 一干燥得花生浓缩蛋白产品 2 3 4 3 酶的选择及复配 由于高温花生粕中非蛋白类杂质主要为碳水化合物，其中的膳食纤维和淀粉类物质占了 很大的比例。研究发现纤维素酶可以作用于植物细胞壁，破坏纤维素，使包埋于其中的碳水 化合物释放出来m 】，从而提高了糖化酶的作用效果。故选取以下四种常用酶进行酶解试验， 分别为中温淀粉酶( 酶活：3 0 0 0u 儋，推荐使用量1 0 2 0u g ) 、高温淀粉酶( 酶活：2 万u g ， 推荐使用量1 5 0 2 0 0u g ) 、糖化酶( 酶活：5 万u g ，推荐使用量3 0 0 4 0 0u g ) 、酸性纤维素 酶( 酶活：4 万u g ，推荐使用量2 0 0 2 5 0u g ) ，分别在每种酶的最佳使用条件下，在其推荐 使用量的左右选点，测定不同加酶量对酶解后花生粕中蛋白含量的影响。以酸性纤维素酶为 例，取等量的花生粕粉，加入1 0 倍体积的水，调节p h 至4 5 ，分别加入1 0 0u g ，1 5 0u g ，2 0 0 u g ，2 5 0u g 、3 0 0u g 和3 5 0u g 的酸性纤维素酶，在5 5 水浴中振荡反应2 h 后，3 0 0 0r m i n 离& 1 5 m i n ，弃去上清液，取沉淀干燥后测定蛋白含量。此外，所有酶解反应中的料液比均参 考厂家建议选取为1 ：1 0 ( v ：w ) 。 选取以上效果最佳的作用酶与效果次之的两种酶分别进行组合复配试验，分别根据复合 酶的种类以及酶的添加量的不同来进行试验的设计，最后以酶解后得到的花生蛋白的纯度为 指标，确定复合酶的种类及添加量。 2 3 4 4 响应曲面法因素水平表的确定 为了制备最优的花生浓缩蛋白产品，在酶解反应完成之后需进行进一步醇洗。本试验采 用响应面分析法进行醇洗工艺的优化。在进行响应面方法优化实验之前，先确定实验目的， 找出影响结果的关键因素。然后将各个关键因素设为自变量，将其换算成编码值，具体方法 参照文献i 4 5 , 4 6 j 进行。 x i = ( x i - - x c p ) a x i ，( i - 1 ，2 ，3 ，k )( 1 ) 式中x i 是自变量的编码值，x i 是自变量的真实值，x c p 是自变量中心点的真实值，x i 是自变量的真实值的步长，相当于编码值的一个单位。 响应值用因变量来表示，自变量和因变量的关系可用下面的二次多项式来表示： y i = b 0 + b i x i + iz j b i j x i x j + b i j x i j 2 ( i j ) ( 2 ) 式中，b 是多项式系数的估计值，x i 代表编码值。上述的二次多项式用s a s 统计软件进行 计算和分析，得到最大的响应值以及与之相对应的变量值。 2 3 4 5 花生浓缩蛋白的性质测定 花生浓缩蛋白的性质测定按照文章中2 3 3 5 方法进行。 8 2 实验材料与方法 2 3 5 花生蛋白的应用研究 2 3 5 1 花生蛋白香肠的制备 花生蛋白香肠的制备分为a 组和b 组，a 组代表花生浓缩蛋白( p p c ) 添加组，b 组为 添加市售花生蛋白粉( p p p ) 对照组。主要研究不同花生浓缩蛋白的替代比例对蛋白香肠的 品质影响，并与市售花生蛋白粉香肠进行对比。设计方案如表2 1 。 表2 - 1 花生蛋白香肠的制备 t a b 2 1p r e p a r a t i o no fp e a n u tp r o t e i ns a u s a g e 试验中的添加百分比为花生蛋白替代大豆蛋白的比例。例如a 4 组香肠为用花生浓缩蛋 白替代6 0 的大豆浓缩蛋白的香肠。试验中的空白对照组为不添加花生蛋白，只添加5 大 豆浓缩蛋白的香肠。 2 3 5 2 香肠工艺 ( 1 ) 基础配方：以1 0 0 9 陵j 计( 肥瘦比2 ：8 ) 、淀粉1 0 9 、蛋白( 大豆分离蛋白+ 花生蛋白) 5 9 ，冰水2 0 9 、食盐3 9 、糖1 卧亚硝酸钠0 0 1 9 、异抗坏血酸钠0 0 5 9 、三聚磷酸钠0 0 3 9 。 ( 2 ) 工艺流程：原料肉处理和切割一腌制一初绞斩拌一乳化一混合一灌装一结扎一漂洗 一烘制一包装一蒸煮一成品一质量检验。 2 3 5 3 感官品质评定 ( 1 ) 感官评定指标的定义与评定方法：本试验采用s a n c h e z b r a m b i l a 等【4 7 】( 2 0 0 2 ) 的定义 和c i v i l l e 等【4 引( 1 9 7 3 ) 的评定方法：硬度( h a r d n e s s ) 是用臼齿第一口咬住样品所施加的力。 评定时，样品放置于臼齿间；逐渐咬下去直至样品破碎。粘聚性( c o h e s i v e n e s s ) 是用臼齿咬 住样品使其变形( 而不是碾碎、裂碎、破碎) 的程度。评定时，样品放置于臼齿间；逐渐压 制样品，观察其变形的容易程度。弹性( s p r i n g i n e s s ) 是用臼齿对样品部分施力使其恢复到 原来状态的程度。评定时，样品放置于臼齿间；逐渐压制样品，观察其恢复程度。咀嚼性 ( c h e w i n e s s ) 是咀嚼样品使其能够吞咽的工作量。评定时，每秒咀嚼一次，决定样品能够吞 咽的时间或咀嚼次数。多汁性( j u i c i n e s s ) 是多汁性样品被咀嚼时在口腔中产生的汁液数量的 多少。评定时，考虑两方面：一是最初几次咀嚼时从肉块中释放出的肉汁数量的多少；二是 继续咀嚼时肉块多汁性口感的持续性。总体接受性( o v e r a l la c c e p t a b i l i t y ) 是对样品总体的接 受程度。 ( 2 ) 感官评定程序：本试验感官评定在食品工艺室内完成，邀请2 0 名从事食品研究的 人员，经过感官评定培训后组成评定小组，先明确本试验的目的和意义以及感官评定的指标 和注意事项。为了减少从测定到形成概念之间的许多因素如嗜好与偏爱、经验、价格等对检 9 江南大学硕士学位论文 验结果的影响，采用双盲法进行检验。即对样品进行密码编号( 本研究采用三位随机数字) ， 检验样品也随机化。评定分数采用1 7 分制，分别对应很差、差、较差、一般、较好、好、 很好。每次评定由每个