（环境科学专业论文）水环境中α萘酚和β萘酚的免疫检测方法的研究.pdf

偶联，合成了萘酚b s a 免疫原和萘酚o v a 包被原。对各偶联物进行 紫外光谱扫描鉴定结构，并计算出半抗原与蛋白质结合比。 ( 2 ) 抗体的制备：将免疫原与适当的佐剂乳化后，免疫新西兰 大白兔，以试管凝集试验和琼脂双向免疫扩散实验测定抗血清的效 价。试管凝集试验中出现了凝集反应，琼脂双向免疫扩散试验中也出 现了明显的沉淀线。将兔子体内获得的抗血清用辛酸一硫酸铵二步沉 淀法、葡聚糖凝胶除盐及d e a e 纤维素精制提纯，得到纯化的q 萘 酚和p 一萘酚的多克隆抗体i g g 。 ( 3 ) 免疫分析方法的建立：用制备的洳萘酚或p 萘酚包被原包 被酶标板，以异硫氰酸荧光素为荧光探针，在优化荧光免疫反应条件 后，建立了i d c 一萘酚或p 萘酚抗原包被竞争荧光免疫分析新方法。用 制备u 萘酚或p 萘酚抗体包被酶标板，以异硫氰酸荧光素为荧光探 针，建立了q 萘酚或p 萘酚抗体包被荧光免疫分析新方法。这两种 方法均具有检出限低，特异性好，线性范围宽的特点，用该方法测定 了水环境中的a 萘酚或p 萘酚，结果令人满意。 本论文建立了两种测定a 萘酚和p 萘酚的荧光免疫分析法，同 时也为进一步建立其它免疫分析法检测环境中q 萘酚和p 一萘酚的残 留，提供了可靠的免疫原和抗体，在环境监测、防止污染和保护人体 健康等方面具有重要意义。 关键词：a 萘酚，p 萘酚，抗原，抗体，荧光免疫分析 i i as t u d yo ff l u o r e s c e n c ei m m u n o a s s a y m e t h o dsf o r 仅n a p h t h o la n d i - n a p h t h o l i ne n v i r o n m e n t a lw a t e r a b s t r a c t p h e n o l i cc o m p o u n d sa r ei m p o r t a n tm a t e r i a l si nc h e m i c a li n d u s t r y t h e ya r ei m p o r t a n te n v i r o n m e n t a lp o l l u t a n t sd u et ot h e i rt o x i c i t yt o h u m a na n dd i f f i c u l tt od e g r a d e ，s oi ti sv e r yn e c e s s a r yt od e t e c tt h e p h e n o l i cc o m p o u n d s r e s i d u e s ine n v i r o n m e n t a lw a t e r s a m p l e s q n a p h t h o l a n dp - n a p h t h o la r ew i d e l yu s e di nm a n yf i e l d s ，s u c ha s t a n n i n g ，p h a r m a c e u t i c a li n d u s t r y , r u b b e ri n d u s t r y , p e s t i c i d ea n dd y e s t h e ya r ea l w a y sm i x e di nt h es a m ei n d u s t r i a lp r o d u c t ，s od e v e l o p i n ga n e wa n a l y t i c a lm e t h o df o rd e t e r m i n a t i o no fa n a p h t h o la n d1 3 - n a p h t h o li s s i g n i f i c a n tf o rc o n t r o l l i n ge n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o n a tp r e s e n t ，t h em a i nm o n i t o r i n gm e t h o d sf o ra n a p h t h o la n d 1 3 - n a p h t h o l a r e g c ，u vs p e c t r o p h o t o m e t r y , h p l c ，c a p i l l a r y z o n e e l e c t r o p h o r e s i s ， f l u o r e s c e n c e s p e c t r a ，p h o s p h o r e s c e n c e m e t h o da n d e l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d b u tt h ep r e t r e a t m e n to ft h e s em e t h o d si sv e r y c o m p l i c a t e d ，t i m e c o n s u m i n ga n dc o s t l y i m m u n o a s s a ym e t h o d sh a v e s h o w nt ob er a p i d ，s e n s i t i v e ，r e l i a b l e ，c o s t e f f e c t i v e ，a n db e c a m eo n eo f t h em o s t c o m p e t i t i v e a n d c h a l l e n g e a b l e e n v i r o n m e n t a l m o n i t o r i n g i i i m e t h o d si nt h e21s tc e n t u r y t h ei n v e s t i g a t i o no fl i t e r a t u r es h o w st h a t i m m u n o a s s a yi s s e l d o mu s e di nc h i n ao nm o n i t o r i n ge n v i r o n m e n t a l p o l l u t a n t s t h ew o r k i ss u m m a r i z e da sf o l l o w s ： ( 1 ) t h ep r e p a r a t i o no fa n t i g e n s ：q n a p h t h o la n d 3 - n a p h t h o la r es m a l l m o l e c u l e s ，w h i c hc a nn o tb ed i r e c t l yu s e df o rr a b b i ti m m u n i z a t i o n t h e y h a v et oc o m b i n ew i t h c a r r i e r s h a p t e n s s h o u l db e s y n t h e s i z e da n d c o n j u g a t e dt op r o t e i nf o rr a b b i ti m m u n i z a t i o n n a p h t h o lw a ss y n t h e s i z e d b ym e a n so ft h ec h l o r o a c t i ca c i dm e t h o d t h eh a p t e n sw e r ec o n j u g a t e dt o t h ec a r d e rp r o t e i n s ( b s a ，o v a ) w i t ht h em o d i f i e da c t i v ee s t e rm e t h o do r w i t ht h em i x e da c i da n h y d r i d em e t h o dt of o r mi m m u n ea n t i g e n sa n d c o a t i n ga n t i g e n s t h ec o n j u g a t e sw e r es c a n n e db yu vs p e c t r u mt oj u d g e w h e t h e rh a p t e n sw e r el i n k e dt ot h ep r o t e i n s ，a l s ot h ec o n j u g a t i o nr a t i o so f a r t i f i c i a la n t i g e n sw e r ec a l c u l a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec o n j u g a t e s w e r ep r e p a r e ds u c c e s s f u l ( 2 ) t h ep r e p a r a t i o no fa n t i b o d i e s ：n e wz e a l a n dw h i t er a b b i t sw e r e i m m u n i z e dw i t ht h em i x t u r eo fi m m u n ea n t i g e n sa n df r e u n da d j u v a n t t h et i t e r so fa n t i - s e r aw e r ei d e n t i f i c a t e db yt u b ea g g l u t i n a t i o nr e a c t i o n t e s ta n da g a rd o u b l e - d i f f u s i o ne x p e r i m e n t i nt u b ea g g l u t i n a t i o nr e a c t i o n t e s t ，t h e r ew e r ev i s i b l ep r e c i p i t a t i o nr e a c t i o n ；i na g a rd o u b l e d i f f u s i o n e x p e r i m e n t ，t h e r ew e r ec l e a rd e p o s i tl i n e s t h ei m m u n es e r aw e r e p u r i f i e db yo c t a n o i ca c i d s a t u r a t e da m m o n i u ms u l f a t e ，s e p h a d e xg 一2 5 a n dd e a e c e l l u l o s e p o l y c l o n a la n t i b o d i e sw e r ep r e p a r e ds u c c e s s f u l i v ( 3 ) t h ee s t a b l i s h m e n to fi m m u n o a s s a ym e t h o d s ：m i c r o t i t e rp l a t e s a r ec o a t e dw i t hc o a t i n ga n t i g e n so fc 一n a p h t h o lo r1 3 - n a p h t h o l ，a n dt h e n o p t i m i z e d f l u o r e s c e n c ei m m u n oa s s a yc o n d i t i o n s t h ef l u o r e s c e n c e i m m u n o a s s a y s ( e t a ) o fa n a p h t h o lo rp - n a p h t h o lw e r ee s t a b l i s h e dw i t h t h es i g n a lo ff l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e m i c r o t i t e rp l a t e sa r ec o a t e dw i t h a n t i b o d i e so fq n a p h t h o lo r1 3 - n a p h t h 0 1 t h ef l u o r e s c e n c ei m m u n o a s s a y s ( v i a ) o fa - n a p h t h o lo r 3 - n a p h t h o lw e r ee s t a b l i s h e dw i t ht h es i g n a lo f f l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e b o t ho ft h e s em e t h o d sh a v eg r e a ta d v a n t a g e s o ns e n s i t i v i t ya n ds h o w e daw i d e rl i n e a rr a n g e s a t i s f a c t o r yr e s u l t sw e r e g a i n e dw h e ni tw a su s e dt od e t e r m i n et h ec o n c e n t r a t i o no fg t n a p h t h o lo r 1 3 - n a p h t h o li ne n v i r o n m e n t a lw a t e r t w ok i n d so fn e wf i am e t h o d so fd e t e r m i n a t i o no fa n a p h t h o la n d 1 3 - n a p h t h o lw e r ee s t a b l i s h e d t h e s er e s e a r c h e ss u p p l i e dr e l i a b l ei m m u n e a n t i g e n sa n da n t i b o d i e sf o re s t a b l i s h i n gn e wi m m u n o a s s a yf o ra - n a p h t h o l a n d 3 - n a p h t h o lr e s i d u e sd e t e c t i o ni ne n v i r o n m e n t a lw a t e r i ti ss i g n i f i c a n t f o re n v i r o n m e n t a lm o n i t o r i n g ，p o l l u t a n tc o n t r o l l i n g ，p r o t e c t i n gh u m a n h e a l t h g a os h a n s h a n s u p e r v i s e db yp r o f e s s o rz h u a n gh u i s h e n g k e y w o r d s ：0 【- n a p h t h o l ，1 3 - n a p h t h o l ，a n t i g e n ，a n t i b o d y , f l u o r e s c e n c e l m m u n o a s s a y v 东华大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位 论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体 已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对 所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：两泔野 日期： 2 。呵年，月汐e t 东华大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允 许论文被查阅或借阅。本人授权东华大学可以将本学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本版权书。 本学位论文属于 不保密呱 学位论文作者签名：岛对伽争 日期：2 咿月d e l 指剥币签砻互 日期：砂多年1 月珀 1 前言 1 前言 1 1 酚类化合物概述及分析研究现状 随着工业现代化时代的到来，人类在生产和生活活动中释放到环境中的化学 物质越来越多，全球每年大约增加1 5 0 0 2 0 0 0 种新的化学物质【1 1 。迄今为止，美 国化学文摘中登记的化学物质已超过2 0 0 0 万种，并且现在仍以每年1 0 万多种的 增长速度不断诞生新的合成化学品。这些物质逐渐对野生动物的健康构成了严重 威胁，并进而影响野生动物物种的繁衍与生存，同时也对人类构成了潜在威胁。 过去5 0 年，大约已有8 万种化合物释放到环境中，而被怀疑影响人类健康的大 约有2 0 0 多种【2 1 。长期以来，有毒有害化学物质对环境污染问题的焦点一直集中 在致死以及“三致 ( 致癌、致畸、致突变) 等对健康有重大影响的诸多方面。 含羟基的酚类化合物是一种重要的化工原料，在工业生产过程中大量的含酚 废水排放造成了严重的环境污染。这些酚类物质有些是表面活性剂，有些是工业 生产的中间体，有些为农药中除草剂类化学物质。其中很多酚类化合物都属于环 境激素。美国环保局e p a 规定优先测定的有机污染物中，有1 1 种是属于酚类物 质【3 1 。欧共体国家和我们国家都把水中酚类化合物列入必测项目。因此对这类物 质的分析非常必要。 酚类化合物具有致癌、致畸、致突变的潜在毒性，是造成环境污染的工业品， 酚类化合物中的氯苯酚类化合物广泛用作杀虫剂、农药和消毒剂，在水体和土壤 中富集。由于酚类物质在环境污染中具有“低剂量，长时间 的特性，而常规的 处理工艺不能有效去除。因此，直接监测往往比较困难。目前用于检测残留酚类 物质的方法有：紫外分光光度法、荧光光度法、极谱法、生物传感器法、气相色 谱法、高效液相色谱法、色质联机法、流动注射化学发光法、毛细管电泳法、免 疫分析法等【引。 1 2 本实验研究对象的研究现状 1 2 1a 萘酚和b 萘酚的理化性质及危害 萘分子中有两种不同的氢，萘环上的一个氢原子被羟基取代，能产生两种同 1 前言 分异构体，即a 萘酚和b 萘酚，分子式c 1 0 h 7 0 h 。结构式如下： 昏萘酚 。了洲 p 萘酚 a 萘酚，又名1 萘酚或甲萘酚，为无色或黄色晶体，分子量为1 4 4 1 6 ，熔点 9 6 ，沸点2 7 8 2 8 0 ，2 8 8 升华，相对密度1 0 9 8 9 ，有类似苯酚的气味；在 光照下变成深棕色；遇高热、明火或与氧化剂接触，有引起燃烧的危险；微溶于 水，易溶于乙醇、乙醚、氯仿、苯和碱水溶液。a 萘酚是一种常见的精细化工中 间体，主要用于有机合成和染料工程，是农药、染料、医药等方面的重要中间体。 a 萘酚是合成农药的原料，是西维因农药的水解产物，也是灌溉水、自来水和井 水环境监测的重要项目。在化妆品行业，a 萘酚作为着色剂应用于一些染发剂中。 但是，a 萘酚在化妆品中属限量物质，我国己规定其在染发剂中最大浓度不应超 过0 5 i 熨。a 萘酚具有致癌、致畸、致敏、致突变性的潜在毒性，对皮肤、眼睛、 血液和肾脏都有较强的刺激性和毒害作用，又是环境污染物。人体大量吸收可导 致肾炎、结膜炎、皮炎、头痛、呕吐、腹泻、肝大、黄胆、蛋白尿和血溶性贫血 等症状。文献【6 j 中有关于其毒理学研究的报道。 b 萘酚又名2 萘酚、乙萘或2 羟基萘，为白色晶体，略有酚的气味，加热引 起升华，见光易变色，熔点1 2 1 1 2 3 ，沸点为2 5 8 2 8 6 ；遇热、明火可燃烧， 微溶于水，易溶于醇、醚、甘油和苛性碱溶液。b 萘酚是重要的有机化工原料和 染料中间体。它本身可广泛应用于染料、有机颜料、橡胶助剂、医药、香料等的 合成，而且可进一步深加工得到一系列的重要的萘系中间体，可用于制备吐氏酸、 丁酸、2 萘酚3 甲酸，也可用于制备防老剂丁、d n p 及其它防老剂、有机颜料 和杀菌剂等，在医药、农药、橡胶助剂、香料、皮革鞣制、纺织印染助剂及选矿 剂原料等方面也有广泛应用。近年来，b 萘酚下游产品用于感光材料及液晶材料 的生产，有着非常广泛的市场前景【7 ，8 】。由于环保和产品结构调整的需要，发达 国家相继停产b 萘酚。目前，我国是世界上b 萘酚的主要生产与出口国。国内 众多染料厂、农药厂、制药厂等在生产过程中会产生各类b 萘酚废水，其质量浓 度可达数千毫克每升。b 一萘酚工业废水具有以下特点：浓度高、毒性大、难以生 2 l 前言 化降解、酸或碱性强、组分复杂。目前我国b 萘酚工业废水的治理率和治理合格 率都很低，治理任务非常艰巨。8 萘酚在生产环境中主要以粉尘、气溶胶形式存 在，它的主要职业病危害为接触性皮炎，亦可经皮肤、呼吸道、消化道吸收引起 全身中毒，可致肾损伤、腹痛、循环系统等病变。由于8 萘酚生产的特殊性，其 环保影响倍受国内外环保部门重视 1 2 2a - 萘酚和8 萘酚的检测研究现状 目前已有许多关于a 萘酚和b 萘酚的单独测定，主要方法包括：紫外可见 分光光度法【9 , 1 0 l ，高效液相色谱法【1 1 , 1 2 1 ，气相色谱法【1 3 , 1 4 1 ，电化学方法【1 5 】，固相 微萃取气相色谱联用技术【1 6 j 和毛细管电泳方法【协，荧光光度法f 1 8 2 n ，磷光光度 法【2 2 】和免疫分析方法【矧。 但由于a 萘酚和b 萘酚为同分异构体，其性质相近，二者往往共存，互相 干扰，使得应用上述方法在分离时需要很长时间，上述方法在实际应用中并不便 利。因此建立同时检测a 萘酚和b 萘酚的分析方法对控制环境污染有着重要意 义。目前测定萘酚异构体的方法主要有：紫外分光光度法【矧，高效液相色谱瞵，2 6 】， 毛细管电泳法【1 7 1 ，卡尔曼滤波光度分析法【2 7 1 ，荧光光度法【1 8 - 2 0 j ，电化学方法【冽 和磷光光度法【勿。 萘酚虽然在紫外区有吸收，但吸收光谱易受样品其它物质干扰互相重叠，不 准确；高效液相色谱速度慢，流动相较贵，且具有毒性；使用气相色谱法，可以 一次进样，使多组份酚类得到完全分离、定性和定量，可使分析快速，结果可靠； 液相色谱法是以液体作流动相，省去了气相色谱法的衍生化手续，且不需专用液 相色谱柱，是近代色谱技术中最受重视的分析技术之一，具有高速化和高效化的 特点：而用g c m s 法测定获得了较高的灵敏度和选择性。虽然使用色谱法测定 有机污染物不仅灵敏度高、精确度好，而且能分别测定结构相似的多种化合物及 异构体，但这类分析方法体系中将待测物从样品中分离提取并去除共存杂质干扰 的前处理过程十分复杂，需经提取、净化、浓缩和衍生等复杂的样品前处理，对 实验室和仪器化程度要求高，并且操作费时，分析成本昂贵，不利于推广使用， 难以适应大量样本和现场检测的要求。而免疫分析法不受周围环境和样本内干扰 物质的影响，具有灵敏度高，选择性好、稳定性强及简单、方便、经济的优点， 3 1 前言 在国内外的实际应用取得的成就不可低估，可进行百余项微量物质的检测，产生 了良好的社会效益和经济效益。 1 3 免疫分析技术 1 3 1 免疫分析技术基本原理 免疫分析法从本质上说是一种形式特殊的试剂分析法，它的起点是抗体成为 分析试剂。从分析的意义上，免疫分析所指的抗体已超出了抗体的原始意义，它 泛指所有能够与待测分子特异性结合的蛋白质分子，包括免疫球蛋白、受体和其 它结合蛋白质。在免疫分析中主要的仍然是免疫球蛋白，其中最常用的是i g g 分 子。 i g g 分子由四条以二硫键相联的多肽链构成，分三个功能区：f c 区，l l i 铰链 区和f a b 区。抗体以f a b 区结合抗原分子，同时通过l l i 区的转动以适应不同距 离的抗原决定簇。与抗原结合后，培g 分子构象将改变，暴露出f c 上的活性位 点，从而表现出固定和激活补体以及粘连单核细胞等亲细胞反应的功能。k g 分 子结构见图1 1 。 n - v c - 翻p 朋代：曩习e i 可，! 区飘饵曩l g - c 。分删代囊i 健可变区和恒赶区 套瓷- 墨 图1 - 1 免疫球蛋白i g g 的基本结构 f i g 1 - 1 s c h e m a t i ci l l u s t r a t i o no fi g g 抗体和抗原作用的最大特点在于抗体对抗原的特异性识别，其专一性可超过 酶对底物的识别，远胜于一般有机分析试剂，这点正是抗体应用于分析化学的基 础。当然抗原对抗体的特异性并不都是绝对的，都存在一定的交叉反应。有时抗 体的交叉反应也有利用的价值。作为分析试剂，抗体的特异性是无与伦比的。在 免疫分析中，样品不需要或只要简单的预处理。抗体抗原复合物的稳定常数一般 为1 0 9 ，有些可达1 0 1 4 - 1 0 1 5 ，有较高的稳定性。这两点奠定了免疫分析高度灵敏 4 1 前言 和高度专一的基础。此外，抗体有一个独特的性质一每个抗体分子具有两个抗原 结合位点，即多价性。在适度浓度范围内，抗体与多价抗原发生凝集或形成沉淀。 然而遗憾的是抗体缺乏高灵敏性试剂所应具备的分析信号反差。虽然结合抗 原后抗体可具备某种催化特性一激活补体反应活性，抗原结合抗体后其理化等诸 性质有一定的变化，但是作为分析信号是难以直接被监测的，因此，免疫分析必 须通过特别的分析设计才能成为行之有效的灵敏分析方法。应运而生的即为标记 免疫分析方法。标记分析依靠在分析体系中引入探针系统，实现检测。由于灵敏 的探针分子和新的测定原理的引进，标记分析可以达到更加灵敏的分析结果的同 时也扩大了待测物的范围。标记免疫分析又分为均相免疫分析和非均相免疫分 析。免疫方法的分类见表1 1 。 表1 - 1 免疫分析技术的分类 t a b l e1 - 1 c l a s s i f yo fi m m u n o a s s a yt e c h n o l o g y 5 1 前言 标记免疫分析的四个环节分别为：抗体生产，标记试剂制备，分析方式设计 和分析信号检测。后三个环节是密切相关的，其中重要的是选择探针来制备标记 物。探针决定了信号检测的方法，同时也影响和限制着分析方法的选择。免疫分 析方法的分类也是按不同的标记物分成放射免疫分析法( r i a ) ，酶免疫分析法 ( e 队) ，荧光免疫分析法( f n ) ，和发光免疫分析法( l 认) 等。定量免疫分析 法自6 0 年代竞争分析原理提出后，近半个世纪以来已获得了巨大的进步，成为 生物，化学分析的一个非常重要的方法【2 9 j 。 1 3 2 常用免疫分析技术 二 1 9 7 1 年，e r c e g o v i c h 首次将免疫化学方法应用到环境领域。由于其具备 简便、快速、特异性强等特点，近年来在环境污染物检测领域逐渐引起关注，已 得到了广泛的认可与应用，许多研究者对此进行了广泛和深入的研究【3 ”4 1 ，本课 题组也对一些小分子环境污染物进行过免疫分析方法的研究【3 5 4 1 1 。 1 3 2 1 放射免疫分析( r a d i oi m m u n o a s s a y , r i a ) 放射免疫分析是将核素分析的高灵敏度和抗原一抗体反应的特异性结合，以 放射性核素作为示踪物的标记免疫测定方法。1 9 6 0 年y a l o w 和b e r s o n 首先创建了 经典放射免疫分析技术，用于血清中胰岛素含量的测定。由于此项技术灵敏特异， 并已制成多种标准试剂盒，使用方便，应用范围十分广泛，至今仍是测定各种微 量物质常用的手段【4 2 1 。但由于放射污染和危害，常用核素半衰期短，试剂盒稳 定期不长，以及具有不易快速，灵活的自动化分析等诸多不足，特别是近年来由 于非放射标记免疫测定技术及其自动化分析的飞速发展和普及，放射免疫分析将 逐渐会被这些优秀的标记免疫分析方法所取代。 1 3 2 2 酶联免疫吸附分析( e n z y m e l i n k e dl m m u n o s o r b e n ta s s a y , e l i s a ) 众所周知，酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可导致大量的催化过程，所 以极为敏感。酶联免疫技术就是将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相组合 而建立的一种新技术。酶与抗体或抗原结合后，既不改变抗体与抗原免疫学反应 的特异性，也不影响酶本身的酶学活性，即在相应而合适的作用底物参与下，使 基质水解而显色，或使供氢体由无色的还原型变为有色的氧化型。这种有色产物 6 1 前言 可用肉眼，光学显微镜和电子显微镜观察，也可以用分光光度计加以测定。显色 反应显示了酶的存在，从而证明发生了相应的免疫反应。由于其标记物相对稳定， 有效期长，应用范围广泛，方法成熟，深受生物医学检测工作者青睐，是目前运 用最多的免疫分析技术。国内外对双酚a 、烷基酚等属于环境激素酚类物质的检 测都有不少e l i s a 法的相关报道1 4 3 朋l 。 1 3 2 3 荧光免疫分析( f l u o r e s c e n c ei m m u n o a s s a y , f i a ) 荧光免疫分析技术是将抗原一抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精 确性相结合的一种免疫分析方法，创始于2 0 世纪4 0 年代初。1 9 4 2 年c o o n s 等 多次报道用异氰酸荧光素标记抗体，检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖 抗原，当时由于此种荧光素标记物的性能较差，未能推广使用。直至5 0 年代末 期，r i g g s 等合成性能较为优良的异硫氰酸荧光素。m a s h a l l 等人对荧光抗体的标 记方法又进行改进，从而使免疫荧光技术逐渐推广应用。其基本原理是将特异性 的抗体或抗原标记上荧光基团使之成为特异性的试剂，与相应的抗原或抗体结 合，形成抗原一抗体复合物，再用荧光检测仪检测荧光信号。荧光免疫技术的主 要特点是；特异性强、敏感性高、速度快，非特异性荧光染色少。但也存在一定 局限性，免疫分析中来自样品的较高和变化大的荧光背景一直困扰着普通方式的 荧光检测。8 0 年代崛起了时间分辨荧光免疫分析方法。在使用了长寿命的镧系 螯合物标记和时间分辨荧光检测方式后，完全克服了荧光背景的干扰问题，并且 第一次使非同位素标记分析在灵敏度上赶超甚至超过了放射免疫分析。目前荧光 免疫分析法在烷基酚、氯苯酚、雌二醇类物质的检测中有相关报道【3 5 1 3 6 4 5 1 。 1 3 2 4 化学发光免疫分析( c h e m i l u m l n e s c e n c ei m m u n o a s s a y , c l i a ) 化学发光免疫分析是借助于化学发光反应的高灵敏性和免疫反应的高特异 性而建立一种高效检测手段。其原理是将发光物质或酶标记在抗原或抗体上，免 疫反应结束后，加入氧化剂或酶底物而发光，通过对发射光强度的检测，计算出 待测物的浓度。化学发光免疫检测技术具有高灵敏度，仪器简单，受广大医学、 环境、化学、生物等领域的科学工作者欢迎，国外不少实验室将其应用于药物、 病毒、细菌等临床医学的检测上 4 6 , 4 7 1 。此外，还有一种发光免疫是生物发光免疫。 以发光菌或荧光素酶标记半抗原，首要条件是制备高纯度的生物发光剂。其优点 7 1 前言 是光量子产率大，发光稳定，精密度高。 1 3 2 5 免疫p c r 技术( i m m u n o p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，i m p c r ) 免疫p c r 方法( i m m u n o p c r ) 是s a n o 等人1 9 9 2 年将免疫学反应和p c r 技 术相结合而创建的一种新的检测技术，因此具有抗原一抗体反应的特异性和p c r 技术的高效性。用d n a 分子作为标记物，在做一般的免疫反应的同时进行p c r 扩增和电泳分析的免疫实验。此法不仅把p c r 惊人的扩增能力与抗原抗体反应 的特异性结合在一起，从而极大地提高了检测抗原的灵敏度( 与e l i s a 平行对 照时，其敏感性可高达1 0 万倍) ，而且因其所用的d n a 分子是任意的，可以 选定一个固定的分子，合成一对引物就可以了，从而避免了每换一种检测对象， 就要设计一对引物的弊病【鹌1 。在免疫p c r 中，多用生物素作为连接分子。生物 素具有两个独立的结合位点，一个可与d n a 分子结合，另一个能与抗原一抗体 复合物上的亲和素结合，由此将d n a 分子和抗原一抗体复合物专一性地连接在 一起，形成抗原一抗体一生物素一亲和素一生物素一d n a 复合物，然后加入p c r 扩增系统，标记的d n a 便可以通过各种合适的引物来扩增。由于免疫p c r 同时 具有抗原抗体反应的特异性和p c r 检测的敏感性，所以对检出少量抗原或抗体 具有重要的意义。 综上所述，在免疫分析的诸方法中，放射免疫分析是第一个定量方法。放射 免疫分析准确而灵敏，然而在应用上的缺点也是同样明显的。因此从其诞生之日 起，研究工作者就开始寻找可以取代它的新方法。酶联免疫分析方法最先发起挑 战，终于在进入8 0 年代后首次占据主导地位，覆盖了一半以上的文献工作。荧 光免疫分析在建立时间分辨荧光免疫分析后有了突破性发展，占目前工作的 1 0 1 5 ，成为取代放射免疫分析呼声最高的方法。非同位素标记的另一手段是 发光免疫分析法，它始终维持了在免疫分析中的位置，每年约占5 的工作【2 9 1 。 其他免疫分析方法还有流动注射免疫法( f i i a ) 矧，毛细管电泳免疫分析 ( c e l q 【4 9 ，5 0 l 等 随着环境污染物残留免疫分析技术的进一步研究和完善，免疫分析技术中存 在的一些问题将会很快得到解决，虽然免疫技术不可能完全替代原有的传统色谱 分析技术，但它将成为环境污染物分析中不可缺少的一部分。很多重要环境污染 物的残留分析已经采用了免疫分析方法。在农药中毒诊断、农药作用机理研究、 8 1 前言 农药残留分析、农药抗性测定及农药代谢、农药残留研究等方面均有广泛应用 1 5 1 - 5 3 j 。在医学上主要应用于临床标本微量物质检测的实用手段【5 4 1 ，在环境监测 中主要应用于水体环境监测，气体环境监测和土壤环境监测【5 5 1 。 1 4 本实验的研究目的和意义 萘酚在环境中的存在有时是非常微量的，这给环境监涣4 提出了更高的要求。 与发达国家相比，我国超微量环境监测正在起步阶段。超微量环境监测技术的开 发和研究是摆在我国环境科学工作者面前的重要任务之一。目前测定萘酚异构体 的方法主要有紫外分光光度法，气相色谱法，高效液相色谱等方法。但这些方法 均在预处理、实验条件、操作性、时效性、成本等方面存在一些限制，因此不利 于现场监测。而免疫分析法则具有灵敏度高、选择性好、稳定性强、操作简单方 便、经济实用的特点，在国内外的环境监测中取得了一定的成就。 有关萘酚的的免疫分析方法在国外仅限于e l i s a 法的报道，国内尚未有相 关报道。本实验对萘酚的免疫分析方法进行了探索，建立了两种荧光免疫方法测 定水环境中的a 萘酚和b 萘酚。通过免疫获得了高质量的抗体，为其他免疫分 析方法的建立提供了支持，在环境监测、防止污染和保护人体健康等方面具有重 要意义。 1 5 本实验的研究内容和技术路线 本实验以抗体对抗原的高度特异性识别的免疫学原理为基础，建立荧光免疫 分析方法来检测环境中的a 萘酚和b 萘酚。 萘酚是一种小分子物质，分子量较小( 1 4 4 ) ，只具有免疫反应性而不具有免 疫原性，不能直接刺激动物产生特异性的抗体，因此要想制备萘酚的抗体，首先 需要制备出能刺激动物机体产生抗体的人工抗原。人工抗原的制备靠偶联一个大 分子的载体来实现，通常为蛋白质。小分子物质要与蛋白质偶联，要求其分子中 必需含有氨基或羧基，才能与蛋白质中的羧基或氨基以肽键的形式结合，形成小 分子物质一蛋白质偶联物。所以合成人工抗原的第一步需先改造小分子物质的结 构，使之成为含有能与蛋白质偶联基团的半抗原。萘酚类物质并不带有羧基，必 须用化学方法引入羧基合成半抗原，才能与大分子物质( 蛋白质，肽等) 偶联为 9 1 前言 人工抗原。 用两种人工抗原分别免疫兔子，在对兔子血清进行血清效价评价，确定免疫 兔子体内存在与这两种抗原有特异性反应的抗体后，对兔子进行颈动脉采血，通 过辛酸一硫酸铵二步沉淀法初步纯化抗血清，然后采用透析和凝胶层析除盐，再 通过d e a e 3 2 纤维素离子交换层析进一步纯化特异性抗体i g g 。 通过优化各种条件，并在抗原抗体免疫体系中加入f 1 t c 荧光物质标记的已 知抗体为探针，用荧光酶标仪来测定待测抗原( a 萘酚和b 萘酚) 的量，从而建 立荧光免疫法测定环境中的a 萘酚和8 萘酚，具有特异、灵敏、准确等特点， 从而初步建立荧光免疫法检测萘酚的新技术。 本实验技术路线如下： 1 0 2 口萘酚和p 萘酚半抗原和人工抗原的合成 2 1 引言 2 q 萘酚和1 3 1 萘酚半抗原和人工抗原的合成 小分子半抗原免疫所产生的抗体，具有灵敏度高、特异性强的特点，除可用 于动物的抗感染免疫和生长、生殖调控等外，还用于多种物质如环境激素、农药 残留、毒物等的污染物环境监测。小分子半抗原免疫的关键是使机体产生效价高、 特异性强的针对小分子的抗体。 用于免疫动物产生抗体的抗原物质如果是人工合成的。质地比较纯，免疫动 物后可获得质量好的抗血清。某些物质的分子量比较小( 分子量 )_ ) 图2 - 1 半抗原免疫原性的获得及其免疫反应性 f 避2 1 t h eo b t a i no fi m m u n i t ya n di m m u n o r e a c t i o no fh a p t e n 在偶联的分子中，半抗原相当于一个抗原决定簇，它诱发的抗体能与半抗原 特异性结合。要与蛋白质偶联，要求其分子中必需含有氨基或羧基，才能与蛋白 质中的羧基或氨基以肽键的形式结合，形成小分子物质一蛋白质偶联物。所以合 成人工抗原的第一步需先改造小分子物质的结构，使之成为含有能与蛋白质偶联 基团的半抗原。 2a 一萘酚和争萘酚半抗原和人工抗原的合成 本实验研究对象是萘酚，分子结构中并不带有羧基，但都含有酚羟基，可以 用化学方法对其分子结构进行改造，在分子中引入羧基，合成含羧基基团的半抗 原，再与蛋白质偶联合成人工抗原。对酚羟基的改造一般采用以下两种方法： ( 1 ) 氯乙酸法：带有酚基的半抗原，可用氯乙酸法，生成带有羧基的半抗原 衍生物。 ( 2 ) 重氮的对氨基苯甲酸法：先将对氨基苯甲酸和亚硝酸钠反应，反应产生 物再作用于带有酚基的半抗原，获得带有羧基的半抗原衍生物。 从结构来看，酚羟基上的氢易被取代，故选取这个位点作为改变基团结构的 目标。本实验采用氯乙酸法合成半抗原，使它们分子结构中具有能与蛋白质偶联 的羧基，经承、1 hn m r 鉴定合成成功后，再通过活化酯法，将半抗原与载体蛋 白偶联，成为具有免疫原性的人工抗原。 2 2 实验材料与仪器设备 2 2 1 实验材料 洳萘酚，d 萘酚， 氯乙酸，氯化钠，氢氧化钠，磷酸二氢钠 磷酸氢二钠，碳酸钠，碳酸氢钠，甘油 盐酸，n n 二甲基甲酰胺( d ) n n 二羟基琥珀酰亚胺( n h s ) 二环己基碳二亚胺( d c c ) 牛血清白蛋白( b s a ) ，卵清蛋白( o v a ) ， 透析带( d m 2 7 ) 考马斯亮蓝g 2 5 0 国药集团上海化学试剂公司 浙江平湖化工试剂厂 c h e m i k a 公司 上海化学试剂总公司 上海华美生物制品公司 f l u k a 公司 以上试剂均为分析纯试剂；实验用水均为双蒸水。 0 0 5m o l l p h9 6 碳酸盐缓冲溶液( c b s ) ；0 0 1m o l l p h7 4 磷酸盐缓冲溶 液( p b s ) 等缓冲溶液按常规方法配制。 1 2 2 旺一萘酚和p 萘酚半抗原和人工抗原的合成 2 2 2 仪器设备 u v2 1 0 2p c 型紫外可见分光光度计 f t - i rs p e c t r o m e t e ra v a t a r3 8 0 傅里叶变换红外光谱仪 a v a r i c e4 0 0 核磁共振波谱仪 a y l 2 0 型托盘电子分析天平 t g d - 1 6 g 型高速台式离心机 磁力搅拌器 j j 1 增力电动搅拌器 p h s 3 c 型精密p h 计 w k y 型微量移液器( 1 0 - - 1 0 0 1 _ l l ) 2 3 实验方法 2 3 1 半抗原的合成与鉴定 美国u n i c o 公司 美国n i e o l e t 公司 德国b r u k e r 岛津制作所 上海安亭科学仪器厂 上海南汇电讯器材厂 江苏省金坛市亿通电子有限公司 上海精密科学仪器有限公司 上海求精生化试剂仪器有限公司 萘酚并不带有羧基，必须用化学方法引入羧基，才能与大分子物质偶联为抗 原。本实验采用氯乙酸法在两种萘酚分子中引入羧基，将萘酚改造为半抗原萘氧 乙酸，合成路线如下： c i c h 2