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浙江大学硕士学位论文有机一重金属复合污染根际微生物生态效应 摘要 近年来，我困部分农业土壤环境日趋恶化，土壤污染表现出由一般性单一污 染向复杂性、复合型污染转变。进入土壤环境的污染物在植物根际会产生一定的 根际微生物生态效应，根际微生物生态系统又影响着各种污染物质在土壤环境中 的迁移、转化，某种程度上决定着污染物质在环境中的归趋。本文以根际土壤微 生物活性和微生物群落结构作为主要研究内容，研究在有机一重金属复合污染 ( p c p c u 、p y r e n e - c u ) 胁迫下不同植物( 黑麦草、番薯、水稻等) 的根际微生 物生态效应。主要结论如下： ( 1 ) 在p c p 污染胁迫下，土壤的呼吸作用和微牛物牛物量都较对照无污染 土壤有明显降低。随着p c p 初始添加浓度的增大微生物生物量碳降低程度更大， 但根际缓解了这种降低。同浓度的p y r e n e 污染，黑麦草和萝p 根际以及非根际对 照土壤呼吸强度、微生物生物量碳都较没有污染时有所增强，而且在植物根际增 加更大。p c p 、p y r e n e 污染对黑麦草和萝h 及其他植物根际以及非根际土壤代谢 熵的影响随不同污染和植物根际不同。 ( 2 ) 在c u 污染下，污染对非根际土壤呼吸强度表现出了一定的刺激作用。 在c u1 5 0 m g k g 。1 和3 0 0 m g k g 。1 两个污染水平下，黑麦草和萝h 根际都减弱了污 染对土壤呼吸强度的刺激。当c u3 0 0 m g k 9 1 时，c u 污染抑制了微生物量碳。不 同植物根际表现出一定的对c u 污染的根际作用，根际缓解了重金属对微生物的毒 害作用，根际微生物生物量碳较非根际土壤的下降程度有明显的减缓。 ( 3 ) p c p c u 复合污染对黑麦草根际和萝h 根际及对照非根际土壤呼吸强 度的影响有所不同，变化表现出一定的复杂性。随着复合污染的加重，根际和非 根际微生物生物量都有明显的下降，但在根际中的下降程度较非根际小，根际作 用缓解了复合污染对根际微生物活性的毒害。p y r e n e - - c u 复合污染下，根际及非 根际对照土壤的呼吸强度都有所增强，而且呼吸强度随着复合污染( 水平) 浓度 的增大而增大。随着复合污染的加重，根际和非根际微生物生物量都有降低，与 p c pc u 不同的是p y r e n e c u 复合污染下微生物生物量降低程度小，而且个别情 况下还会出现根际微生物生物量的增大。p c p c u 以及p y r e n e c u 进入土壤环境， 由于有机、重金属及其复合时对土壤中微生物造成毒性，引起土壤代谢熵的变化。 当p c p g u 以及p y r e n e - - c u 以高浓度复合存在时，非根际及根际土壤代谢熵都较 浙江大学硕士学位论文有机一重金属复合污染根际微生物生态效应 空白剥照有不同的升高。 ( 4 ) 重金属污染土壤中，黑麦草根际c u 铜耐性菌落有着最大的生理生态 指数和稳定性，相反黑麦草根面耐性细菌生理生态指数最小、菌落稳定性最差。 对于未添加外源p o p 污染物的重金属污染黑麦草根阳：土壤、非根际土壤中照样存 在p c p 耐性菌落。添加了外源p c p 污染物的有机一重金属复合污染土壤中非根际 对照土壤中p c p 耐性菌落较早出现，而且p c p 耐性菌落生理生态指数和稳定性高 于根际和根面中p c p 耐性菌。 ( 5 ) 来自p y r e n e 及p y r e n e c u 复合污染处理过的黑麦革、萝h 根际土壤 中都存在能够利用p y r e n e 生长的微生物。在经过1 5 天后，这些微生物都可实现 对8 0 m g l1 的p y r e n e 的完全降解。由于污染胁迫和植物根际作用的不同使得微生 物存在差异，表现出其对p y r e n e 的利用和降解能力有所不同。由于p y r e n e - - c u 复合污染的协同作用使得对有机污染物p y r e n e 有降解和去除能力的微生物的存 在和生长受到抑制。 关键词：五氯酚，芘，铜，复合污染，根际，微生物生态 1 v 浙江大学硕士学位论文有机一重金属复合污染根际微生物生态效应 a b s t r a c t c o m b i n e dp o l l u t i o nc a u s e db yo r g a n i cp o l l u t a n ta n dh e a v ym e t a li so n eo ft h e i m p o r t a n ts o i lp o l l u t i o nf o r m s t h er h i z o s p h e r ei sa d o m i n a n ts i t eo fm i c r o b i a la c t i v i t y i ns o i la n dw h e r e a si tc a nb es h o w nt h a ts o i lp o l l u t i o nc a ni n f l u e n c et h ef u n c t i o no ft h i s c o m i cz o n et h e r ei sa ne s t a b l i s h e dn e e dt om o n i t o re f f e c t so f o r g a n i c h e a v ym e t a l c o m b i n e dp o l l u t i o no n r h i z o s p h e r e m i c r o b i a l e c o l o g yg i v e nt h e s o i l h e a v ym e t a l c o n t a m i n a t i o nw i t ht h es i m u l t a n e i t yo fo r g a n i cp o l l u t i o ni sa ne m e r g i n gp r o b l e m i n t h i sp a p e r , t h ee f f e c to f o r g a n i c h e a v ym e t a lc o m b i n e d p o l l u t i o n ( p c p c u ，p y r e n e c u ) o n r h i z o s p h e r em i c r o b i a la c t i v i t ya n db a c t e r i a lc o m m u n i t yw e r es t u d i e du s i n g s o m es e n s i t i v em i c r o b i a le c o l o g i c a li n d e x e ss u c ha ss o i l r e s p i r a t i o nr a t e ，m i c r o b i a l b i o m a s sc a r b o na n de c o p h y s i o l o g i c a li n d e x h e r et h em a i nr e s u l t so ft h i s s t u d ya r e p r e s e n t e d ： ( 1 ) t h es o i lr e s p i r a t i o nr a t ea n dm i c r o b i a lb i o m a s sc a r b o nd e c r e a s e d o b v i o u s l y u n d e rt h ep c p p o l l u t i o ns t r e s s w t ht h ei n c r e a s eo fp c pc o n c e n t r a t i o n ，t h em i c r o b i a l b i o m a s sc a r b o nd e c r e a s e dd e e p l ya n dr h i z o s p h e r em i t i g a t et h ed e t r i m e n t a le f f e c t so f p c po ns i o lm i c r o b i a lb i o m a s sc a r b o n b u ta tt h es a m ec o n c e n t r a t i o n p y r e n ep o l l u t i o n l e v e l ，t h es o i lr e s p i r a t i o nr a t ea n dm i c r o b i a lb i o m a s sc a r b o no fr i o p l a n t e ds o i lm a d r h i z o s p h e r eo fr y e g r a s sa n dr a d i s hw e r ei n c r e a s e d a n dt h ei n c r e a s eo fr h i z o s p h e r ei s m o r eo b v i o u st h a n n o p l a n t e d s o i l t h ee f f e c t so fp c p ，p y r e n eo nt h em e t a b o l i c q u o t i e n tw e r ed i f f e r e n tb e t w e e nd i f f e r e n tp l a n tr h i z o s h e r ea n dn o p l a n t e ds o i l ( 2 ) t h e p o l l u t i o no fc o p p e rs t i m u l a t e dt h es o i lr e s p i r a t i o nr a t eo fn o p l a n t e d s o i lt h e r h i z o s p h e r e o f r y e g r a s s a n dr a d i s hw e a k e n e dt h es t i m u l a t i o no fs o i l r e s p i r a t i o nr a t eu n d e rp o l l u t i o n ( 1 5 0 m g k g c ua n d3 0 0 r a g k g 。1c u ) c o n d i t i o n t h e m i c r o b i a lb i o m a s sc a r b o nw a sr e s t r a i n e du n d e r3 0 0 m g 。k g c up o l l u t i o ns t r e s s t h e p l a n t sh a dar h z o s p h e r ee f f e c t ，w h i c hl i g h t e n e dt h et o x i c i t yo fc o p p e rp o l l u t i o no n r h i z o s p h e r em i c r o b e s ( 3 ) t h ee f f e c to fp c p c uc o m b i n e d p o l l u t i o n o n r e s p i r a t i o nr a t eo fn o p l a n t e d s o i la n dr h i z o s p h e r eo fr y e g r a s sa n dr a d i s hw a sc o m p l e xw i t ht h ed e t e r i o r a t i o no f p c p - c uc o m b i n e d p o l l u t i o n ，t h e m i c r o b i a lb i o m a s sc a r b o nd e c r e a s e d o b v i o u s l y b e c a u s eo fr h i s o z p h e r e e f f e c t ，t h ed e c r e a s eo fr h i z o s p h e r ew a sn o to b v i o u sa s n o p i n t e ds o i l ，b u tu n d e rt h ep y r e n e - - c uc o m b i n e dp o l l u t i o n ，w i t ht h ea g g r a v a t i o no f c o m b i n e d p o l l u t i o ns t r e s s ，t h e s o i l r e s p i r a t i o n o fn o p l a n t e da n dr h i z o s p h e r ew a s 浙江大学硕士学位论文有机一重金属复合污染根际微生物生态效应 e n h a n c e d a tt h es a m et i m e t h em i c r o b i a lb i o m a s sc a r b o no fn o - p l a n t e ds o i la n d r h i z o s p h e r ed e c r e a s e dt os o m ee x t e n t p c p c u ，p y r e n e c uc o m b i n e dp o l l u t i o nc a u s e d t h ec h a n g eo fm e t a b o l i cq u o t i e n t ，w h e nc ue x i s t e dw i t ho r g a n i cp o l l u t a n t st o g e t h e ra t h i g h e rc o n c e n t r a t i o n ，t h es o i lm e t a b o l i cq u o t i e n to fn o - p l a n t e ds o i l a n dr h i z o s p h e r e i n c r e a s e dm o r eo b v i o u st h a nc o n f f o ls o i l ( 4 ) i n h e a v ym e t a l sc o n t a m i n a t e ds o i l ，t h ec o p p e r - - t o l e t r a n tb a c t e r i a lc o l o n y o fr h i z o s p h e r er y e g r a s sh a dt h el a r g e s te c o p h y s i o l o g i c a li n d e xa n ds t a b i l i t y i no n l y h e a v ym e t a l sc o n t a m i n a t e ds o i l ，t h ep c p t o l e r a n tb a c t e r i aa l s oe x i s t e di nn o p l a n t e d s o i la n dr y e g r a s sr h i z o s p h e r ea f t e ri n t r o d u c i n gp c pi n t oh e a v ym e a l sc o n t a m i n a t e d s o i l ，p c p - - t o l e t r a n tb a c t e r i a lc o l o n yo fn o - p l a n t e ds o i ld i s p l a y e de a r l ya n dh a da h i g h e re c o p h y s i o l o g i c a li n d e xt h a nr h i z o s p h e r e ( 5 ) t h em i c r o b e st h a tc a nu s e d p y r e n et og r o w t hw e r ee x i s t e di nr h i z o s p h e r eo f r y e g r a s sa n dr a d i s h a f t e r15d a yd e g r a d a t i o ne x p e r i m e n t ，t h ep y r e n eo f 8 0m g l 一1c a n b ed e g r a d e dc o m p l e t e l y b e c a u s et h ej o i n tt o x i c i t yo fp c p c uc o m b i n e d p o l l u t i o nt o m i c r o b e sw a s c o m p l e x ，t h eg r o w t h a n dd e g r a d i n g a b i l i t y o ft h ep c pd e g r a d i n g m i c r o b e sw a sd j f f e r e n t k e y w o r d s ：p e n t a c h l o r o p h e n o l ；p y r e n ec o p p e r ；c o m b i n e dp o l l u t i o mr h i z o s p h e r e m i c r o b i a le c o l o g y 本研究由国家高新技术( 8 6 3 ) 青年基金有机一无机复合 污染土壤的植物修复技术( 2 0 0 2 a a 6 9 2 0 0 ) 提供资助 致谢 在导帅林琦副教授和陈英旭教授的悉心指导下，我顺利地完成了这篇学位论 文两位导师在研究工作中所体现出的渊博的学识、严谨的治学态度和一丝不苟 的作风，生活中所具有的睿智、热情、勤奋、求实及创新的精神时刻教育着我、 影响着我，使我在三年的研究生生活中收益良多，这些宝贵的精神财富将在今后 的工作、生活中不断鞭策、激励我进步。 三年【：f 勺研究生生活是短暂的，但这短暂的j 年是不断收获并进步的三年，它 为我未来的人生打下了坚寅的基础。三年中，点点滴滴进步的取得都凝聚了导师 们大量的心血。在此，谨向两位恩师致以我最衷心的感谢和最崇高的敬意。因为 柏你们的耐心教导我得以豪情满怀并信心倍增，我相信我的明天会医f ；j q i 7 今h 的悉心指导和谆谆教诲而更加精彩。 同时，感谢环境工程系郑平教授、田光明教授、徐向阳教授、沈东升教授、 土凯雄教授、吴伟祥剐教授、施积炎老师、楼莉萍老师、李文红老师、王_ ；s 儿老 师、吴坚阳老师等在平时的学习、j 二作巾给予的指导、关心和帮助。感谢学院朱 利中教授、钱秀萍老师等在学业和生活上的关心和支持。 特别感谢杨强师兄在实验过程中给予的无私帮助和全力合作。感谢课题组壬 远鹏、薛生国、沈超峰、陈新才、武贝、徐向华、徐圣友、李锋、金海峰、王冬 等同学对我的支持和帮助。感谢粱新强、千宇峰、陶星名、丁晔、许云苔、丁颖、 詹晓燕、朱亮、王志荣、申震、沈小星等同学平时在科研上的相互变流、生活中 的热心帮助，与你们一起度过的美好时光令我难以忘怀。 感谢我的父母和亲人，感谢你们一直以来对我的严格要求和全力支持与鼓砒， 是你们给j ，我存凼难而前永不低头的信念与力量。 最后，祝所有曾经帮助、关心和支持我的人一生甲安，一路好走 王兆炜 二o o - f i 月- l “t 。同于浙大华家池 浙江大学硕士学位论文有机一重金属复合污染根际微生物生态效应 第一部分文献综述 1引言 在自然界中，单个污染物质构成的环境污染虽时有发生，但事实上绝对意义 上的单一污染是不存在的( 周启星等，1 9 9 5 ) 。污染来源的特点和土壤自身的特性 决定了土壤环境污染更是如此。近年来，我国部分农业土壤环境f 趋恶化，并且 表现出土壤污染在由一般性单一污染向复杂性、复合型污染转变。在美国有近4 0 的污染场所为有机一重金属复合污染( t o d dr s a n d r i na n dr a i n am b t a i e r ， 2 0 0 3 ) 。在我国，已受有机重金属复合污染的耕地面积未见确切报道，但从土壤 污染的来源、局部地区的污染调查均可推断我国存在一定面积的耕地受重金属、 有机污染物复合污染。有机一重金属复合污染的修复与控制已成为非常突出且急 需解决的问题之_ 。近年来，有关复合污染的环境效应、毒理以及污染修复等相 关问题正成为环境科学与工程领域的重要研究方向和热点( 周启星等，1 9 9 5 ： f l a d j i s p y r o use ta 1 ，2 0 0 1 ) 。有关土壤有机一重金属复合污染的生态效应、生 态化学过程及分子机制的研究显得非常必要。 根际是植物根系与土壤微生物之间相互作用所形成的独特圈带，是土壤微生 物活动的一个特殊生态环境。根际因为有了植物根的生命活动而有着非常复杂的 微生物体系，在土壤中形成了一个独特的“生态修复单元”。各种进入土壤环境 的污染物在植物根际会产生一定的根际微生物生态效应，根际微生物生态系统又 影响着各种污染物质在土壤环境中的迁移、转化，某种程度上决定着污染物质在 环境中的归趋。 当前，随着分子生物学和其他一些研究技术的发展和应用，为根际微生物生 态的研究注入了新的活力，对于根际微生物生态效应的研究取得了很大的进步和 发展。在应用传统微生物生态学研究方法的基础上结合现代分子生物学技术研究 有机重金属复合污染胁迫下的根际微生物生态，对于了解有机一重金属复合污 染胁迫下根际微域中植物、污染物与微生物之间的相互作用关系，掌握有机、重 金属污染物质在土壤中的行为、归趋以及生物学过程，研究和发展有机一重金属 复合污染土壤的植物微生物修复技术，从而实现复合污染土壤中有机、重金属 污染物质的消减和净化都有着重要的理论和实践意义。 浙江大学硕士学位论文有机一重金属复合污染根际微生物生态效应 2 有机一重金属复合污染 2 1 复合污染的概念及类型 复合污染( c o m b i n e dp o l l u t i o n ) 的概念是近年提出的。大多数学者均将该 项研究称之为相( 交) 互作用( i n t e r a c t i v ee f f e c t ) 。任继凯等使用了“复合 污染”一词( 任继凯等，1 9 8 2 ) ，m a c n i c a l 使用了“联合毒性效应”( j o i n tt o x i c e f f e c t ) 和“复合毒性效应”( c o m b i n e dt o x i ce f f e c t ) 的提法( m a c n i c a ，1 9 8 5 ) 。 陈怀满提出所谓复合污染是指多元素或多利，化学品，即多种污染物对同一介质( 土 壤、水、大气、生物) 的同时污染( 陈怀满等，2 0 0 2 ) 。周启星等认为复合污染在 内涵i 二要满足四个条件：1 ) 一种以上的污染物同时或先后进入到同一环境介质或 生态系统同一分室：2 ) 化学污染物之间、化学污染物与生物体之间发生交互作用： 3 ) 经历化学、物理化学过程、生理生化过程和生物体发生中毒过程或解毒适应过 程三个阶段；4 ) 产生抑制、促进或独立效应( 周肩星等，2 0 0 4 ) 。 复合污染问题是复杂的，它在生态系统中的存在形式也是各种各样。何勇罔 作出复合污染概念定义的同时，他对于不同的污染类型作了分类( 何勇田等， 1 9 9 4 ) 。关于复合污染的分类，按污染物的类型分：1 ) 有机一有机复合污染：由 两种或两种以上有机污染物( 例如农药、染料、塑判和沈涤剂) 共存于同一生态 系统时所形成，目前研究较多的是两种农药之间的复合污染：2 ) 无机一无机复合 污染：两种或两种以上无机污染物同时作用所形成的环境污染现象。重金属之间 的复合污染是当前无机复合污染研究的重点；3 ) 有机一无机复合污染：有机污 染物和无机污染物在环境中同时存在的环境污染现象，目前研究较多的是重金属 与农药、有机螯合剂、石油烃及芳香类化合物之间的复合污染。 22 有机一重金属复合污染 有机一重金属复合污染由于同时具有重金属和有机污染物各自的污染特性以 及它们交互污染时的污染特征，即有机、重金属污染物不同的浓度水平和污染组 合方式会产生不同的环境行为和环境效应，这也决定了有机一重金属复合污染研 究具有一定的复杂性和独特的科学和实践意义。有机污染物和重金属共存时的复 合污染也是当前复合污染研究的重点、难点。目前有机一重金属复合污染的研究 主要集中在农药、有机螫合剂、石油烃及芳香类化合物与重金属之间的复合污染。 2 浙江大学硕士学位论文有机一重金属复合污染根际微生物生态效应 2 2 - 1农药一重金属复合污染 农药大多数是有机化合物，但很多农药本身含有重金属，进入环境后释放出 米会与共存的其它污染物发生相互作用。各种农药被施用到农田土壤后，难降解 有机物往往与通过其他方式进入土壤环境中的重金属共存于同一环境中。如施用 化学农药和由各种兽药带来的重金属a s 、c u 等引发的复合污染就是农药一重金属 复合污染的一种普遍形式。研究农药与重金属之间的相互作用对研究农药的效用、 降解和毒性以及重金属在土壤环境中的迁移、转化和污染控制都有重要意义( 郑 振华等，2 0 0 1 ) 。农药与重金属复合污染，一方面是由于不同的农药与重金属的作 用方式不同，有的可发生络合作用，有的则不能发生络合作用，另一方面则与农 药和重金属的加入比例有关( t e i s s e i r ehe ta 1 ，1 9 9 8 ：1 9 9 9 ) 。 2 2 2 有机螯合剂与重金属复合污染 加入螯合剂是修复重金属污染土壤的重要方法，但在使用螯合剂修复重金属 污染环境的过程中也产生了有机螯合剂与重金属复合污染。在有机螫合剂与重金 属复合污染中，重金属与螯合剂形成螯合物，往往增加了金属的可溶性，提高了 其转移、扩散能力以及潜在毒性( 郑振华等，2 0 0 1 ) 。不同的重金属离于具有不同 的电荷和不同的离于半径，与螯合剂所形成的螯合物具有不同的稳定性，从而造 成螯合物进入生物体的难易程度不同，其根本原因在于各金属离子的差异。很多 螫台剂如e d t a 、二亚乙基三胺五乙酸( d t p a ) 和氨基三乙酸( n t a ) 等，虽然本身的 毒性并不大( 如e d t a 对发光菌的e c 。值为3 1 7 8 9 ) ，但因其大规模的使用， 其与重金属等污染物形成的复合污染效应应得到重视。 2 。2 3 普通有机污染物与重金属复合污染 在这里普通有机污染物是指除农药和有机螯合剂以外的其他有机污染物，如 多环芳烃类、多氯联苯、石油类污染物等。这种类型的有机污染物与重金属之间 的复合污染在环境中也时有发生，是有机一重金属复合污染的重要形式和研究内 容。普通有机污染物对生物体的生长和代谢有重要影响，同时生物体对重金褐的 吸收也与此有关。如有研究表明，z n 与菲之间存在拮抗作用。菲存在时，生物对 z n 的吸收量减少，但反过来z n 并不影响菲的摄入，在其特定浓度和比例下也存 在着协同作用。 一3 一 浙江大学硕士学位论文有机一重金属复合污染根际微生物生态效应 3 根际与根际微生物生态 3 1 根际与根系分泌物 根系通过吸收和分泌作用来改变其邻近空间的环境。根际就是受植物根系这 些活动影响深刻的部分土壤，是离根表面数微米剑l2 m m 的微小区域( t a ose t a ，2 0 0 5 ) 。根际因其所处特殊环境，具有了独持的物理、化学和生物学特性和 环境学意义( 陈能扬等，1 9 9 4 ) ，是不同于原土体( 宣家祥，1 9 8 2 ) 的复杂的、 动态的、丌放的微型生态系统。由于根际的界面性和物理、化学、生物学性质的 独特性使其直接影响污染物在土壤环境中的循环转化及归宿。从环境科学角度来 说，根际是土壤中一个独特的土壤污染“生态修复单元”( 魏树和等，2 0 0 3 ) ， 是根系和土壤环境相互耦合的生态和环境界面，是污染土壤修复的重要组成部分 及理论基础之一，是土壤与环境科学研究的焦点。作为植物根系生长的真实的土 壤环境，根际研究己越来越引起人们的重视( a n n ecle ta 1 ，1 9 9 2 ) 。 根系分泌物是植物根系在生命活动过程中向外界环境分泌的各种有机化合物 的总称，是植物与根际微生物及土壤进行物质、能量与信息交流的重要载体物质， 是形成根际环境的物质基础。在h i k e r 首次提出了根际概念时就认为根系分泌物 是引起根际土壤与非根际土壤理化性质差异的主要原因( 朱国鹏等，2 0 0 2 ) 。根系 分泌物的种类繁多、数量差异大。据c u r l 估计，植物根系分泌的有机化合物一般 有2 0 0 种以上，既有糖、蛋白质和氨基酸等初生代谢产物，又有有机酸、酚类等。 按分子量的大小可分为低分子量分泌物和高分子量分泌物，前者主要是有机酸、 糖类、酚类和各种氨基酸( 包括非蛋白氨基酸) 。国内外有关根系分泌物中低分 子量化合物组成的鉴定工作已有许多报道( t y l e rga n d s t r o ml ，1 9 9 5 ： g i e s l i n s k ige ta 1 ，1 9 9 7 ) 。高分子量根系分泌物主要包括粘胶和外酶，其中 粘胶有多糖和多糖醛酸两类，由于高分子量根系分泌物中的组分极为复杂，对这 类组分的分离、纯化和结构鉴定工作进展缓慢。根分泌的有机酸、酚类物质和植 物铁载体等物质对于矿质养分的活化、缓解或消除重金属毒害以及在植物间的化 感互作中起着非常重要的作用。 3 2 根际微生物生态 + 土壤是微生物生态系统的重要组成部分，是重要的微生物种质库和资源库， 研究土壤中的微生物生态是开发和利用微生物资源的基础和前提。植物在整个生 a 浙江大学硕士学位论文 有机一重金属复合污染根际微生物生态效应 长期问不断地向生长介质中释放的大量根分泌物质为根际微生物提供了大量的营 养和能量物质，大大促进了土壤尤其是根际微生物的活性，同时根系分泌物组成 的改变也将对根际微生物的活性和生态分布产生重要的影响( l a u r e n tm a r i l l e y e ta 1 ，1 9 9 8 ) 。根际中微生物之间及其与周围环境之间因为这种根际效应而有 着特定的关系，它们彼此影响相互依存构成具有一定结构和功能的开放的根际微 生物生态系统。根际中的特定微生物可以实现对土壤环境中难降解有机污染物质 降解和消除，影响进入土壤中的重金属活性对其可以进行活化或者是固定作用。 这些微生物对于土壤营养物质的生物地球化学循环，对于土壤污染物质的削减， 保证农业生产和农产品的安全有着特别的重要意义。微生物生态学的研究目前主 要集中于微生物活性和多样性的研究，活性研究是检测自然环境中微生物的活性 并监测微生物对生态系统的影响，多样性研究是为了解自然环境的微生物多样性 和微生物群落不同功能群的相互作用( 王爱杰等，2 0 0 4 ) 。根际微生物生态研究的 主要目的是充分了解和掌握在正常土壤环境或者是在环境胁迫( 营养胁迫或污染 胁迫) 下微生物在根际环境中的生态学活性指标上的一些变化和根际微生物群落 多样性的变化，以及微生物与植物体及周围环境问相互作用过程所表现出的宏观 效应即微生物生态系统的功能。当前根际微生物生态研究中，在微生物纯培养、 土壤酶( 脲酶、磷酸酶、脱氢酶、过氧化氢酶等) 活性指标分析、微生物库如土 壤微生物生物量、土壤呼吸作用测定以及根际土壤微生物区系等微生物结构和种 群多样性研究方面取得了一定的进展。 3 3 根际微生物生态研究方法及其进展 研究手段和方法的突破是研究理论取得发展的前提和保证。根际土壤样品的 直接或常规模拟采集技术以及传统的微生物生态学研究方法为根际微生物生态研 究提供了前提和基础。近年来，对根际概念和认识的拓宽为根际微生物生态学研 究不断提出新的挑战，根际新型模拟采样方法、分子生物学技术等在微生物生态 学研究中的应用，推动着微生物生态学研究的不断深入。 3 3 1根际土壤样品的采集方法 根际是一个只有数毫米的微小区域并且根系性质存在梯度变化，在一般条件 下精确区分根一土界面，区分采集根际与非根际土壤样品存在着技术上的困难， 浙江大学硕士学位论文有机一重金属复合污染根际微生物生态效应 建立有效、准确、完整的根际土壤样品采集方法是根际研究的前提和基础。自上 世纪7 0 年代以来根际微域土样采集方法得到不断发展，促进和指导着人们在这一 领域开展积极的探索和研究工作。 3 3 1 1 根际土壤样品的直接采集方法 在7 0 年代初，r i l e y 和b a r b e r ( r i l e yda n db a r b e rsa ，1 9 7 0 ) 等根据土 壤在植物根系表面抖落和粘着的程度来区分根际土与非根际土，即人工轻轻抖落 下来的土壤视为非根际土壤( 原土体，n o n r h i z o s p h e r es o l l ) ，松散粘附在根系 表面1 4 m m 范围内的土壤为根际土( r h i z o s p h e r es o i l ) ，而紧密粘着在根系表 面，约距根面o 2 m m 的土壤为根面土( r h i z o s p l a n es o l l ) 。h e l a t 和s a u e r b e c k ( h e l a lhma n ds a u e r b e c kd ，1 9 8 1 ) 认为把土分成根际十和根面土太粗糙，不 能表明根际t 和根系真正的动力学机制，而且健康的根系在机械分离的过程中将 被扯掉、破坏，影响土壤分析。后来h e n d r i k s 和j u n g k 在研究燕麦根系周围的营养 分布时，对r il e yj f d b a r b e r 的方法进行了改进，他们把根和土一起进行一段时阳j 的干燥，然后轻筛，根系就和根际土分离开来。g o b r a n 和c l e g g 等在研究挪威云杉 的根际时，采用如下方法采集根际土：仔细地从田间土壤中移走根系，然后土壤 过2 m m 筛，当作原土体。剩下的根系( 2 m m ) 和土壤在塑料容器中轻轻地抖动大约 1 m i n ，从根系上分离土壤团聚体( 0 5 5 f i l f n ) 作为根际土。这种方法与h e n d r i k s b j u n g k ( h e n d r i k sma n dj u n g ka ，1 9 8 1 ) 所描述的方法类似，并且他们把根一 界面定义成“剩下的健康的根系( p b ( kspe la 1 ， 1 9 9 8 ) 。陈浮等人研究发现，低浓度z n ”对土壤微生物碳、呼吸强度有刺激作用， 高浓度z n ”则有抑制作用并随着浓度增高而增强。但是尽管高浓度z n ”对土壤微生 1 3 浙江大学硕士学位论文有机一重金属复合污染根际微生物生态效应 物碳、呼吸强度、群落结构的影响具有长期性，其毒害作用主要发生在z n ”进入土 壤的早期阶段( 陈浮等，2 0 0 2 ) 。 f r o s t e g a r d 等人用总磷酸酯脂肪酸( r u p l f a 法) 研究了森林和农用耕地根际 土对外源z n 的反应，结果表明：两种土壤的总磷酸酯脂肪酸均随z n 浓度的增加而 下降，但1 8 ：2 u5 ，9 脂肪酸所占比例随着浓度的加大而上升。但p e n n a n e n 等研究 了长期遭受c u 、z n 、p b 、c d 复合污染的土壤，其结果与f r o s t e r g a r d 的结论不一致， 即重金属使2 0 ：4 及1 8 ：2 6 05 ，9 脂肪酸比例显著下降，同时也使支链1 8 ：0 、1 7 ： 0 、1 6 ：0 、1 6 ：1 的脂肪酸的比例发生变化( 即真菌、细菌的比例有下降趋势) 。 随后，有人用不同浓度的c d 、c u 、n i 、p b 、z n 等重金属元素，详细探讨了1 8 ：2 。5 ， 9 脂肪酸的比例变化，结果表明除c u 污染使其比例下降外，其余污染物使1 8 ：2 u5 ， 9 脂肪酸的比例上升。k n i g h t 等用b i o l o g “微平板反应系统评价t e d 、c u 、z n 污 染土壤微生物的功能多样性( k n i g h tb ，1 9 9 7 ) 。k e l l 等也用b i o l o g “微平板反 应系统对z n 污染下的土壤微生物群落进行了研究，发现锌污染会增加土壤微生物 群落和结构多样性( k e l lj je ta 1 ，1 9 9 8 ) 。b a a t h 等人用碳素利用法研究了 c u 、n i 、z n 等重金属污染土壤的微生物组成，结果得出高铜污染土壤中微生物群 落l l n i 、z n 污染的土壤中微生物群落少，重金属严重污染会减少能利用有关碳底 物的微生物量的数量，降低微生物对单一碳底物的利用能力，减少了土壤微生物 群落结构的多样性( b a a t he d i a z r a v i n ame la 1 ，1 9 9 8 ) 。 在重金属的作用下根际微生物受到毒害，但某些微生物在较高浓度的重金属 污染土壤中仍能存活和生长，表现出一定的“耐受性”。不同类群微生物对重金属 污染的耐性也有所不同，通常为真菌 细菌 放线菌。d u x b u r y 和b i o c h n e l l 研究了 自然土与重金属污染土中的细菌种群，发现重金属污染土壤中耐性菌落比轻污染 土壤数量多1 5 倍。瑞典的n a t u r a l 等发现对照土壤( c u l o o m g k g 。1 ) 有3 5 中真菌， 中等污染土壤( c u1 0 0 0 m g k g 。) 有2 5 种真菌，高度污染土壤( c u1 0 0 0 0 m g k 9 1 ) 只有1 3 种真菌( 杨芳等，2 0 0 2 ) 。一些研究表明，部分微生物表现出对土壤根际 重金属的活化作用。这些微生物在重金属污染土壤的植物一微生物联合修复中将 具有巨大的应用前景和价值。 4 2 有机污染物胁迫下的根际微生物生态效应 进入土壤环境的有机污染物对土壤健康和农产品安全构成了严重威胁。有关 一1 4 浙江大学硕士学位论文有机一重金属复合污染根际微生物生态效应 土壤有机污染物的土壤环境行为以及修复研究是土壤与环境科学的一个热点。其 中有机污染物的植物修复技术的研究和丌发更是受到极火关注。微生物“根际效 应”的存在以及根系分泌物在微生物降解有机毒物时起共“共代谢”或协间作用 是根际环境有利于有机污染物降解。近年来，在有机污染胁迫下，根际微域中的 微生物生态效应的研究受到特别重视并取得一定的发展。 p a h s 、p c b s 、农药等作为重要的土壤污染物，在根际环境中对微生物生态的 影响受到人们的关注。r e i l l e y 等人在1 9 9 6 年用传统方法研究了多环芳烃的降解 ( r e i l 】e ye ta 1 ，1 9 9 6 ) 发现植物使根区微生物密度增加，多环芳烃的降解增 加。r y a n 和f i r e s t o n e 的研究也得到相同的结论( r y a nke ta 1 ，2 0 0 0 ) ，杨 树根区的微生物数量增加，但没有选择性，即降解污染物的微生物没有选择性的 增加。d a a n n el l 等人用脂肪酸甲脂分析方法( f a m e ) 图谱分析技术，r f l p 技 术，s o u t h e r nh y b r i d i z a t i o n 结合传统富集培养的方法研究了盐碱沼泽植物根际 土壤对多环芳烃的降解相关的根际微生物生态效应，结果他们用生态型，多态性， 以及分子序列特性获得并鉴定了三种多环芳烃的降解主要的细菌类群：格兰氏阴 性假单孢菌属，格兰氏阳性非孢子诺卡菌属，格兰氏阳性孢子盘尼杆菌属。他们 的研究还显示盐碱沼泽植物的根际存在着多样的p a h s 降解菌，同时植物辅助修复 对污染的底泥有生物修复有着一定的应用潜力( d a a n n el l e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 m a r l at e s a r 等人用基于1 6 sr r n a 的末端限制性片段长度多态性分析 ( t - r f i p ) ，结合传统培养方法研究了柴油污染土壤在用杨树、黑麦草、紫花苜蓿 等不同植物修复中的根际细菌群落结构，结果发现不同的柴油对根际微生物群落 的影响有着比不同植物更为复杂的效应，他们分离到了1 6 株不同的柴油降解微生 物，他们同时发现了一个与编码柴油烷烃类物质的降解相关的基因a l k b ( m a r i a t e s a re ta 1 ，2 0 0 2 ) 。s t e v e nd s i e i l l a n o 等人用大田试验法，研究了在植物 修复多环芳烃过程中，植物根际微生物群落结构组成和功能多样性的变化。结果 发现，对于碳氢化合物的降解相关的基因( n o d b , a l k b i , x y l e ) 以及十六烷与及 菲的矿化相关的基因的水平在种植植物的根际中要比未种植土壤高出很多。另外 他们还发现在种植不同植物的根际土壤中对于特异性代谢降解基因植物存一种特 异性和选择性效应，高牛毛草增加了碳氢化合物降解代谢基因n o d b ，a 肌宣和x y l e 以及菲的矿化相关的基因优势。相反，苜蓿却降低了碳氢化合物降解代谢基因 1 5 浙江大学硕士学位论文有机一重金属复合污染根际微生物生态效应 n o d b , a k b , 和x y t e 以及菲的矿化相关的基因的优势。植物修复系统通过改变植 物根际微生物系统的种群结构和功能的多样性来增加了根际对污