（生物医学工程专业论文）胚胎干细胞分化神经细胞特性及分化机制的研究.pdf

浙江大学硕士论文 经细胞表达n m d a 受体等中枢神经细胞特有的特征，并且具有对n m d a 反应的 功能特性。为进一步进行胚胎干细胞中枢神经组织工程研究提供了一些依据。 为了进一步认识胚胎干细胞自我更新机制、探讨r a 诱导胚胎干细胞分化神 经细胞的机制，我们研究了与干细胞自我更新、增殖与分化有关的信号转导机制 方面的科研文献，对干细胞信号转导研究的最新进展作了综述。胚胎干细胞通过 l i f s t a t 信号通路、b m p s m a d i d 信号通路等维持自我更新，这两条信号通路 维持了o c t 4 和n a n o g 基因的表达，o c t 4 和n a n o g 是两个维持e s 细胞不分化并 保持自我更新的关键基因。而r a 通过激活核受体r a r 、r x r 来抑制e s 细胞 o c t 4 基因的表达，同时，r a 导致w m 表达增加、w n t 信号通路增强，从而导致 e s 细胞向神经细胞分化。但是，人们对于哺乳动物细胞增殖和分化的信号通路 的认识，还处于数据收集和初步整理阶段，尚需要更多研究才能彻底认识细胞增 殖和分化的机制。 关键词：胚胎干细胞体外培养定向诱导分化神经前体细胞神经细胞 n m d a 受体功能特性分化机制 浙江大学硕士论文 a b s t r a c t e m b r y o n i cs t e m ( e s ) c e l l s o r e p l u r i p o t e n t c e l ll i n e se s t a b l i s h e df r o m u n d i f f e r e n t i a t e de m b r y o n i cc e l l sc h a r a c t e r i z e db yn e a r l yu n l i m i t e ds e l f - r e n e w a la n d d i f f e r e n t i a t i o nc a p a c i t y d u r i n gd i f f e r e n t i a t i o ni nv i t r o ，e sc e l l sw e r ef o u n dt ob ea b l e t od e v e l o pi n t os p e c i a l i z e ds o m a t i cc e l l st y p e sa n dt or e c a p i t u l a t ep r o c e s s e so fe a r l y e m b r y o n i cd e v e l o p m e n t t h e s ep r o p e r t i e sa l l o w t ou s ee sc e l l sa sm o d e ls y s t e mf o r s t u d y i n ge a r l ye m b r y o n i cd e v e l o p m e n tb yg a i n - o r l o s s o f - f u n c t i o na p p r o a c h e s ，o rt o i n v e s t i g a t et h ee f f e c t so fd r u g sa n d e n v i r o n m e n t a lf a c t o r so nd i f f e r e n t i a t i o na n dc e i l f u n c t i o ni ne m b r y o t o x i c i t ya n dp h a r m a c o l o g y n o w , h u r n a ne sc e i l sm a y b eu s e df o r t h eg e n e r a t i o no fs o m a t i cp r e c u r s o ro rd i f f e r e n t i a t e dc e l l si nc e l la n d t i s s u et h e r a p y i no r d e rt os u p p l yt h ee sc e l l sn e e d e df o rt h er e s e a r c ho f t r a n s g e n i ca n i m a l sa n d t i s s u ee n g i n e e r i n gi nf u t u r e ，w ed i ds o m e w o r ko fi s o l a t i n ge s c e l l sf r o mm o u s e t h e s u p e r o v u l a t e di c r a n dk u n m i n gm i c ew e r eu s e dt og e tt h ee m b r y o so f3 5 d ，t h e n c u l t u r e dt h ee m b r y o so nt h em e ff e e d e rl a y e rd e r i v e df r o mi c ro rk u n m i n gm i c e ， d i s p e r s e dt h ei n n e rc e l lm a s s e s ( i c m s ) o r e sc e i lc o l o n i e si nt h ea p p r o p r i a t et i m e w e a n a i i z e dt h ee f f e c t so ff e e d e rl a y e r ，t r y p s i na n de m b r y o si s o l a t e df r o mu t e r io f d i f f e r e n tv a r i e t a lm i c eo nt h ee sc e l ll i n e s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ef e e d e rl a y e r s p r e p a r e db y i c ra n dk u n m i n gm i c eh a dn os i g n i f i c a n te f f e c to na d h e r e n c eo f e m b r y o sa n dp r o l i f e r a t i o no fi c m s t h et r y p s i n ，w h i c ha f f e c t e dt h ei s o l a t i o no f e s c e l l s r e m a r k e d l y ，s h o u l d b eu s e d w i t hl o wc o n c e n t r a t i o nt r y p s i na n de d t a f u r t h e r m o r e ，i ti sm o r ee a s yt oi s o l a t ee m b r y o sa n dg e tt h ee sc e l l sf r o m i c rm o u s e t h a nk u n m i n gm o u s e t oi n v e s t i g a t et h ec h a r a c t e r i s t i c so fn e u r o n sd i f f e r e n t i a t e df r o mm o u s ee m b r y o n i c s t e m ( e s ) c e l l s ，e m b r y o i db o d i e s ( e b s ) w e r ea g g r e g a t e df r o me s c e l l sb ys u s p e n d e d c u l t u r ea n dd i f f e r e n t i a t e di n t on e u r o n sw i t hi n d u c t i o no f1xlo 。6m o l la l l t r a i l s - r e t i n o i ca c i d ( r a ) i nv i t r o t h es i z e so fe b se f f e c ts i g n i f i c a n t l yo nn e u r o n a l d i f f e r e n t i a t i o nt h r o u g ht h ee v a l u a t i o no ft h ec o u n tm o t h e do fd i f f e r e n t i a t e dn e u r o n s 浙江大学硕士论文 a f t e r8d a y so fr a w i t h d r a w a l ，d i f f e r e n t i a t e dc e l l ss h o w e dp o s i t i v eo fb o t hm a p 2 a n dn f - mb y i m m u n o c y t o c h e m i s t r y b yr e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n ( r t - p c r )a s s a y , t h e r e s u l t ss h o w e dc a l b i n d i nd 2 8 ka n d n m e t h y i d a s p a r t a t e ( n m d a ) r e c e p t o r ss u b u n i tm e m b e r s ( n r i ，n r 2 a ，n r 2 b a n d n r 2 c ) w e r eo v e r e x p r e s s e di nn e u r o n s d e r i v e df r o me sc e l l s n r 2 bm r n a d i s t i n c t l y t r a n s c r i b e de a r l ya tt h ef o r t hd a ya f t e rw i t h d r a w a lo fr a a n dt h r o u g ht h ew h o l ep e r i o d d u r i n gw eo b s e r v e d ，n r 2 cm r n a t r a n s c r i b e dl o w l yt h r o u g h o u t ，a n dn r 2 a m r n a t r a n s c r i b e da i d e rt h e6 t hd a y , n r lm r n at r a n s c r i b e da f t e rt h e8 t hd a y t h e s er e s u l t s s u g g e s tt h a tt h ee x p r e s s i o no f r a i n d u c e dn e u r o n s n m d ar e c e p t o rs u b u n i ti nv i t r o i ss i m i l a rt ot h a to ft h en e u r o n s i nv i v o f u r t h e r m o r e ，a f t e rn m d as t i m u l a t i o n ， d i s s o c i a t i v ec a l c i u mc o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y i nt h e s ec e l l s b y m e a s u r i n g t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fc a l c i u mi o n sl a b e l l e dw i t hf l u o 一3a m t h e s e r e s u l t s s u g g e s t e d t h a t r a i n d u c e dn e u r o n sw e r ep r o v i d e dw i t hf u n c t i o n a ln m d a r e c e p t o rs u b u n i t a f t e r8d a y so f d i f f e r e n t i o ni nv i t r o i no r d e rt ou n d e r s t a n dt h em e c h a n i s mh o we sc e l l ss e l f - r e n e w a la n d d i f f e r e n t i a t i o nt on e u r o ni n d u c e db yr a ，w es t u d i e do nm a n ys c i e n t i f i cp a p e ro ns t e m c e l l ss i g n a l i n gs t u d y l e u k e m i ai n h i b i t o r yf a c t o r ( l i f ) d r i v e ss e l f - r e n e w a lo fm o u s e e m b r y o n i cs t e m ( e s ) c e i l sb ya c t i v a t i n gt h et r a n s c r i p t i o nf a c t o rs t a t 3 i ns e r u m f r e e c u l t u r e s h o w e v e r , l i fi si n s u f f i c i e n tt ob l o c ke sc e l l sn e u r a id i f f e r e n t i a t i o n b o n e m o r p h o g e n e t i cp r o t e i n s ( b m p s ) a c ti nc o m b i n a t i o nw i t hl i ft os u s t a i ns e l f - r e n e w a l a n dp r e s e r v em u l t i l i n e a g ed i f f e r e n t i a t i o n ，t h ec r i t i c a lc o n t r i b u t i o no fb m pi st o i n d u c ee x p r e s s i o no fl d g e n e sv i at h e s m a dp a t h w a y e sc e l l sc a nm a i n t a i nt h e s e l f - r e n e w a l p o t e n c yt h o u g hl i f s t a ts i g n a lp a t h w a ya n db m p s m a d i ds i g n a l p a t h w a yw h i c ht h e ms t i m u l a t e t h et w ok e yg e n e se x p r e s s i o n i n c l u d i n go c t 4a n d n a n o g r a c a r ls t i m u l a t er a r r x r ，r e s t r i c tt h ee x p r e s s i o no fo c t 4g e n e ，p r o m o t e w n ts i g n a lw h i c ht h e md r i v en e u r a ld i f f e r e n t i a t i o n b u tw en e e dm o r es t u d i e st o c o m p l e t e l yu n d e r s t a n d t h em e c h a n i s mo f e sc e l l s s e l f - r e n e w a la n dd i f f e r e n t i a t i o n k e y w o r d s ：e m b r y o n i cs t e mc e l l ；d i f f e r e n t i a t i o n ；i nv i t r oc u l t u r e ；n e u r o n ； n m d a r e c e p t o r ；f u n c t i o n a lc h a r a c t e r i s t i c s 6 浙江大学硕士论文 第一章概论 第一节于细朐研究溉述 干细胞研究不仅在人类生命科学中具有重要的基础研究意义，而且将在人 类健康和生命质量领域具有广泛的应用前景。干细胞包括成体干细胞、胚胎干 细胞、生殖干细胞等，它们的共同特点是具有增殖能力、分化为特定成体细胞 的能力。胚胎干细胞( e m b r y o n i cs t e mc e l l s ，e s ) 是来源于受精卵发育早期胚 胎( 着床前) 的干细胞，具有发育的全能性，可以分化为体内所有类型的成熟细 胞。有关胚胎干细胞的研究在第二节详细叙述，本节主要叙述成体干细胞的研 究概况和最新研究进展。 1 成体干细胞 成体干细胞( a d u l ts t e mc e l l s ) 是指存在于人和哺乳动物组织中，具有自 我更新能力和定分化潜能的不成熟细胞，其作用是更新生理性衰老死亡的细 胞或组织受损时的代偿性增生，这类细胞在体外培养条件下，可进行不定期分 化并产生特化细胞。干细胞存在于从受精卵发育到2 5 0 多种细胞类型、数以亿 计的成体以及整个生命过程中。 传统认为，来源于成人组织中的干细胞只能向有限的细胞类型分化，比如 造血干细胞只能分化为各种血液细胞，但最近的研究发现，组织中的干细胞的 分化潜能比人们预想的要大得多 c l a r k ed l ，2 0 0 0 。在骨髓中发现造血干细 胞并用于临床移植治疗已有半个多世纪的历史，但其他组织干细胞的研究最近 几年才取得突破性进展。现己在骨髓、软骨、血液、神经、肌肉、脂肪、皮肤、 角膜缘、肝脏、胰腺等许多组织中发现了干细胞，并且证实某些组织中的干细 胞具有多向分化潜能 k o o yd ，2 0 0 0 。其中间充质干细胞( m e n c h y m a ls t e m c e l i s ，m s c s ) 广泛分和于骨髓、肌肉、血管、肝脏、胰腺和脂肪等组织中。 成体干细胞的研究进展不仅是人类发育生物学的重大技术突破，对揭示生 命的本质和内在规律具有重要意义，而且最激动人心的是可以用于移植治疗多 浙江大学硕士论文 种疾病和构建人工组织器官，在创伤修复、组织或器官功能重建中具有十分诱 人的应用前景。 2 成体干细胞的生物学特点 成人体内的成熟细胞往往由于高度分化而完全失去再分裂的能力和衰老 死亡。成体干细胞存在的生理意义是负责更新正常衰老死亡细胞，维持机体正 常组织的结构与功能。一旦生理需要，这些干细胞可按照发育途径通过分裂而 产生分化细胞。这类细胞的特点是细胞周期缓慢、具有自我更新和分化潜能。 估计体内可能存在着从胚胎干细胞向成熟细胞分化的不同阶段的干细胞或前 体细胞，这些细胞本身不是处于分化途径的终端，具有一定的增殖分裂能力， 可连续分裂，也可在较长时间内处于静止状态。成体干细胞主要以对称分裂和 非对称分裂两种方式生长，对称分裂形成两个相同的干细胞，非对称分裂生成 一个专一的分化细胞和一个干细胞。干细胞在增殖过程中处于相对静止状态， 通常等数分裂为干细胞和定向祖细胞，当受到损伤等情况时，成体干细胞的分 裂方式会发生改变，以适应机体的需要 v o g e lg ，2 0 0 0 ：m a g l im c ，2 0 0 0 。各 种成体干细胞的体内外生长特性和表型可能不尽一致，但成体干细胞通常处于 静息状态，分裂缓慢，在形态学上表现为细胞体积小、胞内细胞器稀少、细胞 内r n a 含量低和在组织结构中位置相对固定 l i e c h t yk w ，2 0 0 0 。针对不同来 源成体干细胞的生物学特点，利用细胞因子组合可大量扩增成人造血干细胞、 神经干细胞、间质干细胞等。 造血干细胞是各种血液细胞的种子细胞，但移植到脑内可转变为神经细 胞，进入肝脏可分化为肝细胞，使肝脏恢复正常功能 l a g a s s ee ，2 0 0 0 。因 此有可能成为退行性脑变和肝损伤功能重建的新型起源细胞。 骨髓间质干细胞是最具有代表性、分化倾向较多的成体干细胞之一，具有 向多种中胚层和神经外胚层来源的组织细胞分化的能力，这些细胞包括肌细 胞、成骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、上皮细胞、神经细胞、肌 肉细胞和肌键等，也可以分化为造血干细胞和基质细胞 c l a r k ed l ，2 0 0 0 ： v o g e lg ，2 0 0 0 ：l a g a s s ee ，2 0 0 0 。 浙江大学硕士论文 3 脐血干细胞 人类脐血含有大量的造血干细胞祖细胞( h e r n a t o p o i e t i c s t e mc e l l h e r n a t o p n i e t i cp r o g e n i t o rc e l l ，h s c h p c ) 。脐血中的淋巴细胞抗原性弱，功能 相对不成熟，移植后发生急性移植物抗宿主病( g r a f t v e r s u sl ：o s td i s e a s e ，g v h e ) 的危险性较低，所以，脐血干细胞有移植成活率高、移植物抗宿主病发生率低 的优点，因而具有广泛应用于临床组织工程学的巨大潜能，已成为干细胞移植 的一种重要途径，与之相关的基础研究和临床应用越来越受到重视。作为骨髓 的替代物，脐血干细胞已应用于血液系统恶性肿瘤、再生障碍性贫血、部分遗 传性疾病等的治疗。目前，国内外均已建立了或正在着手建立脐血干细胞库， 用于上述疾病的治疗。 脐血干细胞是一种具有分化潜能的原始细胞，具备自我更新和增殖的能 力，并能在特定因素的影响或在分化诱导剂存在下，向各种细胞或组织分化。 研究证实，脐血中不仅含有可向血液系统定向分化的h s c h p c ，而且含有大 量与骨髓间质干细胞性质相似的间质干细胞，即脐血间质干细胞，可在一定条 件下分化为多种间质来源细胞 e r i c e sa ，, 2 0 0 0 。来源于脐血的单核细胞经培养 后出现的贴壁细胞有两种表型，破骨样细胞和间充质样细胞，其中间充质样细 胞呈梭形，表达s h 2 、s h ：3 、s h 4 、a s a m 、m a b l 4 7 0 、c d l 3 、c d 2 9 、c d 4 9 等，与骨髓间质干细胞一致。脐血间质干细胞在体外具有向骨和脂肪细胞分化 的能力。脐血间质干细胞有8 5 以上处于细胞周期的g 0 g i 期，在地塞米松、 b 一磷酸甘油、抗坏血酸、胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤等诱导剂存在时可以向 成骨细胞和脂肪细胞分化。 4 骨髓基质干细胞与骨键间充质干细胞 1 9 6 0 7 0 ，f r i e d e n s t e i n 等在骨髓培养时发现有少量纺锤状贴壁细胞，以2 4 个细胞的集落形式存在，并将其称为成纤维细胞集落形成单位( c o l o n yf o r m i r g u n i t - 一f i b r o b l a s t i c ，( f u - - f ) ，这些细胞经过2 4 d 的休眠后迅速增殖，并继续保持纺 锤状，分泌类似骨与软骨的小的沉积物。8 0 年代o v v e n 等研究证明，帖壁的 各个细胞集落大小、形态和酶的表达均有所不同，认为不同的细胞集落处于不 浙江大学硕士论文 同的分化阶段。通过对成骨分化的标志物碱性磷酸酶( a l p ) 表达水平的测定， 发现多数( 约7 5 ) c f u - f 处于分化早期的干细胞阶段，称之为骨髓基质干细胞 ( b o n em a r r o ws t r o m a lc e l l ，b m s c ) 。 骨髓基质干细胞具有很强的自我更新能力，在体外培养条件下，成人骨髓 基质干细胞分裂4 0 次后，仍可以保持纺锤形态和成骨潜f l b r u d e rs p , 1 9 9 7 。 骨髓基质干细胞也具有多向分化能力，在不同诱导条件下，可分化为不同 的间充质细胞，如成骨系细胞、成纤维系细胞、肌肉细胞、脂肪细胞及内皮细 胞等，因此又被称为间充质干细胞( m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ，m s c s ) 。 诱导m s c 单细胞克隆可向成骨细胞分化，部分可分化为脂肪细胞、软骨 n t 胞 p i t t e n g e rm f ，1 9 9 9 ；m u r a g l i aa ，2 0 0 0 】。另外，m s c 有转分化的现象，已 表达成骨细胞活性的b m s c 可转分化为脂肪细胞 n u t t a l 1m e ，1 9 9 8 。软骨细胞 也可转分化而表达成骨细胞产物。m s c 还可以向非间充质细胞分化，如神经 元等 w o o d b t t r gd ，2 0 0 0 】。这些结果充分说明了骨髓基质干细胞具有多向分化 能力。 5 脂肪间充质干细胞 脂肪来源的间充质干细胞( m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ，m s c s ) 来源广泛，取材 方便，给患者带来的痛苦较小，在细胞治疗和组织工程中具有广泛的应用前景。 脂肪来源的m s c s 呈梭形生长，胞浆和核仁丰富，呈平行排列或漩涡样生 长。 m i z u n o 等 m i z u n oh ，1 9 9 9 和z u k 等【z u l cp a ，2 0 0 2 用氢化考的松作为主要 诱导剂，证明了脂肪来源的m s c s 可以分化为骨骼肌细胞。 r a n g a p p a 等 r a n g a p p as ，2 0 0 3 用5 一氮杂胞苷作为主要诱导剂，证明了脂肪 来源的m s c s 可以分化为心肌细胞。 w i n t e r 等 w i n t e r a ，2 0 0 3 用含转铁蛋白、地塞米松、转化生长因子一b 的软 骨诱导分化体系培养，证明了脂肪来源的m s c s 可以分化为软骨细胞。 s a f f o r d 等 s a f f o r dk m ，2 0 0 2 、z u k 等 z u kp a ，2 0 0 2 和a s h j i a n 等 a s h j i a n p h ，2 0 0 3 用不同诱导剂成功诱导脂肪来源的m s c s 分化为神经细胞。 z u k 等【z u kp a ，2 0 0 2 】用1 ，2 5 一二羟维生素d 3 作为主要诱导荆，证明了 浙江大学硕士论文 脂肪来源的m s c s 可以分化为成骨细胞。 z u k 等 z u k p a ，2 0 0 2 用地塞米松、胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤、吲哚美 辛作为诱导剂，证明了脂肪来源的m s c s 可以分化为脂肪细胞。 c o u s i n 等 c o r s i nb ，2 0 0 3 以c 5 7 雄性小鼠脂肪中分离出来的间充质来源的 细胞，经尾静脉输注给经致死量照射的c 5 7 雌性小鼠，受体小鼠造血功能完 全恢复。p c r 检测y 染色体的s r y 基因，在受体小鼠的骨髓、脾脏、外周血 均可以检测到供体来源的细胞。阳性的p c r 结果可以持续到l o 周以上，证明 供体来源的细胞在受体小鼠中可以稳定存在，并可能已经分化为不同系的血液 细胞。 6 皮肤干细胞 皮肤干细胞是皮肤发生、修复、重塑的关键性细胞，是皮肤组织工程理想 的种子细胞。表皮干细胞主要来像于毛囊的干细胞及皮肤基底层本身存在的少 量干细胞( 占基底层细胞的1 一1 0 ) 组成 o s h i m ah ，2 0 0 1 】。 表皮干细胞的典型特征是：慢周期性：在体内表现为标记滞留细胞，在新 生动物细胞分裂活跃时皮下注入3 h t d r 或b r d u ，由于干细胞分裂缓慢，因 而，可长期探测到放射活性。如小鼠表皮干细胞的标记滞留可长达2 年。自 我更新能力：在体外培养时，表皮干细胞呈克隆状生长，可进行1 4 0 次分裂， 产生1 1 0 4 0 个子代细胞 c o t s a x e l i sg 1 9 9 9 。对基底层的粘附：干细胞主要 通过表达整合素受体实现对基底膜的糕附，这是干细胞维持其特性的基本条 件。故可利用表皮干细胞较易枯附在胶原上的特性，直接将细胞用胶原进行 快速粘附后，去除未粘附细胞，对粘附细胞进行长期培养，不断传代，克隆， 获得较纯的干细胞 b i c k e n b a c hj r ，1 9 9 8 。分子标志：表皮干细胞高水平表达 3 种整合素受体：q201 、q3pl 、q5b1 ，由b1 组成的整合素受体在表皮 干细胞与基底膜的粘附中起重要作用，在于细胞中的表达是短暂扩充细胞的2 倍。结合q6 整合素及转铁蛋白受体c d 7 1 检测发现a6 阳性而c d7 1 阴性( c 1 6b r i c d 7 1 d i m ) 的细胞为干细胞，而6 与c d 7 l 均阳性( 6 b r i c d 7 1 b r i ) 的细胞 为短暂扩充细胞 l i a ，1 9 9 8 】。细胞角蛋白1 5 及1 9 ( k 1 5 ，k 1 9 ) 也可作为表皮 干细胞的标志，在干细胞的分化过程中，k 1 5 表达的减少较k t 9 更早，k 1 9 浙江大学硕士论文 阳性的细胞可能是早期的短暂扩充细抱，k 1 5 更能鉴别出毛囊的隆突部表皮干 细胞 l y l es ，1 9 9 8 。 自皮肤分离的真皮干细胞，在培养条件下，单个细胞的克隆可扩增分化， 产生神经元、神经胶质细胞、平滑肌细胞和脂肪细胞 t o m aj g , 2 0 0 1 。 7 造血干细胞 造血干细胞具有高度的自我更新、自我维持和多向分化的能力。它以不对 称性有丝分裂方式进行分裂。一个干细胞分裂产生两个子细胞，其中一个分化 为造血祖细胞( h e m a t 叩o i e t i cp r o g e n i t o rc e l l ，h p c ) ，另一个则保持干细胞全部 特征不变。造血祖细胞只具有限的自我更新能力和高度的增殖分化能力，能进 一步增殖、分化形成各种血细胞，以补充衰老、死亡细胞，使外周血成熟细胞 数量保持动态平衡。 目前造血干细胞的主要来源为骨髓、动员的外周血和脐血。c d 3 4 是人们 普遍认同的造血干祖细胞的代表性表面标志，随细胞分化成熟逐渐减少甚至 消失。造血干细胞可以诱导分化形成脑细胞( 外胚层) 、肝前体细胞( 内胚层) 和心肌、平滑肌及骨骼肌细胞( 中胚层) 。 j a c k s o n 等 j a c k s o nk a ，2 0 0 1 利用裸鼠冠状动脉缺血再灌注损伤的模型，将 纯化的骨髓造血干细胞移植到裸鼠的体内，观察到造血干细胞经体循环迁移到 心肌损伤的病灶内，形成新生血管及心肌细胞，而对照组( 假手术组) 无此现象 的发生。 s u z u k i 等 s u z u k it , 2 0 0 3 1 研究了一例移植外周血干细胞的患者，观察其大 动脉和外周动脉内皮新生化程度。结果发现在大动脉中2 5 的内皮细胞被移 植来的内皮细胞所替代，此现象在外周动脉也发生，但程度相对较低。表明了 内皮祖细胞的移植治疗在对血管新生有潜在性研究价值。 8 成体干细胞组织工程 完美地修复或替代组织、肢体或器官的伤残或病损一直是现代医学研究的 重点目标之一。成体干细胞、胚胎干细胞、治疗性克隆、生物相容性可降解性 新材料等为组织工程技术的发展奠定了基础。但从应用的角度考虑，胚胎于细 1 2 浙江大学硕士论文 胞来源的细胞在临床应用还存在许多技术问题，需要攻克定向诱导分化机制、 免疫排斥和致畸胎瘤等问题。体细胞治疗性克隆可以解决免疫排斥间题，但目 前的技术还不成熟。成体干细胞具有离成熟细胞距离较近、来源丰富、可塑性 强、具有多向分化潜能、可以实现个体化治疗、无免疫排斥问题等特点，因而 成体干细胞是目前最具有应用优势的种子细胞，将优先进入临床使用。 干细胞及以它为基础的现代组织工程技术几乎涉及人体所有的重要组织、 器官和人类面临的大多数医学难题，如火器伤、烧伤、放射损伤等伤员的植皮， 肌肉、骨及软骨缺损的修补，髓、膝等关节的置换，血管疾病或损伤后的血管 替代，糖尿病患者的胰岛植入，心脏病患者的瓣膜置换、房室间隔缺损的修补， 癌症患者手术切除后组织或器官的替代，放射损伤及大剂量放、化疗后的造血 与免疫重建，肝、肾等重要脏器损伤或功能衰竭的置换，部分遗传缺陷性疾病 的治疗等。千细胞及其衍生组织器官的临床广泛应用将产生一种全新的治疗技 术，再造正常的甚至年轻的组织器官。加工修饰的细胞移植疗法是替代、修复 或加强受损的组织或器官的生物学功能的新策略，目前临床上的许多难治性疾 病都有可能通过干细胞及其衍生的细胞或组织移植得到有效治疗。 成体干细胞是组织工程的理想种子细胞，以干细胞为种子的人工皮肤、骨、 肌键、血管、角膜、肌肉、神经等正在实验室形成 s t o c ku a ，2 0 0 l ：b i a n c or 2 0 0 1 1 。组织工程人工皮研究已取得突破性进展，并已应用于临床。目前，利 用组织工程技术再造的组织和器官总的来讲还是结构比较单一的器官，或器官 的一部分，对于结构十分复杂的组织，如肝、肢体等尚有一定距离，但现代生 物技术的发展相当迅速，相信在不久的将来，人类将会很方便地利用自身的干 细胞生产的新的组织、器官用于移植治疗。 a s a h a r a 等从人的外周血中分离得到c d 3 4 + 细胞( 造血干细胞) ，体外培养 后回输给裸鼠后肢动脉急性结扎的缺血模型，发现造血干细胞可参与新生血管 形成，而非缺血部位则无血管形成及c d 3 4 + 细胞参与；自兔外周血白细胞中 分离得到的c d 3 4 + 细胞，在兔后肢动脉急性结扎情况下，自体回输，具有同 样生物学活性 a s a h a r at ，1 9 9 7 。 k a w a m o t o 等 k a w a m o t oa ，2 0 0 1 使用裸鼠左前降支动脉结扎形成心肌缺血 模型，缺血后3 h 输注体外培养内皮祖细胞，在心肌缺血前和2 8 天后，心脏超 浙江大学硕士论文 声检察显示心室体积明显小于对照组( 只接受培养基输注，未接受内皮祖细胞 输注) ，而射血分数明显大于对照组，心室区域性壁活动仍得到很好的保存， 从而证实外源性输注内皮祖细胞，靶向性聚集到心肌血管新生部位，增加脉管 系统，以及对于维持左室功能有利。k a l k a 等 k a l k ac ，2 0 0 0 研究移植人内皮祖 细胞到下肢缺血的无胸腺的裸鼠中，血流恢复和毛细血管密度显著改善，下肢 丧失比例显著减少。 用骨髓来源的干细胞直接注射到实验动物受损的骨骼肌中，2 5 周后发现 骨髓来源的干细胞己转变为表达1 3 半乳糖苷酶( b g a l ) 的肌肉细胞；而m y o s i n 轻链3 f 启动子上的b g a l 仅在骨骼肌有表达 f e r r a r ig , 1 9 9 8 。实验显示骨髓 来源的干细胞经诱导分化后可重建大约3 0 一5 0 的肝细胞，并且此类再生的 肝细胞可使缺乏f a h 酶的突变小鼠的肝功能恢复正常。延胡索酰乙酰水解酶 ( f u m a r y l a c e t o a c e t a t eh y d r o l a s e ，f a h 酶) 是一种酪氨酸代谢的必需酶，它可 以防止高酪氨酸血症和肝毒性酪氨酸代谢的发生 l a g a s s ee ，2 0 0 0 1 。 将骨髓间质干细胞( m e s e n c h y m a ls t e mc e l l ，m s c ) 移植到心肌梗塞区，9 d 后 可观察到来源于m s c 的肌细胞，并表达肌细胞增强因子( m y o c y t ee m p h a s i s f a c t o r2 ，m e f 2 ) 、肌特异性转录因子g a t a 4 、细胞分化早期标志物( c s x n k x 2 5 ) 和c o n n e x i n 4 3 ，进行心肌移植后除具有心肌再生外，同时可促进新生血管的 形成，缓解心室的重建，明显改善心功能 o r l i cd ，2 0 0 1 1 。 这些成体于细胞组织工程相关研究表明，可以从病人的骨髓、血液、脂肪、 皮肤等处方便地获得干细胞，然后在体外扩增、诱导处理后再移植回体内发挥 作用，或者与生物相容可降解支架材料相结合，移植修复或再造组织、器官。 干细胞组织工程将是临床常见的各种退行性疾病，如糖尿病、帕金森氏病、肝 硬化以及肿瘤等疾病的最佳治疗策略。 1 4 浙江大学硕二f ：论文 第二节胚胎干细胞 胚胎于细胞( e m b r y o n i cs t e mc e l l ，e sc e l l ) 是来源于受精卵发育早期 胚胎( 着床前) 的干细胞，是从早期胚胎内细胞团( i n n e rg e r mc e l l s ，1 c m ) 或者原始生殖细胞( p r i m o r d i a lg e r mc e i l s ，p g c s ) 经体外分化抑制培养分 离克隆的。e s 细胞具有发育的全能性，可以分化为体内所有类型的成熟细胞。 出于胚胎干细胞的一系列特性，不仅可以作为基础研究的实验材料，而且可以 作为细胞治疗、组织器官工程开发的初始材料，所以，越来越多的生物科学工 作者都把胚胎干细胞作为研究主题，应用于胚胎发育研究、遗传病治疗、基因 工程、细胞治疗、组织工程、药物评价与开发等研究中。 1 胚胎发育与胚胎干细胞研究简述 4 删囊捧嚏 上图描述了人类排卵、受精与卵裂的过程。 受精卵由输卵管向子宫运行中，不断进行细胞分裂，此过程称卵裂 ( c l e a v a g e ) 。卵裂产生的细胞称卵裂球( b l a s t o m e r e ) 。随着卵裂球数目的增 加，细胞逐渐变小，到第3 天时形成一个1 2 1 6 个卵裂球组成的实心胚，称 桑椹胚( m o r u l a ) 。桑椹胚的细胞继续分裂，细胞间逐渐出现小的腔隙，它们最 后汇合成一个大腔，桑椹胚转变为中空的胚泡。胚泡( b l a s t o c y s t ，又称囊胚) 于受精的第4 天形成并进入子宫腔。胚泡外表为一层扁平缅胞。称滋养层 浙江大学顶：l ：论文 ( t r o p h o b l a s t ) ，中心的腔称胚泡腔( b l a s t o c o e l e ) ，腔内一侧的一群细胞， 称内细胞团( i n n e re e l lm a s s ) 。胚泡逐渐长大，透明带变薄而消失，胚泡得 以与子宫内膜接触，植入丌始。 上图描述了e s 细胞的来源、培养和分化。e s 细胞来源于胚泡( b l a s t o c y s t 又称囊胚) 的内细胞团( i n n e rc e l lm a s s ) 。 小鼠e s 细胞建系的过程如下： 1 取孕3 5 的小鼠： 2 引颈处死：消毒；取子宫； 3 冲胚： 4 囊胚培养； 5 取内细胞团( i c m ) ； 6 培养分散的i c m ，碍到e s 群落 6 浙江火学硕士论文 7 e s 细胞传代。 e s 细胞分化的过程如下 ( 拟胚体常规法) 1 e s 细胞传代、培养； 2 悬滴培养形成拟胚体； 3 悬浮培养拟胚体； 4 拟胚体贴壁培养： 5 诱导培养基培养。 2 胚胎干细胞的研究历史 1 9 8 1 年，e v a n s 和k a u f m a n 等利用延迟着床的小鼠早期胚胎体外培养，分 离出小鼠e s 细胞 e v a n sm l ，1 9 8 1 】，开辟了哺乳动物e s 细胞研究的新纪元。 m a r t i n e 用e c 细胞条件培养液( c o n d i t i o n e dm e d i u m ，c m ) 和免疫手术分离i c m 细胞，进而得到e s 细胞系 m a r t i ng1 9 8 1 】。随着研究的进一步深入，科学家 们又相继建立了仓鼠、兔、猪、牛、羊以及水貂的类e s 细胞。1 9 9 8 年t h o m o s o n 等分离得到了人类e s 细胞 t h o m s o nj a ，1 9 9 8 ，同年s h a m b l o t t 等用5 9 周龄 胎儿p g c s 分离克隆出人类e g 细胞 s h a m b l o t tm j ，1 9 9 8 ，引起了全世界的轰 动。e s 细胞的研究成果被评为1 9 9 9 年世界十大科技进展之首。至2 0 0 4 年， 已经有1 7 个人类e s 细胞系建立 c o w a nc a ，2 0 0 4 。动物克隆技术成熟后，出 现了利用核转移技术建立e s 细胞系的技术 w a k a y a m a t , 2 0 0 1 。 e s 细胞应用方面的研究更是层出不穷，分化成许多特异性的成体细胞， 包括心肌细胞、骨骼肌细胞、血管平滑肌细胞、神经细胞、神经胶质细胞、上 皮细胞、造血细胞、软骨细胞、成骨细胞、胰岛细胞、肝细胞、生殖于细胞等 r o h w e d e l ，2