（环境科学专业论文）电化学传感器用于堆肥中简青霉产漆酶检测的研究.pdf

电化学传感器用丁堆肥中简青霉产漆酶中令测的研宄 a bs t r a c t c o m p o s t i n gi s c o n s i d e r e da sau s e f u lp r o c e s sf o rt h ed is p o s a lo f m u n i c i p a la n da g r i c u l t u r a ls o l i dw a s t e ，i nw h i c he n z y m e sp l a ya ni m p o r t a n t r e l e e l e c t r o t h e m i c a ls e n s o t sa r ee l e c t r o c h e m i c a ld e v i c e st h a ta r eb a s e do n t h es i g n a lt r a n s m i s s i o no fb i o c h e m i c a lr e a c t i o n s i nc o m p a r i s o nw i t h t h e c o n v e n t i o n a lc h e m i c a la n db i o c h e m i c a l a n a l y t i c a l m e t h o d s ，t h e e l e c t r o c h e m i c a ls e n s o r sh a v et h ea d v a n t a g e so fc o n v e n i e n c e ，t i m e s a v i n ga s w e l la s h i g hp r e c i s i o n m o r e o v e r ，t h e ya r ec o n v e n i e n tf o rc o m p u t e r st o c o l l e c ta n dp r o c e s sd a t a ，a n dt h es a m p l ew o n tb ed a m a g e do rp o l l u t e d e l e c t r o c h e m i c a ls e n s o ra san e wk i n do fa n a l y t i c a lt o o li sw i d e l ya p p l i c a b l e i nm o n i t o r i n ga n dc o n t r o l l i n go fc o m p o s t i n g t h es e n s o r sh a v eb e e no n eo f m o s tc o n c e r n e da r e a sb e c a u s eo ft h e i rs p e c i f i c i t ya n dh i g h - e f f i c i e n c y i nt h e d e s i g na n df a b r i c a t i o no fe l e c t r o c h e m i c a ls e n s o r s ，t h ek e yt e c h n o l o g yi s t o m o d i f yt h ew o r k i n ge l e c t r o d ew i t ht h em u l t i w a l lc a r b o nn a n o t u b e s ( c n t s ) w h i c hc a ne n h a n c et h ee l e c t r o c h e m i c a l s i g n a l o ft h e l a c c a s ei nt h e m i c r o e n v i r o n m e n t i nt h i sp a p e r ，t h er e s e a r c hw a sa i m e dt od e v e l o pt h e p r o d u c t i o no ft h el a c c a s ef r o mp e n i c i l l i u ms i m p l i c i s s i m u mi s o l a t e df r o mt h e c o m p o s t i n g ，a n dc h a r a c t e r i z et h ee l e c t r o c h e m i c a la c t i v i t yo ft h el a c c a s ea s w e l la st h ee n h a n c e ds i g n a lf r o mt h ei n t r o d u c t i o no ft h ec n t s t h ed e t a i l e d r e s e a r c hc o n t e n t sa r es h m m a r i z e da sf o l l o w s ： t h e o p t i m a l f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sf o rl a c c a s e p r o d u c t i o nb y p e n i c i l l i u ms i m p l i c i s s i m u mi ns h a k e f l a s kc u l t i v a t i o nw e r es t u d i e d t h e c o m p o s i t i o no ff e r m e n t a t i o nm e d i u mw a sm a l t o s e2 9 l ，p e p t o n e 1 2 g l ， 10 0m l lm a s s i v ee l e m e n t ss o l u t i o n ，2 5m l lt r a c ee l e m e n t ss o l u t i o n ， 1 0 0ug lv b l ，0 0 5 t w e e n8 0 s h a k i n gc u l t u r eo ft h el i q u i dc o n t a i n i n g 10 7 c o n i d i a m lf o r8d a ya tt h er e g i m eo f30 。ca n d15 0r m i nr e s u l t e di n t h ee n z y m ea c t i v i t yo f12 4 4u l t h eo p t i m u mp ho fp r o d u c t i o nl a c c a s e w a s4 0 t h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o no fc u w & s6 0 um e l l a n e l e c t r o c h e m i c a ls e n s o rf o rd e t e c t i o no ft h ea c t i v i t yo fl a c c a s ef r o m p e n i c i l l i u m s i m p l i c i s s i m u m i s o l a t e df r o mt h e c o m p o s t i n g h a sb e e n d e v e l o p e d t h es e n s o ri sb a s e do ng l a s s yc a r b o ne l e c t r o d em o d i f i e dw i t h m u l t i w a l lc a r b o nn a n o t u b e s ( c n t s ) t h ei n t r o d u c t i o no fc n t si n t ot h is s y s t e mc a ng r e a t l ye n h a n c et h ee l e c t r o c h e m i c a ls i g n a li nt h i sa s s a ym o r e 硕l 学p 论之 s e n s i t i v e l y ， s e l e c t i v e l y a n d r a p i d l y t h a nt h a ti n c o n v e n t i o n a l s p e c t r o p h o t o m e t r i ca s s a y s i tw a sf o u n dt h a tt h eo p t i m a lp hv a l u eo ft h e e l e c t r o l y t ew a s5 6 t h er e s u l t ss h o w e dag o o dl i n e a rc o r r e l a t i o nb e t w e e n t h ec u r r e n ta n dt h ec o n c e n t r a t i o no fl a c c a s e a c t i v i t i e sm e a s u r e d b y s p e c t r o p h o t o m e t r y ， w h e r et h e c u r r e n t s l o p e w a sm e a s u r e d b y c h r o n o a m p e r o m e t r y w i t ha c o e f f i c i e n to f0 9 8 35 t h e r e f o r e ，t h i s e l e c t r o c h e m i c a ls e n s o rc a nb eu s e df o rr a p i dd e t e c t i o no fl a c c a s ea c t i v i t y f r o mp e n i c i l l i u ms i m p l i c i s s i m t l m f u r t h e r m o r e ，i tm a yb ep o t e n t i a l l yu s e d f o rr a p i d q u a n t i f i c a t i o no fp e n i c i l l i u ms i m p l i c i s s i m u ma c c o r d i n gt ot h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h el a c c a s ea c t i v i t ie sa n dt h eb i o m a s s k e yw o r ds ：a m p e r o m e t r i cd e t e c t i o n ；l a c c a s e ；p e n i c i l l i u ms i m p l i c is s i m u m ； c o m p o s t ；l i q u i dc u l t u r e ；c a r b o nn a n o t u b e s 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的 研究成果。除了文中特j j t l ；h i ：l 以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：日期：年月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“，”) 作者签名： 导师签名： 日期： 日期： 1 年月日 年月日 硕i 学伊论文 第1 章绪论 目前，世界各国都把城市固体废弃物的减量化、无害化和资源化的 “三化”方针作为综合解决城市垃圾的原则，采用堆肥法处理城市垃圾 符合这一方向。堆肥化处理是在微生物的作用下通过高温发酵使垃圾中 的病源菌无害化，有机质腐殖化、稳定化，最终达到腐熟的过程。堆肥 化处理既解决了污染的问题，减轻废弃物给环境的压力，又使废弃物资 源得到充分利用，有利于农业可持续发展，是目前有机废物处理的最理 想的一种处理方式。在微生物分解有机物的过程中，不但大量可被植物 利用的有效态氮、磷、钾化合物，而且又合成新的高分子有机物一一腐 殖质，它是构成土壤肥力的重要活性物质。堆肥腐熟度是衡量堆肥产品 质量的尺度之一，其评价对于安全农用有着重要意义。未腐熟的产品施 用于土壤后，微生物还会利用土壤间隙中的氧气继续活动降解有机物， 从而造成厌氧的环境，使植物根系缺氧，并产生h 2s 和n o 等气体。未腐 熟的产品中有很高的碳氮比( 2 5 ：1 或更高) ，造成微生物去摄取土壤中的 氮，使土壤产生缺氮现象。并且在微生物的持续降解活动中还会产生作 为副产品的各种有机酸，对植物产生毒性，尤其是乙酸和酚类化合物会 抑制植物种子发芽、根系的生长，减少作物的产量【2 l 。 1 1 堆肥过程的影响因素及其控制 堆肥化过程是一个复杂的过程，要达到良好的堆制效果，必须控制 一些主要影响因素，它们分别是水分、碳氮比( c n ) 、氧含量、温度和 p h 等。这些因素决定微生物活动强度，从而印象堆肥的速度和品质。 1 1 1 水分 堆肥过程中，水分是一个重要的因素l3 1 。堆肥中水分的主要作用在 于溶解有机物，参与微生物的新陈代谢，水分蒸发时带走热量，起调节 堆肥温度的作用，堆肥原料水分的多少直接影响堆肥反应速度的快慢， 影响堆肥的质量，甚至关系到堆肥工艺的成败。因此，堆肥水分中的控 制过程十分重要。堆肥的起始含水率一般为5 0 - 6 0 。 1 1 2c n 堆肥化操作的一个关键因素是堆料中c n ，其值一般在2 0 30 之间为 电化学f 专感器用于二堆孵巾简青需产浴僻辛。删的研究 宜。c n 过高( 超过35 ) 微生物必须经过多次生命循环，氧化掉过量的碳， 直到达到一个合适的c n 供其进行新陈代谢。如果c n 过低，特别是p h 值 和温度高时，堆体中的氮以n h 3 挥发形式大量损失，并且堆肥产品也会给 农作物带来不利影响【4 l 。 1 1 3 含氧量 好氧堆肥是利用好氧微生物在有氧状态下对有机质进行快速降解。 同期是好样堆肥成功的重要因素之一。同期的第一个作用是为堆体的微 生物提供氧气。如果堆体内的含氧量不足，微生物处于厌氧状态，是降 解速度减缓，产生h 2 s 等臭气，通红死使堆体温度下降。通气的第二个作 用是调节温度【5 l ，堆肥需要微生物反应而产生高温。但是，对于快速堆 肥来讲，必须避免长时间的高温。大部分研究者认为堆体中的氧含量保 持在5 15 之间比较适宜。氧含量低于5 会导致厌氧发酵而产生恶 臭，氧含量高于l5 则会使堆体冷却，导致病原菌的大量存活【6 1 。 1 1 4 温度 对于堆肥系统而言，温度是堆肥系统微生物活动的反应，它是影响 微生物活动和堆肥工艺过程的重要因素。堆肥中微生物分解有机物而释 放出热量，这些热量使堆肥温度上升。堆肥初期，堆肥各层基本呈中温， 嗜温菌较为活跃，大量繁殖。它们利用有机物的过程中，有一部分转化 热量，堆层温度不断上升，1 2d 后可以达到5 0 6 0 。在这个温度下， 嗜温菌生长受到抑制，大量死亡，而嗜热菌的繁殖进入了激发状态1 7 - s l 。 堆肥作为一种生物系统，他与非生物系统是有差别的i9 1 。对于非生 物系统而言，反应速度直接与温度有关，温度越高反应的速度越快。然 而，靠酶促进行的堆肥生物化学反应系统，有利于反应进行的温度是有 限定范围的，限度意外的反应则是衰弱的。当温度超过极限时，温度越 高，反应的衰退变得更加迅速【l0 1 。不同种类微生物的生长对温度有不同 的要求。一般而言，嗜温菌最适合的温度是30 4 0 ，而嗜热菌发酵最适 合温度是4 5 6 0 【l 。所以堆肥过程中温度控制是十分重要的，堆肥化 过程，堆体温度应该控制在4 5 6 5 之间【1 2 l ，超过6 5 就会对微生物的 生长活动产生抑制作用，堆肥化是一个放热过程，若不加以控制，温度 可达到7 5 8 0 ，温度过高会过度消耗有机质，并且降低堆肥产品的质量 1 1 3 1 。 国家c o u n t r y温度t e m p e r a t u r e ( )时间d a y s ( d ) 2 硕士学伊论文 表1 中国和部分欧洲国家堆肥无害化标准 t a b l eli n n o x i o u ss t a n d a r do fc o m p o s t i n go fc h i n aa n ds o m ee u r o p ec o u n t r i e s 1 1 5p h 堆肥过程中，p h 值是一个重要的因素。一般来讲，p h 在3 12 z 间 都可以进行堆肥1 引。但又研究发现，在堆肥初期堆体的p h 降低，低p h l 直 会严重抑制堆肥反应的进行。有研究发现微生物在高温极端最大分解能 力为p h t 直7 5 8 5 i ”1 。 1 2 堆肥过程中腐熟度判定 目前国内外在堆肥腐熟度的评价方面已经作了广泛而且很深入的研 究，提出了众多的评价指标及方法，但仍没有形成种公认的堆肥腐熟 度指标。李承强等【l6 j 把堆肥腐熟度指标划分为三类：物理学指标、化学指 标( 包括腐殖质) 和生物学指标。 1 2 1 物理学指标 物理学指标是指堆肥过程中的一些变化比较直观的性质，如温 度、气味和颜色等。具体说来有：( 1 ) 温度；堆肥开始后堆体温度是逐渐升 高再降低的变化过程，温度的变化分为三个明显阶段，初期加热阶段， 堆体温度很快上升到55 以上；接着维持一段时间高温阶段；随后是堆 肥逐渐达到腐熟的冷却阶段，堆体腐熟后堆体温度与环境温度致，一般 不明显变化，因此温度是堆肥过程中最重要的常规检测指标之一；( 2 ) 气 味；堆肥原料具有令人不快的气味，并在堆肥过程中会产生h 2s ，n o 等 难闻的气体，而良好的堆肥过程后这些气味逐渐减弱并在堆肥结束后消 失，堆肥结束和翻堆后，堆体内无不快气味产生，堆肥产品具有潮湿泥 土的气息。所以气味也可以作为堆肥腐熟的指标；( 3 ) 色度；堆肥过程中 堆料逐渐发黑，腐熟后的堆肥产品呈黑褐和黑色，颜色也可以作为一判 断标准。不过，堆肥的色度显然受其原料成分的影响，很难建立统一的 3 电化学传感器用于堆肥中简青霉产漆酶辛令测的研究 色度标准以判别各种堆肥的腐熟程度；( 4 ) 光学性质；对不同时间的堆肥 的水萃取物在波长2 8 0n m ，4 6 5n m 和6 6 5n m 的光学性质研究表明，由于 个别有机成分的少量存在，抑制了对短波的吸收，而对6 6 5n m 波长的可 见光影响较少，由此通过检测堆肥萃取物在波长6 6 5n m 下的吸光度变化 可反映堆肥腐熟度。 1 2 2 化学指标 由于物理学指标难于定量化表征堆肥过程中堆料成分的变化，所以 通过分析堆肥过程中堆料的化学成分或化学性质的变化以评价堆肥腐熟 度的方法更常用一些。这些化学指标有：有机质变化指标、氨氮指标、 腐殖化指标、碳氮比和有机酸等。具体内容包括：( 1 ) 有机质变化指标； 在堆肥过程中，堆料中的不稳定有机质分解转化为二氧化碳、水、矿物 质和稳定化有机质，堆料的有机质含量变化显著，因此可以通过一些反 映有机质变化的参数( 如c o d ，b o d5 及v s 等) 的测量及某些有机质在堆肥 过程中的变化规律来表征腐熟度：( 2 ) 氨氮指标；在堆肥的生化降解过程 中含氮的成分发生降解产生氨气，在堆肥后期部分氨气被氧化成亚硝酸 盐和硝酸盐，所以可以用亚硝酸盐或硝酸盐的存在判断腐熟度，并且由 于这两个指标的测定较为快速而简单，具有较好的实用价值；( 3 ) 腐殖化 指标；堆肥过程中伴随着腐殖化的过程，研究各腐殖化参数的变化是评价 腐熟度的重要方法，由此提出c e c ( 阳离子交换容量) 、腐殖质h s 、腐酸 h a 、富里酸f a 、富里部分f f 及非腐殖质成分n h f 等参数用以评价堆肥腐 熟度：( 4 ) 碳氮比；碳源是微生物利用的能源，氮源是微生物的营养物质， 碳和氮的变化是堆肥的基本特征之一，c n ( 固相) 是最常用于评价腐熟度 的参数。而也有研究指出微生物在对堆肥原料的降解中代谢发生在水溶 相，因此水溶性有机碳有机氮的指标可以作为堆肥腐熟度的参数；( 5 ) 有 机酸；有机酸广泛存在于未腐熟的堆肥中，可通过研究有机酸的变化评价 堆肥腐熟度。 1 2 3 生物学指标 堆料中微生物的活性变化及堆肥对植物生长的影响常用于评价堆肥 腐熟度。这些指标主要有呼吸作用、生物活性及种子发芽率等。具体有： ( 1 ) 呼吸作用；堆肥是富含腐殖质的稳定产品，微生物处于休眠状态，此 时腐殖质的生化降解速率及二氧化碳产生和氧气消耗都较慢，因此可以 用二氧化碳的产生和微生物的耗氧速率作为反映腐熟度的指标；( 2 ) 生物 活性；可以用反映微生物活性变化的参数如酶活性、a t p 和微生物的数量、 种类来表征堆肥的稳定和腐熟；( 3 ) 种子发芽率；未腐熟的堆肥产品对植 4 坝t 掌佗论文 l_ ! 一, 皇鼍曼曼 物的生长有抑制作用，因此可用堆肥和土壤的混合物中植物的生长状况 来评价堆肥的腐熟度，考虑到堆肥腐熟度的实用意义，这是最终和最具 说服力的评价方法。 1 3 堆肥腐熟度的检测方法 1 3 1s o l v i t a 测试法 s o l v i t a 澳0 试法| 17 1 由美国w o o d se n d 研究实验室提出并申请了专利，已 广泛应用了二十几年，有十三个国家采用了该方法，瑞典、丹麦、西班 牙、挪威已经将该方法作为官方测试方法【1 8 】。该测试方法以现代凝胶技 术为基础，操作简易、快速，可在4h 内得出结论。将样品放人密闭小杯 中并放人一个信号器，该信号器能反映c 0 2 的存在( 通过颜色) ，对照颜色 表可得出结论，颜色对照表从1 ( 生堆料) 到8 ( 腐熟堆肥) 变化，读数越大则 腐熟程度越好19 1 。 1 3 2d e w a r 自热测试法 d e w a r 自热测试法 2 0 i 基于最初欧洲的自热测试标准方法，由w o o d s e n d 实验室总结整理。先调节测试样品的水分，然后插入一支温度计，温 度计距瓶底大约5c m 。样品放入一个绝热真空瓶中，这样置于室温至少5 d ，但不超过l0d ，并测试每天的最高温度，其结果即为腐熟过程的最高 升温。该方法的缺点是测试结果只能区分腐熟和不腐熟，时间较长，但 比较直观，具有很强的操作性。测试结果分为i v 五个等级来评价。 1 3 3 电化学传感器 利用电化学传感器对腐熟度生物学指标中的酶活性进行监测。堆肥 中酶活性开始时不断提高，到达最大活性，然后降低，当酶活性随时间 降低非常缓慢时，即可认为堆肥腐熟完成。电化学传感器成为直接或间 接检测生物分子生理或生化过程相关参数的新方法。 1 4 电化学传感器概述 电化学传感器是化学传感器的一个非常重要的分支，也是目前研究 最多、应用最为广泛的一种化学传感器。它也成为近二、三十年来发展 较快的电化学测试和监测的新技术，其发展速度之快，应用范围之广， 生产厂家之多都是非常可观的。电化学分析所测的信号是电位、电流、 电阻、电容和频率等的变化，可以直接测量，也便于自动化、小型化和 智能化【2 1 1 。 5 宅化学传愍器用二j 堆俨中简青霉产漆酶拎测的石开究 1 4 1 电化学传感器原理及特点 传感器是能感受设定的被测定物，并按照一定规律将其转化为可检 测信号的器件或装置，它通常由敏感元件、转换元件及相应的机械结构 和电子线路所组成 2 2 1 。电化学传感器按照其输出信号的不同可以分为电 位型传感器、电流型传感器和电导型传感器。电位型传感器是将溶解于 电解质溶液中的被测物质作用于电极而产生的电动势作为传感器的输 出，从而实现对被测物质的检测1 2 3 l ，电极最常使用的基底电极是ph 玻璃 敏感电极，可以利用电极的响应信号的改变量间接测定有机磷农药，。 有机磷农药抑制指示酶反应，影响溶液的p h 值，由此可以设计电位型电 极，因此可以通过测定溶液中的氧或h 2 0 2 来检测有机磷农药1 2 4 1 ：电流型传 感器是在保持电极和电解质溶液的界面为一恒定的电位时，将被测物直 接氧化或还原，并将流过外电路的电流作为传感器的输出，从而实现对 被测物质的检测：电导型传感器是将被测物氧化或还原后电解质溶液电 导的变化作为传感器的输出，从而实现被测物质的检测【2 5 1 。 与传统的分析方法相比，电化学传感器具有灵敏度高，选择性好， 响应快，操作简便，样品需要量少，可微型化，成本低等特点，巳在生 物医学，环境监测，食品医药工业等领域展现出广阔的应用前景。 1 4 2 电化学传感器的分类 按照电化学传感器所检测的物质不同，电化学传感器主要可以分为 离子传感器、气体传感器和生物传感器。 1 4 2 1 离子传感器 电位型传感器中，研究最多的是离子型传感器，而离子型传感器研 究最早和最多的是p h 传感器1 2 6 1 。离子传感器也叫离子选择性电极，它响 应于特定离子，将离子活度转化为电位，并遵从能斯特公式【27 1 。 离子选择性电极构造的主要部分是离子选择性膜和内导系统。离子 选择性膜是离子选择性电极最重要的组成部分，它决定着电极的性质， 不同的离子选择电极具有不同的离子选择性膜，其作用是将溶液中特定 离子活度转变成电位信号一一膜电位。膜电位随着被测定离子的活度而 变化，所以通过离子选择性膜的膜电位可以测定出离子的活度。内导系 统一般包括内参比溶液和内参比电极，其作用在于将膜电位引出【2 8 1 。 目前，离子选择性电极被广泛应用于环境监测，其优点在于测量对 象广、设备简单、灵敏度高、样品不需要复杂的前处理等。 1 4 2 2 气体传感器 近年来，随着人们环保意识的增强以及各国对有毒气体排放和污染 6 硕十学1 7 论文 物排放方面的严格立法，各种气体监测及预警装置正在得到越来越广泛 的应用，所以气体传感器的研究也成为了热点 2 9 】。电化学气体传感器以 体积小、检测速度快、准确、便携、可现场直接检测和连续检测等独特 优点，越来越受到人们的普遍重视。 电化学气体传感器包括半导体气体传感器、接触燃烧型气体传感器 和固体电解质气体传感器等1 3 引。 1 半导体气体传感器 在催化领域中，人们早己发现半导体金属氧化物的电学性能对气体 环境极为敏感，但直到l9 6 2 年金属氧化物陶瓷气体传感器才于日本问世， 并于l9 6 8 年实现商品化【3 卜32 1 。最早应用于气体传感器的金属氧化物半导 体材料主要包括s n 0 2 、z n o 和f e 2 0 3 ，在近些年的研究中，人们不断利用 物理、化学方法对它们进行修饰改性以及搀杂，使得这类气体传感器的 灵敏性、选择性和稳定性不断得到提高1 3 3j 。氧化物半导体传感器是目前 所有气体传感器中产量最大的，其研究、开发和应用都有了很大的进展。 半导体式气体传感器分为电阻式和非电阻式，电阻式半导体气体传 感器主要是指半导体金属氧化物陶瓷气体传感器，其电阻随着气体含量 不同而变化，除了传统的s n 0 2 、z n o 和f e 2 0 3 三大类外，现在又研究开发 了一批新型材料。m o s - 二- - 极管式和结型二级管式以及场效应管气体传感 器是非电阻式半导体气体传感器，其电流或电压随着气体含量而变化， 主要检测氢和硅烷气等可燃性气体，主要优点是灵敏度高，但制作工艺 比较复杂，成本高 3 4 i 。 2 接触燃烧型气体传感器 接触燃烧式气体传感器可分为直接接触燃烧式和催化接触燃烧式 【3 引。其工作原理是可燃性气体在检测元件( 如p t 电热丝等在通电状态下) 表面产生无焰燃烧，检测元件由于燃烧而升温，从而使其电阻值发生变 化。利用接触燃烧式传感器的这一原理可以检测各种可燃性气体在其爆 炸下限以内的浓度，实现对可燃气危险浓度的早期预报【”l 。 目前美日在这一领域处于领先地位，在日本，检测h 2 、l p g 、c h 4 以 及有机溶剂蒸汽的接触燃烧式气体传感器已经实现了规模生产，实用效 果好，可靠性高 3 6 】。 3 固体电解质气体传感器 固体电解质气体传感器是产量仅次于金属氧化物半导体气敏传感 器的一类气敏传感器，它以离子导电占绝对优势的固体电解质为原料， 制成各种结构的电化学电池【37 1 。固体电解质气体传感器对于一些常见的 气体如0 2 、c o 、c 0 2 、n o 。、s o x 等的检测具有较高的灵敏度和选择性。 7 电化学f t 慝器用卜墙犯中衙霄碍产漆隧拎测疗勺研究 研究最早的固体电解质气体传感器是采用对氧离子具有传导性的z r 0 2 系 列固体电解质为工作介质的浓差电池式氧传感器，并己经广泛应用于燃 煤工业的废气检测以及汽车尾气中有害气体的控制等领域 3 8 - 4 0 l 。基于质 子导体n a t i o n 膜的全固态c o 传感器最近得到研究并取得良好的结果1 4 1 1 。 在c 0 2 传感器的研究中，n a + 离子导体na s i c o n 材料己经取代了早期的 k 2 c0 3 固体电解质并极大地改善了传感器的性能 4 2 - 4 4j 。而最近，以浓硫 酸处理na f i o n 膜为固体电解质的全固态s 0 2 传感器的研究在国内也己经 有了报导1 4 5 - 4 6j 。 1 4 2 3 生物传感器 生物传感器技术是现代生物技术与物理学、化学等多学科、多领域 相交叉和结合的产物。从最先提出生物传感器的设想距今己有4 0 多年。 从2 0 世纪6 0 年代中期报道的最早的生物传感器一一葡萄糖传感器。至今， 己有多种生物传感器问世。2 0 世纪8 0 年代以来，由于新原理、新技术的 不断采用，生物传感器的发展取得了长足的进步，并被广泛的应用于生 物学、环境科学、医学等领域。 生物传感器是用生物活性材料( 酶、蛋白质、d n a 、抗体、抗原、生 物膜等) 与物理化学换能器有机结合的一门交叉学科。目前，生物传感器 在美国、欧洲和日本等地区都拥有广阔的市场，其份额在逐年增长 4 7 , 4 8 l 。 在2l 世纪知识经济发展中，生物传感器技术必将是介于信息和生物技术 之间的新增长点，在临床诊断、工业控制、食品和药物分析( 包括生物药 物研究开发) 、环境保护以及生物技术、生物芯片等研究中有着广泛的应 用前景。 生物传感器技术是建立在固定化细胞和固定化酶技术的基础之上 的，它以生物分子去识别被测目标，然后将生物分子所发生的物理或化 学变化转化为相应的电信号予以放大输出，从而得到检测结果【4 9 1 。 分 信 信 号 子 待测 识 生物 号 放 光信号 信号 转 大 物质 别 信息 电信号输出 换 信 元 器 号 件 8 硕十学位论文 图1 1 生物传感器的工作原理 f i g 1 1s c h e m ef o rt h ep r i n c i p l eo fb i o s e n s o r s 如图l 所示，待测物质经扩散作用进入分子识别元件，经分子识别， 与分子识别元件特异性结合，发生生物化学反应，产生的生物学信息通过 信号转换器转化为可以定量处理的光信号或电信号，再经仪表的放大和 输出，即可达到分析监测的目的【5 0 l 。 生物传感器主要包括微生物传感器、酶传感器、免疫传感器及d n a 传感器。 1 微生物传感器 微生物传感器主要由固定化微生物细胞与敏感的换能器密切接触组 成。常用的微生物有细菌和酵母菌，微生物的固定方法主要有吸附法、 包埋法、共价交联法等，其中以包埋法用得最多。载体有胶原、醋酸纤 维素和聚丙烯胺酰凝胶等。固定时需采用温和的固定化条件，以便保持 微生物生理功能不变【”】；能量转换器件可以是电化学电极或场效应晶体 管等，其中以电化学电极为转换器的称为微生物电极。微生物电极开发 较早较成熟。可用的电化学电极有许多种。如p h 玻璃电极、0 2 电极、n h 3 敏电极、c 0 2 气敏电极等。 微生物传感器是以活的微生物作为敏感材料，利用其体内的各种酶 系及代谢系统来测定和识别相应底物。微生物呼吸时消耗氧并且产生二 氧化碳，因此将固定化好的徼生物膜与氧电极或二氧化碳电极组合起来 就可以作为呼吸活动测定型微生物传感器；微生物同化有机物后，可生 成h 2 、c 0 2 、n h 3 和有机酸类电化学活性代谢物，这些代谢物中含有能在 电极上响应或与之反应的物质，于是固定化微生物膜和燃料电池型电极、 离子选择性电极或气体电极组合在一起就可以构成电极活性测定型微生 物传感器p 引。 微生物电极的种类很多，可以从不同的角度分类。根据测量信号的 不同，微生物电极可分为如下两类：( 1 ) 电流型微生物电极，换能器输出 的是电流信号，根据氧化还原反应产生的电流值测定被测物。常用o ：电 极作为基础电极；( 2 ) 电位型微生物电极，换能器输出的是电位信号，电 位值的大小与被测物的活度有关，二者呈能斯特响应。常用的电极为各 种离子选择性电极、c0 2 气敏电极、n h 3 敏电极等。根据微生物与底物作 用原理的不同，微生物电极又可分为如下两类：( 1 ) 测定呼吸活性型微生 物电极，微生物与底物作用，在同化样品中有机物的同时，微生物细胞 的呼吸活性有所提高，依据反应中氧的消耗或二氧化碳的生成来检测被 微生物同化的有机物的浓度；( 2 ) 测定代谢物质型微生物电极，微生物与 9 电化学传感器用于堆肥中蔺青霉产漆酶柃测的研究 底物作用后生成各种电极敏感代谢产物，利用对某种代谢产物敏感的电 极即可检测原底物的浓度 5 2 j 。 微生物电极的应用范围十分广泛，种类已达六、七十种，现己应用 于食品与发酵工业、环境监测等领域。l a r s e n p3 j 等发展了测定硝酸盐的 小型微生物传感器。他们将一种假单细胞菌固定在小毛细管上。该传感 器对o 4 0 0m o l l 的n 0 3 - 浓度响应呈线性，当介质中呈涡流或静止状态， 对结果影响不大。唯一的干扰物是n 0 2 和n 2 0 ，高浓度的硫化物将使传 感器永久失活。p a n d a r d ”j 等人将小球藻固定在聚四氯乙烯包被的碳电极 表面的a i c l 3 之间，借助二极管的照明可以在3 0 m in 内检测出浓度低于 l0 0 m g l 的莠去剂。在没有残留物存在时，其稳定性很好，可以进行2 4 h 以上的连续监控。微生物电极在测定b o d 方面也重要的贡献，如k a r u b e 1 5 5j 等人采用生物燃料细胞传感器快速测定b o d 的方法，于l9 7 7 年使用活 性污泥中的混合菌种研制出第一支b o d 电极，这种原理基于测量由于生 物燃料引起的电流值，这种生物燃料源于由产氢菌在岩羊环境下与有机 物作用产生氢或者甲酸盐的生物氧化。从此基于生物传感器的快速b o d 测定方法的研究得到了进一步的发展；r i e d e l 5 6 l 等在l9 88 年使用酵 母菌研制成功另一支新颖的b o d 电极，响应时间大大缩 短，可在l 5 30s 内完成一次测量，因而有望实现b o d 的连续实时监测。 微生物电极与酶电极相比，它具有造价低、使用寿命长、无需考虑 辅助因素、微生物成分可以再生等优点，尤其适用于堆肥过程中的发酵 控制和需群酶顺序作用的反应。并且微生物电极还有可能排除在堆肥发 酵过程中常存在干扰酶的物质带来的干扰。然而，它在选择性和长期稳 定性尚有不尽人意之处，响应时间比酶传感器要长。选择性不强主要是 由于微生物细胞中含有多种酶，可同时对多种底物响应而产生干扰，需 通过加入专门抑制剂才能得到一定程度的解决【57 1 。微生物电极的应用范 围十分广泛，种类已达六、七十种，现已应用于食品与发酵工业、环境 监测等领域，其中应用最多的是测量生化耗氧量( b o d ) 微生物传感器。 2 酶传感器 酶传感器是生物传感器领域中研究最多最早的一种类型【5 引。酶是生 化反应的高效催化剂，对底物具有高度的专一性。在反应过程中酶与底 物形成了酶一底物复合物，此时酶的构象对底物分子显示识别能力。利用 氧化还原酶电子转移的特性或反应前后底物或产物浓度的差异，通过换 能器可检测产生的电流或电位的变化。 酶传感器是第一代生物传感器。c l a r k 和l y o n s 于19 6 2 年研制了第一支 电流型酶传感器；g u i b a u l t 和m o n t a l v o 研制了第一支电位型酶传感器，到 1 0 够士掌位论文 了7 0 年代酶传感器达到实用阶段 5 9 - 6 0j 。 生命体内的反应大多是在酶的催化下完成的。因此以酶作为生物敏 感元件的生物传感器一一酶生物传感器，己成为当今世界范围内的研究 热点，但由于酶的活性受环境影响较大，因此在酶生物传感器的研究当 中需要解决选择性、稳定性和灵敏度这几个主要问题： 选择性可从两个主要方面提高生物传感器的选择性：改善酶与信号 转换器之间的联系以减少干扰；选择、设计新的酶活性单元以增加其对 目标分子的亲和力。 要解决酶传感器稳定性主要是克服酶生物单元结构的易变性，增加 其稳定性，最常用的手段是采用对酶具有稳定作用的贪质、固定剂。研 究表明选用合适的溶胶凝胶作为生物单元的固定剂应用于酶电极，可 大大提高生物单元的稳定性。 灵敏度的提高主要依赖子寻求能大幅度提高灵敏度、降低检测限的 方法，因此在选定生物敏感元件的条件下，用不同的材料和方法对酶进 行固定，加速了酶与电极之间的电子传递速率，来提高传感器的灵敏度 和检测限，不论是在基础科学研究还是在工业应用领域都引起了广泛的 关注【61 1 。但是要实现酶与电极之间的直接电子传递并非易事。首先，由 于酶的活性中心多被多肽链包埋，与电极表面之间的距离较大，因此难 于进行电子传递：其次，由于酶在电极表面不合适的构像增大了活性中心 与电极表面之间的距离，从而加大了活性中心与电极之间进行电子传递 的阻力：因此选择不同的材料或固定方法改善酶在电极表面的取向来提 高酶生物传感器的性能已成为生物传感器研制中的热点。 我国酶传感器的研究取得了很大的进步，主要表现在防止电子媒介 体和酶的流失、提高固定化酶活力的技术、载体选择范围扩大和各种高 新技术在酶传感器中的应用等方面1 6 2j 。 曾光明研究小组用葡萄糖氧化酶传感器测定六价铬1 63 1 ，将抑制性酶 传感器应用到测试堆肥样品中的铬：使用葡萄糖氧化酶传感器计时电流 法测量可以确定痕量的六价铬。当葡萄糖存在时，把抑制剂加入电解液， 葡萄糖氧化酶传感器的电流响应降低。由于廉价、稳定性和专一性好【64 1 ， 而且，某些活性中心区域能被一些重金属所抑制，葡萄糖氧化酶( g o x ) 是研究抑制作用的一种理想酶 6 5 l 。一定浓度的铬被加入到堆肥浸出液中， 然后用传感器检测，电流强度分别在0 4 9 9 5 7 3 g l 和9 5 7 3p g l - - 8 ，0 5m g l 范围内呈线性相关。可逆性高，抑制之后能立刻恢复。而且非 常稳定，在4 0d 后仍然保持9 0 的酶催化活性。 还有汤琳等利用辣根过氧化酶测定苯肼【66 1 ，将辣根过氧化物酶固定 电化学传唇器f j 于堆肥中衙青嚣产漆酶柃测的研究 在玻碳电极表面形成多层膜，制成高灵敏的辣根过氧化物酶传感器，在 优化条件下测定对苯肼的电流响应，以研究在抑制剂苯肼作用下的动力 学机理。辣根过氧化物酶传感器对苯肼的抑制实验中，h r p 传感器的抑制 度同苯肼浓度的自然对数呈线性相关，抑制度达到3 。在l5 d 连续使用该 传感器进行测定的情况下，其对p b s ( p h 6 81 ) 中0 5m m o i lh 2 0 2 的响 应电流仍保持初始值的9l 。h r p 传感器的环境实用性己通过监测堆肥浸 出液中苯肼含量的实验测定，平均回收率达到l0 2 6 6 。 堆肥系统中含有多种重金属和难降解有机物，抑制型酶传感器抗干 扰性能强，能够高效、快速、简便、灵敏的监测出待测组分的浓度，对 于复杂成分的测定，表现出很大的优势 6 7 1 。作为一种有效的有机废物资 源化技术，堆肥的腐熟程度、有机物质的降解，以及重金属、芳香族化 合物等有害物质的转化情况都直接影响到堆肥的质量，所以对堆肥体系 中酶的活性、p h 值的进行动态测定是非常重要的。本实验室在这些方面 作了大量的相关工作。牛承岗报道了用固化卟啉和苯并三唑的共价制备 荧光比率p h 传感器 6 s 1 以及基于两个p h 敏感的荧光团为指示剂的比率荧 光传感器1 69 1 。汤琳采用电化学酶传感器检测了堆肥体系中毛平革菌中木 质素降解氧化酶的活性【7 叫，同时把电化学酶传感器与人工神经网络结合 【7 1l ，从而同时有效地检测城市生活垃圾堆肥体系中毛平革菌分泌的木质 素过氧化酶和锰过氧化酶的活性，这种方法具有灵敏度高、简便、快速 等优点。 3 免疫传感器 免疫传感器( i m m u n o s e n s o r ) 是将免疫测定法与传感技术相结合而构 建的一类新型生物传感器，应用于痕量免疫原性物质的分析研究它利用 动物体内抗原、抗体能发生特异性的吸附反应的性质，将抗原( 或抗体) 固定在传感器基体上，通过传感技术使吸附发生时产生物理、化学、电 学或光学上的变化，转变成可检测的信号来测定环境中待测分子的浓度 7 引。抗体具有高的可靠性、灵敏性及特异性。目前，对细胞、抱子及病 毒等最成功的检测手段是抗体的免疫检测【_ 7 3 】。由于分析模式和传导技术 的提高使该技术更加微型化，灵敏度也大大提高，对于未来的商业化发 展有很好的影响【74 1