（生物医学工程专业论文）控制多种细胞在同一表面有序黏附的方法研究.pdf

as t u d yf o rp a t t e r n i n gm u l t i p l et y p e so fc e l l so nt h es a m es u b s t r a t ep o s t g r a d u a t e ：l iy o n gt u t o r s ：c h e ns h i q i a na b s t r a c t耵1 ca i mo f p a t t e r n i n gm u l t i p l et y p e so f c e l l so nt h es a l t l es u b s t r a t ei st oc o n 仃o io f t h ec e l l u l a re n v i r o n m e n tw i t hp r e c i s e l yw a y t l l i st e c h n i q u ei sc r u c i a lf o ru n d e r s t a n d i n gt h em e c h a n i s mo f c e l l e e l li n t e r a c t i o n s f a b r i c a t i o no ft h em i c r o s t r u c t u r e si na l le x p e r i m e n t sf o l l o w e dat r a d i t i o n a ls o f tl i t h o g r a p h ym e t h o d w eh a v ec o m b i n e dm i c r o c o n t a e tp r i n t i n g ，m i c r o f l u i d i c sa n de l e c t r o c h e m i s t r yf o rp a t t e r n i n gm u l t i p l et y p e so fc e l l so nt h es a n l es u b s t r a t e o u rm e t h o de m p l o y sap o l y e t h y l e n e g l y c o l ( p e g ) 一t e r m i n a t e da l k a n e t h i o l ，t of o r mas e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r s ( s a m s ) o nt h eg o l ds u r f a c et h a tr e s i s t sa d s o r p t i o no fp r o t e i n sa n da d h e s i o no fc e l l s ap o l y ( d i m e t h y l s i l o x a n e ) f p d m s ) s t a m pw i t l le m b e d d e dm i c r o f l u i d i cc h a n n e l st oc a r f yo u ts e l e c t i v ee l e c t r o c h e m i c a ld e s o r p t i o no fs a mf r o mt h eg o l ds u b s t r a t ea n dt h e n , d i f f e r e mt y p e sc e l l sa r ed e l i v e r e dt ot h e s e a r e a sf o ra t t a c h m e n t t l l i sp r o c e d u r ea l l o w sp a a e m e dd i f f e r e n c et y p e so fc e l l si ns t r i p e s( c o n t i n u o u sp a t t e r n s ) i na n o t h e ra p p r o a c h , o u rm e t h o ds t a r t s 、i 血m i c r o c o n t a c tp r i n t i n g ( p c p ) t of o r map a r e mo fs e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r s ( s a m s ) o ng o l ds u b s t r a t e 1 1 1 em e t h y l t e r m i n a t e da l k a n e t h i o lf o r ms e r i e so fl i n e so nt h eg o l ds u b s t r a t e ，w h i c hc a l la d s o r bp r o t e i nf o r ms o l u t i o na n dp r o m o t et h ea t t a c h r a e n to fc e l l s n o n - p r i n t e dr e g l o n sa r es u b s e q u e n t l y1 0 a d e dw i t has a mb vi m m e r s i n gt h es u b s t r a t ei nap o l y e t h y l e n e g l y c o l ( p e g ) - t e r m i n a t e da l k a n e t h i o ls o l u t i o nt or e s i s ta d s o r p t i o no f p r o t e i n sa n da d h e s i o no fc e l l s t op a t t e r nd i f f e r e n tt y p e so fc e l l si nd i s c o n t i n u o u sp a t t e r n s ，ap d m ss t a m pw i t he m b e d d e dm i c r o f l u i d i cc h a n n e l si sp l a c e do n t ot h es u b s t r a t et of o r me n c l o s e dm i c r o c h a n n e l s a f t e rw ef i l l e dt h ec h a n n e l sw i t hs o l u t i o n so ft h ee x t r a c e l l u l a rm a t r i x ( e c m ) p r o t e i na n dt h e nc e l l s ，c e l l sa t t a c ho nt h ea r e a so fm e t h y l - t e r m i n a t et h i o lw i t h i nt h ec h a n n e l w eu s i n gh e l ae e l la n dn i h 3 t 3e e l la sm o d e lc e l l e s t a b l i s hm e t h o d so fp a t t e r n i n gd i f f e r e n tt y p e so fc e l l si nc o n t i n u o u sp a r e r n sa n dd i s c o n t i n u o u sp a t t e r n s t h e s es y s t e mc o u l dh a v eav a r i e t yo fa p p l i c a t i o n si nb i o l o g y , b i o m e d i c a le n g i n e e r i n ga n dd r u gs c r e e n i n g k e yw o r d ss e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r s ；m i c r o f l u i d i c s ；m i c r o c o n t a c tp r i m i n g ；e l e c t r o c h e m i s t r y ；e e l la d h e s i o n军事医学科学院研究生学位论文独创性声明秉承军事医学科学院严谨的学风和科研作风，本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下独立进行的研究3 - - 作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得芏圭匡堂盘堂堕或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。论文作者签字：痊霆签字日期：2 竺2 年上月上日军事医学科学院研究生学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解芏主堡堂盘堂睦有关保留、使用学位论文的规定。特授权芏主匡堂壁堂堕可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意将本学位论文的复印件和磁盘送交国家有关部门和机构。( 保密学位论文在解密后适用本授权书)论文作者签字：褪签字日期：盟年上月兰兰日指导教师签字：雌签字日期：查卑年上月生日第一章引言第一章引言1 1 前言现在正处在生命科学研究领域的变革时期【l ，2 】。生物科学和物理科学的高速发展使得研究纳米尺度的科学成为了新热点【3 1 。如今，通过生物学家，化学家，物理学家和工程师们的通力合作使得人类基因组计划顺利完成 4 - 6 。尽管这一蓝图为所有生命过程提供了模板，但是每个细胞与它的周围环境相互作用研究将启动特定基因表达，继而决定细胞行为的过程却是独特的生命过程【7 1 ”。在由多种细胞组成的生命体中，在其内部广泛存在着同种细胞和不同种细胞的相互作用【1 2 l 。异种细胞之间的信号传递和相互作用在组织形成和正常生理功能中有着重要作用，如大部分正常血管只有在血管内壁细胞和平滑肌细胞适当的相互作用条件下才能形成；神经系统的功能由神经元细胞和神经胶质细胞协同作用完成1 3 ；1 4 1 。现有的细胞培养技术大部分都是基于单一种类的细胞。近些年来，随着软刻蚀技术的广泛应用，微接触印刷、微流控及电化学方法在控制不同种细胞有序黏附方面取得了一些进步。有限的几种能培养多种细胞的尝试已经开阔了细胞生物学的研列1 5 d 9 】。例如，与辅助纤维原细胞或内皮细胞起培养时，肝实质细胞的功能得到增强【2 0 ；2 1 1 。能够把功能相关的不同种细胞实现共培养，具有深远意义 2 2 - “1 。但是目前在同一表面有效控制不同种细胞的有序黏附，还是一个巨大的挑战。软刻蚀技术是一系列的微加工方法的统称，主要指产生具有各种人为设计图案的软塑料的工艺过程，及把其应用到微接触印刷和微流控中【1 ；2 5 1 。作为适应于生物研究的微结构制各技术，软刻蚀克服了很多传统光刻的缺点。尤其是软刻蚀可以用于：控制基底表面的分子的组成；将很多生物相关的复杂大分子图案化在基底上；制备用于微流控的管道结构：图案化细胞及控制其微环境等。由于应用在生物学方面所需的微结构相对大些( 一般大于5 0 岫) ，所以微结构的整个加工过程较方便、廉价和迅速。基于软刻蚀技术产生的印章，硫醇能在金表面形成不同图案的自组装单分子膜，而且这一方法能精确地控制生物学相关的表面化学 2 6 - 2 9 。软刻蚀技术在控制多种细胞在同一表面有序黏附的研究方面发挥着重要的作第一章引言用【3 0 】。基于软刻蚀技术，我们用纳米尺度的自组装单层膜、微流控、微接触印刷以及电化学，来建立在同一表面的多种细胞共培养体系。在连续的多种细胞共培养体系中，结合微流控和电化学选择性解吸附基底表面抗拒蛋白质吸附的单分子膜，再用微流管道运送细胞到可黏附的区域。而在非连续的多种细胞培养体系中，表面化学修饰和微流控的联合运用可以达到此目的。用具有图案的聚二甲基硅氧烷( p o l y ( d i m e t h y l s i l o x a n e ) ，p d m s ) 印章将甲基结尾的硫醇转移到金表面，然后把基底浸泡在聚乙二醇结尾的硫醇分子溶液中，使得基底的空余地方组装上抗拒蛋白吸附的单分子膜。在修饰的基底表面，附加具有选择输送细胞的微流管道，可以使多种细胞达到以阵列方式有序黏附在同一表面。1 2 基于表面化学建立的方法1 2 1 利用自组装单分子膜达到多种细胞共培养的途径自组装单分子膜是通过不同末端基团的烷烃硫醇分子的头基和基底( 如：金基底) 之间产生化学吸附，在界面上自发形成有序的单分子层，用其不同的末端基团赋予单分子膜乃至整个表面不同的物理、化学和生物性质【3 m 6 】。m r k s i c h 等人用自组装单层膜培养多种细胞的策略关键在于使用由五个聚乙二醇结尾的烷烃硫醇单分子膜中夹杂少量的以对苯二酚结尾的烷烃硫醇末端基团与环型戊二烯之间发生狄尔斯阿德耳反应( 双烯合成反应) 1 6 1 。聚乙二醇结尾的烷烃硫醇单分子膜能够抗拒蛋白质和细胞在表面的黏附( 这类表面称为“惰性表面”) 。以往的研究成果表明，在常温下组装有单分子膜的金片上附载一定的氧化电压，末端为对苯二酚基团会转变成对应的苯醌。而苯醌因为具有共轭双键可以在水溶液中高效率的和环戊二烯的双键发生狄尔斯邛可德耳反应，生成结合体d 7 。如果环戊二烯修饰结合一个配体，就可以通过这一反应在表面上固定特定配体。实验中，环戊二烯共价连接了一个精甘天冬氨酸( a r g g l y a s p ，r g d ) 序列的多肽。细胞膜上的整合素( i n t e g r i n ) 为广泛表达的细胞黏附受体家族，它粘附于细胞外基质和不同的细胞上，介导细胞黏附的相互作用。而r g d 多肽是细胞黏附分子( c e l la d h e s i o nm o l e c u l e ，c a m ) 中整合素识别和结合配体肽链中的最短序列。将r g d 多肽序列结2第一章引言合到材料表面上，r g d 通过与整合素的结合，能促进细胞在材料表面的黏附、铺展、生长【3 3 1 。通过共价结合反应后，以前具有“惰性”的表面就可以被结合有r g d 多肽的对苯二酚结尾的烷烃硫醇被“活化”，其结果是本来不能黏附细胞的表面就可以黏附细胞了。实验所需3 t 3 细胞分成两部分，其中一部分用活细胞荧光染料染色。染色的细胞和没有染色的细胞分别代表两种不同种类的细胞。接种细胞之前，首先用微接触印刷法把十六烷基硫醇固定在金片表面，形成3 0 0l a i n 宽的表面条带( 间距8 0 0 岬) 。然后把这一金片放入由五聚乙二醇结尾的烷烃硫醇和对苯二酚结尾的烷烃硫醇( 体积比为9 9 ：1 ) 组成的混合酒精溶液中。这样在非印刷区域就组装了这两种硫醇组成的混合单层膜。因为对苯二酚结尾的烷烃硫醇相对比较少，该区域大部分表面为聚乙二醇，所以该区域是“惰性”的。接着把金片放入纤粘连蛋i 刍( f i b r o n e c t i n ，f n ) 的p b s 溶液中( 1 0 0 鹇，m 1 ) ，蛋白质可以吸附在以甲基结尾的十六烷基硫醇组装的单层膜区域，而不能吸附在其他区域。过4 h 后，把活体荧光标记的3 t 3 纤维原细胞接种在金片表面，这些细胞只黏附于以甲基结尾的十六烷基硫醇组装的单层膜区域。等到细胞增殖到紧密排列的情况时，在整个金片上附加1 0 s1 5 0 0m v 的氧化电压，并在溶液中加入具有环戊二烯的r g d 三肽。自组装膜末端的苯醌基团与溶液中的r g d 发生共价反应后，r g d 多肽就固定在了金表面。这样，就把本来细胞不能黏附的惰性表面变得可以黏附细胞。反应完成后，加入没有荧光标记的3 t 3 纤维原细胞。这些细胞大部分黏附在本来没有黏附细胞的表面上，见图1 1 。培养细胞黏附生长后，经荧光显微镜观察，两种细胞形成了共培养，且相互之间的入侵很少。这种方法广泛适合于两种异种细胞的共培养。这一方法的特点是非侵入式的达到两种细胞共培养。但是这种方法的缺点是实验所用到的化学分子合成复杂。第一章引言图1 1 按特定图案在电活化基底表面共培养两种细胞图l 一1 中，( a ) 制备基底：在干净的玻璃表面先蒸镀5s i l l 的钛，再蒸镀1 5n n l 的金。( b ) 用微接触印刷的方法( m i c r o c o n t a c tp r i n t i n g ，p ) ，把十六烷硫醇转移到金表面，形成3 0 0p , m 宽的线条阵列图案，间隔为8 0 0p a n 。( c ) 把金片放在五聚乙二醇结尾的烷烃硫醇和对苯二酚结尾的烷烃硫醇的乙醇溶液中，在非印刷区域组装上第二种单分子膜。( d ) 基底在纤粘连蛋白的p b s 溶液中浸泡4 h 。( e )接种荧光标记的3 t 3 细胞( a 细胞) ，细胞黏附在有蛋白质的区域，由于第二种单分子膜对抗拒蛋白吸附，所以细胞长成了规则的图案。( f ) 电活化后，使得r g d多肽序列共价的结合在非细胞生长区域，然后接种非荧光3 t 3 细胞( b 细胞) 。荧光相片显示，两种细胞形成规则的共培养。1 2 2 利用离子型生物高聚物的不同特性达到两种细胞共培养r o b e r tl a n g e r 等人先采用旋转涂布把抗拒蛋白质和细胞黏附的带负电的透明质酸( h y a l u r o n i ca c i d ，h a ) 涂布在干净的硅片表面，常温固化，形成大概6 0 0n l n厚薄膜f 1 7 1 。然后把经等离子清洗器处理过的具有一定图案的聚二甲基硅氧烷( p o l y ( d i m e t h y l s i l o x a n e ) ，p d m s ) 印章放在薄膜表面，在1 3 0 下高温加热，涂布在硅表面的h a 液化，由于毛吸力的作用使得液态的h a 全部填充到p d m s 印4第一章引言章的空隙处，1 2 h 常温固化后，形成规则的图案的h a ，而硅片上其他区域是干净的硅表面。这时接种第一种细胞，黏附到硅片上没有附着h a 的区域，然后加入带正电的多聚赖氨酸( p o l y - 1 一l y s i n e ，p l l ) ，让它与h a 结合从而使得h a 表面变为可以吸附蛋白质和细胞。这一系统已经用于肝实质细胞或胚胎干细胞与纤维原细胞共培养，证明这一方法具有对多种细胞的适用性。1 2 3 秘用高分子电解质的细胞共培养c h i a - c h ih o 等提出：在生物可降解的壳聚糖和凝胶的基底上，通过多层组装抑制和促进细胞生长的高分子电解质，达到两种细胞的共培养【3 9 】。有序黏附多种细胞的难点在于，把限制第一种细胞黏附的非细胞生长区域，用一种无生物毒性的方法转变成可细胞黏附的区域，然后在可控制的区域内接种第二种细胞，达到两种细胞序黏附。具有抗拒细胞黏附的甲基丙烯酸乙二酯甲基丙烯酸共聚物( p o l y ( o l i g o e t h y l e n e g l y e o lm e t h a e r y l a t e c o m e t h a c r y l i ea c i d ，p o l y 一( o e g m a - c o m a ) )由于自身带有负电荷，可以通过微接触印刷的方法，把其转移到壳聚糖基底上面，形成宽度为6 0p a n ，间隔为2 0 岬的一系列线条。人血管内皮细胞被接种到这一表面，在没有共聚物的裸露壳聚糖上黏附和增殖，形成2 0i n n 宽的细胞层。然后把黏附细胞的基底放入壳聚糖溶液中，由于其带正电荷，通过正负电荷作用，壳聚糖结合在非细胞生长区域。最后把第二种3 t 3 纤维原细胞接种到表面。3 t 3 纤维原细胞也可以黏附在人血管内皮细胞上面，两种细胞就形成了共培养体系。为了表明这一方法在组织工程方面的应用，进行了如下实验：把抗拒细胞黏附的p o l y - ( o z g m a - c o - m a ) 共聚物按上面方法转移到凝胶表面，形成宽度为6 0 岫，间隔为2 0i m a 的一系列线条。人血管内皮细胞接种到凝胶基底表面，通过5 d 培养，在2 0 1 m a 的凝胶表面，形成脉管状结构。然后按上述方法，在壳聚糖水溶液中活化其余表面，接种3 t 3 纤维原细胞。通过激光共聚焦照片表面确认中间形成类似空腔的结构形式。第一章引言1 2 4 电化学方法g u n t h e rw i t t s t o c k 等人最近利用电化学的方法在多种细胞共培养方面取得了新的研究进展【1 引。调控与细胞黏附固体表面的性质是个重要的研究方向，它与很多应用研究相关，如细胞生物学，组织工程，细胞检测器和细胞筛选芯片。在深入了解自组装单分子膜与细胞黏附相互作用机制后，现在已经可以通过微接触印刷的方法精确地控制单个细胞和多个细胞在表面的图案化黏附。以寡聚乙二醇( o e g ) 结尾的单分子膜( h s ( c h 2 ) i i ( o c h 2 c h 2 ) n o h ；n = 3 - 7 ) ，广泛用于抗拒蛋白质和细胞吸附在修饰表面。用超微电极调控o e g 的性质，在没有模版的情况下，实时原位的控制细胞黏附在特定修饰位置。这一策略基于的原理是：o e g 因为可以被如b r 2 等试剂氧化而使其失去抗拒细胞黏附的性质，改变为促进细胞黏附。而b r -可以通过电化学的方法变为b r 2 。把修饰了o e g 的金片放入2 5m m 的k b r 的磷酸缓冲溶液( p h = 7 4 ) 中后，电极( 半径为2 5i n n ) 在距离金片5 ) m l 的高度处，通入1 2 v 的电压5 s ，可以选择性的把基底表面的性质改变。先把一些区域表面活化，待接种的第一种细胞在活化区域长满后，再进行第二次活化，接种第二种细胞，这样实现多种细胞的共培养，见图1 2 。这一方法的优点是能准确活化表面任何区域，缺点是不能精确控制细胞形成的几何图案，而且表面修饰时产生的溴对细胞有一定毒性。6第一章引言图1 2 利用电化学方法的多种细胞共培养图1 2 中，左图：经微电极作用后，使得细胞在o e g 结尾的单层膜表面黏附和生长。a ) 电化学修饰单层膜表面：通过电化学产生的b r 2 与o e g 相互作用完成修饰；b ) 电化学扫描显微镜( s c e m ) 拍摄的修饰后的单层膜相片；c ) 定点吸附标记有荧光分子的细胞外基质蛋白质f i b r o n o g e n - a l e x a4 8 8 ；d ) 激光扫描共聚焦显微镜在吸附蛋白后拍摄取得的结果；e ) 接种人纤维原细胞；f ) 细胞黏附2 4 h 后，相差显微镜拍摄所得结果。右图：先后接种两种分别进行活体荧光染色的细胞，荧光显微镜检测的结果。微流控通道也可以用来在同一表面培养多种细胞。w h i t e s i d e s 等人运用三维微流系统内部复杂的网络通道，可以把多种蛋白质或多种细胞以不同的图案吸附或黏附在平的基底表面上。此前使用的基于光刻的技术都由于其图案化的步骤而在把蛋白质和细胞图案化的方面具有很大的局限性。现在应用最广泛的微接触印刷和微管图案化方法，微接触可以在表面上制作出很复杂的图案，但是每次实验只能图案化一种蛋白质或细胞，如果要达到多种材料的图案化，则需要复杂的多个步骤。微流管图案化可以同时图案化几种蛋白质或细胞，但是其缺陷在于只能做7第一章引言出很简单，连续的图形。通过对标准的三维微流管道拓扑结构分析，得到两层相互连通的沟道系统，可以在平的基底表面做出任意图案。总的来说，如果把三维结构投影到一平面，平面上的节点都可以认为是一系列微流管道的交叉，这些管道中一定是一条在另一条的上面或下面穿过，见图1 3 。所以如果要在平面上做出任意图案，节点可以认为是需要的图案，这样只需要两层沟道系统相互连接就可以制备任意( 连续和不连续) 的复杂图案。依据这个分析结果，做出的三维管道印章，只需要制备两层结构，和进行一次对准，得到的印章就可以反复的使用。实验中用红色和绿色细胞活体荧光染料分别标记牛肾上腺毛细血管内皮细胞( b o v m ea d r e n a lc a p i l l a r ye n d o t h e l i a lc e l l s ，b c e s ) 和人膀胱癌细胞( h u m a nb l a d d e rc a n c e l - c e l l s ，e c v s ) 。运用不同的三维印章把这两种细胞固定成同心的正方形和其他规则排列的整列，见图1 4 。两种细胞被图案化后，拿开印章，细胞就可以自由移动，从而达到接触及相互作用，这种方法对于研究体外细胞间相互作用提供了有效的手段。这一方法的优点在于可以在表面制造出所需的任意图案，但是其本身制备仍然比较复杂而使其广泛应用受到限制。图l 一3 印章制作示意图图1 3 中，模版上表面需要一步光刻制成，而模版下表面需要两次曝光的光8第一章引言刻步骤，两个模版分别用p d m s 翻模，制备得到p d m s 膜。为了保证上下模板两部分的通道连通，不被没有固化的p d m s 堵塞，需要在没有固化的p d m s 液体上放置一块薄的聚四氟乙烯，在( 1 0 5 0 ) k p a 压力下高温聚合。然后把两个p d m s膜按位置在对准台上对准，然后放入氧气等离子清洗器中，清洗4 0 s ，接着把两块膜压紧，发生不可以逆的封合，制各出三维p d m s 印章。图1 4 三维印章两种细胞规则排列的整列图1 4 中，左图运用三维p d m s 印章把e c v s 和b c e s 两种细胞固定成同心的正方形。右图把活体荧光标记的e c v s ( 绿色) 和b c e s ( 红色) 培养成规则排列的整列，把印章拿走后，细胞开始爬动( 粗的白色虚线代表两种细胞的交汇处)的现象。1 4 其它方法在多种细胞共培养体系方面，t o n e r 等人早期用微加工的方法，先在硅片表面做出由光刻胶构成的图案，然后让细胞外基质蛋白如纤粘连蛋白( f n ) 吸附在非光刻胶区域，吸附完成后，把硅片放在丙酮溶液中用声裂法去除光刻胶，硅片经7 0 酒精溶液中消毒后，再放入无血清的培养基中接种第一种细胞，待细胞贴壁后，洗去表面未黏附的细胞，然后接种第二种细胞，这样就达到了两种细胞共培养2 0 1 。9第一章引言利用这一系统研究了肝实质细胞和纤维原细胞或内皮细胞的相互作用，取得一些研究成果，如肝实质细胞和非实质细胞共培养，可以达到保持或改变肝实质细胞的表面标志物( 如尿素的合成和白蛋白的分泌) 。但是这一系统的制备过程复杂而且其中有很多非生物相容性的物质( 如光刻胶，丙酮等) 参与，所以限制了它的应用。w h i t e s i d e s 小组用微加工方法制备出具有贯穿整个薄膜的阵列图案的聚二甲基硅氧烷( p o l y ( d i m e t h y l s i l o x a n e ) ，p d m s ) 薄膜( 大约5 0 m - n ) ，也可用相同的过程培养两种细胞，主要优点是只要第一种细胞黏附后，就可以手动的把膜从基底上剥落。此方法具有很好的生物相容性，但关键是薄膜制备和操纵难度比较大。1 5 本章小结综上所述，有序的在同一基底面上黏附多种细胞领域的研究已经取得初步进展，近期的突破点是在正常组织细胞和病变癌症细胞相互作用方面的研究。其最终日标是要实现体外多种生理功能相关的细胞在更接近生理的状态下的共培养。把这些功能相关的不同细胞在空间和时间上精确地控制在同一表面黏附，不仅对于异种细胞间相互作用、组织发生等基础研究，而且对功能化人造器官、活性药物筛选等应用领域都具有很重要的意义。目前该领域还处在起步阶段，已经研究出来的方法大都需要复杂的操作过程，本研究的主要目标是用简单和具有好的生物相容性的办法来达到多种细胞在更可控的情况下实现共培养。1 0第二章传代细胞培养及海马神经元细胞原代培养方法的建立第二章传代细胞培养及海马神经元细胞原代培养方法的建立2 1 前言细胞是生物体的基本结构和功能单位。机体内所有的生理功能和生化反应都是在细胞及其产物( 如细胞间隙中的胶原蛋白和蛋白聚糖等) 的物质基础上进行的。早在1 9 2 5 年e b w i l s o n 就意识到细胞水平研究的重要性并宣称：“解决生物学问题的关键最终将在细胞中找到”【帅1 。细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织( 或器官) 取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养，使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象一1 ；4 2 1 。细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构( 如细胞骨架等) 、细胞生长及发育等过程的观察 4 3 1 。因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的一种简便易行的实验技术，同时我们也不可忽略的另一个因素，那就是它脱离了生物机体后的一些变化。细胞培养技术目前己广泛地被应用于生物学的各个领域。如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、病毒学等。由于需要细胞系和原代细胞作为模型细胞来建立多种细胞共培养体系，所以本章建立的培养方法将为后续试验提供所需的细胞材料。2 2 传代细胞培养2 2 1 实验前期准备清洗与消毒是细胞培养实验的第一步，是细胞培养中工作量最大，也是最基第二章传代细胞培养及海马神经元细胞原代培养方法的建立本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质，否则影响细胞生长。灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。2 2 1 1 材料及用品材料：孔径为0 药品：仪器：微孔滤膜( 直径2 5n t i s ) ：孔径为0 2 2d m ；微孔滤膜( 直径9 0m n l ) ：2 2 哪国产混合纤维素脂微孔滤膜过滤器( i 0 0 0i n l )型号：3 0 0 4 0 0海宁市郭店桃园膜分离设备厂酒精( 9 5 )分析纯天津大学科威公司新洁尔灭化学纯长沙市雨化消毒剂厂过氧乙酸化学纯天津盛庆化学试剂甲醛分析纯天津市光复精细化工研究所高锰酸钾分析纯天津盛庆化学试剂氢氧化钠分析纯天津盛庆化学试剂盐酸分析纯天津市化学试剂三厂重铬酸钾化学纯天津盛庆化学试剂浓硫酸分析纯石家庄市试剂厂超净台s w - c j - 2 f d苏州净化设备有限公司干燥箱d h g 一9 0 5 3上海基玮试验仪器设备有限公司高压灭菌器札s 一3 0 2 0s a n y 0 公司2 2 1 2 清洗1 ) 新玻璃器皿的清洗新玻璃器皿先用自来水刷洗，再浸泡于5 稀盐酸中，以中和玻璃表面的碱性物质和其他有害物质。第二章传代细胞培养及海马神经元细胞原代培养方法的建立2 ) 使用过的玻璃器皿的清洗( 1 ) 使用过的培养用玻璃器皿应立即浸入清水，避免干涸难洗。( 2 ) 用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥。( 3 ) 经初步洗刷过，并干燥的玻璃器皿浸酸性洗液中，过夜。( 4 ) 从酸性洗液捞出后的玻璃器皿用自来水冲洗( 1 0 1 5 ) 次，去除残余酸液，蒸馏水再涮洗3 次，倒置烘干。( 5 ) 包装( 牛皮纸或一般纸) 。( 6 ) 高压( 1 5p s i2 0r a i n ) 或干热( 1 7 0 21 1 ) 灭菌。( 7 ) 贮存备用。3 ) 胶塞的处理( 1 ) 新胶塞应先用清水清洗之后，再用0 2 n a o h 溶液煮沸( 1 0 2 0 ) m i n 。( 2 ) 取出后，用自来水清洗1 0 次。( 3 ) 再用1 稀盐酸浸泡3 0r a i n 。( 4 ) 取出后，自来水清洗1 0 次，蒸馏水涮洗3 次。晾干，待高压灭菌。旧胶塞不必用酸碱处理，可直接用洗涤剂煮沸和清洗数次，过蒸馏水，晾干，包装并高压灭菌后，便可使用。2 2 1 3 消毒1 ) 物理消毒法( 1 ) 紫外线消毒用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿，如塑料培养皿、培养板等。( 2 ) 干热灭菌主要用于玻璃器皿的灭菌。将用于细胞培养的器皿放人干燥箱内，加热至1 6 0 ，保温( 9 0 1 2 0 ) m i l l 。用于r n a 提取实验的用品，则需1 8 0 ，保温( 5 8 ) h 。( 3 ) 湿热灭菌此方法也称为高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。主要应用范围是布类、橡胶制品( 如胶塞) 、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液( 如h a n k s 液、p b s 等) 。电热自动灭菌锅操作：放气筒加水至l o w 水平线处，将与高压灭菌器相连的导气管插入放气筒里，第二章传代细胞培养及海马神经元细胞原代培养方法的建立然后将放气筒归于原位。打开高压灭菌器盖，加入蒸馏水至高压锅底的水位线，水位线位于v 型凹槽的l 3 2 3 处。打开电源。设定高压温度及时间，高压锅内的温度范围为( 1 0 5 1 2 1 ) ，高压灭菌一般采用1 2 1 ( 2 0 3 0 ) r a i n 。把待高压灭菌的物品置于高压锅内，顺时针方向将e x h a u s t 钮旋至c l o s e位置。关闭高压灭菌器盖，旋至显示屏左上角的红亮点刚出现为止。按s t a r t 钮，开始高压灭菌，在温度达8 0 c 时显示器开始显示温度，当温度达到所需的设定温度时，在显示屏的左下角有一长形的指示灯闪亮，直到高压时间结束后指示灯灭，此时蜂鸣器报警一声。当压力降至0m p a 时，蜂鸣器再报警一声。温度降至8 0 c 时，蜂鸣器报警1 0 次。显示屏温度指示消失，此时才可打开灭菌器盖。关电源，开高压锅盖，取出已灭菌的物品，烘干。( 4 ) 滤过除菌滤过除菌用于培养液和各种不能耐高压灭菌的溶液的灭菌。采用金属滤器和小型的塑料滤器，配上可以更换的微孔滤膜，较好地方便了操作。滤器型号按直径大小划分。如过滤量大的培养用液常用较大型号的金属滤器( 直径9 0m m 、1 0 0m m 、1 4 2m i l l 等) ，配以过滤泵使用。过滤量较小的液体常用注射器推动的塑料小滤器( 直径2 0i l l m 、2 5m m 等) 。滤膜孔径有0 6 0 岫、0 4 5 斗m 、0 3 5 岬l 、0 2 2 “m 、0 1 0 岫1 等，以0 2 2 | l m 除菌最为安全可靠。但对于较粘稠难滤过的液体，仍需选用孔径较大的滤膜。在过滤器上装上微孔滤膜，孔径为o 2 2p m 。用布包好，湿热灭菌后使用。2 ) 化学消毒法常用的消毒液有如下几种：( 1 ) 7 0 ( 或7 5 ) 酒精溶液：超净台里常备7 0 酒精棉球( 卫生级酒精) ，用于手和一些金属器械或工作台面的消毒。1 4第二章传代细胞培养及海马神经元细胞原代培养方法的建立( 2 ) o 1 新洁尔灭：主要用于手和前臂的清洗，以及工作后超净台面的清洁。超净台旁应常备盛有o 1 新洁尔灭溶液的容器及纱布。( 3 ) 来苏儿水：主要用于无菌室桌椅、墙壁、地面的消毒和清洗，以及空气喷撤消毒，特别是污染细胞的消毒处理。( 4 ) o 5 过氧乙酸：是强效消毒剂，i or a i n 即可将芽孢菌杀死。用于各种物品的表面消毒，采用喷撤和擦拭方式进行。( 5 ) 乳酸蒸气：用于空气中漂浮的微生物的消毒。将乳酸放入坩锅内用酒精灯或电炉加热至沸腾为止，同时将门窗紧闭( 1 3 ) d 。( 6 ) 3 7 甲醛加高锰酸钾：使用前先紧闭门窗。将3 7 甲醛用酒精灯或电炉加热至沸腾后断电或灭火。用一张纸盛好适量的高锰酸钾，迅速放人己加热好的甲醛中形成蒸气。( 1 3 ) d 后可达到消毒空气的且的。3 ) 煮沸消毒急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸1 5r a i n 后使用。1 ) 清洗玻璃制品时，浸酸之后一定要用自来水冲洗( 1 0 1 5 ) 次，因为残存的洗液对细胞黏附有很大影响。清洗塑料制品时要用脱脂棉花或柔软纱布擦洗，不要用硬毛刷洗，否则损害塑料表面后细胞不易贴壁。t i p 和t u b e 一定要用超声清洗处理后逐个清洗，如没有洗净会影响下一次使用的效果。2 ) 干热灭菌时，应在白天进行。使用烤箱时，应不断观察，以免发生意外。当温度超过1 0 0 时，不许打开烤箱门。器皿烤完后，待温度降至1 0 0 之下时才能开烤箱门。金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热灭菌方法。3 ) 高压灭菌后的器材务必晾干或烘干，以防包装纸潮湿发霉。4 ) 牛血清、大部分培养基、胰酶和一些生物制剂等有机溶液，均不能高压灭菌( 如t d r ，秋水仙素，谷氨酰胺，异硫氰酸胍，m o p s 等) 。5 ) 滤过除菌时，过滤器在使用前先装好滤膜( 有时可在上面加一层定性滤纸) ，包好，经高压灭菌后才能使用。滤过酶类制剂时，应待滤器温度降至室温下再进行。过滤时压力不宜过大，压力数字以2p s i 为宜。压力太大时，微孔滤膜可第二章传代细胞培养及海马神经元细胞原代培养方法的建立能破裂，或使某些微生物变形而通过滤膜。加装滤膜时位置要准确。另外，滤器包装时，螺钉不要拧得太紧，以防高压蒸汽不能进入，待高压灭菌之后，再拧紧使用。6 ) 采用化学消毒法时，配制7 5 酒精溶液应用卫生级即可。来苏儿水不能溅到皮肤上，因为它对皮肤有刺激性。空气消毒时，所有的物品要事先准备齐全。由于甲醛或乳酸加热后挥发的蒸气对人的角膜和呼吸道上皮组织有严重的刺激和伤害作用，消毒实施者应有较方便的退出环境的途径。2 2 2 传代细胞培养方法传代培养是指细胞从一个培养瓶以i ：2 或1 ：2 以上的比例转移，接种到另一培养瓶的培养。这种培养，首先是制备细胞悬液。当细胞长成致密单层时，它很容易被蛋白水解酶和印t a ( 乙二胺四乙酸盐) 所破坏。所以本试验采用胰蛋白酶和e d t a 的混合物，做为消化液。细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节；二是严格控制无菌条件。2 2 2 1 材料及用品药品：培养基( d m e m )胎牛血清0 2 5 胰蛋白酶h a n k s 液仪器；c 0 。培养箱m c o - 1 8 a i c倒置显微镜x d s - 2超净台s w - c j - 2 f d1 6h y c l o n e 公司h y c l o n e 公司h y c l o n e 公司自配s 心o 公司重庆光电仪器有限公司苏州净化设备有限公司第二章传代细胞培养及海马神经元细胞原代培养方法的建立2 2 2 2 操作方法( 1 ) 操作人员入无菌室之前用肥皂洗手，用7 5 酒精溶液擦拭消毒双手。( 2 ) 倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养液置于3 7 下预热。( 3 ) 超净台台面应整洁，用0 1 新洁尔灭溶液擦净。( 4 ) 打开超净台的紫外灯照射台面2 0r a i n 左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气，除去臭氧。( 5 ) 点燃酒精灯；取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮头；过酒精灯火焰略烧后，插在无菌试管内。( 6 ) 将培养液瓶口用7 5 酒精消毒，过酒精灯火焰后，斜置于酒精灯旁的试管架上。( 7 ) 倒掉培养细胞的旧培养基。酌情用( 2 3 ) m lh a n k s 液洗去残留的旧培养基，或用少量胰酶涮洗一下。( 8 ) 每个大培养瓶加入ln l l 胰酶，小瓶用量酌减，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察。当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉，勿使细胞提早脱落入消化液中。( 9 ) 加入少量的含血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基，( 7 1 0 ) i i l l 大瓶，( 3 5 ) n l l 小瓶，制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于c 0 ：气体的进入，将培养瓶放回c o 。培养箱。( 1 0 ) 对悬浮培养细胞，步骤7 至步骤9 不做。可将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清液，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。2 2 2 3 光学显微镜观察在无菌条件下，对培养皿上生长良好的细胞系( h e l a 和n i h 3 t 3 ) 连同培养皿直接置于显微镜下，选择合适的视野及放大倍数，观察并拍照。时间不宜过长，以免由于外界条件改变对细胞的生长产生影响。拍照后放入c 0 2 培养箱中继续培养。第二章传代细胞培养及海马神经元细胞原代培养方法的建立2 2 2 4 技术关键1 ) 传代培养时，严格地无菌操作，防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。2 ) 适时观察细胞形态，控制健康细胞的饱满形态，及优良的折光性；生长致密时即作传代培养。3 ) 发现细胞有污染迹象，立即弃置污染的细胞。如果必须挽救，可加含有抗生素的培养基反复清洗细胞，随后培养基中加入较适量的抗菌素，并经常更换培养基等。2 2 3 结果与讨论严格按照无菌和无毒操作原则，分别培养h e l a 细胞和n i h 3 t 3 细胞，图2 一l为生长状态良好细胞图片。细胞在培养过程中的环境条件控制很重要，如二氧化碳的浓度，培养基p h 值等。另外，细胞在传代过程中，胰蛋白酶的细胞消化时间和细胞分散过程要细心操作，否则，易造成细胞损伤。图2 1 生长状态良好的细胞系细胞a ：h e l a 细胞。细胞呈现平展的鹅卵石状；b ：n i h 3 t 3 细胞。细胞为梭形或多突起形扁平细胞。第二章传代细胞培养及海马神经元细胞原代培养方法的建立2 3 海马神经元细胞原代培养2 3 1 材料与方法2 3 1 1 材料1 ) 实验动物新生1 2h 以内w i s t a r 乳鼠，早6 不拘，由北京实验动物研究中心提供。2 ) 主要设备及仪器超净工作台s w c j 一2 f d苏州净化设备有限公司c o ：培养箱m c o _ 1 8 a i cs a n y 0 公司倒置相差显微镜c k 2o l y m p u s 公司解剖显微镜s m z l 4 0 - n 2 g g麦克奥迪实业有限公司显微手术镊0 1 5 r a m塑料培养皿3 5 m mc o m i n g 公司9 6 孔塑料培养板c o m i n g 公司微孔滤膜( 0 2 r