（农产品加工及贮藏工程专业论文）豆豉溶栓酶的分离纯化及酶学性质研究.pdf

缩写 a p c l t c m s e p h a r o s e f a s tf l o w d e a e s e p h a r o s e f a s tf l o w d v t e d l a e l i s a e l t f d p p a p a i p e g 8 0 0 0 p l g p m s f s a k s d s s d s p a g e s k s p f 英文缩略表 英文名称中文名称 a n t i p l a s m i n c l o tl y s i s ti m e c a r b o x y m e t h h t l - s e p h a r o s e f a s tf l o w d i e t h y l a m i n oe t h y l s e p h a r o s ef a s tf l o w d e e pv e n o u st h r o m b o s i s e t h y l e n e d i a mi n e t e t r a a c e t i c a c i dd i s o d i u ms a l t 抗纤溶酶 纤维蛋白溶解时间 羧甲基一琼脂糖凝胶 f f 二乙基氨基琼脂糖 凝胶f f 深静脉血栓形成 乙二胺四乙酸二钠 e n z y m e - l i n k e d酶联免疫吸附 i m m u n o s o r b e n ta s s a y e u g l o b u l i nl y s i st i m e f i b r i n o g e nd r o pp r o d u c t i o n p l a s m i n o g e na c t i v a t o r p l a s m i n o g e na c t i v a t o r i n h i b i t o r p o l y e t h y l e n eg l y c o l8 0 0 0 p l a s m i n o g e n p h e n y lm e t h y ls u l f o n y l f l u o r i d e s t a p h y l o k i n a s e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s o d i u md g d e c y ls u l p h a t e - p o l y l a m i d eg e le l e c t r o r e s i s s t r e p t o k i n a s e s p e c i f i cp a t h o g e nf r e e 优球蛋白时f 刚 血浆纤维蛋白降解 产物 纤溶酶原激 工剂 1 = 溶酶原激活剂的 抑制剂 聚乙二醇8 0 0 0 纤溶酶原 苯甲基磺酰氟 葡激酶 十二烷基硫酸钠 s d s 聚丙烯酰胺凝 胶电泳 链激酶 无特定病原 t r i s u k v t e t r i s h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e n 三羟甲基氨基甲烷 u r o k i n a s e尿激酶 v e n o u st h r o m b o e m b o l i s m 静脉血栓栓皋 y9 0 5 9 5 9 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研 究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要 贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本 人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规 定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质 本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可 以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名： 导师签名： 日期： _ 2 印参占， 彭务纱弋翮哎 、陇船 摘要 豆豉是我国传统的药食两用资源，溶栓酶是其中重要的生理活性物 质。本研究首先对1 4 种豆豉产品的溶栓活性进行比较，然后对细菌型豆 豉的代表产品一一山东临沂豆豉( 半成品) 进行深入研究。探索了豆豉溶 栓酶的分离纯化条件：确定了纤维蛋白平板法与水解酪蛋白法测定溶栓 酶酶活的相关性；最后通过动物试验证实了溶栓酶在体内、外的溶栓作 用。主要试验结果如下： 1 利用纤维蛋白平板法对1 4 种传统豆豉产品的溶栓活性物质进行研 究。结果表明，豆豉提取物的溶栓活性范围为o 3 2 6 1 6 1 9 7 2 尿激酶单 位m l 。永川毛霉型豆豉提取物表现出的活性最大，达1 6 1 9 7 2 尿激酶单 位m l ，曲霉豆豉与辣豆豉活性较小。 2 豆豉溶栓酶的分离纯化试验首先确定了硫酸铵沉淀豆豉溶栓酶 饱和度为7 5 ，其纯化倍数为6 5 6 倍，回收率6 1 6 9 ；不同离子交换 剂对溶栓酶的吸附效果不同，在所选的两种离子交换剂中，d e a e s e p h a r o s ef f 阴离子交换层析更适合于溶栓酶的分离纯化，得到纯化倍 数为9 8 7 倍的豆豉溶栓酶酶液，回收率为3 56 ：最后经过s e p h a d e xg 7 5 凝胶过滤，得到较纯的豆豉溶栓酶，最终纯化倍数为11 2 9 倍，回收 率为6 5 5 。s d s p a g e 凝胶电泳显示，经纯化后的酶无杂蛋白，初步 鉴定其分子量接近3 1 k d 。 3 豆豉溶栓酶酶学性质建立了一种更为简便直观的测定方法一 水解酪蛋白法，并用该法测定豆豉溶栓酶的酶学性质，该酶最适作用温 度为6 0 。c ，p h 7 8 时酶活性最高。豆豉溶栓酶在p h 6 1 0 的范围内稳 定性较强，在2 5 和3 7 。c 下，酶在4 h 内基本没有活性损失。高于4 5 时酶活下降很快，6 0 。c 、o 5 h 酶活基本丧失。由试验结果看出，该酶没 有明显的金属离子激活剂，高浓度的c u ”、f e p 、a l n 对酶有抑制作用； 添加蛋白胨、明胶可以提高酶的活性。抑制剂p m s f 对豆豉溶栓酶抑制 率几乎达到1 0 0 ，e d t a 、口一毓基乙醇对酶活几乎无抑制作用。 4 动物试验豆豉溶栓酶对血块的体外溶解试验结果表明：豆豉溶栓 酶高、低剂量组对血块的溶解率均明显高于对照组( p 均为0 0 0 0 ) ，并 豆豉溶栓酶的分离纯化及酶学盹质硎究 且随剂量的增加和作用时侧的延长，豆豉溶栓酶对血块的溶解作用更为 显著。 豆豉溶栓酶对小鼠尾静脉血栓形成的预防试验表明：豆豉溶栓酶 大、小剂量组( 分别为1 0 0 0 、5 0 0 u k g ) 均能够减小血栓形成率及血栓 平均长度，对血栓形成有一定的预防作用，并随剂量的增大抑制血栓形 成的作用增强，具有量效关系。 豆豉溶栓酶对小鼠肺血栓形成的影响，试验结果为：大剂量( 3 0 0 0 u k g ) 的豆豉溶栓酶能减少小鼠瘫痪或死亡数，对小鼠肺血栓形成具有 明显的抑制作用，抑制率达到6 2 5 ；而小剂量( 1 5 0 0u k g ) 豆豉溶栓 酶对小鼠急性肺栓塞形成抑制作用不明显。 关键词： 豆豉溶栓酶，分离纯化，离子交换，凝胶层析，酶学性质，动 物试验 山东农业大学倾卜学位论文 a b s t r a c t l o b s t e rs a u c e1 st h et r a d i t i o n a le d i b l e h e r b a lm e d i c i n e1 nc h i n a f i b r i n o l y s i se n z y m ei so n ek i n do ff i b r i n o l y s i sa c t i v em a t e r i a lc o n t a i n e di nt h e 】o b s t e rs a u c e i nt h i sa r t i c l e ，f i r s t l y ，t h ef i b r i n o l y s i sa c t i v i t i e so f14t r a d i t i o n a ll o b s t e r s a u c ew e r ec o m p a r e d ；n e x t ，r e p r e s e n t a t i v el o b s t e rs a u c eo fb a c t e r i a lt y p ew a s f l l r t h e rs t u d i e d t i f f sp a p e re x p l o r e dt h em e t h o df o ri s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n o ff i b r i n o l y s i se n z y m e ；e s t a b l i s h e dt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e np r o t e o l y t i cc a s e i n a n df i b r i np l a t em e t h o d ；p r o p e r t i e sa n dt h r o m b o l y t i ce f f e c ti nv i t r oa n dv i v oo f f i b r i n o l y s i se n z y m ew e r er e s e a r c h e db ya n i m a lt e s t p r i m a r i l ys t u d yr e s u l ta s f o l l o w s ： 1 t h ef i b r i n o l y s i sa c t i v i t i e so f14t r a d i t i o n a ll o b s t e rs a u c ew e r es t u d i e d b yf i b r i np l a t em e t h o d t h ef i b r i n o l y s i sa c t i v i t i e sw e r ef r o m03 2 6t o16 1 9 7 2 u k m l m u c o rl o b s t e rs a u c ef r o my o n g c h u a ns h o w e dt h eh i g h e s ta c t i v i t y u n i t si na l ls a m p l e s ，i tr e a c h e dt o161 9 7 2u k m l ，a s p e t | ；g i l l u sl o b s t e rs a u c e a n dp e p p e r yl o b s t e rs a u c ew e r el o w e r 2 s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n o ff i b r i n o l y s i s e n z y m e a t f i r s t ， p r e c i p i t a t i o nw i t h7 5 a m m o n i u ms u l f a t et os e p a r a t ee n z y m ep u r i f i c a t i o nf o l d w a s6 5 6a n dr e c o v e r yw a s6 1 6 9 f u r t h e r , p u r i f i c a t i o nw a sa c h i e v e db y d e a e - s e p h a r o s ef f , b e c a u s et h i sm e t h o dw a sb e t t e rt h a nc m - s e p h a r o s ef f i nt h es t u d y , p u r i f i c a t i o nf o l dw a s9 8 7a n dr e c o v e r yw a s3 56 u l t i m a t e l y f i b r i n o l y s i se n z y m ew a sp u r i f i e du pt o1 1 2 9t i m e sw i t har e c o v e r yo f 6 5 5 b ys e p h a d e xg - 7 5 s d s p a g es h o w e dt h a tn ou n p u r p o s e dp r o t e i nw a sf o u n d a f t e rs e p h a d e xg 一7 5c h r o m a t o g r a p h y ，m o l e c u l a rw e t g h tw a sa p p r o x i m a t e l y 3 1 k d 3t h ep r o p e r t i e so ff i b r i n o l y s i se n z y m e p r o t e o l y t i cc a s e i nm e t h o d ，a s i m p l e ra n dm o r ee f f e c t i v em e t h o dw a s e s t a b l i s h e d t h ep r o p e r t i e so f f i b r i n o l y s i se n z y m ew e r ed e t e r m i n e db yt h i sm e t h o dt h eo p t i m a lr e a c t i o n t e m p e r a t u r e a n d p ho ff i b r i n o l y s i se n z y m ew a s6 0 ，p h 7 8 r e s p e c t i v e l y f r o mp h6 1 0 f i b r i n o l y s i se n z y m ee x h i b i t e dh i g hs t a b i l i t y u n d e r2 5 a n d3 7 。c a f t e r4 ht h el o s i n go fa c t i v i t yw a sn o tv i s i b l ew h e n t e m p e r a t u r ei n c r e a s e dt o4 5 ，t h ee n z y m ea c t i v i t yd e c r e a s e dv e r yf a s t ，a n d 3 豆驶溶拴酶的分离纯化驶酶学卜质 _ j i _ 究 t e m p e r a t u r er e a c h e dt o6 0 。c t h ee n z y m el o s ti t sa c t i v i t yi n o 5 ht h er e s u l t s h o w e d ：t h e r ew e r en o tm e t a li o nt h a tc a na c t i v a t et h ee n z y m e ；b u tt h eh i g h e r c o n c e n t r a t i o nc u 2 + 、f e 3 + 、a 1 3 + h a ds o m ed e a c t i v a t i o ne f f e c t ；g l u t i na n d p e p t o n ec o u l da c t i v et h ee n z y m e t h e0 1m m p m s fc o u l dt o t a l l yd e a c t i v e f i b r i n o l y s i se n z y m e ，e d t aa n d8 一t h i o le t h y la c i d si n f l u e n c ew e r en o t a p p a r e n t - 4 a n i m a le x p e r i m e n tt h et e s to ft h r o m b o l y t i ce f f e c to ff i b r i n o l y s i s e n z y m ei nv i t r os h o w e d ：f i b r i n o l y s i se n z y m eo fh i g ha n dl o wd o s eg r o u p e f f e c t i v e l yd i s s o l v e dt h eb l o o dc l o t ( p ：o0 0 0c o m p a r e dw i t hc o n t r 0 1 ) ： b e s i d e s ，t h ee n z y m ed i s s o l v e dt h eb l o o dc l o tm o r eo b v i o u s l yw i t ht h ed o s e a d d e da n dt h et i m ep o s t p o n e d e f f e c t so ff i b r i n o l y s i se n z y m eo nt h et h r o m b o s i sm o d e li nm i c et a i lv e i n ： f i b r i n o l y s i se n z y m eo fh i g h ( 10 0 0 u k g ) a n dl o wd o s eg r o u p ( 5 0 0 u k g ) r e d u c e d t h ef o r m a t i o nr a t ea n dl e n g t ho f t h r o m b u s e f f e c t so ff i b l i n o l y s i s e n z y m e o nt h r o m b o s i sf o r m a t i o ni n d u c e d b y c o l l a g e n a d r e n a l i n ei nm i c eh i g hd o s e ( 3 0 0 0u k g ) f i b r i n o l y s i se n z y m e d e c r e a s e dp a r a l y s i so rd e a t hn u m b e ro fm i c e ，i n h i b i t i n gr a t er e a c h e dt o 6 2 5 a n dt h a t ，l o wd o s e ( 15 0 0u k g ) f i b r i n o l y s i se n z y m ew a sn o ta p p a r e n t f o rl u n gt h r o m b o s i sf o r m a t i o n k e yw o r d s ：f i b r i n o l y s i se n z y m e i nl o b s t e rs a u c e ；p u r i f i c a t i o n ；i e c c h r o m a t o g r a p h y ；c h a r a c t e r i z a t i o n ；a n i m a le x p e r i m e n t 4 1 引言 1 1 血栓疾病及溶栓剂 血栓性疾病是严重危害人类健康的常见病、多发病，其致残和致死 率均较高，主要包括动脉粥样血栓形成、静脉血栓栓塞和外周动脉栓 塞。据估计，全世界每年心血管病死亡人数约1 3 0 0 万，仅美国急性心肌 梗死人数即为1 5 0 万，约1 3 致命，占美国疾病总死亡率的3 0 ，掘统计， 我国急性血栓病年平均发病率为6 4 5 5 人1 0 万人，心肌梗塞平均发病率 为4 2 人1 0 万人 1 1 1 血栓疾病 1 1 1 1 常见血栓性疾病 动脉粥佯帆栓：动脉m 检形成( a t h e r o t h r o m b o s i s ) 上要累及心血 管、脑血管和外周动脉曲管，这些部位的血栓形成多数是存动脉粥样硬 化斑块破裂的基础上形成的，岬虮管内壁的损伤导致i 1 ：| l 栉形成。 静脉血栓栓采( v t e ) ：深静脉血栓( d v t ) 和肺血栓栓塞症为 静脉血栓栓塞症的两种类型，是同一疾病痛程的两个不同阶段。 外周动脉栓塞：其形成机制包括动脉上游向f 游柃塞； ：心向外周 动脉栓塞：左室附擘血栓向外词动脉栓寨；外周箭脉向脚动脉挣褰，如 下肢深静脉形成的咖栓顺流栓塞争舯动脉，导致肿枪塞；反常栓塞， 如深静脉血栓形成经末用的卯圜孔或者其他异。带通道栓塞壬i 外周动脉。 11 1 2 血栓产生机制 血栓形成( t h r o m b o s i s ) 是指在活体心肌或m l 管内皿液凝固，或血流 中菜些成分析渤凝集形成固体质块的过程，所形成的崮体质块称为血栓 ( t h r o m b u s ) 。导致皿栓形成的常见因素何：，l 、j f l 管内媵损伤，m 流 改变及血液性质的改变。( 陈蓉，谢梅林，2 0 0 4 ) 豆妓溶栓翦的分离纯化驶酶学阡质州究 血管壁损伤 轴突反射 暴露胶原和 a d p 【l 工| b 坐x q 日 l i 上ip l l 毗j 正t uj 1 i l 【c 血小板( 萋鬟凝血冈子鬟 释放凝血冈子 l 向 + 激活l 栓 凝血酶液原一+ 榭l 血酶j 裂解f 夺 图1 血栓形成示意图 f i g 1s k e l c hm a po f t h r o m b o s i s 1 1 1 ，3 溶栓机制 在人和哺乳动物血液。f 一，都有一个纤溶系统，如冈2 所示，它担任溶 解m 栓和防j t 出椭与煤护伤lj 的双重作用。存纤溶酶原激活卉u ( p a ，包括 组织型纤溶酶原激活剂t - p a 和尿激酶型纤溶酶原激活剂u p a ) 的作用 下，纤溶酶原( p l a s n s n o g e n ) 转变成纤溶酶( p l a s m i n ) ，纤溶酶将血块上不溶 的纤维蛋白降解为可溶州的产物，从而使i m 栓溶解。 正常情况下，血液中只存在少量的p a ，而形成微量的纤溶酶，并通 过纤溶酶原激活剂的抑制剂( p a i 1 ) 和抗纤溶酶( 2 一a p ) 来保持纤溶系统的 平衡。纤溶酶原激活剂分直接和间接两类，t p a 和u p a 是白体细胞产生 和分泌的属直接激活剂。间接激活剂是由细菌产生的链激酶( s k ) 和葡 激酶( s a k ) 等( 宋纲，宋后燕等，1 9 9 9 ) 。在纤溶系统中纤溶的底物为纤 维蛋白。而纤维蛋白的前体是可溶性的纤维蛋白原，它在凝血酶的催化 作用下形成纤维蛋白。纤维蛋白的积累也是一些疾病发生的标志，如各 山东农业大学坝卜学位论文 种血栓病，脑中风，老年痴呆等( c h a v a k i st ，r o b i na ，p i x l e y i ，e t a l ，2 0 0 2 ) 。 纤溶酶隙撒活剂( p a ) i p a 的抑黼4 t 纤溶酶 l 一抗纤溶酶抑韵i 荆( a s “a i ) + 纤维蛋白纤维蛋白降解产物 图2 人和哺乳动物体内纤溶系统示意图 f i g 2s k e l c hm a po f t h t o m b o y s i s 1 1 2 溶栓剂 目前在治疗诸如肺栓塞、急性心肌梗塞、脑血栓等血栓疾病溶栓疗 法，即注射溶栓剂使血管再通。从溶栓剂开始作为药物使用到现在，溶 栓剂的开发基本分为三代。 1 1 2 1 第一代溶栓剂 第一代溶栓药物溶栓力强，但缺乏溶栓特异性，在溶解纤维蛋白时 又将血中的纤维蛋白原降解，而导致出向等严重不良反应。此类药物以 链激酶( s t r e p t o k i n a s e ，s k ) 和尿激酶( u r o k i n a s e ，u k ) 为代表。 尿激酶：是从人尿或肾组织培养物中提取出来的一种丝氨酸类蛋白 水解酶，分子量5 4 k d ，它可使纤溶酶原中的精氨酸一缬氨酸肽键断裂， 激活纤溶酶原转化为纤溶酶从而起到溶栓作用。u k 是由w i l l i a m s 于 1 9 5 1 年从哺乳动物的尿中发现，l o 年后，h a n s e n 最先将其应用于临床， 1 9 9 0 年我国的上海生物化学制药厂f 式生产u k 制剂。 豆鼓溶栓酶的分离纯化及简学性赝训究 链激酶：是从b 一溶血性链球菌培养液中分离提取出的一种非酶糖蛋 白，单链，分子量4 7k d - - 5 0k d 。t i l l e r 和g a v n e r 于1 9 4 3 年首次发现 s k 具有溶栓作用，并于1 9 5 5 年将其用于f 临床。s k 是通过催化血纤维蛋 白溶酶原转变为血纤维蛋白溶酶，引起血栓溶解。 s k 和u k 这两种药物在体内的半衰期短，只有3 2 0 m i n ，要使其达 到应有的疗效，必须大剂量长期服药，容易产生全身出血的倾向。 1 1 2 2 第二代溶栓剂 第二代溶栓药物以组织型纤溶酶原激活剂( t - p a ) 、尿激酶原( p r o u k ，又称单链尿激酶型纤溶酶原激活剂s c t l p a ) 、纳豆激酶、蚓激酶、 蛇毒制剂等为代表的一些具有较高纤溶能力的蛋白激酶和多肽。第二代 溶栓药物具有一定程度的溶栓特异性，出血副作用较小。 s c u - p a ：即尿激酶原，由4 l1 个氨基酸残基组成，分子量5 4 k d ， 丝氨酸蛋白酶。其优点是酶活性较强，血栓选择性高；缺点是半衷期 短，需要大量用药，因而也会出现轻度出血现象。 ( 邹和昌，1 9 9 7 ) t - p a ：由5 2 7 个氨基酸残基组成的丝氨酸蛋白，分子量6 7k d 。t p a 能选择性地与血栓表面纤维蛋白结合，结合后的复合物对纤溶酶原有 很高的亲和力，在局部能有效的使纤溶酶原转化为纤溶酶，过多的纤溶 酶则被血浆9 2 一抗纤溶酶等抑制。t - p a 这种“血凝块特异性”溶栓，很 少产生全身纤溶和全身抗凝状态。t - p a 可广泛用于治疗各种血栓，但其 价格昂贵，而且半衰期短( 5 6 m i n ) ( 陈飞虎，1 9 9 9 ) 。 纳豆激酶：1 9 8 6 年，日本的须见洋行博士考察了1 7 3 种食品，发现 只有纳豆可以溶解血栓( s u m ih ，1 9 9 0 ) 。1 9 8 7 年须见洋行等从纳豆中分离 出了一种丝氨酸蛋白酶，命名为纳豆激酶。研究发现，纳豆激酶具有纤 溶活性和溶栓能力，可治疗和预防血栓病；还可以刺激内皮细胞产生t p a ，增强溶栓能力( s u m ih ，1 9 8 7 ) 。纳豆激酶来源广泛、价廉易得，溶栓 活性高，特异性强，被认为是一种很有前途的新抗栓药物。目前纳豆激 酶的研究已成为热点。 蚓激酶：蚓激酶是从蚯蚂f 中提取的具有激活人体纤维蛋白溶酶原和 溶解体内血栓双重功能的丝氨酸蛋白酶，它富含酸性氨基酸，p i 为3 5 、分子量2 0 4 0 k d ( 李菁华，2 0 0 4 ) 。蚂i 激酶能明显降低血粘度、血 浆粘度、纤维蛋白原及血小板聚集率，将其用于预防急性脑梗死复发， 疗效明显优于抵克立得、阿司匹林加潘生丁、羟乙基芦丁、右旋糖酐一4 0 加川i 芎嗪、丹参( 张东菊，。2 0 0 3 ) 。 1 1 2 3 第三代溶栓剂 第三代溶栓药物是应用现代分子生物学对第一代和第二代溶栓药物 进行改造，在特异性、半衰期、溶栓效率等方面进行改进，各方面效能 有较大提高的新型溶栓剂。主要包括突变体、嵌合体及导向体3 大类 ( 孙天霄，1 9 9 6 ) 。 值得注意的是，虽然第三代溶栓剂具有更优良的应用前景，但目前 大多还处于实验室研究阶段：而且溶栓药物的分子结构的改变势必会或 多或少地引起整个分子空间构象的改变，进而打破此类重要生理病理调 节分子多种功能的自然平衡，影响其自身的调节功能，另外，由于涉及 复杂的技术并依赖基因工程菌进行生产，势必供应有限、价格不菲。 1 2 溶栓酶活性测定方法 目前已有的溶栓酶活性测定方法有以下五种：纤维蛋白平板法、纤 维蛋白块溶解时间法、血清板法、四肽底物法、酶联免疫吸附法。 1 2 1 纤维蛋白平板法 纤维蛋白平板法是a s t r u p ( 1 9 5 2 ) 发表的，也是较常用的方法之一，它 是参照尿激酶( u k ) 或组织纤溶酶原激活剂( t - p a ) 的测活方法建立 的。其原理是凝血酶作用纤维蛋白原产生由交联纤维蛋白组成的人工血 栓平板，然后注入溶栓酶，根据溶栓酶分解纤维蛋白原产生的透明圈面 积来表示溶栓酶的溶栓活性。 测定时，先制备纤维蛋白平板：在培养皿中加入血纤维蛋白原溶液 f f i b r i n o g e n ) ；和l 凝血酶溶液，搅拌使其凝固制成平板。然后用微量注射器 将酶液滴于平板上，3 7 。c 恒温放置1 8 h ，测其溶解圈直径，以其乘积表 示酶活或计算出相当于尿激酶活力的单位数。研究发现，酶活力与溶解 面积呈直线关系。以标准u k 为标准品做标准曲线。此法较为简便易 行，所以常被采用，但由于完全是表观值，受恒温时间影响较大，因此 对恒温时间控制是非常重要的。 1 2 2 纤维蛋白块溶解时间法( o l t 法) ( 须见洋行等，1 9 9 3 ) 豆鞋溶栓酶的分离纯化及酶学忖质州究 在0 下，依次加入凝血酶、硼酸生理盐水缓冲液、溶栓酶溶液和 纤维蛋白原至一小试管，强烈搅拌后，置于3 7 恒温水浴。从纤维蛋白 形成开始计时，随着反应液混浊，有气泡上升到液面，到气泡冒出停止 时，作为纤维蛋白溶解时间( c l t ) 。同时以标准u k 或纤溶酶作为标准 品，以c l t 对溶栓酶的浓度的对数作图为测量工作曲线，该线在1 0 7 0 9 9 范围内有很好的线性关系。 此法迅速快捷，有较大的分辨率，更适于粗酶的活性测定。但随着 灵敏度的提高，溶解时间的判定也更加困难。除非有新型、方便的计时 装置，否则同时测定多个样品是较困难的。 1 2 3 血清板法 血清板法是纤维平板法的改进( 原敏夫，等，1 9 9 6 ) 。其原理是：纤 维蛋白形成初始，在6 5 5 n m 处的吸光度最大，随着豆豉溶栓酶的加入， 纤维蛋白溶解，吸光度会逐渐降低。试验发现吸光度的减少同豆豉溶 栓酶的浓度成线性关系。 将血清板制成微型纤维平板，然后在每个孔内加入不同浓度的溶栓 酶，反应开始后4 h 内，每3 0 m i n 测定一次o d 6 5 5 值，然后计算出每个时 刻o d 6 55 值同初始o d 6 5 5 值的差一o d 6 如利用最小二乘法算出直线的 斜率：一a o d 6 5 5 h 。以次斜率同溶栓酶浓度的对数作图，可得到良好的 线性关系。 此法可以同时测多个样品，而且4 h 内可对酶活性进行测定，操作简 便，快捷，样品消耗小，成本低，可信度高。 1 2 4 四肽底物法 溶栓酶与枯草杆菌蛋白酶( s u b i t i l i s i n ) 同源性极高，而且其催化中心 相同( f u j i t a ，m e t a l ，1 9 9 3 ) 。因此用测定枯草卡t 菌蛋白酶的方法来测定溶栓 酶活性。在四肽底物s u e 。a l a - a l a p r o p h e p n a 溶液中加入溶栓酶酶液， 3 7 。c 水浴中孵育1 m i n ，测定单位时间内4 1 0 n m 处光吸收的变化。1 m i n 水解该四肽底物生成1 此硝基苯胺的溶栓酶量为l u 。 该法简便易行，可迅速测定酶的活性。缺点是得到的蛋白酶并不能 完全表示其纤溶活性，二者之间是否有相关性有待进一步试验。 1 2 5 酶联免疫吸附法( el | s a ) ( y o s h i k a z u ，y e ta 1 ，1 9 9 4 ) o 山东农业大学硕卜学位论义 该法用对溶栓酶有特异性的单克隆抗体与之结合，再同连有标志酶 的多克隆抗体结合，形成一种类似三明治的结构，通过标志酶一过氧化 物酶的反应活性测定溶栓酶的活性。测定时将溶栓酶的单克隆抗体吸附 在微孔板上，b s a p b s 冲洗并封堵未被吸附的部位，加入溶栓酶，与单 克隆抗结合，孵育2 h 后，再加入连有过氧化氢酶的多克隆抗体与两者结 合。然后加入新配制的底物，孵育1 0 m i n ，再加入1 m o l l h 2 s 0 4 ，测定 4 9 0 r i m 下的光吸收值。该法灵敏度好，可达到0 1 n g m l ，而且特异性 好，缺点是操作复杂，成本高。 综上所述，溶栓酶活性测定方法多样，各有优缺点。如今普遍使用 的仍是经典的平板法和c l t 法。得到一个更精确，更灵敏，更简便，更 经济的溶栓酶测活方法是一个有待继续研究的课题。 1 3 豆豉功能成分及作用概述 豆豉是我国传统的大豆发酵制品之一，是以黑豆、黄豆为主要原 料，利用微生物发酵制成的一种调味副食品。豆豉中除含丰富的营养物 质外，还含多种生理活性物质，近十余年固内外学者对大豆发酵食品中 功能性成分己进行不同程度研究，尤其对丹贝t e m p e ( 印度尼西亚根霉 型豆豉) 和纳豆n a t t o ( 日本细菌型豆豉) 的研究成果显著、引人注目。 1 3 1 大豆异黄酮 大豆异黄酮是一类类黄酮物质，由于具有一定的雌性激素作用，又 被称为“植物雌激素”( p h y t o e s t r o g e n ) 。大豆异黄酮具有清除自由 基、抗真菌及真菌毒素、抗血管收缩、抗溶血因子等生物学活性，所以 在抗肿瘤、抗氧化、防治老年人毛细血管脆化等方面起着重要的作用。 大豆异黄酮是目前大豆中最引人注意的一种功能性成分。 己知大豆中含有的异黄酮化合物，包括染料木苷( g e n i s t e i n ) 、黄豆苷 f d a i d z e i n ) 、大豆苷( g l y c i t e i n ) - - 种配基以及它们各存在的3 种配糖体，总 共有1 2 种。通常大豆异黄酮都以b 一糖营的形式出现，称为异黄酮糖 苷。糖苷经酶解或酸碱水解可以脱去糖基，其基本母核称为异黄酮甙 元。研究表明，游离的甙元比糖苷更具有广泛的生物学活性。大豆制品 在发酵过程中，由于一些发酵的微生物能够分泌b 一葡萄糖昔酶，作用于 异黄酮糖苷，使糖苷几乎完全水解为异黄酮甙元( 张晓峰，2 0 0 2 ) 。张炳 豆豉溶栓酶的分离纯化及酶学忡质 i j | 究 文，宋永生f 2 0 0 2 ) 等通过对豆豉与发酵酸豆乳的研究发现，发酵处理基 本上不改变异黄酮的总含量，但游离型异黄酮的含量明显提高，糖苷型 异黄酮的含量明显降低，因此发酵可大大提高大豆食品的功能保健性。 1 3 2 大豆低聚糖 低聚糖具有独特的双歧杆菌增殖特性，因此又称为双歧因子，是目 前研究较多的一种功能活性成分，已明确具有改善人的消化系统功能、 降低血压和血清胆固醇、降低有毒产物以增强机体免疫力延缓衰老等生 理功能。 成熟大豆中约含有1 0 的大豆低聚糖，主要成分是水苏糖、棉子三 糖和蔗糖等寡糖。大豆食品通过微生物发酵，低聚糖既有损失也有生 成。发酵过程中低聚糖形成有两大途径：一是微生物产生的糖苷转移酶 通过转糖基作用合成低聚糖；另一是微生物产生的内切半纤维素酶类， 如半乳聚糖酶、甘露聚糖酶和木葡聚糖酶及木聚糖酶等水解半纤维素类 多糖产生低聚糖。大豆发酵食品中己发现的低聚糖有低聚果糖、低聚半 乳糖、低聚异麦芽糖等。其中，低聚果糖主要是由蔗果三糖的三种异构 体在果糖基转移酶的作用下形成的；而低聚半乳糖是由b 一半乳糖营酶 转糖基作用形成的，在自然界许多微生物如根霉、毛霉等都会产生半乳 聚糖酶，可以水解半乳聚糖产生低聚半乳糖；低聚异麦芽糖是支链淀粉 的酶解产物。( 张延坤，1 9 9 6 ；唐传核，2 0 0 0 ) 1 3 3 大豆多肽 大豆多肽是大豆蛋白经水解得到的以分子量低于1 0 0 0 为主的低聚肽 混合物，其氨基酸组成与大豆蛋白质完全一样，但大豆多肤具有比大豆 蛋白更丰富的功能特性：易消化吸收、促进能量代谢、消除疲劳、低过 敏性、降胆固醇、抗氧化、降血压、调节胰岛素等作用。此外，大豆多 肽对一些微生物如乳酸菌、双歧杆菌、酵母以及霉菌等的生长有一定的 促进效果。s m a c c h i 和g o b b e t t i ( 2 0 0 0 ) ，对乳源性活性多肽的研究中，发 现发酵乳制品更富含各种活性多肽。腐乳中的蛋白质主要以大豆多肽的 形式存在，发酵成熟后的豆腐乳，小分子短肽约占豆腐乳水溶性总氮量 的8 6 4 8 8 9 ，并与豆腐乳的鲜味有密切关系( 李理，2 0 0 2 ) 。目前， i 东农业大学硕一f 学位论文 国内对大豆肽的研究，己在蛋白酶的选择，酶解工艺参数，水解液的脱 苦、脱盐、分离精制等方面取得了一定的进展。 1 3 4 褐色色素类 褐色色素也称蛋白黑素或类黑精( m e l a n o i d i n ) ，是大豆蛋白质以及 它的分解产物多肽类与还原糖之间发生美拉德( m a i l a n d ) 反应生成的。 呈水溶性，弱酸性高分子，具有特有的强蓝色萤光，在酸或碱条件下很 容易被水解，然而不受消化酶降解。它具有很强的抗氧化活性，主要是 由于分子内有稳定的自由基结构，此结构能捕集溶液中自由基。同时， 它还会与铁、铜等金属离子相结合，形成不溶化合物。褐色色素还有类 似食物纤维功能、调节血糖及抑制a c e 活性等功能( 陈晓光2 0 0 1o 阚 建全( 1 9 9 9 ) 等对豆豉类黑精进行深入研究发现：毛霉型豆豉非透析类黑 精具有较强的清除羟自由基能力；在干燥体系中剥猪油有较明显抗氧化 作用；在模拟人胃液条件下抑制亚硝胺的合成而不受等电点的影响。 1 4 豆豉溶栓酶概述 纤维蛋白溶解酶在自然界中广泛存在，如蛇、蚯蚓体内均分离纯化 出不同的溶栓酶。在用于食品酿造( 发酵) 的微生物( k i mw 1 9 9 6 ) 、海洋 生物( s u m ih ，1 9 9 2 ) , g l 草药( c h o ihs ，2 0 0 0 ) 也不断发现有溶栓酶。纳豆激 酶是最早在传统发酵食品中被发现的溶栓酶，随后在中国豆豉、韩国大 豆酱( c h u n g k o o k j a n g ) 、泡菜等中也发现含有溶栓酶，最近在发酵虾 酱这种很流行的调味品中也发现具有很强溶解纤维蛋白能力的酶，如表 1 所示。 表1 传统发酵食品中的溶栓酶 t a b l e1 f i b r i n o l y t i ce n z y m ei nt r a d i t i o n a lf e r m e n t e df o o d s 豆鼓溶栓酶的分离纯化及酶学性质研究 彭勇在豆豉中分离出解淀粉芽孢杆菌d c 一4 豆豉溶栓酶( b a - d f e ) 与韩国大豆发酵食品c h u n g k o o k j a n g 中枯草杆菌k - - 5 4 的溶栓酶 核苷酸和氨基酸同源性分别达到9 8 2 和9 78 。b a d f e 与纳豆激酶 的核苷酸同源性为8 0 1 ，氨基酸同源性为8 6 9 。这从分子水平上证 明了豆豉溶栓酶b a d f e 与纳豆激酶不是同一种酶。 无论是日本纳豆、中国豆豉、泡菜、韩国大豆酱还是发酵虾酱，其 发酵过程都是利用空气中的微生物进行的，而溶栓酶也是在自然发酵过 程中产生的。但是它们产生的溶栓酶却有不同，有的同源性较高，如枯 草杆菌，有的则相差甚远，如发酵虾酱。图2 为几种传统发酵食品纤维 蛋白溶解酶n 末端1 4 1 5 氨基酸序列比较，可以看出，发酵虾酱同其 它几种同为枯草杆菌发酵的食品所产的纤溶酶明显不同。 发酵虾酱dp yeepgp cenl qv a 纳豆激酶 韩国大豆酱c k 枯草杆菌b k 1 7 枯草杆菌d c 4 ls lp vs vs p d pa pa 图3 几种传统发酵食品纤维蛋白溶解酶n 一末端氨基酸序列比较 f i g 3c o m p a r i s o no f n t e r m i n a la m i n oa c i ds e q u e n c eo f t h e f i b f i n o l y t i ce n z y m e si nt r a d i t i o n a lf e r m e n t e df o o d s 豆豉溶栓酶是从传统食品中发现的新型纤溶酶，豆豉的长期食用证 明其安全性较高，而实验也证明豆豉溶栓酶是安全的。豆豉溶栓酶的急 性毒性表明用豆豉溶栓酶给小鼠灌胃后无任何明显毒性反应。当剂量达 到6 0 9 k g 。时，仍不能测出其l d 5 0 ，而且在所观察的任何测试剂量水 平均无任何毒性表现。说明该药口服的急性毒性极微弱( 李江伟， 1 9 9 9 ) 。豆豉纤溶酶各剂量组给小鼠灌胃后，任何剂量水平均无明显毒 性表现。直至最大剂量8 0 e 2 k g 时仍测不出l d 5 0 ，则m t d 8 0 9 k g 。按化 学物质的急性毒性分级标准( w h o ，1 9 7 7 ) ，豆豉纤溶酶属于实际无毒 ( 阎家麟，2 0 0 0 ) 。 目前国内对于豆豉溶栓酶的研究主要集中在菌种优化、纯种发酵、 分离提取等方面，而对于豆豉溶栓酶的药理药效学方面研究较少，对不 同类别的豆豉产品中溶栓酶的研究则属空白。 山东农业，、学顾l 学位论文 1 5 本课题研究的目的和意义 血栓栓塞症作为老年人一种常见突发症，近年来患者人数明显上 升，年龄范围明显扩大。目前临床应用最多的药物是链激酶和尿激酶， 但这两种药物在体内的半衰期短，必须大剂量长期用药，且易产生全身 性出血的倾向。链激酶