（材料学专业论文）磁性壳聚糖微球的制备及其在漆酶固定化中的应用.pdf

中文摘要 光纤生物传感技术在医学、生物工程、食品工业和环境监控等方面有广阔的应 用前景。基于漆酶催化的耗氧型光纤生物传感器可被应用于临床医学检测和早期 疾病诊断。而生物传感材料是影响这类光纤生物传感器灵敏性，精确度和测试范 围的主要蚓素。 在本文中我们进行了大量的实验来制备固定化漆酶，使用该固定化酶可望提高 基于漆酶催化的耗氧型光纤生物传感器的性能。我们的工作主要包括以下方面： 1 、利用反相悬浮法来制备磁性壳聚糖微球，通过加入戊二醛来实现微球的交 联和硬化。并通过s e m ，f t i r 等测试技术对微球的形貌和结构进行观察和研究。 测试结果表明制备的微球具有良好的球形形貌，且表面平滑，f e 。0 a 纳米粒子被包 裹在微球内形成核壳结构。微球的平均粒径为0 9um ，尺寸分布范围窄。 2 、漆酶通过吸附和与戊二醛的交联被固定在磁性壳聚糖微球上。通过研究彳i 同条件对漆酶固定化的影响，得出最佳的固定化条件为：5 0m g8 戊二醛交联的 磁性壳聚糖微球，加入l o m l0 8 m g m l 漆酶磷酸盐缓冲液( 0 1 m o l lp h = 7 0 ) ， 在4 固定2 h 。在此固定化条件下，酶的固定化效率为2 4 。 3 、研究固定化漆酶的性质。固定化酶的最适温度分别为1 0 和5 5 ，最适p h 为3 0 2 。与游离酶相比，固定化漆酶与a b t s 的亲和力降低，其k m 值从3 6 8 um o j i 增至1 7 1 1hm o l l 。但固定化酶的稳定性明显改善，在6 0 条件下保温2 1 0m i n ， 固定化酶保留酶活7 4 ，而在相同条件下游离酶酶活仅保留1 9 4 。固定化酶连续 进行1 0 次操作后，酶活仍保持8 0 以上，漆酶使用效率明显提高，且该固定漆酶具 有良好的存储稳定性。固定化也提高了漆酶在酸性条件下的稳定性。 关键词：光纤生物传感器，漆酶，壳聚糖，固定化，稳定性 a b s t r a c t f i b e ro p t i c b i o s e n s i n gt e c h n o l o g y h a saw i d ea p p l i c a t i o np r o s p e c ti nm e d i c a l s c i e n c e ，b i o l o g i c a le n g i n e e r i n g ，f o o di n d u s t r i e s a n de n v i r o n m e n tm o n i t o r i n g t h e f i b e ro p t i cb i o s e n s o rb a s e do no x y g e nc o n s u m p t i o ni nr e l a t i o nt oa n a l y t eo x i d a t i o no f l a c c a s ec a l lb ea p p l i e do nc l i n i c a lm e d i c i n ee x a m i n a t i o na n dd i s e a s ed i a g n o s i s t h e b i o s e n s i n gm a t e r i a li st h em a i nf a c t o rt oi n f i u e n c et h ed e l i c a c y , p r e c i s i o na n dt e s t i n g s c o p e o f t h ef i b e ro p t i cb i o s e n s o r i nt h i sp a o e r - w eh a v ed o n eag r e a td e a lo fe x p e r i m e n t so nt h ep r e p a r a t i o no f i m m o b i l i z e dl a c c a s ew h i c hc a nb ee x p e c t e dt oi m p r o v et l l ep e r f o r m a n c eo ft h ef i b e r o p t i cb i o s e n s o rb a s e do no x y g e nc o n s u m p t i o ni n r e l a t i o nt oa n a l y t eo x i d a t i o no f 1 a c c a s e 0 u rm a i nw o r k sa r e ： 1 、m a g n e t i c c h i t o s a nm i c r o s p h e r e sw e r e p r e p a r e d w i t h r e v e r s e d - p h a s es u s p e n s i o n m e t h o d o l o g y c r o s s - l i n k i n ga n dh a r d e n i n g o f t h e s p h e r i c a lp a r t i c l e sw e r e a c h i e v e db y t h ea d d i t i o no fg l u t a r a l d e h y d e t h et e s t i n gt e c h n o l o g i e s ，s u c ha ss e m 、f t i r ，w e r e u s e dt o i n v e s t i g a t et h em o r p h o l o g ya n ds t r u c t u r eo ft h em i c r o s p h e r e s t h er e s u l t s i n d i c a t e dt 1 1 a tt h em i c r o s p h e r e sh a dw e l ls h a p e ds p h e r i c f lf o r mw i t hs m o o t hs u r f a c e a n dm a g n e t i cf e 3 0 dn a n o p a r t i c l e sw e r ep a c k e di nt h em i c r o s p h e r e st of o r i l lc o r e s h e l l s t r u c t u r e i t sm e a n p a r t i c l es i z ew a s 0 9i lmw i t han a l t o ws i z ed i s t r i b u t i o n 2 、l a c c a s ew a si m m o b i l i z e do n m a g n e t i cc h i t o s a nm i c r o s p h e r e sb ya d s o r p t i o n a n d c r o s s l i n k i n gw i t hg l u t a r a l d e h v d e t h ee f f e c t so ft h ei m m o b i l i z a t i o nc o n d i t i o n s o n l a c c a s ei m m o b i l i z a t i o nw e r es t u d i e d t h eo p t i m a li m m o b i l i z a t i o nc o n d i t i o n sf o r l a c c a s ew e r e ：1 0 m lo f0 8 m g m lo fl a c c a s ei np h o s p h a t eb u f f e r ( 0 1 m o l l ，p h = 7 0 ) r e a c t e dw i t h5 0m go fm a g n e t i cc h i t o s a n m i c r o s p h e r e s a t2 5 f o rl ha n d s u b s e q u e n t l yw a sk e p ta t4 f o r 2 h u n d e r 廿l ei n u n o b i l i z a t i o nc o n d i t i o n s ，2 4 o f y i e l d so fp r o t e i nc o u p l i n gw a s o b t a i n e d 3 、1 1 1 ep r o p e r t i e so ft h ei m m o b i l i z e de n z y m ew e r ei n v e s t i g a t e d t h eo p t i m a l t e m p e r a t u r ef o ri m m o b i l i z e de n z y m ew a s1 0 0 ca n d5 5 。c t h ei m m o b i l i z e de n z y m e e x h i b i t e dt h em a x i m a la c t i v i t ya tp h3 0 t h ek mv a l u eo fi m m o b i l i z e dl a c c a s ew a s 1 7 1 1 m h i g h e r t h a n t h a to f f r e e l a c c a s e ( 3 6 8 a m ) ，w h i c h m e a n s t h a t t h e i m m o b i l i z e d 1 a c c a s eh a dl o w e r 蕊血t yt o w a r d s 廿l es u b s t r a t e n e v e r t h e l e s s t h ei m m o b i l i z e d l a c c a s ee x h i b i t e dr e m a r k a b l yi m p r o v e ds t a b i l i t yp r o p e r t i e s a t i e rt h ei m m o b i l i z e d e n z y m ew a sk e p ta tat e m p e r a t u r eo f 6 0 f o r2 1 0m i n , i ts t i l lh a d7 4 o fi n i t i a l e n z y m ea c t i v i t y , w h i l et h ea c t i v i t yo f f r e ee n z y m ec o u l do n l y r e m a i n1 9 4 u n d e rt h e s a m ec o n d i t i o n s a t i e r1 0c y c l e so fo p e r a t i o n t h ea c t i v i t yo fi m m o b i l i z e de n z y m e r e m a i n e do v e r8 0 o fi t si n i t i a l a c t i v i t y t h e r e f o r e t h ec a t a l y t i ce m c i e n c ya n d s t o r a g es t a b i l i t y o fl a c c a s ew e r eg r e a t l y i m p r o v e d a f t e ri t si m m o b i l i z a t i o no n m a g n e t i cc h i t o s a nm i c r o s p h e r e s i na d d i t i o n i m m o b i l i z a t i o ni m p r o v e d t h es t a b i l i t yo f 1 a c c a s ei nt h ea c i d i cr e g i o n k e y w o r d s ：f i b e ro p t i cb i o s e n s o r l a c c a s e ，c h i t o s a n ，i m m o b i l i z a t i o n ，s t a b i l i t y i i 武汉理工大学硕十学位论文 第1 章：绪论 生物传感器是能够感受生物量并转换成可用输出信号的传感器。它是一种 实时监测生物体内、组织、细胞内各项成分、性质指标的技术。由于具有灵敏 度高、选择性好、响应快、操作简便、样品需要量少、易于微型化、价格低廉 等特点，其在生物医学、环境监测、食品医药工业等领域得到迅速发展和应用。 时至今日生物传感器己发展成为现代生物技术的重要领域之一。生物传感器主 要出两部分组成：其一是分子识别元件或称感受器，由具有分子识别能力的生物 活性物质构成：其二是信号换能器，是一个电化学或光学转换元件。当分子识别 元件与底物( 待测物) 特异结合后，所产生的复合物( 或光、热等) 通过信号转换器 转变为可以输出的电信号、光信号，从而达到分析检测的目的。作为生物传感器 的一种，光纤生物传感器因其检测物质灵敏度高、抗干扰性强、无需参比电极 而被广泛地运用于生物传感技术，发展至今光纤生物传感器己成为生物传感器 中种重要的类型。 1 1 光纤生物传感器简介 光纤生物传感器是一种集成化的器件，它能够利用生物识别元件( 生物化 学受体如：酶、抗体、核酸、细胞等) 对被分析物来进行定量或半定量的分析， 是一种具有高度选择性的现代化分析仪器。光纤生物传感器主要由产生信号的 敏感元件、光学换能器( 又称为“光极”) 和信号处理仪器等几部分组成。光纤 生物传感器的光极多种多样，如吸收光谱、反射、折射率变化、荧光、磷光、 散射、消失波和表面等离子共振( s p r ) 等各种形式川。按照生物受体元件盼陛 质分，光纤生物传感器可分为五大类。3 ，即酶传感器、免疫传感器、核酸传感器、 细胞器或全细胞传感器和仿生受体传感器。 光纤生物传感技术则是一门新兴的交叉学科，它是在生物工程和各种技术学 科相互渗透的基础上发展起来的，主要涉及到临床医学、生物化学、材料科学、 微电子学和光学等多门学科。由于基于“光极”的光纤生物传感器具有探头直 径小，信息传输容量大，能量损耗低和抗电磁干扰能力强等重要优点，在医学 临床、生物工程、食品工业、环境监控乃至军事等方面有广泛而巨大的应用前 景。 武汉理t 大学硕士学位论文 光纤乍物传感器诞生于2 0 世纪八| - 年代，是在电化学生物传感器的基础f ： 发展起来的，从9 0 年代初开始，各类光纤生物传感器的研制开发成为生物传感 器的发展热点，在光纤生物传感器的组成部分方面( 分子识别系统、换能器系 统、传感膜基质和传感动力学等) 的研究不断涌现新的成就。许多生物元件， 如受体，抗原、抗体、酶、核酸、d n a ，微生物，动植物组织和细胞等，都成功 的用与传感器的分子识别系统，通过荧光、磷光、消失波，化学和生物发光等 信号进行检测，灵敏度己达较高水准”1 “。光纤生物传感技术的蓬勃发展使之成 为光纤传感技术的一个重要分支。 1 1 1 光纤生物传感器的原理 光纤生物传感器的原理分成两个部分：( 1 )生物功能物质的分子识别： 光纤生物传感器的原理是以生物功能物质的分子识别为基础的，用固定化的生 物活性物质和底物作用进行分子识别“。例如：酶是一种高效的生物催化剂， 酶传感器就是基于酶促反应来进行生物识别的， 酶+ 底物- + 酶底物中间复合物_ 产物+ 酶 由于酶分子具有一定的空间构型，只有当底物的结构与酶的一定部位上的 构型吻合时，才可能发生酶促反应。细胞器、微生物及动物组织等是分子集合 体，结构比较复杂，其识别功能亦复杂。 ( 2 ) 传感器的信号转换：简单的说，就是光换能器，又称“光极”。经过分 子识别后产生的生物信号经过换能器将生物信号变成光信号，然后再经过光电 转换装置转化成电信号( 数据) 输出。如图1 1 所示： 被测物 生物受体( 分子识别) 光极电信号 图1 1 光纤生物传感器的原理 2 武汉理t 大学硕十学位论文 1 1 2 敏感基元在光纤生物传感器中的作用 光纤生物传感器其主要组成部分是光导纤维( 光纤) 、光源、光电元件，产 生信号的敏感元件和处理信号的辅助仪器两部分组成的，其中敏感元件是仪器 的核心。就光纤生物传感器而占，它的敏感元件主要是具有分子识别功能的敏 感基元 敏感基元指的是对目标物进行选择性作用的生物活性单元。最先被使用的 是具有高度选择催化活性的酶。酶或是以物理方法( 包埋、吸附等) ，或是以化 学方法( 交联、聚合等) 固定在传感器的敏感膜中，然后以光极作为换能器测 定酶催化目标物反应所生成的特定产物的浓度，从而间接地测定目标物的浓度。 随着物理检测手段的引入，人们已成功地把抗体、d n a 聚合物、核酸、细胞受体 和完整细胞等具有特异选择性作用功能的生物活性单元用作了敏感基元“。敏 感基元的性能对光纤生物传感器的测量范围，准确性和响应灵敏度都具有重要 的影响。 1 1 3 光纤生物传感器特点 光纤生物传感器有其特有的特点“4 1 ：( 1 ) 光纤及探头均匀可微型化，生物 兼容性好，加之良好的柔韧性和不带电的安全性，使之特别适用于生物和临床 医学上的实时、在体检测。 ( 2 ) 光纤传输功率损耗小，传输信息容量大，抗电磁干扰，且耐高温、高 压，防腐蚀，阻燃防爆，使之可用于远距离遥测和某些特殊环境的分析。 ( 3 ) 可采用多波长和时问分辨技术来提高方法的选择性，可同时进行多参 数或连续多点检测，以获得大量信息。 ( 4 ) 适当选择生物化学试剂及其固定方法，可检测多种物质，灵活性很大。 ( 5 ) 不需要电位法的参比电极。当用廉价的光源照射样品时，成本可大大 降低。 ( 6 ) 在大多数情况下，光纤生物传感器不改变样品的组成，是非破坏性分 析。 武汉理1 ：大学硕士学位论文 1 2 酶的固定化 固定化酶是2 0 世纪6 0 年代开始发展起来的一项新技术。最初主要是将水溶 性酶与不溶性载体结合起来，成为不溶于水的酶的衍生物，所以曾称为“水不 溶酶”和“固相酶”。但后来发现也可以将酶包埋在凝胶内或至于超滤装置中。 高分子底物与酶在超滤膜一边，而反应产物可以透过膜逸出，在这种情况下， 酶本身仍是可溶的。因此，用水不溶酶和固相酶的名称就不恰当了。在1 9 7 1 年 第一届国际酶工程会议上，j f 式建议采用“固定化酶”( i m m o b i l i z e de n z y m e ) 的名称。所谓固定化酶，是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续的进 行反应，反应后的酶，可以重复回收使用。 1 2 1 酶固定化方法 1 2 1 1 吸附法 吸附法是利用离子键、物理吸附等方法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖 类或多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。工艺简便及条件温和是其 显著特点，其载体选择范围很大，涉及天然或合成的无机、有机高分子材料，吸 附过程可同时达到纯化和固定化：酶失活后可重新活化，载体可以再生“。 m o j o v i c 等“”将从c a n d i d ar u g o s a ( c a n d i d a 为念珠菌属) 中提取的脂肪 酶吸附固定在大孔共聚物载体上，在最优条件下最大吸附量为1 5 1 4m g g ，酶 固定效率为6 2 。动力学研究表明，脂肪酶是通过局部化学反应选择固定在载 体卜。作者在卵磷脂异辛烷存在下，用此固定酶水解椰子油，酶活力为游离酶 的7 0 ，重复使用1 5 次后，固定酶活性仍保持其最初活性的5 6 。辛嘉英等 “”根据c a n d i d ar u g o s a 脂肪酶( c r l ) 同工酶( c r l a 和c r l b ) 在结构组成上的轻 微差别，即c r l a 的活性位点处疏水腔的开放程度较c r l b 大，c r l b 上非共价 结合有一些小分子酸性化合物，分别将其选择性地固定在疏水性不同的载体 y w g c , h 二和y w g n h 。上，通过一个简单易行的选择吸附步骤，同时达到了同工 酶的分离纯化及固定化目的，由此提供了。一种分离结构上相近的同工酶的方法 为c r l 同工酶的应用范围的扩大提供了方便。吸附法也有许多不足，如酶量的 选择全凭经验，p h 值、离子强度、温度、时间的选择对每一种酶和载体都不同， 酶和载体之间结合力不强易导致催化活力的丧失和玷污反应产物等。因此，其 应用受到限制。 1 ，2 1 2 交联法 4 武汉理t + 大学硕十学位论文 交联法是用多功能试剂进行酶蛋白之间的交联，是酶分子和多功能试剂之 问形成共价键，得到三向的交联网架结构，除了酶分子之间发生交联外，还存 在着一定的分子内交联。根据使用条件和添加材料的不同，还能够产生不同物 理性质的固定化酶。常用交联试剂有戊二醛、双重氮联苯胺一2 ，2 一二磺酸、 1 ，5 一二氟2 ，4 一二硝基苯、己二：酰亚胺酸二甲酯等。q u i n n 等“”用戊 二醛作交联剂，将由乳酸制得的8 一乳糖苷酶固定在石墨表面，在石墨特有活 性区域1 7 1 0 0 和2 5 1 0 0 时，固载量分别为1 1 8 u c m 2 和1 1 1u c 1 1 2 时，活 性随酶固载量的增加而增加，固定酶的k m 值约为游离酶的5 倍。用此固定酶 ( 质量分数5 ) 水解乳糖，在3 7 、3 1 5 h 以上乳糖水解接近7 0 。实验证明， 该固定酶有很好的贮存稳定性和可操作性。交联剂一般价格昂贵，此法也很少 单独使用，科研工作者一般都将其作为其他固定化方法的辅助手段，以达到更 好的固定效果。 1 2 1 3 共价结合法 共价结合法是酶蛋白分子上功能团和固相支持物表面上的反应基团之间形 成化学共价键连接，以固定酶的方法。由于酶与载体问连接牢固，不易发生酶 脱落，有良好的稳定性及重复使用性，成为目前研究最为活跃的一类酶固定化 方法。其常用载体包括天然高分子( 纤维素、琼脂糖、淀粉、葡萄糖凝胶、胶原 及衍生物等) 、合成高聚物( 尼龙、多聚氨基酸、乙烯一顺丁烯二酸酐共聚物等) 和无机支持物( 多孔玻璃、金属氧化物等) 。 w a n g 等。将由绿脓杆菌制备的壳多糖酶用共价结合法固定在聚合物载体羟 丙甲基纤维素乙酸一琥珀酸盐上。该载体在p h5 5 以上是可溶性的，p h 低于 4 5 时是不溶性物质，用粗制酶溶液固定，有效固定酶达9 9 。天然壳多糖酶 激活能量为4 1 3 8k j ( g m 0 1 ) ，而固定酶激活能量为2 4 9 1k j ( g m 0 1 ) ， 固定最适p h 为8 ，温度5 0 ，半衰期由游离酶的9d 提高至现在的1 3d ， 酶重复使用1 0 次后，酶活力仍保持7 0 。d e s s o u k i 等。”将支链淀粉酶用共价 结合法分别固定在由环氧氯丙烷活化的琼脂糖和由环氧氯丙烷活化的三氯三嗪 一酪蛋白上，并合成共聚物丙烯酸盐一丙烯酸。使用1 0 次仅有轻微损失( 约2 0 ) 。使用5 1 0 0k g yy 射线作一次照射实验，游离酶在5 0k g y 时，活性完全 丢失，而固定酶在5m a r d 时仍对射线有很高抵抗能力。共价结合法载体的活化 或固定化操作较复杂，要严格控制条件才能使固定化酶的活力高。蛋白质通过 什么基团参加共价连接、载体的物理和化学性质等对固定化酶都有影响。 1 2 1 4 包埋法 武汉理工大学硕士学位论文 这是一种不需要化学修饰酶蛋白的氨基酸残基，反应条件温和，很少改变 酶结构的固定化方法。其基本原理是单体和酶溶液混合，再借助引发剂进行聚 合反应，将酶固定于载体材料的网格中。固定化时保护剂和稳定剂的存在不影 响酶的包埋产率。这种酶包埋在高聚物内的方法对大多数酶、粗酶制剂甚至完 整的微生物细胞都适用。包埋法又分为凝胶包埋法和微囊化法“。凝胶包埋法 是将个别酶分子包在高聚物格子中，可以将块状聚合形成的凝胶切成小块，也 可以直接包埋在珠状聚合物中，后者可以使固定化酶机械强度提高1 0 倍，并 改进酶的脱落情况。微囊化法是将酶溶液或悬浮液包裹在膜内，膜既能使酶存 在于类似细胞内的环境中，又阻止酶的脱落或直接与微囊外环境接触。小分子 底物则能迅速通过膜与酶作用，产物也能扩散出来。此法包埋的酶量很多，在 医学上具有很大的应用可能性，因此越来越受到人们的注意。 m a r k v i c h e v a 。”采用一种比较温柔的方法一步将细胞或酶包埋固定在大孔复 合聚( n乙烯基己内酰胺)藻酸钙( p v c l c a a l g ) 水凝胶上，并研究了固 定酶的热稳定性和贮存稳定性以及酶在水有机介质中的性能。研究表明，复 合p v c l c a a l g 水凝胶固定蛋白( 水解) 酶、胰蛋白酶、一胰凝乳蛋白酶、羧( 基) 肽酶、凝血酶都非常成功。热稳定性实验表明，酶在6 5 8 0 仍可使用，而天 然酶在5 0 5 5 时就会完全失活。钱军民”“以羟乙基纤维素( h e c ) 和四甲氧 基硅烷( t m o s ) 为原料，利用溶胶一凝胶技术，通过t m o s 水解和缩聚反应制得 了h e c s i o t 凝胶复合物，并用此凝胶复合物对葡萄糖化酶( g o d ) 进行包埋固定 化，在给酶量2 1m g ，磷酸盐缓冲液p h6 1 5 ，温度3 2 条件下，固定化g o d 的活力可达10 0 0um o l ( g m i n ) ( 载体质量以干态为基准) 以上，约为游离 g o d 活力的5 0 ，其反应稳定性、贮存稳定性均有提高，分离后重复使用1 2 次，活力仅有稍许下降。 1 2 2 固定化酶的优缺点 固定化酶有以下优点： 反应完成后经过滤或离心等简单的方法就可回收，重复使用，降低了酶制剂 的成本； 可以装成酶柱，当底物溶液流经酶柱时，就能发生酶促反应，适合于工业化 应用： 酶经固定化后，稳定性一般都有所提高。 固定化酶的缺点有： 武汉理l 一人学硕士学位论文 使用过程中酶从载体上落掉；由于底物必须经扩散爿唷和载体中的酶接触， 反应产物也要经过扩散进入液相，所以固定化的酶的催化速度一般低于相应游 离酶的反应速度；由于化学反应、空气或固态污染物堵塞酶的活力中心及载体 结构而导致酶活力下降。搅拌反应混合物或增加反应混合物可以部分地消除扩 散效应，提高反应速度。 1 2 3 固定化酶的应用 1 2 3 1 工业上的应用 目前在工业上应用的主要是水解酶类，因为这些酶一般比较稳定又不需要 辅酶，主要应用领域是食品和制药工业。例如：高果糖浆的生产，利用含葡萄 糖异构酶的固定化酶生产高果糖浆是固定化酶在工业应用方面规模最大的一 项。早期工业生产果葡糖浆是采用游离的葡萄糖异构酶或含有此酶的微生物菌 体分批进行的。近年来，比蔗糖更便宜的果糖浆的需求量日渐增大，因此很多 国家都进行了旨在以大量和廉价生产柴葡糖浆为目的的固定化葡萄糖异构酶的 应用研究，并成功地实现了工业生产。 氨基酸和有机酸生产，l 一天门冬氨酸是最早用固定化酶在工业上大规模生 产的氨基酸。所用的固定化方法有：聚丙烯酰胺凝胶法，琼脂凝胶包埋法，明 胶一戊二醛包埋法和卡拉胶包埋法。随后，又发展起利用固定化细胞生产l 一丙 氨酸。目前，可以利用固定化酶和细胞生产的氨基酸和有机酸还有l 一谷氨酸， l 一异亮氨酸，l 一瓜氨酸，l 一赖氨酸，l 一色氨酸，l 一精氨酸，乳酸，醋酸， 柠檬酸，葡萄糖酸等。 半合成抗生素母核的生产，工业生产半合成青霉素类和头孢酶素类抗生素的 主要问题是制备母核，即6 一氨基青霉烷酸( 6 a p a ) 和7 氨基头孢霉烷酸( 7 一a d c a ) 6 一a p a 是半合成青霉素的关键中问体，在6 a p a 的氨基上用化学方 法接上适当的侧键，可以制得高效，广谱，服用方便的半合成抗生素。生产6 一a p a 有化学裂解法和青霉素酰胺酶水解法两种。起初，酶水解法常用含有青霉 素酰胺酶的菌体进行反应，但菌体易失活，且菌体易带来异种蛋白，影响产品 质量，从而使酶水解法难以和化学法竞争。但随着固定化技术的发展，人们利 用固定化青霉素酰胺酶或含青霉素酰胺酶的菌体细胞来水解青霉素生产6 一a p a 时，由于固定化酶和细胞性能稳定，可长期反复使用，有利于提高6 一a p a 的产 率和质量。因此，在工艺上，经济上都可与化学法竞争。现在，固定化酶生产6 一a p a 己实现工业化。 武汉理l 一人学硕十学位论文 1 2 3 2 临床医疗方面的应用 现在，人们已将酶作为药物广泛地在医疗上加以应用，发展成为酶疗法。但 用于治疗目的的酶，本身是一种蛋白质，进入人体后，会产生抗体，由于抗体 反应，能引起患者的过敏性休克。此外，作为药物使用的酶，一般活力比较低， 酶本身也坷：太稳定，易被蛋白酶水解，失去治疗作用，如果将酶制成微小的胶 囊型固定化酶再注入人体，则可以增加稳定性，并且避免与体液接触而产生抗 体。 例如，l 一天门冬酰胺酶具有治疗白血病的作用。但天然l 一天门冬酰胺酶 进入人体会产生抗体，使病人出现休克，因此，需将其微囊化或用可溶性高分 予如羧甲基壳聚糖对其进行修饰以降低其毒副作用，这种修饰实际上与固定化 在化学本质上是一样的。微小胶囊还适于包埋多酶系统，因而可用于代谢异常 症的治疗或制造人工器官如人工l 肾脏以代替血液透析等。 1 2 3 3 化学分析方面的应用 酶的专一性可以使酶在一个复杂体系中不受其他物质干扰，准确地测出某 一物质含量。但由于纯酶不够稳定且价格昂贵，因而限制了其应用范围。而固 定化技术的发展为酶法分析的应用开辟了新途径，这方面比较经典的例子是葡 萄糖的检测。将葡萄糖氧化酶，过氧化物酶和邻联甲苯胺等还原色素原固定在 纸片上即可制成检糖试纸，将其浸入待测溶液中，如存在葡萄糖，试纸则呈现 蓝色。根据试纸上蓝色的深浅，可判断葡萄糖多少，以此可检验尿液，血液中 的糖含量。 1 2 3 4 环境保护方面的应用 消除环境污染，保护环境，是人们普遍关心的问题，固定化酶在这方面也大 有用武之地。 环境监测，根据固定化酶用于化学分析的原理，固定化酶也可以用于测定有 毒物质含量易进行环境监测，如定酚，有机磷，有机氯，氰化物等的检测。美 国宾夕法尼亚大学利用多酚氧化酶制成固定化酶柱，将其与氧电极检测器合用， 可以检测出水中2 1 0 “的酚。 处理三废。人们可以利用活性污泥法来处理工业废水，现在还可以从活性污 泥中分离出微生物，然后将酶或微生物细胞本身固定，因此组成快速，高效， 能连续处理的系统，例如，从处理含氰化物的活性污泥中分离出能分解氰化物 的细菌，然后用聚丙烯酰胺包埋，装柱，用以除去废水中的氰化物。 武汉理工大学硕士学位论文 经历了近血十年的研究发展，酶的固定化技术己成为生物技术中非常活跃 的跨学科的研究领域之一。开发新型固定化技术，改进传统固定化方法和注重 天然高分子载体的改性是酶固定化研究的主要趋势，虽然以后不少具有一定规 模成功应用的工业实力，但面对其稳定性及使用效率提高，成本降低及实现较 大规模连续应用等方面，仍存在许多理论及实际问题。可以这样认为，随着酶 活性及失活机制这一酶学基本理论的深入研究，将对酶的固定化设计及合成和 这一生物技术最佳应用条件的选择具有指导意义。遗传工程，杂交技术，动物 细胞技术的发展及新的物理手段的j 泛应用和高分子化学等多学科的相互渗 透，无疑将成为酶固定化技术的新的推动力。着眼于在具有综合性能的新型载 体及简便固定化方法基础上的，具有效率高，稳定性强的固定化体系及可连续 操作与运行的器件的建立，将必会使这一技术在更为广泛的领域内得到工业化 应用。 1 3 磁性高分子微球 磁性高分子微球是指通过适当的方法使有机高分子与无机磁性物质结合起 来形成的具有一定磁性及特殊结构的微球。因磁性高分子微球同时兼具高分子 微球的众多特性和磁响应性，不但能通过共聚及表面改性等方法赋予其表面功 能基( 如- - o h 、- - c o o h 、- - c h o 、- - n h 。、一s h 等) ，还能在外加磁场下方便迅速 地分离。因此自7 0 年代以来，磁性高分子微球作为一种新型的功能材料，在磁 性材料、生物医学( 临床诊断、靶向药物、酶标) 、细胞学( 细胞标记、细胞分 离等) 和生物工程( 酶的固定化) 、分离工程以及隐身技术等诸多领域显示出强 大的生命力 磁性高分子微球按结构可分为三类：一是核为磁性材料，壳为聚合物的核 壳式结构，由金属氧化物( 如铁、钴、镍等氧化物) 组成核，高分子材料组成 壳层：二是以高分子材料为核，磁性材料作为壳层的核壳式结构；三是内层、 外层皆为高分子材料，中间层是磁性材料的夹心式结构。核一壳式结构中，核 既可为磁性材料，也可由聚合物组成，壳则相应为聚合物或无机物。通过单体 共聚可以在磁性微球表面载上一定的功能团，实现磁性微球的表面功能化。如 果单体共聚反应困难或表面无功能团，则可通过功能团的转化得到所需的功能 团。 9 武汉理上人学硕士学位论文 1 3 1 磁性高分子微球的制备 制备磁性微球通常应用的磁性物质有：纯铁粉、羰基铁、磁铁矿、f 铁酸 盐、铁钴合金等，尤以f e 。吼磁流体居多。与磁性材料结合的高分子材料中天然 高分子材料有壳聚糖、明胶、纤维素等，合成高分子材料最常用的是聚丙烯酰 胺( p a m ) 和聚乙烯醇( p v a ) 。其中天然高分子材料因具有价廉易得、生物相容 性好、可被生物降解等优点，得到了广泛的研究和应用。从制备方法来看，主 要包括包埋法、单体聚合法和原位法三类。 1 3 1 1 包埋法 包埋法是运用机械搅拌、超声分散等方法使磁性粒子均匀悬浮于高分子溶 液中，通过雾化、絮凝、沉积、蒸发等手段制得磁性高分子微球。磁性粒子表面 与亲水性高分子之间存在一定的亲和力，所以若把磁性粒子浸泡于这些高分子 的溶液中，再经过乳化等处理过程，就可以在磁性粒子表面形成高分子壳层。为 了增加微球的稳定性，可用交联剂交联高分子壳层等进行稳定化处理。天然高分 子磁性微球均采用这种方法制备。c u p y 等用磷脂处理纳米级的磁性粒子，制得磁 性脂质体微球。g u p t a 等将磁性粒子与牛血清蛋白和棉籽油进行超声处理，然后 加热得到外包牛血清蛋白的磁性微球。y e 等制备了磁性粘多糖( 如壳聚糖) 微球 李民勤等制备了磁性葡萄糖纳米微球。包埋法制备磁性高分子微球所需的条件 简单，易于进行，但制得的粒子粒径分布宽，形状不规则，粒径不易控制，壳层中 难免混杂一些诸如乳化剂之类的杂质，极大的限制了磁性微球的应用。 1 3 1 2 单体聚合法 单体聚合法是在磁性粒子和有机单体存在的条件下，根据不同的聚合方式 加入引发剂、表面活性剂、稳定剂等物质聚合制备磁性高分子微球的方法。单 体聚合法主要包括悬浮聚合、分散聚合、乳液聚合法。 悬浮聚合法制备磁性高分子微球的主要原理是在磁粉、悬浮稳定剂和表面 活性剂存在的条件下、依靠引发剂的作用使一种或几种单体在磁性粒子表面发 生均聚或共聚，将磁性粒子包裹在聚合产物中。悬浮聚合法制备的磁性高分子微 球在粒径分布、磁含量等方面都不理想。 分散聚合法制备磁性高分子微球的主要原理是由溶于有机溶剂( 或水) 的 单体通过聚合生成不溶于该溶剂的聚合物，并形成胶态稳定的分散体系。磁性种 子用量、单体用量、引发剂种类和用量、分散介质等因素对分散聚合行为及最 0 武汉理t 大学硕士学位论文 终产物的性质具有极大的影响。国内学者利用分散聚合法合成了具有光导性和 两亲性的磁性高分子微球。分散聚合法对于合成大粒径、单分散的磁性高分了 微球具有较大的优势。 乳液聚合法是目前应用较多的一种制备磁性高分子微球的方法，其关键在 于如何得到复合胶乳粒子并形成稳定的乳化体系。高兰萍等用s d s 作乳化剂， 制得了单分散性和稳定性都很好的磁性p ( s t 。a a 。d v b ) p f e 。0 4 微球。乳液聚合法的 最大弱点是产物中存在乳化剂等杂质限制了微球在生物医学领域的应用，因此 人们又开发了无皂乳液聚合技术，它是一种不含乳化剂或仅含微量乳化剂的乳 液聚合技术。k o n d o 等用两步无皂乳液聚合技术制备了热敏性的磁性 p ( s t 。n i p a m 2 m a a ) 微球。 1 3 1 3 原位法 该方法首先制得致密或多孔聚合物微球，此微球含有可结合铁、钴、镍、锰 等金属离子的基团( 譬如可与铁离子等形成配位键的n h 。、n h 、n o 。等含氮基团 以及可与铁离子等形成离子键的c o o h 、s o 。h 、o h 等基团) ，随后依靠高分子在 金属盐溶液中的溶胀以及功能基团与金属离子的作用来制备磁性高分子微球。 如果含有n h 。、n h 、c o o h 等基团，可直接加入合适比例的二价和三价铁赫溶液， 使聚合物微球在铁盐溶液中溶胀、渗透，再升高温度和p h 值，制得磁性高分子微 球：如果含有n o 。、o n o ：等氧化性基团，可加入二价铁盐，使其氧化而得到磁性高 分子微球：如果含有n h ，n h 。等还原性基团，可加入三价铁盐，使其还原而制得磁 性高分子微球。原位法的突出优点在于：磁性微球的粒径和粒径分布取决于 聚合物微球本身，因此磁性微球具有良好的单分散性：各微球的磁含量相同， 在磁场下具有一致的磁响应性：可制备磁含量大于3 0 的高磁含量微球。其 缺点在于：对聚合物的要求比较严格，一。般不适用于那些不含上述基团的高 聚物：由于磁性粒子在聚合物微球表面的沉积，导致所制微球表面不平滑。 1 3 2 磁性高分子微球的性质 与非磁性材料相比，磁性高分子微球具有磁响应性，磁性高分子微球在外 磁场的作用下会发生磁化现象，因此通过测定磁化率，可以知道磁性微球的磁 性种类和磁性强度。当一种材料的质量磁化率( x ) 为负值时，该磁性材料便为 逆磁体；当x 为较小正值时( 1 0 。5 1 03 e m u g ) ，该材料为顺磁体；当x 为特大正 值时，该磁性材料便为铁磁体，铁磁性材料在没有外磁场时仍可保留磁性，不 武汉理j 人学硕十学位论文 适合其在生物医学方面的应用：顺磁性物质的磁响应性较弱，需要很强的外加 磁场才能产生较强的磁作用力；超顺磁性物质具有较强的磁响应性，而且和顺 磁性物质一样在无外加磁场时磁性町以很快消失，是理想的磁性微粒。 磁性高分子微球与外加磁场作用力的关系可用下式表示 f = ( x v x v * ) v h ( d h d x ) 式中，f 为作用力；x v 为磁性微球的质量磁化率；x v * 为介质的质量磁化率； i i 为外加磁场；v 为磁性微球的体积；d h d x 为磁场强度。 从上式可知，影响磁性微球磁响应性的因素主要有微球的粒径，质量磁化 率以及外加磁场的强度。磁性高分子微球的体积越大，磁场作用力越大。对于 粒径较大的磁性高分子微球( d ) l o g m ) 可在较弱的磁场下被分离，但却容易沉 降，所以不适应均匀反应体系；而小粒径的微球( d o 0 3 p m ) ，通过热搅拌，可 以分散在溶液中而不沉淀，但在分离时，需要很强的外磁场，磁场作用力还与 微球的质量磁化率成正比。微球的质量磁化率由构成磁核的磁粉组成、粒径大 小以及数量所决定。 1 3 3 磁性高分子微球的应用 由于磁性高分子微球具有磁性，在磁场作用下司。定向运动到特定部位，或 迅速从周围介质中分离出来具有磁响应性和不同的表面功能性，因此自7 0 年代 中期以来，磁性高分子微球不但在细胞分离、固定化酶、免疫测定、生物导弹、 脱氧核糖核酸( d n a ) 分离及核酸杂交等领域得到广泛的研究，而且在有机和生 化合成、环境食品微生物检测等方面的应用研究也f ；j 益增多。 1 3 3 1 细胞分离 磁性高分子微球作为不溶性载体，可在其表面接上具有生物活性的吸附剂 或其它配体等活性物质，利用它们与特定细胞的特异性结合，在夕i - d i 磁场的作用 下将细胞分离、分类并对其种类、数量分布进行研究。如把单克隆抗体与磁性 微球结合可将磁微粒直接地连接到肿瘤细胞上，利用外加磁场就可将结合的肿 瘤细胞与未结合的正常骨髓细胞分离开。p o y n t o n 用含有抗生素蛋白、植物凝结 素等配体结合的磁性微球，进行骨髓中t 细胞的分离，应用于白血病的治疗： g h a z a r o s s i o n 等利用多烷基亚胺、氨基葡萄糖磁性微球，以定向吸附法从血液 巾提取红细胞，其分离纯度可达到9 9 。现在能结合抗体的磁性微球有铁蛋自、 武汉理工大学硕士学位论文 胶体钴及含磁多聚复合物。铁蛋白和胶体钴分离所需磁场强度较强，含磁多聚复 合物则可较易地从细胞液中分丌。英国、美国已将这一技术应用于临床。比起 常用的细胞分离方法来，磁性微球分离法简便、快速、高效，在这一领域显示出 了引人注目的应用前景。u g l s t a d 认为磁性微球用于细胞分离需要考虑以下几个 关键因素：化学稳定性好，在细胞分离介质中刁i 凝结：具有灵敏的磁响应性 不与非特定细胞结合：能快速彻底地分离细胞：最低程度的吞噬细胞。 1 3 3 2 蛋白质的提纯 蛋白质的磁分离是通过对磁性微球表面进行改姓，共价结合能被目标蛋白 质识别和可逆结合的配基，然后对目标蛋白质进行分离。在磁分离过程中，将 磁性微球直接放入含有目标蛋白质的混合溶液中，目标蛋白质与磁性微球紧密 结合，然后利用外部磁场进行分离。以磁性微球为固相介质对蛋白质进行提纯 是一种新兴的蛋白分离技术。目前已经成功地对溶血细胞产物、血浆、原生质 和腹水中的各种蛋白质进行了分离和纯化。与传统分离方法相比，蛋白质的磁 分离技术具有快速、高纯、高收率等优点。丁小斌等人采用热敏性磁性微球用 于人血清白蛋白的吸附解吸研究，讨论了温度、保温吸附时间、蛋白质初始浓 度等因素对微球吸附解吸蛋白质的影响规律。结果表明该微球具有简便，快捷 的磁分离特性。而且微球在分离过程中无凝集现象，可循环使用。 1 ，3 。3 4 固定化酶