（发酵工程专业论文）乳酸菌素产生菌的分离鉴定及培养条件的初步研究.pdf

摘要 摘要 乳酸菌是一类能剥用可发酵的糖产生大量乳酸的细菌的通称。长期以来，乳酸毽广 泛应用于乳制晶、蔬菜及肉制品等发酵食品的生产中。在其生长代谢中，乳酸菌能产生 具有抑菌或杀菌效果的细菌素，不仅可以改善肠道生态，还可以用于食品与饲料的防腐， 细菌豢在抑箭各种食物腐败菌方面的重要作用已愈来愈多的受至人们的关注。 本实验对乳酸菌素产生菌进行分离，从辣白巢中分离得到四个理想菌株1 1 4 、儿、 i i1 3 、1 1 3 2 。稠用齑效液相色谱检测其发酵滚，初步确定4 菌株均为乳酸翁，其中 1 3 2 菌株产乳酸最多、对各指示菌的抑制作用最显著，只对该菌株作进一步的研究。i i3 2 菌拣在m r s 培养基上w 以生长，最适生长湿度为2 8 c ，蘩兰氏染色呈阳拣，无芽豫。 过氧化氢酶、淀粉水解、硫化氯产生、乙酰甲基甲醇试验( v - p 试验) 、石蕊牛奶胨化、 明胶液化试验为阴性；麓萄糖、萄萄糖酸盐、石蕊牛奶产酸、石蕊牛奶还原为阳性。 通过a p i 生亿反应试验、1 6 sr d n a 测序可进一步确定该菌株是la p l a n t a r u m 或 l p a r a p l a n t a r u m 。最终通过对r e c a g e n e 的p c r 产物检测，鉴定菌株1 1 3 2 为l a c t o b a c i l l u s p a r a p l a n t a r u m ( 类植物孚杆菌) 。牛津杯拘菌试验显示，该菌株的发酵液不仅对多数g + 细菌的生长有较强的抑制作用，而且对大肠杆菌、沙门氏菌等g 细菌的生长也具有明 显翦抑制作用，但对窦蘸没有活经。 另外，本实验还对1 i3 2 的发酵条件进行研究，实验采用的是单因子筛选法：即保持 其他培养条件不变，只改变其中一个条j 牛豹方法，确定出最适合生长、抑菠活性最大的 培养基组分和培养条件。 确定3 2 最适合发黪的培养慕： 通过实验表明，甄苯基乙醇蔗糖液体培养蒸、改进的乳杆菌选择培养基、碓- 肠球菌 液体培养基、m r s 液体培养基等四种培养基中m r s 液体培养基最适合于i i3 2 的生长且抑 菌活性最大。 确定出最适合i i3 2 的培养条件： 通过实验表明最佳碳源为麦芽糖；氮源为酵母粉，浓度为2 o ；最佳金属离子为 n i ”；最适的p i 值范围为5 5 7 o ，但其中最佳的p h 为6 o ；最适宜的温度范围为2 8 。c 3 0 ，其中最佳的温度为2 8 。 关键词：乳酸菌；分离鉴定；乳酸菌素；抑菌活l 生；r e c a g e n e ， a b a s t r a c t a b s t r a c t l a c t i c a c i db a c t e r i ar e f e r st oal a r g eg r o u po fb e n e f i c i a lb a c t e r i at h a th a v es i m i l a r p r o p e l t i e sa n da l lp r o d u c e l a c t i ca c i da sa ne n dp r o d u c to ft h ef e r m e n t a t i o np r o c e s s t h e ya r e w i d e s p r e a di nn a t u r ea n da r ea l s of o u n di no u rd i g e s t i v es y s t e m s a l t h o u g ht h e ya l eb e s t k n o w nf o rt h e i rr o l e 诬t h ep r e p a r a t i o no ff e r m e n t e dd a i r yp r o d u c t s ，t h e ya r ea l s ou s e df o r p i c k l i n go fv e g e t a b l e s ，b a k i n g ，w i n e m a k i n g ，c u r i n gf i s h ，m e a t sa n ds a u s a g e s m a n yl a c t i ca c i d b a c t e r i ap r o d u c e r so f b a c t e r i o e i n so fi n t e r e s t ，w o u l ds h o wal a r g ep o t e n t i a la ss t a r t e r , p r o t e c t i v eo rp r o b i o f i cc u l t u r e si nf o o da n d f e e d b e c a u s eo ft h e i rc o n t r i b u t i o n st om a n yk i n d o fa p p l i c a t i o n s ，t h e yh a v eb e e np a i dm o r ea n dm o r ea u e n f i o n ， l a c t i c a c i d b a c t e r i aw e r ei s o l a t e df r o mf e r m e n t e df o o d _ 一p i c c a l i l l i ，a n ds c r e e n e df o r b a c t e r i o c i np r o d u c t i o n f o u rs t r a i n s ( s t a i n i l 4 、s t a i n i l l l 、s t a i n i l l 3 、s t a i n i l 3 2 ) e x h i b i t e d h i g h e r a n t i b a c t e r i a la c t i v i t yt e s t e db ya g a rd i f f u s i o na s s a ya n dp r o d u c e dl a r g ea m o u n to fl a c t i ca c i d a n a l y z e db yh p l c s t r a i ni i3 2s h o w e dt h es t r o n g e s ta n t i b a c t e r i a la c t i v i t y a n dh i g h e s tl a c t i c a c i dp r o d u c t i o na m o n gt h e m t h es t a i ni i3 2c a ng r o wi nm r sm e d i a ，a n dt h eo p t i m u m g r o w i n gt e m p e r a t u r ei s2 8 d i f f e r e n tb i o c h e m i c a lp r o p e r t i e so fs t r a i n i i3 2w e r eo b s e r v e d a n di sg r a m - p o s i t i v ea n dn o n s p o r i n gg e r m t h es t r a i ni i3 2w a sf u r t h e rc h a r a c t e r i z e db yi t sc a r b o h y d r a t ef e r m e n t a t i o np a t t e r nu s i n g t h ea p i5 0c hs y s t e ma n dt h es e q u e n c ea n a l y s i so ft h ec l o n e d1 6 sr d n af r a g m e n t s u l t i m a t e l y , s t r a i ni i3 2w a si d e n t i f i e da sl a c t o b a c i l l u sp a r a p l a n t a r u mb yt h ep c rp r o d u c t so f r e c a g e n e s t r a i n1 13 2e x h i b i t e dp o w e r f u li n h i b i t o r ya c t i v i t ya g a i n s tn o to n l yg r a m - p o s i t i v e b a c t e r i ab u ta l s og r a m - n e g a t i v eb a c t e r i as u c ha se c o l i ，s a l m o n e l l as p h o w e v e lt h es t r a i n h a sn oa n t i m i c r o b i a la c t i v i t yt o w a r df u n g i i na d d i t i o n ，f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so ft h es t r a i ni i3 2 w a si n v e s t i g a t e d b y s p o t i n o c u l a t i o n a sar e s u l t ，m a l t o s ew a su s e da sc a r b o ns o u r c e ；n i t r o g e n s o u r c ew a sy e a s t e x t r a c t i o no f2 0p e r c e n t ；o p t i m m nm e n t a l i o nw a sn i + ；a n do p t i m a lp hw a sr a n g i n gf r o m5 5t o 7 0 ，a m o n gt h e m ，p h6 0w a se x c e l l e n t ；o p t i m u mt e m p e r a t u r eo f f e r m e n t a t i o nw a s2 8 。c k e yw o r d s ：l a c t i c a c i d b a c t e r i a ；i s o l a t i o n ；i d e n t i f i c a t i o n ；a n t i m i c r o b i a l a c t i v i t y ； r e c a g e n e i i 关于硕士学位论文使用授权的说明 论文题目：塾酸菌蠢主生菌鲍佥离篮量羞鍪鲑鲢麴坐婴巍 本学位论文作者完全了解大连轻工业学院有关保留、使用学位论文 的规定，大连轻工业学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复 印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容 编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档昭内容和纸须论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 是否保密( 石) ，保密期至年 月日为止。 学生签名：圭! 绥建 导师签名： 凇波 代 拜乱窍 第一章绪论 第一章绪论 乳酸菌( l a c t i ca c i d b a c t e r i a ) 在自然界分布广泛，从远古时代，就被人们用于食品 加工及保存中，特别是用于奶制品生产以及肉、蔬菜、面包、青贮饲料的发酵等方面。 一些乳酸菌是人和动物的胃、肠、口腔、雌性生殖道的益生菌，可以促进人和动物的健 康，已经成为十分重要的益生菌。乳酸菌除产生乳酸、乙酸、双乙酰和过氧化氢等物质 外，还能产生具有抑菌或杀菌效果的蛋白类活性物质一细菌素( b a c t e r i o c i n s ) 。作为乳 酸菌代谢过程中合成和分泌的一类对亲缘关系较近的种是有抑制作用的蛋白( 或多肽) 物质，细菌素在抑制各种食物腐败菌方面的重要作用已愈来愈多的受到人们的关注。 1 1 乳酸菌 1 1 1 乳酸菌的定义、种类 乳酸菌均归类于乳酸菌科( l a c t o b a c t e r i a c e a e ) ，是能从碳水化合物( 主要指葡萄糖) 产大量乳酸的细菌通称。这个名称从分类学而言可谓不合乎规范。由于这类细菌在自然 界中分布广泛，在工业、农业、医学等与人类生活密切相关的重要领域应用价值高。且 有的属种细菌对人畜致病，受到人们的极大重视，而乳酸菌名称可能易于为人们所理解 和接受，所以通常被人们所引用。乳酸菌能分解蛋白质但不产生腐败产物，革兰氏阳性， 不形成芽孢，不运动或极少运动，过氧化氢阴性的厌氧或兼性厌氧微生物“一。 乳酸菌按传统的观念理解，其范围较窄。如按上定义和目前研究的进展其涉及的科 属种则相当多。在全面认识这类群细菌的种类及其特征之前，需要对其分类上涉及的科 属及目前的概况有所了解。目前在自然界已发现的这类菌在细菌分类上现在划分至少有 1 8 个菌属，涉及到的有关属则更多。这些属包括：乳杆菌属( l a c t o b a c i l l u s ) 、肉食杆菌 属( c a r n o b a c t e r i u m ) 、双歧杆菌属( b i f i d o b a c t e r i u m ) 、链球菌属( s t r e p t o c o c c u s ) 、肠球 菌属( e n t e r o c o c u s ) 、乳球菌属( 1 _ a c t o c o c c u s ) 、明串珠菌属( l e u c o n o c t o c u 溶) 、片球菌 属( p e d i o c o c c u s ) 、气球菌属( a e r a c o c c u s ) 、奇异菌属( a t o p o b i u m ) 、漫游球菌属 ( v a g o c o c c u s ) 、利斯特氏菌属( l i s t e r i a ) 、芽孢乳杆菌属( s p o r o l a c t o b a c i l l u s ) 、丹毒丝 菌属( e r y s i p e l o t h r i x ) 、孪生菌属( o e m e l l a ) 和糖球菌属( s a c c h a r o c o c c u s ) “”。 乳酸菌属于食品级安全的( g e n e r a l l y r e g a r d e d a s s a f e ，g r a s ) 微生物，与人类的生 活密切相关，它们是人体和动物肠道微生物菌群中的优势种类，具有调节肠道菌群平衡， 第章绪论 提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇，抑制肠道内腐败菌的生长以及腐败产物的 形成等作用眠“”乳酸菌也常常被人们有意识地引进到食品中或自然地发生在食物当中 ( 发酵剂) ，使食物拥有渴望的风味、结构和营养特征。目前，与乳酸菌相关的发酵食 品约占整个食物产品的2 5 以上，如干酪和发酵乳饮料等大宗发酵乳制品、发酵肉制品 ( 香肠) 、发酵蔬菜制品、果酒类产品、调味品( 酱油) 以及烤焙食品( 面包) 等o “删。 ， ， 1 1 2 乳酸菌的特性、主要分布 乳酸菌在形态上差异颇大，既有长杆状或短杆状的，又有圆形的。乳酸菌基本特征 是革兰氏阳性、不形成芽孢、不形成色素、不能产生含铁的卟啉化合物、过氧化氢酶阴 性、能够在空气或氧气下生长，是厌氧菌，但是具有氧耐受性；发酵的终产物为乳酸、 过氧化氢、丁二酮和细菌素( b a c t e r i o c i n ) 等多种拮抗物质。乳酸菌营养要求复杂，一 般需要氨基酸类化合物、维生素( 核黄素、硫胺素、泛酸、烟酸等) 以及其他生长因子； 具有大部分微生物所没有的利用乳糖的能力，但不能利用复杂的碳水化合物。 乳酸菌广泛分布于自然界中。它属于化能营养型微生物，环境中需要有丰富的营养 底物。有机质丰富的土壤、污水、人畜的粪便生长着大量的乳酸菌；完整的健康植物体 内只存在很少量的乳酸菌。而在植物受到损伤或者植株、果实腌制过程中，比如青贮饲 料、果蔬发酵食品、果酒、谷物制品中都有种类繁多和数量很大的乳酸菌；乳酸菌还广 泛存在于动物消化道及动物产品中，比如鲜乳中常有乳酸乳球菌、嗜热链球菌、粪肠球 菌、乳脂乳球菌、腐橙链球菌( 即嗜柠檬酸链球菌) 、戊糖明串珠菌、干酪乳杆菌、保 加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热乳杆菌，有时也有植物乳杆菌、短乳杆菌等，另外乳 制品、肉制品等也有大量乳酸菌；人体的消化道和生殖道中也生存大量乳酸菌“”“”。 1 1 3 乳酸菌的分类鉴定 乳酸菌对发酵食品和食品添加剂有很重要的经济价值，对乳酸菌进行快速、可靠的 分类和鉴定在微生物学和食品科学的研究中是必需的。乳酸菌的鉴定和分类的方法很多 ( 见表1 一1 ) ，国内、外应用很多经典方法如细菌的菌落特征、菌体形态、生理生化特 性、代谢产物等对乳酸菌进行鉴定。这里值得一提的是，由于细菌能利用许多碳源，因 此能否利用不同碳源成为一种十分重要的鉴定手段，出现了多种简便、快速、微量式自 动化的鉴定技术，如a p is y s t e m 、肠管系统( e n t e r o t u b es y s t e m ) 、b i o l o g 系统等。其基 本原理差不多，一般为多个“小管”组成，每个中含有四唑盐染料( 或其他指示物质) 2 第章绪论 和不同碳源。试验时，将待测菌株的悬浮液加入各管中。如果细菌能利用该碳源，则颜 色发生变化，这些结果被输入计算机，几分钟便能显示出该菌的名称“1 1 。 ” 随着分子生物学的深入发展，人们已逐渐认识到仅依靠传统的表型、生物化学方法 进行细菌的分类与鉴定存在一定的局限与不足。因为传统分类方法观察的只是一小部分 基因组的表达。例如噬菌体类型和血清反应只是单一基因的表达，检查的只是基因组的 一个小片段。而且传统的鉴定方法耗时耗力，也会因培养条件的改变而导致结果发生变 化。鉴定结果很不稳定，缺乏基因水平( 分子层面) 的数据作支持，因而已不足以对细菌 的分类与鉴定提供充分有力的证据“。 表1 - 1 乳酸菌鉴定的特性 t a b l e l 一1 c h a r a c t e r u s e d t o c l a s s i f y a n d i d e n t i f y b c t e r i a 特征类别举例 应用范围 。+ 细胞形状、排列；鞭毛排列；革主要用于种属鉴定；革兰氏 彤悉 兰氏染色等染色可分细菌为两个类群 生长条件( p h 、温度、渗透压、 传 生醚化 耍萎黧墓黑? 鬈囊篡嘉豸嚣黼懿鞭献 统 产生等 方 法 血清反应玻片凝集试验；荧光抗体主要用于种和菌株鉴定 噬菌体类型噬菌体的敏感性试验 主要用于菌株鉴定 乳酸旋光性、细胞壁组分 主要用于种属鉴定 7 化学分类性状 醌类测定 主要用于对放线菌鉴定 基 【g 摩+ 尔c 分t o o 数l 饼q a 的解链温度和密度 对较近缘类群有效 因 型d n a - d n a 杂交单链d n a 退配对数量 属内鉴定 特 征 d n a 碱基序列 嚣蠹量，序列编码蛋 所有细胞生物亲缘关系鉴定 因此人们希望能找到一种快速、稳定、灵敏的方法用于微生物的分类研究。随着分 子生物学和相关技术的发展，人们的这一愿望正逐渐成为现实，不过目前还没有一种分 3 第一章绪论 子生物学方法能单独胜任对微生物进行鉴定，而应该和其他方法结合起来进行比较研究， 互相补充。将传统方法和分子生物学方法结合起来对微生物进行研究将会得到比较好的 结果咖。 分子生物学方法是利用乳酸菌的遗传物质一核酸，结合p c r 技术、电泳技术等分子 生物学实验方法对乳酸菌进行分类和鉴定。随机扩增多态性d n a 即r a p d 限柚d o m l y a m p l i f i e dp o l y r n o r p h i c d n a ) 、扩增片段长度多态性( a f l p ，a m p l i f i e df r a g m e n t l e n g t h p o l y m o r p h i s m ) 、重复性元件序列p c r ( r e p - p c r ，r e p e t i t i v e e l e m e n t s e q u e n c e - b a s e d p c r ) “”、 1 6 s 2 3 sr d n a 间区删、1 6 sr d n a 序列分析等是近年来在乳酸菌鉴定中常用的方法。 而1 6 8r d n a 序列分析在乳酸菌的分类和鉴定中应用得较多，目前的研究主要将1 6 s r d n a 测序和其它方法结合起来“ 。 细菌的1 6 sr d n a ( 编码1 6 sr r n a 的基因) 因其在漫长的进化中具有高度的保守性 而且其长度适中( 约15 0 0 个核苷酸) 便于测序，因而近十年来细菌分类学家广泛采用 1 6 sr d n a 序列分析法进行细菌的遗传特性、分子差异、发育进化和分类学研究。本研究 使用了该方法。当前，国际上已经建立了多个生物科学的核酸序列数据库( 如g e n b a n k 、 e i v l b l 、d d b j 等) ，为微生物的分类与鉴定提供了一个非常有用的参照系“”“翻。 该方法包括样品总d n a 的提取、引物及探针的设计、p c r 扩增、序列测定、序列分 析及系统树构建。根据不同的目的设计特异性不同的引物，引物的特异性可以在界、n 、 纲、目、科、属、种甚至菌株等水平上显示。要确定引物的特异性需要将所要扩增的类 群的1 6 sr d n a 序列与所有细菌的1 6 sr d n a 序列进行对排，然后找出合适的寡核苷酸序 列，这些寡核苷酸序列与所要扩增的种属1 6 sr d n a 全部匹配，但与其他所有的1 6 sr d n a 有错配或尽可能少的全配。w o e s e 等人建立了专门的核糖体小亚基1 6 s 和1 8 sr d n a 序列 数据库( t h er i b o s o m a ld a t a b a s ep r o j e c t , r d p ) 。该数据库已包括2 2 3 2 6 个核糖体小亚基核 酸序列；用于构建系统树的原核生物1 6 sr d n a 序列有6 2 0 5 个，真核生物1 8 sr d n a 序列有 2 0 5 5 个嘲。 对乳酸菌的1 6 sr r n a r d n a 进行特异扩增、测定，并与已知菌种的1 6 sr d n a 序列进 行比较，以此进行乳酸菌鉴定和系统学研究，这是比较准确的方法之一。研究表明，4 0 0 6 0 0 碱基的序列足以对环境中微生物的多样性和种群分类进行初步的估计，但这样短 的序列通常不能用于新物种鉴定和探针设计“”。因此无论是全长还是部分1 6 sr d n a 序 列，都可以提交到o e n b a n k ，采用b l 猫t 和砒) p ( r i b o s o m a ld a t a b a s ep r o j e c tp r o g r a m s ) 与已 知序列进行相似性分析o ”。g e n e b a n k 将按照与测得序列的相似性高低列出已知序列名 4 第章绪论 单、相似性程度以及这些序列相对应的微生物种类，但更为精确的微生物分类还取决于 系统发育分析( p h y l o g e n 鲥ca n a l y s i s ) 。系统发育分析，就是根据能反映微生物亲缘关系 的生物大分子( 如1 6 sr d n a 、a t p 酶基因) 的序列同源性，计算不同物种之间的遗传距离， 然后采用聚类分析等方法，将微生物进行分类，并将结果用系统发育树( p h y l o g e n e t i e t r e e ) 表示。当前普遍的观点认为：1 6 sr d n a 序列同源性小于9 8 ，则可认为属于不同的种； 1 6 8r d n a 序列同源性小于9 3 9 5 ，则可认为属于不同属“7 ”。 1 2 乳酸菌素 1 2 1 乳酸菌素的定义 最早文献记录的细菌素是1 9 2 5 年g r a t i a 发现的一株大肠杆菌产生的c o l i c i n c ，它对 其它的大肠杆菌有抑菌活性。1 9 5 3 年，j o c o b 等对由细菌产生的对同源细菌具有高度专 一的抗菌蛋白物质统称为b a c t e r i o c i n 。1 9 7 8 年，k o n i s k y 提出，细菌素是某些细菌通过 核糖体合成机制产生的分泌释放到环境中的一类具有抑菌活性的蛋白或多肽，其抑菌范 围不仅仅局限于亲缘关系较近的种。此外，产生菌对细菌素具有自身免疫性。但是到目 前为止，细菌素的定义尚无定论，普遍接受的观点是：细菌素是一类由质粒d n a ( p l a s m i d d n a ) 编码形成的，在细胞溶解时释放并通过专一位点结合而对近缘相关种有致死作用 的活性蛋白类物质，产生菌对其细菌素具有自身免疫性。细菌素不同于青霉素等抗生素， 为多肽或蛋白质；此外，传统的多肽抗生素是有细胞多酶复合体催化形成的，不存在结 构基因，而细菌素由基因编码，可以通过基因工程加以改造”“1 。 1 2 2 乳酸菌素的分类 根据细菌素的分子量、热稳定性和修饰氨基酸的种类，k l a e n h a m m e n ( 1 9 9 3 ) 把细 菌素分为三类，后来又扩展为四类：羊毛硫细菌素：它在乳酸菌的核糖体中合成，是 一类小分子的修饰肽，分子内通常含有脱氢( 不饱和) 氨基酸、羊毛硫氨酸或1 3 一甲基 羊毛硫氨酸。如n i s i n 、l a c t i c i n 4 8 1 、l a c t i c i nj 4 9 、p l a n t a r i c i nc 、l _ x n a l ( l a c t i c i n 3 1 4 7 的 一个混合物) 、p l w a 、l m a 2 、p l w l 3 、c y l l i 、c y l l s 等。热稳定的小分子肽，其结构 特征为：n 末端信号肽序列长度为1 8 2 1 个氨基酸，前导肽链由一个蛋氨酸开始，并常 随一个赖氨酸；有活性的细菌素其n 一末端+ l 的位置上通常是赖氨酸或精氨酸。可分为 两个亚类：i i a 型，n 末端氨基酸序列为t y r - g l y - a s n g l y - v a l ，并由两个半胱氨酸所构 5 第章绪论 成的s s 桥，对利斯特氏杆菌有活性。如：p e d i o c i n p a - i 、s a k a c i n s a 、s a k a c i n s p 、l e u c o c i n a 、 e n t e r o c i n a 、c a m o b a c t c d o c i n s 等。1 i b 型，孔道复合物由两个具有不同氨基酸序列的肽 类寡聚体形成，并且二者都具有活性。如l a c t o c o c c i n s g 、l a c t o c o e c i n s f 、l a c t a c i n f 、 p l a n t a r a r i c i n s e f 、p l a n t a r a r i c i n s j k 等。热敏感大分子细菌素。它们的分子量一般大于 3 0k d a ，通常在1 0 0 0 c 或更低温度3 0s 内即失活，它们的抑菌谱较窄。如h e l v e t i c i n s j 、 e n t e r o l y s i n a 等。复合型的大分子复合物，除蛋白质外还含有碳水化合物或脂基团， 目前这类细菌素还未被纯化西“明。 1 2 3 乳酸菌素的特性 细菌素除种类繁多外，它们的性质也有很大差别。从分子组成看，细菌素包括大分 子量的蛋白颗粒( 这样的细菌素常被看成是优秀抗原，能诱导抗体形成) ，以及低分子 量的蛋白( 如乳酸菌细菌素，一般不具抗原性) 和小分子量的肽类。从抑菌谱看，大量 的研究表明，部分乳酸菌菌株产生的细菌素不仅对近缘相关的种有抑制作用，而且对革 兰氏阳性和部分革兰氏阴性菌也有良好的抑制效果，特别是当它们与各类螯合剂( 如 e d t a ) 结合后，其抑菌范围甚至拓宽到许多其它的革兰氏阴性菌，他们的抑菌活性大大 提高。从对热、p h 值和蛋白酶的敏感性来看，细菌素的敏感性和耐性差异很大。因此， 尽管研究人员确定了许多细菌素或类细菌素物质，但发现这些细菌素在数量、遗传基因 的位置、后翻译修饰和抑菌模式等方面差异很大，很难用某种准确的定义来概括和描述。 所以，目前有关细菌素比较通用的说法是，细菌素是一类具有生物活性的蛋白( 或多肽) ， 能够对亲缘关系较近的微生物种( 或菌株) 产生抑制作用。乳酸菌产生的拮抗物质已有 很多报道，其它的有益代谢产物也不少，应该对这些产物产生的机理、影响因素、这些 有机物对其它微生物的作用及其机理等诸多方面进行深入研究，以便更好的开发和利用 这些代谢产物m 。 乳酸菌产生的细菌素的特点概括如下：活性组分中有蛋白类物质；对于亲缘关 系较近的种属具有抗菌生物活性；具有杀菌作用；具有特定的细胞接受器；产细 菌素细胞具有自身免疫力，其免疫力和抑菌物质的产生受质粒控制。 1 2 4 乳酸菌素的研究进展 目前国际上研究最深、应用最广的是乳酸乳球菌产生的n i s i n 。r o g e r s ( 1 9 2 8 ) 第一 个报道了由乳酸乳球菌产生的有抑制作用的物质n i s i n ，它的抗菌谱包括抑制链球菌、 6 第一章绪论 葡萄球菌、芽孢菌属的一些种、梭菌及其他乳杆菌，特别是它抑制芽孢的形成，而对人 未发现毒性，因此，成为一个新型的食品添加剂。n i s i n 有一个3 5 0 0 d a 的分子量。不含 芳香氨基酸，但含有l 一氨基酸和少见的含硫氨基酸隗捌。 除对乳酸乳球菌产生的n i s i n 进行了深入的基础理论和实践研究外，对许多其它乳 酸菌产生的细菌素，如和l a c t i c i n 3 1 4 7 、乳杆菌素、肠球菌素、片球菌素、明串珠菌素 等也作了比较翔实的报道。 - 1 2 5 5 l 酸菌素活性检测方法 乳酸菌所产生的乳酸菌素各不相同，其抑菌谱也不同，有的乳酸菌素具有较宽的抑 菌谱，而有的乳酸菌素的抑菌谱较窄，甚至没有抑制腐败菌的能力。到目前为止，对乳 酸菌素活性即乳酸菌素抑菌能力的检测方法已有许多报道，概括起来，可分为液体检测 法和固体检测法。 液体检测法主要包括试管稀释法：将抑菌样品进行系列稀释，与指示菌共同培养， 可得肉眼可见的微生物生长所需的最低稀释浓度；比浊法：其原理及操作大致与试管 稀释法相同，也是将不同量的样品及标准品加入培养基，观察其对指示菌的效应一即细 菌生长所引起的浑浊。该方法虽能快速得出结果，但由于其操作繁琐已很少使用。 目前，乳酸菌素活性的检测主要采用固体检测法，亦称琼脂扩散法( a g a r d i f f u s i o n a s s a y ) ，即在无菌平皿中倒入1 0 m l 力l 热融化的素琼脂，待其充分冷却凝固后，放入已 灭菌的牛津杯，并按一定次序排列整齐。将固体检测培养基融化后冷却至5 0 左右，放 入1 0 0 个m l 指示菌液，迅速混合均匀，冷却后用无菌镊子取出牛津杯。分别向孔洞里加 入等量的相同稀释倍数的乳酸菌素液，培养2 4 h ，用游标卡尺准确测量抑菌圈的直径。 抑菌圈大小与乳酸菌素活性强弱呈正相关。最常用的有杯碟法( w e nt e s t ) 、滤纸片法 ( d i s cd i f f u s s i o n ) 和点种法( s p o ti n o c u l a t i o n ) 均属此类o “嘲。 1 3 乳酸菌及细菌素的功能与应用 随着我国国民经济的快速增长，人民的生活水平正由传统的温饱型向健康型转变， 人们对关乎到身心健康的食品安全性问题，特别是对食品中防腐剂的安全性以及食品的 保质期都提出了更高的要求，从而减少或避免食品化学防腐剂所带来的安全隐患。中国 入世后，国外食品大量涌入，其良好的原材料、较长的保质期和限量使用化学添加剂等 优良特性，给国内同类产品带来了极大的冲击。因此，努力寻找新型有效的天然防腐剂 7 第一章绪论 来提高食品的保存期限，维持食品的质量和安全，是我国食品行业迫切关注和急待解决 的问题，所以人们正积极寻求新的、自然型的食品保护剂来逐渐替代化学防腐剂嘲。显 然，利用细菌素作为一种生物型保护剂来阻止不渴望微生物在食品中的生长和存活，对 提高食品安全性具有重要意义。正是基于这些特性，有关细菌素的基础和应用研究是目 前食品微生物领域的热点问题嘲。 1 3 1 乳酸菌素的食品安全性 乳酸菌在工业、农业和医药等与人类密切相关的重要领域应用价值很高。和益生作 用有关的如乳杆菌属、乳球菌属、肠球菌属、双球菌属等狭义的乳酸菌尤其受到人们的 重视，关于其安全性也在评估中。评价的方法有：1 、细菌内在性质的研究；2 、药物动 力学的研究：3 、细菌和寄主间的相互作用。 乳酸菌由于长期以来一直为人们所食用，普遍认为是安全的微生物有机体。乳酸菌 安全性争议最大的是肠球菌。关于粪肠球菌制剂在人体的有效性和安全性曾经有人进行 了两个随机的双盲实验实验表明1 6 0 例扁桃体病人服用肠球菌菌株是有效和安全的。 对1 0 6 例免疫缺陷所致的各种慢性呼吸道感染患者试验结果也表明了粪链球菌的有效性 和安全性。内源性乳酸菌，尤其是定植于健康人肠道的乳酸菌，对人是安全的。而且未 发现任何副作用。1 9 8 9 年美国食品药品管理局( f d a ) 和美国饲料公共协会( a a f c o ) 批准可以作为安全的益生菌菌种4 2 株，其中包括屎肠球菌和粪肠球菌。 1 3 2 乳酸菌的生理功效 改善制品的风味，提高制品营养价值：乳酸菌可发酵糖产生酸味柔和的乳酸、醋酸、 丙酸等有机酸。它们在赋予制品以酸味的同时，还可与乳酸发酵过程中产生的醇、醛、 酮等物质相互作用，形成多种新的呈味物质，改善制品风味。乳酸菌产生的有机酸可以 提高钙、磷、铁的利用率，促进人体吸收。而乳酸菌在代谢过程中还可以产生多种氨基 酸、维生素和酶类。提高制品的消化吸收性能及营养价值。 治疗肠道功能紊乱，维持肠道菌群平衡：乳酸菌进入肠道后，即在肠内进行繁殖， 抑制病原菌和有害人体健康的细菌的繁殖，从而起到预防感染，维持肠内菌群的平衡。 并且其代谢产物能够促进宿主消化酶的分泌和肠道的蠕动，促进食物的消化吸收并预防 便秘的发生。有机酸乳酸和醋酸等使肠道p h 值下降，促进肠蠕动对病原性微生物有拮 抗作用。而细菌素对多种革兰氏阳性菌，如葡萄球菌、链球菌、微球菌、分支杆菌、斯 8 第一章绪论 特氏菌和乳杆菌均有抑制作用。 延缓衰老：乳酸菌能够产生超氧化物歧化酶( s o d ) 。s o d 是一种含有金属离子的酶， 能清除体内产生的过量超氧阴离子自由基，延缓衰老，提高机体对那些由于自由基侵害 而诱发的疾病的抵抗力，减少肿瘤患者在化疗和放疗时的疼痛和副作用。还有抗肿瘤和 免疫赋活、降低血清胆固醇水平，可预防由动脉硬化而引起的心脏病等作用“删。 1 3 3 乳酸菌素的利用方式 目前，乳酸菌形成的细菌素包括三种利用方式：( 1 ) 直接添加产细菌素的菌体细胞 到食品中，起到保鲜效果；或细菌素也可以作为发酵剂发酵的副产物存在于成熟奶酪、 酸奶、腊肠、泡菜等食品中，达到保存食品的目的。( 2 ) 直接投放纯化的细菌素到食品 中，提高食品的货架期。( 3 ) 将乳酸菌形成的细菌素与各类螯合剂结合，提高他们的抑 菌活性谱，扩展他们的应用范围，使他们不仅能够抑制革兰氏阳性菌，而且能够抑制革 兰氏阴性腐败菌和病原菌，延长食品的保藏期限。 1 3 4 乳酸菌及代谢产物的应用 乳酸菌可以产生多种细菌素，目前已经报道的有4 0 余种。它们分别是由乳球菌、 片球菌、明串珠菌、乳杆菌、双歧杆菌、肠球菌、链球菌、肉食杆菌等属的菌株产生的。 目前研究最突出并在实际生产中得到广泛应用的乳酸菌细菌素是由各种l g c t o c o c c u $ l a c t i c s u bs p 1 a c f i s 产生的n i s i n 。对大多数革兰氏阳性菌( 如利斯特氏菌、梭菌、葡萄球菌 和芽孢杆菌等) 有抑制作用。当n i s i n 与螫合剂e d t a 二钠螯合后，可以将其抑菌活性谱 拓宽到革兰氏阴性菌。目前已有6 0 多个国家在乳制品、肉制品、蔬菜产品、罐头、鱼 产品、乙醇类饮料等上使用n i s i n 作为安全、无毒、天然的食品防腐剂“”。 细菌素也可以作为发酵剂发酵的副产物存在于成熟奶酪、酸奶、腊肠和泡菜等食品 中。许多研究证明，具有产细菌素能力的发酵剂在发酵过程中可以防止和控制不良菌丛 引起的污染。因此普遍认为，在发酵食品和活菌制剂中使用产细菌素的乳酸菌以及在食 品中添加产细菌素的乳酸菌比直接添加细菌素更可取。然而并不是所有的乳酸菌都产细 菌素，若通过生物工程技术将细菌素的结构基因克隆到生产中应用的菌株中，那将具有 更广的应用价值。事实上已有几个克隆了细菌素基因到不产细菌素的乳酸菌中的研究报 道。这不仅可以使不产细菌素的菌株获得产细菌素的能力，而且为人工合成大量的细菌 素提供了可能m 蜘。 9 第一章绪论 1 4 发酵过程中影响乳酸菌素产量的主要因素 f 、i， + f 一 “ 乳酸菌为化能异养型微生物，代谢活动需要单糖，尤其是葡萄糖为碳源和能源，经 发酵将单糖转变为低分子的乳酸和其他有机酸，获取生命代谢需要的能量。乳酸菌的发 酵作用依据代谢途径和产物的差异，可分为同型乳酸发酵：葡萄糖经糖酵解途径几乎 全部变成乳酸。如链球菌、片球菌和部分乳杆菌。异型乳酸发酵；葡萄糖的分解完全 依赖磷酸戊糖途径转化为乳酸和其他不同产物。如明串珠菌和部分乳杆菌将葡萄糖转化 为乳酸、乙醇、二氧化碳；而双歧杆菌转化葡萄糖为乳酸和乙酸”1 。 1 4 1 乳酸菌素的生物合成 细菌素是通过核糖体蛋白合成机制包括转录和翻译来合成的。他们有的是染色体编 码( 如n i s i n 、l a c t a c i n b 、l a c t a e i n f 、h e l v e t i c i nj 等) ，有的由质粒编码( 如d i p l o c o c c i n 、 l a c t i c i n 4 8 1 、l a c t o c o c c i n s 、p e d i o c i n s 、s a k a e i n a 、l a c t o c i n s 等) ，而c a r n o b a c t e r o c i n b l 则是染色体和r d n a 都参与了细菌素活性的编码。大多数革兰氏阳性菌的细菌素是由质 粒基因编码的，与细菌素合成相关的基因组通常还包括细菌素合成基因，以及编码在转 录调控、翻译后修饰、加工转运到细胞表面和菌株的自我保护性( 免疫性) 中发挥作用 的蛋白产物的其他基因帆“删。 7 细菌素的生物合成与细菌产生的多肽抗生素的合成的不同之处是细菌素的合成可 被蛋白质合成制剂所干扰。多肽抗生素如杆菌肽是由一系列的多酶复合体的酶反应所合 成的，而n i s i n 是由核糖体合成的前体肽经过酶修饰后合成“螂。与抗生素相比，乳酸 菌产生的细菌素有着特殊的优点，主要表现在；细菌素是由安全的食品级的微生物产 生的：而抗生素是由非食品级微生物产生的；细菌素是蛋白或多肽类物质，由核糖体 控制合成，可以被肠道系统的水解蛋白酶分解，对肠道微生物菌群没有不利影响；而许 多抗生素并不具蛋白成分，是由多种微生物的多种复合酶催化而来的，肠道内的水解酶 类对它们没有影响，常常引起肠道微生物菌群出现紊乱“2 1 4 2 培养条件的控制 乳酸菌产生的细菌素，具有作为食品生物防腐剂以控制腐败和病原细菌的潜在用 途，为了能在食品中更经济的使用，必须通过菌株、培养基组成、最终p h 值、培养时 间和最适生长温度来提高细菌素的产量，而且为了保证所生成的细菌素符合食品卫生的 1 0 第章绪论 要求，最好是在食品级的培养基中进行培养。因此研究影响细菌素产量的因素是十分重 要的嘲 一。“。4 许多研究表明，决定细菌素产量的因素有菌株、培养基组成、最终p h 值、培养时 间和最适生长温度。简单和经济的培养基，如含有食品级肠粉的t g e 或t g e 缓冲培养液， 在合适的p h 条件下培养，可以获得较高的产量嘶“”。 除了上述影响因素外，还存在细菌素产生的诱导物。由指示菌l d e l d r u e c k i i s u b s p 1 a c t i sa t c c 4 7 9 7 产生的一个分子量为2 8 k d a 蛋白质( 由两个亚单位组成) ，能诱 导嗜酸乳杆菌提高细菌素l a c t a c i nb 的产量蚓。 1 4 3 菌种的改良 随着人们对乳酸菌生理功能和保健功能的认识以及分子生物技术的飞速发展，相信 在不久的将来，集中多种有益基因的食品级乳酸菌菌株和工程菌菌株将不断出现并给人 类带来巨大的经济效益、社会效益和生态效益，2 l 世纪必将是乳酸菌更为辉煌的时期。 无耐药因子的乳酸菌菌株、风味好的和促进发酵食品成熟的乳酸菌菌株、产生特殊酶系 的乳酸菌菌株、耐氧性能强的乳酸菌菌珠、具有粘附性和定植能力的乳酸菌菌株、合成 细菌素等抑菌活性代谢产物的乳酸菌菌株n 1 “s 。 1 5 乳酸菌素研究中存在的问题及展望 随着研究的深入，乳酸菌细菌素的应用前景越来越受到人们的广泛关注，然而在细 菌素的研究中仍存在许多有待解决的问题，主要体现在：( 1 ) 细菌素的产量普遍较低， 目前的研究方向主要集中在筛选高产菌株及构建工程菌株上；( 2 ) 细菌素的抑菌谱普遍 较窄，目前报道的细菌素一般只对革兰氏阳性菌有抑制作用，而对革兰氏阴性菌、霉菌 和酵母菌没有作用，而且不同种属的抑菌机制尚不十分清楚；( 3 ) 细菌素在不同食品介 质中的溶解性和稳定性较差，限制了它们的广泛应用；( 4 ) 评价其应用潜力的工作仍然 是以一般性报道为主，尚有待更深入的研究