（物理电子学专业论文）单模光纤共焦扫描显微成像系统总体设计与平面扫描技术研究.pdf

摘要 碡2 5 6 5 2 j 单模光纤激光共焦扫描显微镜是现代光电技术结合的新型扫描显微成像系 统，其独特的点照明与点探测机理排除了离焦光线对图像造成的模糊和斑点影 响，因而具有出众的轴向分辨率，能够实现对微小物体的三维成像。因此在医 疗、生物、物质结构、微电子等领域均具有广泛的应用前景。， 本文从理论上系统地分析了单模光纤激光共焦扫描显微成像系统的成像原 理；探讨了系统中各关键部件对整个系统性能的作用和影响，并结合对现有国 内外相关资料的消化，完成了总体方案的分析论证，确立了系统的总体组成方 案和对各子系统的要求；重点提出了一种简便紧凑的平面扫描机构设计方案， 深入分析了扫描机构中存在的扫描畸变及光学渐晕等问题，针对分析结果，设 计了带有扫描畸变校正与图像处理功能的扫描控制与图像采集电子系统。 关键词：激誊共即描显微镜，单模光纤，检流计式光学扫描器( 振镜) ，畸变 渐晕 t t e r f e r e n c e ) c o n f o e a l 圯与红外， 女程，第1 篇8 8 页 a b s t r a c t s i n g l e m o d ef i b e r - o p t i c a l c o n f o c a l s c a n n i n g l a s e r m i c r o s c o p y i san e w s c a n n i n gm i c r o s c o p i ci m a g i n gs y s t e m ，w h i c h i sb a s e do nt h em o d e r n o p t i c s t e c h n o l o g ya n de l e c t r o n i c st e c h n o l o g y t h ec h a r a c t e r i s t i co fp o i n ts o u r c ea n dp o i n t d e t e c t o rr e m o v e st h eo u t o f - f o c u sl i g h tt h a tm a k e st h ei m a g eb e c o m e b l u r t h e r e f o r e ， i th a se x c e l l e n tr e s o l u t i o ni na x i a l d i r e c t i o n s ，a n dc a na c h i e v e3 - di m a g i n go f m i c r o o r g a n i s m 、i th a sab r i g h tp r o s p e c ti nt h ea p p l i e dd o m a i no fm e d i c a l ，b i o l o g y , p h y s i c a ls t r u c t u r e ，a n dm i c r o e l e c t r o n i c s t h ei m a g i n gt h e o r yo ft h es i n g l e - m o d e f i b e r - o p t i c a lc o n f o c a ls c a n n i n gl a s e r m i c r o s c o p y i s a n a l y z e ds y s t e m i c a l l y i nt h i s p a p e r t h e e f f e c to fa l lt h e k e y c o m p o n e n t si nt h ew h o l es y s t e mi sa l s od i s c u s s e dt h e o r e t i c a l l y t h ea n a l y s i sa n d d e m o n s t r a t i o nf o rt h ew h o l e p r o j e c ti sc o m p l e t e d ，a n dt h es y s t e m sc o m p o n e n t sa n d t h er e q u e s to ft h ec o m p o n e n t sa l ee s t a b l i s h e d t h es c h e m eo fc o n v e n i e n ta n d t i g h t p l a n a rs c a n n i n go u t f i ti sd e s i g n e da n dd e v e l o p e di ne m p h a s i s t h ep r o b l e m so f s c a n n i n g d i s t o r t i o na n d o p t i c a lv i g n e t t i n ge x i s t i n gi nt h ep l a n a rs y s t e ma r ea n a l y z e d t h o r o u g h l y a c c o r d i n gt o t h ea n a l y s e s ，t h es c a n n i n gc o n t r o la n di m a g es a m p l i n g e l e c t r o n i cs y s t e m ，w h i c hh a st h ef u n c t i o n so fd i s t o r t i o nc o r r e c t i o na n d i m a g e p r o c e s s i n g ，i sd e s i g n e d k e yw o r d s ：l a s e rc o n f o c a ls c a n n i n gm i c r o s c o p y , s i n g l e - m o d eo p t i c a l - f i b e r ， g a l v a n o m e t e r s c a n n e r , d i s t o r t i o n ，v i g n e t t i n g 研究生学位论文 1 绪论 1 绪论 1 1 课题研究背景与意义 光学显微术是一种观察微观世界而被研究了一个多世纪的古老课题。光学 显微术的无破坏性显微观察对各种领域都很重要，例如对生物和材料科学的研 究。普通光学显微镜的主要缺点是分辨率受到了衍射极限的限制，它的分辨率 与照明波长是同一个数量级；另一个限制是它的焦深。这些限制使利用普通光 学显微术对具有定厚度的物体成像很困难，因此对厚样品不可能实现三维成 像。然而，随着科学技术的发展，在许多应用场合，如医疗、生物、生命科学、 遗传基因学、材料科学、精密机械、半导体工业等研究领域，都需要研究微小 物体的三维结构，如生物细胞、集成电路等。这不仅需要高分辨的无前后表面 叠加的断层图像，还必须成清晰的三维图像。所以，普通显微镜难以达到上述 要求。而激光共焦扫描显微镜是现代光电技术结合的新型成像系统，由于排除 了离焦光线造成的图像模糊，能够在像面上获得高对比度的高倍率放大图像， 并且由于它具有亚微米的轴向分辨能力，能够实现图像的层析，建立起一系列 不同高度上的高分辨率光学断层图像，配合计算机图像处理技术的使用，便可 实现细微结构的三维成像。因此激光共焦扫描显微镜是研究细微结构的有效技 术手段，受到国内外学术界和科技界工作者的广泛研究和关注。 激光共焦扫描显微镜与传统的光学显微镜相比，它既具有比普通光学显微 镜高的横向分辨率，又克服了普通显微镜观察景深小的缺点，具有较高的纵向 分辨率。激光共焦扫描显微镜的独特成像特性来自于点源和点探测器的引入， 使其能抑制共焦点以外的光线进入探测器中。因此，激光共焦扫描显微镜共焦 平面的图像不会因被来自其共焦平面外的扫描反射光线所模糊，能够实现光学 层析，这是与普通光学显微镜的根本区别。正因为激光共焦扫描显微镜突破了 普通光学显微镜在观察三维结构时受到的限制，它可以将一系列二维断层图片 通过计算机合成三维立体图像，使其在许多科学领域中都具有重要的应用价值。 例如，在生物医学领域方面：以往，科研人员在研究生物组织或样品时通常是 研究生论文专用纸第l 页 研究生学位论文1 绪论 将其割开、切片，然后用普通显微镜观察，这样不可避免地造成一系列问题， 如样品在切片过程中由于变形而破坏了原有结构，造成位置错位、表面形态变 形等；此外，切制过程极为耗对，而且有些样品是不能切割的。使用激光共焦 扫描显微镜就可避免上述问题。在观察生物活细胞接受药物处理的反应时，激 光共焦扫描显微镜也起到极为重要的作用，它可以在计算机的控制下每隔一定 时间记录下一次细胞图像，从而使得工作人员可以在实验后从容地观察和研究 细胞受药物作用后的变化情况。 点源和点探测器是激光共焦扫描显微镜系统中的关键元件。在传统的激光 共焦扫描显微镜系统中通常是将一微米量级的针孔放置在光源和光探测器之 前，来构成点光源和点探测器，而针孔的使用将带来一些实际操作上的困难。 如果激光束的会聚点与针孔的对准存在偏差将会产生失真和像差，而探测器针 孔的对准更为关键，亚微米的移动都将导致像差及分辨率的下降。如果有灰尘 落到其中的一个针孔上，将会减弱信号光强并引入像差。擦除针孔上的灰尘必 须将它从装置上拆除下来，而后安装时又得进行极为繁琐的重新对准。另外， 由于其扫描结构与点光源和点探测器等测量机构基本上是一体的，因而系统结 构比较复杂、笨重。光纤是现代新技术的光信息传输介质，具有很强的光信号 传输和抗干扰能力，同时光纤还具有很好的柔性等许多优良性质。通过对单模 光纤的传输特性进行研究可知，用单模光纤代替针孔作为激光共焦扫描显微镜 系统的点光源和点探测器是完全可行的，单模光纤激光共焦扫描显微镜系统与 传统的激光共焦扫描显微镜系统有着相同的轴向分辨力；同时，单模光纤的应 用使单模光纤激光共焦扫描显微镜系统具有实现该类系统商用化很有价值的优 点：用单模光纤代替针孔作为点光源和点探测器使得激光会聚点与光纤输入端 的对准即使略有偏差也不会对系统引入像差，因而系统安装调试过程中只需大 致对准即可；而且光纤端面沾染灰尘的可能性大大降低，光纤端面的清洗也不 需要拆卸及重新对准；单模光纤耦合器可以替代传统共焦扫描显微系统中的分 光镜与相应的机械结构，大大简化了系统结构，降低了整机的成本；另外，由 于光纤的灵活性，使得激光、信号探测部分可实现分布式摆放，而不是象传统 激光共焦扫描显微镜那样必须安装在支撑架上一固定的位置，这样可以防止激 光器的震动对扫描部分产生不良影响，提高了抗干扰能力和可靠性。 综上所述，研究单模光纤激光共焦扫描显微的成像特性和提高系统像质有 研究生论文专用纸 第2 页 研究生学位论文 1 绪论 着重要的理论价值和应用意义。本课题的研究对于提高共焦扫描系统成像的分 辨率，提高系统的抗干扰能力和可靠性，简化系统的结构有重要的意义，同时 具有重要的理论价值。在微观结构的研究中具有重要意义并具有广泛的应用前 景。 1 2 国内外研究现状 共焦显微术的概念是由m i n s k y 在5 0 年代提出的。此后，紫外光源的使用 和激光的发明，对扫描显微镜的发展起到了很大的推进作用。之后有许多文献 报道了该系统在理论和实践方面的研究工作。激光共焦扫描显微镜( c c s m ) 系统 作为研究细微结构的有效工具，得到了国内外学术界和科技工作者的广泛关注 和研究。特别是在8 0 年代和9 0 年代，它引起了人们的高度重视，美国、日本、 英国、德国都投入了大量的人力和财力进行研究，在理论上和实践上都取得了 巨大的发展。在理论上，更加全面地研究了系统的各种特性，提出了许多改进 成像质量、提高成像分辨率的方案。在应用实践方面，现国外已有正式产品投 入市场。如德国蔡司公司、日本尼康、英国剑桥分子生物实验室以及美国科学 仪器公司都已推出成熟的商用共焦显微镜。这些产品设备档次高、系统庞大， 价格昂贵。9 0 年代初，国内外开始掀起研究光纤共焦扫描显微镜的热潮。目前 澳大利亚已研制出性能优越、结构小巧的相关商用产品。国内激光共焦扫描显 微技术的起步较晚，近几年才有几个单位开始研究。而在利用光纤作为激光共 焦扫描显微镜系统中点光源和点探测器方面的研究，国内从事这方面研究的单 位更少，目前还没有研制出产品。 课题正是在这样的背景下提出的，并且得到了高等学校博士学科点专项科 研基金资助项目的支持。 1 3 课题研究的目的、内容与所进行的创造性工作 1 3 1 课题研究的目的和内容 本课题研究的主要目的是探讨采用光纤作为点源和点探测器而构成光纤共 研究生论文专用纸第3 页 研究生学位论文 1 绪论 焦扫描显微成像系统的新原理、新技术，研制光纤共焦扫描显微成像系统的二 维扫描成像实验装置。 ( 1 ) 通过检索和学习消化国内外有关的资料和文献，对传统的激光共焦扫 描显微镜作一定的理论分析，并研究以单模光纤代替传统激光共焦扫描显微镜 中的针孔作为点光源和点探测器所产生的影响。根据理论分析确定实现共焦特 性所需光纤及相关器件的参数。 ( 2 ) 在深入分析单模光纤共焦扫描显微镜成像原理的基础上，完成总体方 案的研究论证，研究系统原理方案的技术实现与关键技术，确定各子模块的实 现方法。 ( 3 ) 具体计算确定了整个系统各主要部件的技术要求。 ( 4 ) 着重对二维扫描成像系统作深入研究，确定具体的扫描方式，完成扫 描头的结构设计，力求该系统简便实用。对高精度二维扫描和采样系统存在的 各种畸变和渐晕问题进行深入分析，根据分析结果设计带有畸变校正的扫描控 制及图像采集系统。电子系统要求实现高速采样、精确定位、图像处理及与计 算机之间的数据传输功能。 1 3 2 本课题所进行的创造性工作 本课题所进行的创造性工作主要在于： ( 1 ) 以傅立叶光学为分析手段，从理论上把薄透镜成像、普通非共焦扫描 显微镜成像、激光共焦扫描显微镜成像及单模光纤共焦扫描显微镜成像的机理 以联系和发展的体系作了深入地分析。得出单模光纤共焦扫描显微成像系统具 有出色的轴向分辨率的理论依据和必备条件并以此作为系统设计的准则。 ( 2 ) 提出以普通显微目镜作为扫描透镜，与转动轴垂直放置的双振镜系统 构成一个简便的二维扫描装置，该装置与普通的三目显微镜具有很好的兼容性， 便于产品化。对因简化所引起的扫描畸变与渐晕等问题作了全面深入的分析， 提出了把所有存在的畸变并校正的硬件电路设计思路，并且不增加电子系统 的复杂程度。 研究生论文专用纸第4 页 里兰壁生羔堕翌王墨璺塑兰燮篁星堂塑塑堕堡至竺塑璺矍 2 单模光纤共焦扫描显微成像系统的理论 分析 2 1 引言 焦 一 。竺竺，譬开始，随着激光器的发明，各种扫描显微镜应运而生。这些扫描 詈堡篓包苎：。手了描光学显微镜、扫描电子显微镜、扫描声学显微镜、丢磊蘧薹 詈登彗i 。苎苎塑显微镜、近场扫描显微镜以及光学共焦扫描显微镜。姜磊藉茹 光学显微镜与普通光学显微镜的光学系统实质上是相同的，其主要的差茹羞； 丽两弦五面瓦 第5 页 像常较跚醐黼嵫懒 记有需氏概椭编眠获技像氟 来像成”艮式成描勘姚 一一一一一 鼢非确穰聊狲戡站吼朔雌鼬就蜩啦翩麟舫姚椭 一描息咖影铲觥黼蚴黻 ， 。像创茨径钒欧删馘船麟购黼脯舰硼狐椭阳 取重的粑澎胍趣棚赫黜鼬就斟黻峻 吨舫魅蝴她炉黜椭骗默拟腑啼觐锨 研究生学位论文2 单模光纤共焦显微扫描成像系统的原理 光照射法和光探测法。共焦扫描光学显微镜的共焦特性可以由图2 1 来说明。 在图2l 中，( a ) 图表示样品位于与光源针孔、探测器针孔共轭的物面上。 当系统被精密校准时，由光源通过针孔射出的光，经物镜形成受衍射限制的光 点。此光点照射在样品上的一点，由该点反射回来的光线再次通过物镜及其后 的探测针孔被探测器所探测，即可获得共焦图像。被光源照射的针孔，起点光 源的作用；探测针孔及其后的探测器起点探测器的作用。因为光源针孔与物面、 物面与探测针孔( 即像面) 都是共轭的，所以称它们为“共焦”关系。 在图2 1 中的( b ) 图中，可设想为样品移出焦平面，即处于“离焦”状态， 则其反射光线来自物平面下方或上方物面的反射，将使大部分反射光线经物镜 后不能被聚焦到探测针孔里去，而被散射到针孔之外，从而使位于观察针孔后 面的探测器所接收到的光信号的幅度迅速地减少，这就说明，位于对准面前后 的物面不能与对准面成像；而在普通的显微镜中，来自物平面之外的反射光线 也将进入目镜而被观察和记录，从而使位于物平面上的物体图像变得模糊。因 此，共焦扫描显微镜与普通显微镜相比，所获得的图像具有更好的对比度和更 高的分辨率。当用共焦扫描光学显微镜观察一个透明的生物标本时，这个“分 立”的物平面可以被轴向前后移动，从而可得到标本轴向不同高度处薄层的图 像，即可实现“光学切片”。这是普通显微镜所无法实现的。在这种结构中，由 于物镜被两次使用，即照明和成像，因而显微镜是共焦的，如图2 1 所示。在某 一时刻样品上仅一点被照明，所以对样品或光束进行扫描。整个图像是由一个 像元接着一个像元形成的，象电视图像一样。因此，共焦扫描光学显微镜的三 个基本要求是：点光源照射与点探测、共焦和扫描成像。 2 2 薄透镜的三维傅立叶光学 薄透镜的透过率函数以及三维衍射性质是理解共焦扫描成像系统中三维成 像概念的基础。 2 2 1 蒋透镜的菲涅尔衍射 薄透镜的透过率函数表示为 研究生论文专业纸第6 页 研究生学位论文2 单模光纤共焦显微扫描成像系统的原理 如叫w ) 唧 _ 蚪 ( 2 1 ) 式中，j p g ，y ) 为透镜的瞳函数，k = 2 州五为波数，f 为透镜的焦距。 图2 2 衍射平面和观察平面的坐标选取 如图2 2 所示，u g ，y ) 是在衍射平面x y 上的a 点光场，u m ( x l ，y ，) 是在观 察平面x - y 。上的光场。当观察面和衍射面之间的距离远大于观察点和光轴之 间的距离时，通过菲涅耳近似，可得到如下的菲涅耳衍射公式： u “北掣二u g ，y ) 唧怯k x ) 2 + ( y 。一砌螂( 2 2 ) 上式的成立条件在通常的光学成像系统中都成立。 要考虑一个薄透镜的衍射花样，需将该透镜看作一个衍射屏。假定透镜被 均匀平面波照明，则透镜前的光场为：u o 。，乃) = u 通过薄透镜后，根据式( 2 1 ) 和式( 2 2 ) 在薄透镜后z 处的光场分布g ：，y ：) 为： u ：g ：，y ：) = e x f p ( i k z ) jj _ 。( ，, 。尸g ，y ) 一卜掣h 弘刊：叱叫雌也q 3 ( 1 ) 焦面_ f ：的衍射模式 研究生学位论文2 单模光纤共焦显微扫描成像系统的原理 将z = ，代入2 3 式就可以得到焦平面上衍射分布为 吣小了i t s , e x p ( i 矽) 唧 一峭幽) ( 2 。) 唧一i k t x + y ：y 1 ) d x l d y l 对于球对称的透镜，1 其瞳函数仅与半径坐标相关，即p ( x ，y ) = j p ( ，) ，其中 ，= ( x ：+ j ，：) y 2 。若p ( ，) 是一个半径为口的均匀圆孔函数，则透镜的瞳函数可以 写成 p ( ，) = ：，巍情况 s ) 根据汉克尔变换的定义，忽略常量u i ，并利用径向光学坐标 v = 堡x 陋t j ，2 ( 2 6 ) 可将( 2 4 ) 化简为 u ：= ，州唧旧，唧( 杀爿 三铡 c ： 上式中= 万a - 。 焦平面上的强度分布是( 2 7 ) 式的模的平方： ，：汹) ：型 2 ( 2 8 ) lvl 该强度分布被称为爱里斑。这表示由于衍射作用，一束平行光通过薄透镜 后在透镜后焦面上并不能成像为一个理想点，而是一个强度分布如( 28 ) 式表 示的斑点。 ( 2 ) 焦面匕的衍射模式 研究生论文专业纸 第8 页 研究生学位论文2 单模光纤共焦显微扫描成像系统的原理 a a ，此时观察面到透镜的距离为z = f + a z ，代入( 23 ) 式并进行汉克尔变换， 得到： 嘶) = 可i e x p ( i c ) e 刮譬卜) 。唧卜害( 爿m 警 z 砌 q 8 上式的变换中将u 。假定为一个单位的照明。 设透镜的离焦瞳函数为： 洲嘶，唧降) ， 则从( 2 8 ) 式可知u ：( ，2 ) 是离焦瞳函数的二维傅立叶变换。对于半径为口的 圆形透镜引入径向光学坐标v 和轴向光学坐标“： v 一2 7 r ( a ：， ， 2z 等睁弘“了2 z c 删n 口 c 2 。， “：竿口：卜斗2 j ，r a a a ：i (211)f 五 l ，z 旯 2”7 对于一个均匀的圆形透镜，将( 2 1 0 ) 和( 2 1 1 ) 代入( 2 8 ) 式可得u ：作为离 焦量u 的函数： 啪川= z 删唧阿】e x p f 篆 e 唧f 等* 二 1 2 上式给出了焦平面附近的三维衍射场分布，式中p = 么是对透镜的孔径归 一化后的半径坐标。当“= 0 时，观察面就在焦平面r ，i 比时的* 谒锛布 研究生论文专业纸 第9 页 研究生学位论文2 单模光纤共焦显微扫描成像系统的原理 州( v , u = o ) 1 2 制2 掣 2 该式与( 2 8 ) 是相同的。 当v = 0 时，沿轴向的强度分布是 州= i u 2 ( v = 0 , u ) 卜叫等 ( 21 3 ) ( 2 1 4 ) 上式表示平行光束通过薄透镜后在不同离焦距离处光轴上的强度分步。 2 2 2 薄透镜的相干成像与三维点扩散函数 光学系统一般可看成是由若干薄透镜组成，对于薄透镜成像的研究有助于 对整个光学系统成像的理解。激光共焦扫描显微系统作为一个光学系统，是以 相干光照明的，而且在以后章节中可知单模光纤共焦扫描显微系统是相干成像 的。为此，首先讨论薄透镜的相干成像理论。 r + a - l u o ( x o , y o )u 】 卜 u i l u l d od 。 u ，y i ) 圈2 3 正透镜成像坐标图 设有一个振幅透过率为t o k ，j ，。) 的平面物体放在一个正透镜前巩处( 透镜 研究生论文专业纸1 f 而 研究生学位论文 2 单模光纤共焦显微扫描成像系统的原理 的参数与2 1 1 小节中的相同) ，照射物体的光波为单色平面波a ，如图2 3 所 示，图中。面称为物平面，分析在透镜后4 处像平面，上的光场分布u ，0 ，y ，) 。 单色平面a 波透过物体后，光场分布为： u ( x o ，y o ) = a t o k ，儿) ( 2 1 5 ) 将这称为物函数。由于光波的传播过程是线性的，则成像系统也可以看成 是线性的。根据线性系统理论 2 2 - 3 ，利用占函数性质，物函数u 。( ，y 。) 可 表示为： u ox 。，y 。) = 7 u 。g ：，成弦g 。一x j ，y 。一y j l ；砂： ( 2 1 6 ) 该式表明物函数x o ，j ，。) 是无数加权的占函数的线性组合，其中占函数是 构成物函数的基元，而b ：，y j ) 是它的权重因子。 根据上述理论，若求出成像系统对万函数的响应表达式，将它与每个相应 物面元上的复振幅相乘后求和，就得到像平面上的复振幅分布u ，k ，只) 。通常 将系统对于万函数的响应称为脉冲响应，对于光学成像系统也可称为点扩散函 数，用 g 。，y 。；一，y ，) 来表示物面元k ，) 在像平面_ 一只上的点扩散函数，则 有： 以0 。儿) = f 砜g 。，y 。k g 。，y 。：墨，y ，。咖。 ( 2 1 7 ) 在图2 3 中，物函数经菲涅尔衍射到透镜前表面，上，根据式( 2 2 ) ，则， 面上的光场分布u g ，j ，) 为： 啪= 掣卿赢执) 唧悟一o ) 2 + 牺痧0 ( 2 1 8 ) 再将式( 2 1 8 ) 代入式( 2 3 ) 得： 研究生论文专业纸 第1 1 页 堑塑生堂垡堡壅 ! ：苎堡堂堑茎塞里丝塑垫堕堡垒笙堕垦墨 一 戊) = 掣j f f 觚盹y ) 唧 等h h o ) 2 9 e x 一 一掣 眨 e x p 怯k ，叫2 地刊2 d x 。砂。螂 式中x - - y 是薄透镜面上的坐标。 引入透镜的横向放大率m ，并定义： m = 4 a o ( 2 2 0 ) 嘛妁= 掣e x 一 矗h 讪脚舢。) 幽蛔伊 ( 挂一加 挚“ ( 2 z ， e x 一毒 g ，一xk 似+ m ：x 协。出 ( 2 3 8 ) 这里蚝表示物体上的扫描位置；x 表示物面坐标；和毛分别表示光源面和 探测面上的坐标位置；参数 4 、 如为透镜成像放大倍数；h l 和h 2 则分别是物 镜和收集透镜的点扩散函数，它们对应的傅立叶变换为孔径函数p 1 和p 2 。 研究生论文专业纸 第1 9 页 研究生学位论文2 单模光纤共焦显微扫描成像系统的原理 为了得到光纤f ：出射端的复振幅，现在考虑复振幅u ，( z 、，x ，) 通过光纤f ： 的传播情况。根据a w s n y d e r 和j dl o v e 的光波导理论，一个绝对的电场复振 幅u ( x ，z ) 可以在光纤中展开成一系列正交模的叠加，即： u ( x ，z ) = 。，乃0 ) 唧，：) ( 2 3 9 ) 上式中乃g ) e x p 似，：) 表示特定光纤中一系列的正交模，它有一定的解，并 且沿着z 方向传播没有损耗。a j 叫做模态幅，它由正交关系来确定。函数 g ) 是 垂直于z 轴的平面上光纤的模分布。如果光纤是单模光纤，则j 只有第一项j = 1 ， 因此等式( 2 3 9 ) 变为： u ( x ，：) = a 1 ( x ) e x p 似l z ) ( 2 4 0 ) 其中： z + g ) u 0 ，z = o 妞 a l = ! l ：- ( 2 4 1 ) 讥俐2 出 一。 这样就可推导出在第二根光纤f z 的出射端面上点x 3 的复振幅g ，) 为： u 化，b ) = z 沁) e x p 。知汀z ( 一虹传，一协 了b 】2 d x ( 2 4 2 ) 其中7 0 表示光纤f 2 的长度。假设大面积探测器d 具有均匀的强度灵敏度， 则此探测器探测到的光强为： m ，) ：”ii v , ( t ，码】2 d x 3 = m ( 2 4 3 ) 研究生论文专业纸 第2 0 页 研究生学位论文2 单模光纤共焦显微扫描成像系统的原理 上式中t i z ( r , 1 2 d x ，是一常数，因为z b ) 的分布对于特定的光纤是固定 的。所以把等式( 2 3 8 ) 代入上式，可得： ，。0 。) = f i i i i i f , g ，妙。g 。娩g + m 。x 。 g ，一x 弦：g ，+ m ：x ) f l i x i t l u o g 。溉( x + m x 。) ，( rx ) h ：lx ，+ 彳2 x l ( 西西q d x ld x ，d x f ( 2 4 4 ) ，g 。) = ! 弘( x m x * ，一x 卜出 = i g l g ，) ，g ，) 2 ( 2 4 5 ) 式中 表示卷积运算。等式( 2 4 5 ) 表示上面讨论的单模光纤激光共焦扫 描显微镜是一相干成像系统，它的有效点扩散函数为： 蜀g ，) = jju o g 。h g + “k ( x ，k ：( x ，+ m ：x 。d r ， ( 2 4 6 ) 若光纤f l 和f 2 有相同的横截面，即u 。g 。) = z g 。) ，则上式就可表示为： g l 代) = | 了z k h g + ，x o ) z & 溉k + m ：咖。出，( 2 4 7 ) 如果光纤是单模的，是6 函数，且m - 2 壶，上式就可转化为： g ，k ) - - m x 娩b ) ( 2 4 9 ) 代入式( 2 4 5 ) 可以得到探测器可探测到的光强为： ，= f h l h 2o r i ( 25 0 ) 比较等式( 25 0 ) 和( 2 3 7 ) ，发现它们是等价的。由此可见，引入单模光 纤，并不改变激光共焦扫描显微镜独特的相干成像特性。因此，用单模光纤代 替针孔来实现激光共焦扫描成像是完全可行的。 根据已有的光纤理论可知，光纤本质上是一相干探测器，所以在理论上就 可以用多模光纤代替单模光纤。可以把光纤中每一个模式想象成一个分立的相 研究生论文专业纸 第2 l 页 研究生学位论文 2 单模光纤共焦显微扫描成像系统的原理 干探测器，它的振幅探测灵敏度与相应的光纤模式成正比。例如，在采用双模 光纤作为点光源和点探测器的双模光纤激光共焦扫描显微系统中，通过探测最 低阶模l p 0 ，就可得到标准的共焦图像，探测二阶模l p l l 可以得到差分图像。上 面这种方法是分立探测光纤模式的方法。也可以把两种不同光纤模式的图像信 号同时投射到两个分立的探测器上。当把两个分立的两个探测器所得的图像信 号相加，可以得到真正的共焦图像；当把分立的两个探测器所得的图像信号相 减，通过简单地改变光纤的长度，就可获得振幅差分模式图像和相位差分模式 图像。对比单模光纤激光共焦扫描显微系统和双模光纤激光共焦扫描显微系统， 后者具有更强大的功能，但它也需要更复杂的探测和处理技术，如两个探测面 要紧靠着，探测器的探测性能应该完全一致等。随着模式的增多，不难发现相 应的探测手段和处理技术会变得非常复杂。目前，国外只有关于双模光纤激光 共焦扫描显微镜成像技术的报道。考虑到现有的条件和设备，开展对单模光纤 激光共焦扫描显微成像系统的分析和研究是适宜的。 2 5 单模光纤激光共焦扫描显微镜的分辨率 2 5 1 单模光纤激光共焦扫描显微镜的平面分辨率 对于普通的显微镜，其分辨率取决于物镜参数。根据( 2 2 8 ) 式，设物镜 的三维振幅点扩散函数为 0 ，v ) 。当仅考虑平面分辨率时，其平面点扩散函数为 j i j 0 = o ，v ) 。则根据前面的分析，并对一些常量作了省略，可知物空间的一个点 在像平面上的光强分布为： m h 州2 = ( 掣) 2 汜s t ， 相应的强度分布图如图( 2 5 ) 中实线所示。 对于单模光纤激光共焦扫描显微镜系统，由于实际系统中物镜与集光镜是 同一个，也即： 研究生论文专业纸第2 2 页 研究生学位论文2 单模光纤共焦显微扫描成像系统的原理 0 ：o ，p ) ：矗：0 ：o ，y ) ：2 j l ( v ) v ( 25 2 ) 田2 5 黑平面上的光强分布情况 考虑点物体的反射率为f b ，y ) = j k x ，只一y ) 时，代入到式( 2 5 0 ) 中， 得： ，p ) _ f 垄掣 4 ( 2 5 3 ) 、y， 、7 此时，其强度分布如图25 中的点划线所示。 根据瑞利判据，当一个物点像的主极大和另一个物点像的第一极小相重合 时，这两个物点刚好被分辨开，可以看出单模光纤激光共焦扫描显微镜比普通 的扫描显微镜具有更高的平面( 横向) 分辨率。 2 5 2 单模光纤激光共焦扫描显徽镜的轴向分辨率 单模光纤激光共焦扫描显微镜与普通显微镜相比，除了具有较高的平面分 辨率外，更重要的是其显著的纵深( 轴向) 分辨能力。下面将通过分析单模光 纤激光共焦扫描显微镜与普通扫描显微镜在某一离焦平面上的光强分布来说明 单模光纤激光共焦扫描显微系统具有高的纵向分辨能力。 对于普通的非共焦扫描显微镜，根据( 21 4 ) ，令归一化光学坐标变换后的 研究生学位论文2 单模光纤共焦显微扫描成像系统的原理 略去一些常量，即可求得离焦平面上的光强分布 ( 2 5 4 ) 对于单模光纤激光共焦扫描显微镜，被测样品的周期分量可以由它的频谱 来表示，这一频谱是由被测物体的反射率r 的傅立叶变换推导而来的： 尺) = _ j e r ( x ) e x p ( - 2 n j x m ) t 6 c ( 2 5 5 ) 通过傅立叶反变换，可得： ，g 。一x ) = e 尺妇) e x p 【2 巧g 。一xh 如 ，(矿x=即60)exp2巧(xa-x60)exp) p p ，h x | e r 2 巧(p 陋 f ( 2 5 6 ) ( 2 5 7 ) 把等式( 2 5 6 ) 和( 2 5 7 ) 代入等式( 2 4 5 ) 可以得到： ，0 ，) = f ：c 似，p ) r ( m ) a 0 ) e x p 【2 巧( 掰一p ) b l d m 印 ( 2 5 9 ) 其中： c ，p ) = 亡g 。g 。g l x o e x p ( 一2 r c j m x o + 2 砌h d x 。出。 ( 2 5 9 ) m 和p 是横向方向上的空间频率；c ( 1 1 1 ，p ) 是系统传递函数，它描述了在强 度分布图像中的周期分量的能量，这是由于物体振幅反射率r 中存在两种空间 频率( m ，p ) 所造成的。因为单模光纤激光共焦扫描显微系统是一相干成像系统， 就可引入横向相干传递函数c ( m ) ，所以c ( m ，p ) 可以写成： c ( m ，p ) = c 咖- 6 0 ) ( 2 6 0 ) 其中： c ) = e g 。) e x p ( - 2 巧m x o 皿。 ( 26 1 ) c + g o ) = j = ：一( 7 ) e x p ( 一z 概b ( z 也) 它们分别是有效点扩散函数g lx o ) 和g l * x o ) 的傅立叶变换。进而探测器可 探测到的光强就可表示为： 研究生论文专业纸 第2 4 页 研究生学位论文2 单模光纤共焦显微扫描成像系统的原理 ，o ，) = l e 如，) r ( m ) e x p ( 2 n j m x ，k 吖 ( 2 6 3 ) 用等式( 24 7 ) 代替g l ( x ) ，并用移相和相似定理，可以推出： 删= k 曷坳瑚q 院眺伽瑚 ( 26 4 ) f 。( m ) 和f 2 ( m ) 分别是f i ( x ) 和( x ) 的傅立叶变换。在圆形单模光 纤和具有圆形孔径函数的透镜的情况下，上两式就可换算成柱对称二维情况： ，) = l e c ( f l r ( ，) e x p ( 2 砂印1 2 ( 2 6 5 ) c ( ，) = 暇蚴) b 渺) 】 阪迎( 硎 ( 26 6 ) ，：2 + 力2 弘表示横向方向上的径向空间频率；v 是横向光学坐标，与径 向距离r 的关系为： y = ( 2 霈肛) r s i n 口( 26 7 ) 假设光纤f l 和f 2 有相同的横截面，即f i ( r ) = ( r ) 。对于圆形、线偏振 光纤，利用高斯逼近，点尺寸为r o 的单模光纤的横截面可以表示为： 删= 圳= o x p 一吆) 2 j s s ， 相应的傅立叶变换为： 鼻( ，) = 五= 2 确2 唧 - 侈1 2 砒) 2 j ( 26 9 ) 如果透镜无像差，它的孔径函数的半径为a o ，等式( 2 6 6 ) 可推导为： c ( f ) = 而= 云翮唧( 等 旷6 一唧( - 彳印枷 c z ，。， 其中： 风：一( ；c o s 护) 2 卅+ ，s i n z ( 0 4 ) 2 ( 2 7 1 ) a = ( 2 ，嘞，o 倒) 2 ( 27 2 ) 上式中a 是一个无量纲的参数，它表征光纤点尺寸、物镜孔径半径a o 和距 离d 的综合效应。对于非共焦的成像情况，孔径函数可以用下式表示： 研究生论文专业纸 第2 5 页 研究生学位论文2 单模光纤共焦显微扫描成像系统的原理 b ( ) = e x p k “1 2 x r l 口。) 2j p 口。) ( 27 3 ) 只( r ，“) = 0( ，a 。) ( 27 4 ) 其中u 是轴向光学坐标，对应于真实的离焦平面轴向距离z 有如下关系： = ( 8 州旯) z s i n 2 ( 纠2 ) ( 27 5 ) s i n ( 叫2 ) = t 7 0 i 是透镜的半角数值孔径。根据等式( 2 6 6 ) 可得共焦情况下，相 干传递函数为： c ( ，”) = 阪m 她泓洲p k 蚴地( x s ，“，) 】 ：型e x 。二丝二型： 2 面丽币砸习唧l 下一j 2 l o x p - ( a i u ) p 0 2 如 ( 27 6 ) 这里c ( f ，“) 已经被c ( f = 0 , u = 0 ) 归一化了。 在共焦扫描成像时，样品上的扫描物点在同一振幅下应包含所有的周期分 量，即点物体的反射率的傅立叶变换为尺( ，) = 1 ，根据等式( 25 5 ) 可得光强分 布为： 如) = i = 触，砒蚓2 ( 2 7 7 ) j 0 是零阶贝塞尔函数，v 是横向光学坐标，u 是轴向离焦量。令上式中v = o ， 把等式( 27 6 ) 代入等式( 2 7 7 ) 可以计算出轴向光强分布i ( 0 ，u ) ，如图2 6 所示。 当a = 0 ，就对应于理想的激光共焦扫描显微镜，则在像面上，轴向光强变 化i ( 0 ，u ) 为： 删= 错 ，s ， 研究生论文专业纸第2 6 页 研究生学位论文2 单模光纤共焦显微扫描成像系统的原理 图2 6 在共焦扫描成像情况下轴向光强随轴向光学坐标u 的变换情况 从图2 6 中可以得到以下的结论：随着a 的增加，单模光纤激光共焦扫描 显微成像系统的轴向分辨能力将降低。当a l 时，i ( o ，u ) 的点几乎重叠在 一起，说明轴向分辨能力没有明显的变化，即拥有理想的共焦扫描显微镜的成 像特性。 由此可见，光纤共焦扫描显微镜中光强沿轴向u 方向的衰减变化要比普通 显微镜快，这正说明共焦扫描显微镜具有较高纵深分辨能力。 另一重要表征纵深分辨能力的参数是离焦物点对图像引入的背景。这可用 点扩散函数的积分来描述，即引入积分光强。定义为： ，积分0 ) = f ，p ，z ，弦矿 ( 2 7 9 ) i * ”( u ) 表示在离焦量为u 的平面上的一个物点对图像引入的背景能量，若 i * h ( u ) 随着u 的增大而衰减很快，说明成像系统有很强的纵深分辨能力。对 于普通的扫描显微镜成像系统，有 分0 ) = f p ( v ，”】2 v d v ( 2 8 0 ) 由帕塞瓦尔( p a r s e v a l ) 定理，应有： f 陋d ，甜】埘一j ：p ( ，”】2 r d r ( 2 8 1 ) 研究生论文专业纸 第2 7 页 研究生学位论文2 单模光纤共焦显微扫描成像系统的原理 其中p ( r ) 为光瞳函数，它与h ( v ) 是傅立叶变换对( 光栏半径己归一化) ， 故有： ，积分0 ) = l j d p ，“l 。r d r ( 2 8 2 ) p ( v ，u ) 表示不同离焦u 时的光瞳函数。由于不同离焦量相当于在光瞳函 数e p 引入二次位相因子，即： p ( r ，”) = p ( r ，o ) e x p ( - 弦2 2 ) ( 2 8 3 ) 可见离焦并不会改变等式( 27 6 ) 的值。也就是说对于普通扫描显微镜，不 管物点是否在焦面上，它对图像贡献的光能量作用是相同的。在焦面上物点的 反射光能量形成图像，而在焦面外物点的反射光能量则成为模糊图像的背景。 因此，普通扫描显微镜的成像系统对离焦物点几乎没有任何能量滤除的作用， 因而没有纵向光学剖面即层析的能力。如图2 7 中的曲线a 所示。 然而对光纤共焦扫描成像系统，情况则完全不同。设照明和接收系统有相 同的光学系统，当离焦量为u 时，它们的光瞳用有效瞳函数表示为： 叱) = c i r ( r ) e x n ( 千j 吉u r 2 ) s 。， 它们的点扩散函数分别为： | b 。：( v ，u ) - - e l ，h ：， ) j ( 2 8 5 ) 利用极坐标下的傅立叶变换，有： ) = i ：厶) 唧( 千j l u r 2 ) 砌 = c ( v ，) 千声0 ，“) ( 2 8 6 ) 其中： 如) = c ，。( w ) c 。g w 2 r d r( z ) 娟，班，。吣t n g 计2 卜 c z 研究生论文专业纸第2 8 页 研究生学位论文2 单模光纤共焦显微扫描成像系统的原理 第一、二娄扫伯戚埠 。k f 图2 7 共焦扫描显微镜与普通扫描显微镜的纵深分辨特性曲线 曲线8 代表普通非共焦扫描显微镜：曲线b 代表共焦扫描显微镜 故积分光强为： ，0 ) = f 陋。( v ，“m ：( v ，】2 v d v = f 吣x 牲1j u r 2 ) 砌1 4 = f 【c 2 ( v ，) + s 2 ( v ，“) r v c 扣( 2 8 9 ) 图2 7 中的曲线a 表明普通非共焦扫描显微镜成像系统，其曲线是一水平 线，这表示系统对不同平面的光能没有任何滤除作用：而反映上式的计算结果 的曲线b 则表明共焦扫描显微成像系统随着离焦量u 的增大，积分背景能量迅 速下降。因而，对离焦背景的滤除是共焦扫描显微镜最重要的优点。 综上所述，单模光纤激光共焦扫描显微成像系统比普通非共焦光学扫描显 微成像系统具有更高的横向和纵向分辨率，因此能够实现对细微结构的三维成 像。 本章从薄透镜成像这一基础出发，按照逐步递推的关系依次分析了非共焦 扫描显微镜、共焦扫描显微镜及单模光纤共焦扫描显微镜的成像理论。关于光 纤共焦扫描显微镜的轴向及横向分辨力的理论推导和分析结果是系统总体方案 及各关键部件参数正确选择确定的理论依据。 研究生论文专业纸第2 9 页 堕塞竺兰生丝苎! ：塞堕墨竺竺璺笪查塞星墨圭墨塑壁塑垄堡一 3 实验系统的总体方案及各主要部件的选 择 3 1 实验方案的设计基础 单模光纤共焦扫描显微镜是