（食品科学专业论文）茁酶多糖生产菌的复合诱变筛选及发酵条件研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进彳于的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特g , l j j n 以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其他教育机 构的学位证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：囊i ) 目f 签字目期：瑚疹年f 月。f 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解吉林农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即 吉林农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。本人授权吉林农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等；复制手段保存、汇编学 位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：，赳铜f 签字日期：o e 咚年6 月i 日 学位论文作者毕业去向： 工作单位： 冲2 j j 趣孚 通讯地址： 硖博 导师签名：础臻碍 签字日期：埘哆年6 月l 日 电话：| j s9 6 掣6 孓s 0 邮编： 吉林农业大学硕士学位论文 茁霉多糖生产菌的复台诱变筛选及发酵条件研究 摘要 茁霉多糖( p u l l u l a n ) ，主要是由出芽短梗霉( h u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n s ) 在 糖质培养基中生长、代谢产生的一种胞外同多糖，可以被广泛用于医药制造、食 品包装、水果和海产品保鲜、化妆品工业、烟草制造工业和农业种子保护以及工 业废水处理等众多领域，是一种具有极大开发价值和前景的多功能生物制品。 出发茵株p 5 3 是一株野生型出芽短梗霉，其多糖产量较低，不符合工业化发 酵生产茁霉多糖的需求。本研究着眼于茁霉多糖的x - , 1 k 化发酵生产，选育适于工 业化生产的高产茁霉多糖生产菌株。同时，对筛选得到的诱变菌株进行了发酵条 件研究，确定了其最住的培养基和培养条件。并且对工业化大规模生产茁霉多糖 的纯化技术进行了探索性研究。 本研究在对出发菌株p 53 进行了形态与发酵动态研究的基础上，采用紫外线 和亚硝基胍( n t g ) 复合诱变对出发菌株p 53 进行选育，以提高目的产物一茁霉 多糖的产量并且改善菌株的发酵特性。经两轮紫外线和两轮亚硝基胍( n t g ) 复 合诱变获得一株茁霉多糖产量高且基本无色素生成的变异菌株u 2 n ：一3 2 6 ，遗传稳 定性试验表明该菌株的多糖生产能力比较稳定，在连续培养1 0 代过程中，多糖 产量无明显变化，始终维持在较高水平。 继而进行了变异菌株u ：n ：一3 2 6 发酵条件研究，包括培养基和培养条件的探索 及优化，最终确定u ：n ，- 3 2 6 的最佳发酵条件为：市售砂糖7 ，蛋白胨0 4 ，硫酸 铵0 0 6 ，硫酸镁0 0 1 ，磷酸二氢钾0 2 ，氯化钠0 2 ，温度3 0 ，初始p h 7 0 ， 种龄3 6 h ，装液量8 0 m l 5 0 0 m l ，接种量5 ，转速1 8 0 r p m ，发酵五天。在优化条 件下，变异菌株u2 n ：一3 2 6 的多糖产量达43 2 9 l ，且基本无色素生成。 另外，本研究对出发菌株p 53 生产的粗多糖进行了纯化研究，利用工业级的 d e a e 一纤维素、d 0 0 1 一c c 强酸大孔阳离子树脂与d 2 9 6 r 强碱大孔阴离子树脂混合 床，进行了粗多糖的纯化，结果证明d e a e 一纤维素的去蛋白和色素的效果比 d 0 0 1 一c c 强酸大孔阳离子树脂、d 2 9 6 r 强碱大孔阴离子树脂要好，并且初步确定 p 53 产生的色素为阴离子型色素。经d e a e 一纤维素纯化的多糖回收率为93 7 。 阴、阳离子大孔树脂混合床纯化的多糖回收率为9 7 7 。 关键词：茁霉多糖复合诱变纯化发酵 重塑窒些查! 塑圭兰壁堡壅 堕堡兰鲨皇主堕堕塞宣堡壅塑垄墨垄壁墨： 型堕 a b s t r a c t p u l l m a nj sak i n do f e x t r a c e l l u l a rh o m o p o l y s a c c h a r i d em o s t l y p r o d u c e db ys t r a i n s o f a u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n si ns a c c h a r i d ec u l t u r ed u r i n gg r o w t ha n dm e t a b l i s m i tc a l l b ea p p l i e di nm a n yf i e l d si n c l u d i n gp h a r m a c e u t i c a li n d u s t r y , f o o dp a c k a g i n g ，f r u i t sa n d s e a f o o dp r e s e r v a t i o n ，c o s m e t i c s ，t a b a c o om a n u f a c t u r i n g ，s e e d sp r o t e c t i o n ，d i s p o s a lo f i n d u s t r i a is e w a g ee t c p u l l u l a ni sak i n do f m u l t i 。f u n c t i o nc r e a t u r em a t e d a lw i t hg r e a t v a l u ea n dp r o s p e c tt od e v e l o p o r i g i n a ls t r a i np 5 3i so n eo f w i l d a u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n s p 5 3d o e sn o ta e c o r d w i t ht h er e q u i r e m e n t so f p u l l u l a ni n d u s t r i a l i z e dp r o d u c t i o nb yf e r m e n t a t i o nb e c a u s e i t sp o l y s a c c h a r i d ey i e l di sr e l a t i v e l yl o w w j t 1av i e wo f p u l l u l a ni n d u s t r i a l i z e d p r o d u c t i o nb yf e r m e n t a t i o n ，t h es t u d yb r e e d st h es t r a i nt h a tp u l l u l a ny i e l di sh i g ha n d f i tf o rp u l l u l a l li n d u s t r i a lf e r m e n t a t i o n m e a n w h i l e f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so f t h e m u t a n ti n c l u d i n gt h eo p t i m a lc u l t u r em e d i 啪a n dc u l t a r ec o n d i t i o n sa r e d e t e r m i n e d a n dt h ep u r i f i c a t i o nt e c h n o l o g yo f p u l l u l a no nt h el a r g e s c a l ei n d u s t r i a l p r o d u c t i o ni se x p l o r e d o nt h eb a s eo fo r i g i n a ls t r a i n ss h a p ea n df e r m e n t a t i o nk i n e t i cd i a g r a m t h i ss t u d y s c r e e nt h es t r a i nb yc o m p o u n dm u t a t i o nu s i n gu va n dn t gi no r d e rt oi n c r e a s et h e y i e l do fp u l h d a na n di m p r o v et h ef e r m e n t a t i o nc h a r a c t e r i s t i c s b yt w ot i m e su va n d t w ot i m e sn t g , am u t a n tu 2 n 2 3 2 6i so b t a i n e dw h i c hp o l y s a c c h a r i d ey i e l di sh i g h a n dm e l a n i nb a s i c l yi sn o tp r o d u c e d g e n e t i cs t a b i l i t ye x p e r i m e n t a t i o no ft h em u t a n t s t r a i nu 2 n 2 3 2 6s h o wt h a tp o l y s a c c h a r d et h r o u g h p u ti sr e l a t i v e l ys t a b l e i nc o u r s eo f t e ns u b c u l t u r e s , t h ep o l y s a c c h a r i d ey i e l dc h a n g e dl i t t l ea n dm a i n t a i n e di nh i g h e rl e v e l s t u d yo i lf e r m e n t a t i o nc o n d i f i o i l so f m u t a n ts t r a i nu 2 n 2 3 2 6i n c l u d i n gc u l t u r e m e d i u n la n dc u l t u r ec o n d i t i g r i sw a si n v e s t i g a t e d f i n a l l yt h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n so f u 2 n 2 3 2 6w a sc o n f i r m e d ：g r a n u l a t e d s u g a r 7 ，p e p t o n e 0 4 ，( n h 4 ) 2 s 0 4 0 0 6 ，k h 2 p 0 4 0 3 ，m g s 0 4 。7 h z 0 0 0 1 ，n a c l 0 2 ，c u l t u r et e m p e r a t u r e3 0 ，i n i t i a lp h 7 0 ，s e e da g e3 6 h ，l i q u i dm e d i u mv o l u m e s 8 0 m l 5 0 0 m l ，i n o c u l a t e dv o l u m e s5 ，r o t a t es p e e d1 8 0 r p m ，f e r m e n t a t i o nt i m e5 d u n d e r t h eo p t i m a lf e r m e n t a lc o n d i t i o n s ，ah i g hp o l y s a c c h a r i d ey i e l do f 4 3 _ 2 9 l w a s o b t a i n e da n dp i g r n e n tp r o d u c e dl i t t l e i na d d i t i o nt h ec r u d ep o l y s a c c h a r i d et h a tp r o d u c e df r o mt h eo r i g i n a ls t r a i np 5 3w a s p u r i f i e du s i n gi n d u s t r yg r a d ed e a e - c e l l u l o s e ，c o m p o s i t ep i l l a rw i t hd 0 0 1 c c w e a k l ya c i d i cc a t i o ne x c h a n g e r - s u l f o n i ca c i df u n c t i o n a l i t ya n dd 2 9 6 rw e a k l yb a s i c a n i o ne x c h a n g e r - p r i m a r ys e c o n d a r ya n dt e r t i a r ya m i n ef i m c t i o n a l i t y n l er e s u l t s t e s t i f l e dt h a td e p r o t e i na n dd e p i g m e n tp r e f e r r e dd e a e - c e l l u l o s eo v e rd 0 0 i c c w e a k l ya c i d i c c a t i o ne x c h a n g e r - s u l f o n i ca c i df u n c t i o n a l i t ya n dd 2 9 6 rw e a k l yb a s i c a n i o ne x c h a n g e r - p r i m a r ys e c o n d a r ya n dt e r t i a r ya m i n ef u n c t i o n a l i t y p i g m e n t p r o d u c e db yp 5 3w a se l e m e n t a r yc o n f i r m e dt h a ti sa n i o np i g m e n t p u r i f i e d p o l y s a c c h a r i d er e c y c l er a t ew a s9 3 7 a n d9 7 7u s i n gd e a e 。c e l l u l o s ea n dc o m p o s i t e p i l l a r k e y w o r d s ：p u l i u l a n ；c o m p o u n dm u t a t i o n ；p u r l f i c a t i o n ；f e r m e n t a t i o n 2 吉林农业大学硕士学位论文 茁霉多糖生产菌的复合诱变筛选及发酵条件研究 第一章绪论 1 1 茁霉多糖的研究进展 1 1 ，1 茁霉多糖的性质与特点 茁霉多糖( 又称为短梗霉多糖，普鲁兰，h 多糖，p u l l u l a n ) 是由出芽短梗霉 ( a u r e o b a s i d i u mp u l u l a n s ) 产生的胞外同多糖，由一1 ，4 一糖苷键连接三个葡 萄糖形成麦芽三糖，在通过n 一1 ，6 - 糖苷键连接麦芽三糖，形成高分子量的线形 多糖“。其中a l ，4 一糖苷键与。一l ，6 一糖苷键的比例为2 ：1 。聚合度在1 0 0 5 0 0 0 ， 平均分子质量为4 - 2 0 0 万”1 。 茁霉多糖是无色、无味、无臭的线形商分子材料，在水中膨胀、溶解，溶解 度无限，溶解速度比羧甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯醇等快二倍以上。溶液为 中性，不离子化、不凝胶化、不结晶“1 。在相对湿度7 0 以下时平衡水分为1 0 - - 1 5 ，不吸潮、不胶粘。在金属离子存在下不凝胶化，粘度不仅不下降，且有 升高，任何浓度的食盐均不影响茁霉多糖溶液粘度。 茁霉多糖溶液的粘度在常温下受p h 的影响较小，只有在p h 3 以下和p h l l 以上时才不稳定，慢慢水解。粉末状的茁霉多糖对热的反应与淀粉相同，加热不 融化，1 0 0 。c 失去平衡水，2 5 0 以上迅速分解炭化，颜色由白变淡黄，褐至黑色， 但与其它高分子不同，不产生有毒气体”。 茁霉多糖分子为线形结构，它的水溶液的粘度远低于其它多糖，茁霉多糖 溶液的表面张力随其浓度的增加变化较小。低分子量的茁霉多糖溶液的粘度在加 热时的变化也较小，与其它分子材料有很好的共溶性，与淀粉和动物胶有很好的 。擘u。芒 斜4 一 盖一 。乒。 。融 吉林农业大学硕士学位论文 茁霉多糖生产菌的复合诱变筛选及发酵条件研究 共溶性“。 茁霉多糖的可朔性强、可制膜、纺丝，任意造型。茁霉多糖水溶液经干燥热 压制成薄膜，该薄膜透明、无色、无味、无毒、抗油、抗氧气渗透，且一般不用 增塑剂，其理化性能如光泽、强度、耐热性与常用的聚氯乙烯薄膜接近。也可直 接在物体表面涂抹或喷雾涂层干燥成膜，茁霉多糖对具有一定的亲水性的物体均 有较好的附着能力。茁霉多糖膜具有玻璃纸一样的光泽及透明度和硬度，膜对温 度的变化稳定，在o 。c 以下仍柔软，具有耐油性、热封性。茁霉多糖膜和成形物 的表面硬度高、弹性强，表面摩擦系数小，但伸展率在平衡水分3 一1 5 时低。 为增强茁霉多糖膜的柔软性，在制膜时可添加糖醇。茁霉多糖膜最特殊的性质是 比其他高分子膜的透气性能低，氧、氮、二氧化碳和香气等气体几乎不能通过 1 l ，1 2 ，1 舶 茁霉多糖水溶液对木材、纸张、纤维、干燥食品、玻璃、金属、水泥等具有 一定的亲水性的材料均具有很强的粘合作用和涂层性“4 ”1 。 茁霉多糖的急性，亚急性和慢性毒性试验和致畸试验表明“：它不会引起任 何生物学毒性和异常状态的产生，所以用于医药和食品工业是安全的，可用于生 产可食性膜。更重要的是，该薄膜能在土壤或水中被微生物所分解，产物为麦芽 三糖。另外，a 一淀粉酶也可将其缓慢水解形成寡糖“。 1 1 2 生产菌种“”她”1 茁霉多糖生产菌种主要有：出芽短梗霉( a u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n s ) 、出芽 茁霉( p u l l u l a r i ap u l l u l a n s ) 、发酵茁霉( p f e r m e n t a n s ) 、发酵茁霉暗色变 种( p f e r m e n t a n sv a t ，f u s c a ) 、出芽暗色孢霉( d e m a t i u mp u l l u l a n s ) 、产气 杆菌( a e r o b a c t e ra e r o g e n e s ) 、黄金银耳( t r e r n e l l or n e s e t e r i c o ) 等。另外， z h e n m i n ge h i 等筛选到一株产茁霉多糖的酵母菌株，初步鉴定属于红酵母 ( r h o d o t o r u l ab a c a r u m ) 。 1 1 3 茁霉多糖的研究进展阻2 “3 1 目前，国内外对于茁霉多糖的研究报道不多。日本林原生化研究所1 9 7 4 年已开发出茁霉多糖商业化的生产工艺，日本目前年产量已达万吨。国内的研 究从8 0 年代开始至今已二十多年，大多停留在菌种的选育及茁霉多糖酶的分离 纯化阶段，但距离工业化应用还有很长一段距离。另外国内关于茁霉多糖的应 4 吉林农业大学硕士学位论文 茁霉多糖生产菌的复合诱变筛选发发酵条件研究 用性研究较多，国内尚未见商品问世。主要原因为尚未找到理想化工业生产用 菌株。 1 2 茁霉多糖的应用 1 2 1 茁霉多糖在食品工业中的应用 茁霉多糖的突出特点是无毒无害以及良好的食用性，故在食品工业中可用做 食品配料与添加剂、粘着剂、抗氧化剂、包装材料和被膜剂等。 1 2 1 1 食品) j i l t 方面的应用“”1 作为功能型食品配料由于茁霉多糖是水溶性的，又不易被体内消化酶消化 是一种无害的食品配料。用适当比例的面粉、直链淀粉和茁霉多糖混合可制成风 味不同的人造米、鸡蛋面、通心面或馅料，热量比一般产品低一半。 作为食品添加剂茁霉多糖可作为许多食品的品质改良剂，例如，在肉制品 中添加0 1 左右的茁霉多糖，可使肉制品的粘弹性、口感和持水性明显提高。煮 饭时，添加相当米量的0 0 5 左右的茁霉多糖，能使饭粒保持蓬松。另外，高分子 量的茁霉多糖对食品中的高分子蛋白质有特殊的作用。如往豆浆和氯化镁的混合 物中加入0 0 1 0 3 的茁霉多糖可很容易的制成豆腐，其效果与用石膏或6 葡萄糖内酯凝固剂一样好。 1 2 1 2 在保鲜方面的应用。“”嘲 高油脂食品的保鲜由于氧气、氮气极难通过茁霉多糖膜，故用它制成薄膜 和涂层是防止高脂肪食品氧化酸败和酸价升高的一种极有效的隔膜。因此它完全 适合包装含油脂量高的食品及油脂制品，如花生、糕点等。 易氧化变质制品的保鲜可用于维生素强化食品、酶制剂、药物等易氧化变 质物品，以及易氧化变质的粉末食品类如汤料、咖啡、酱、各种香辛料等的保存 保鲜剂。 农产品的保鲜茁霉多糖具有良好的成膜性，与其他果蔬抗菌剂同时涂于果 实表面，茁霉多糖起到隔绝氧气，延缓抗菌剂分解，延长药效作用。茁霉多糖和抗 菌剂混合使用后，对果实货架期质量保持，减少水分损失，延长货架期具有明显效 果。利用茁霉多糖对鸡蛋、蔬菜、水果进行涂层保鲜也可以明显延长货架期。但 茁霉多糖不能单独使用，因为其抗湿性差。 海产品的保鲜茁霉多糖作为一种新型海产品被膜保鲜剂，能充分有效地抑 吉林农业大学硕士学位论文 茁霉多糖生产菌的复合诱变筛选及发酵条件研究 制海产品体内挥发性盐基氮的大量积累，对海产品体内的水分蒸发也有良好的保 护作用，因此对海产品具有良好的保鲜作用，是一种非常有前途的海产品保鲜剂 1 2 2 茁霉多糖在污水处理中的应用凹3 茁霉多糖用作絮凝剂同其它无机絮凝剂和有机合成高分子絮凝剂比较，具有 安全无毒、无二次污染、可生物降解、对环境和人体健康无害、投药量省、絮凝 效果好、矾花结构密实、沉降速度快、排泥耗水率低等特点。在投入量达2 5 0 3 0 0g l ，搅拌速度为5 0r mi 1 1 可排除污染，也有将茁霉多糖与聚合氯化铝复 合处理污水的报道口o 3 “。 1 2 3 其它方面的应用3 3 1 茁霉多糖用作促长剂对育肥猪具有增强食欲，促进生长的功能。茁霉多糖可 用作化妆品的填充料，在医药工业中可作为淀粉、甲基纤维素等药品胶粘剂的替 代品及血浆的代替品，添加5 - 1 0 的茁霉多糖可适当提高胶囊的柔性、弹性、粘 性，使其在胃肠预定区域溶解释放内含物，提高药效。 造纸工业中茁霉多糖的水溶液具有良好的成膜性，其生产的纸张具有良好的 吸水性，便于书写和f 1 1 $ , j ；茁霉多糖作为粘结剂配料可生产出某些特殊用途的高 级纸张；茁霉多糖作粘结剂结成的沙模在浇铸时具有不产生气体、尘埃、噪音和 振动的特点。茁霉多糖还可作为石油工业的三次采油的驱油剂等等。 1 3 本课题的研究意义及内容 1 。3 1 本课题的研究意义 据统计，近年来中国包装用塑料已超过4 0 0 万吨，而一次性塑料废弃物达 2 0 0 万吨左右。由此引发的环境问题日益严重。因此新型绿色环保可降解塑料的 研究与生产迫在眉睫。而茁霉多糖具有优良的可塑性及可降解性，茁霉多糖膜的 抗张力4 0 0k g m 2 ，优于p v c ( 聚氯乙烯) ；渗透率大，达1 4 1 0 0k g c m 2 ，优于 玻璃纸、p v c 、p v d c ( 聚偏氯乙烯) ；引张强度大，氧透过性极低仅为玻璃纸的十 分之一，p v d c 及l d p e ( 低密度聚乙烯) 的1 3 0 1 8 0 。经适当成型处理制成薄 膜，可部分取代现有的聚乙烯及聚氯乙烯材料，对减少“白色污染”、保护生态 环境具有深远意义。 吉林农业大学硕士学位论文茁霉多糖生产菌的复台诱变筛选及发酵条件研究 本课题着眼于茁霉多糖的工业化发酵生产，利用现代微生物诱变育种技术， 选育适于工业化生产的高产茁霉多糖生产菌株。通过对变异菌株的培养基和培养 条件的优化试验进一步提高茁霉多糖的产量。本课题为工业化发酵生产茁霉多糖 提供基础研究资料和可借鉴的方法和经验。 1 3 2 本课题研究的内容 本课题主要研究内容包括：对出发菌株p 5 3 进行细胞形态鉴别的基础上，进 行了原始菌株的发酵状态曲线的测定。同时对工业化大规模生产茁霉多糖的纯化 技术进行了探索性研究。采用紫外线与亚硝基胍( n t g ) 复合诱变育种技术对出 发菌株p 5 3 进行选育，经初筛和复筛获得茁霉多糖产量较高且无色素产生或色素 淡化的变异菌株。对变异菌株进行发酵条件研究和优化，进一步提高其多糖产量， 改善其多糖产品品质。 吉林农业大学硕士学位论文 茁霉多糖生产菌的复合诱变筛选及发酵条件研究 第二章出发菌株p 5 3 的性质研究 2 1 前言 微生物本身，在漫长的进化过程中，达到适合于它的生存和繁衍的水平。野 生型微生物经自然选择，能适应它的周围环境，但却不能按人们的意志生产人们 大量需要的物质。因此，从人类的需求利益出发，须对从自然界获得的野生型菌 种进行改良，使之产生数量远远超过微生物本身需要的物质，或者不是它征常产 生的新物质。 在发酵工业中进行生产菌种改良通常采用诱变育种，通过诱变育种，除了可 以获得高产菌株之外，还可以选育到一些具有良好性状的变株，包括改善产品质 量、提高目的产物的产量、简化工艺、缩短周期等，还可以获得适合工业化发酵 工艺要求的变株。 在进行诱变育种之前，首先要对出发菌株进行大致了解，主要包括形态特征 及生产性能研究，为下一步的诱变育种作好充分的准备。4 ”3 。 2 2 材料与方法 2 2 1 材料 2 2 1 1 菌种：出芽短梗霉( a u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n s ) ，编号p 5 3 ，为本实验室 保藏菌种。 2 2 1 2 培养基 斜面培养基( ) ：马铃薯2 0 ，葡萄糖2 ，琼脂1 5 - 2 。 种子培养基( ) ：蔗糖6 ，蛋白胨0 2 ，硫酸铵0 0 4 ，磷酸二氢钾0 2 硫酸镁7 h ：00 0 1 ，氯化钠0 2 ，p h6 0 ，1 2 1 灭菌1 5 m i n 。 发酵培养基( ) ：蔗糖6 ，蛋白胨0 2 ，硫酸铵0 0 4 ，磷酸二氢钾0 2 硫酸镁7 h 2 00 0 1 ，氯化钠0 2 ，p h6 0 ，1 2 1 灭菌1 5 m i n 。 2 2 1 3 试剂 蔗糖、硫酸铵、磷酸氢二钾、硫酸镁7 1 。0 、氯化钠、葡萄糖均为分析纯； 蛋白胨与琼脂为北京鼎国有限公司产品；9 5 的乙醇( 医用级) ； 2 2 1 3 仪器与设备 表1 出发菌株p 5 3 的性质研究设备表 t a b l e it h ee q u i p m e n t so fs t u d yo i lc h a r a c t e r so fp 5 3 吉林农业大学硕士学位论文 茁霉多糖生产菌的复合诱变筛选及发酵条件研究 电热恒温培养箱 电热恒温干燥箱 手提式压力蒸汽消毒锅 电热恒温水浴箱 水浴恒温振荡器 分光光度计 恒温水浴锅 p h 计 高速离心机 电子天平 电吹风 磁力搅拌器 超净工作台 层析缸 移液器 振荡式恒温培养箱 h g 3 0 3 型 南京实验仪器厂 1 g 2 0 2 型 南京实验仪器厂 y x q s g 4 1 2 8 0上海华线医用核子有限 公司 h w s y 北京市长风仪器仪表公 司 p s h z 一3 0 0 江苏太仓市实验设备厂 7 2 2 型山东高密分析仪器厂 h h s y l l 一n i 北京市长风仪器仪表公 司 p h s 一3 c 上海雷磁仪器厂 l g i o 一2 4 a 北京医用离心机厂 b s 一2 1 0 s 北京赛多利斯有限公司 r c t x t l 广州西特尔电吹风厂 8 5 2 型上海仪表集团供销公司 s w c j i f苏净集团安泰公司 自制 2 0 0 1 0 0 0 o 1 2 5 ul 荷兰进口 h z q f 1 6 0哈尔滨市东联机械厂 2 2 2 方法 2 2 2 1p h 值测定：用数字p h 计直接测定。 2 2 2 2 生物置测定：称重法。 发酵液经高温灭酶3 0 m jn 、冷却，8 0 0 0 r m i n 离心l o m i n ，取沉淀8 0 。c 干燥 至恒重。生物量( g l ) = 菌体干重发酵液。 2 2 2 3 多糖测定：称重法。 灭酶后的发酵液经离心，取上清液，加入2 倍体积的9 5 乙醇，4 。c 静置1 2 h ， 8 0 0 0 r m i n 离心1 5 m i n ，收集沉淀，将沉淀于1 0 5 。c 烘至恒重，精确称量。 2 2 2 4 色素测定：利用7 2 2 分光光度计测定提取多糖后的溶液中的色素。先以 空白调零，然后加溶液调节波长至最大透光率( 6 5 4 n m ) ，在用此波长测定各处理 吉林农业大学硕士学位论文茁霉多糖生产菌的复合诱变筛选及发酵条件研究 溶液的吸光值( o d 值) ，以吸光值表示色素含量。 2 2 2 5 菌株p 5 3 的形态观察哺：采用载玻片培养观察法。 2 3 结果与讨论 2 3 1 菌株p 5 3 的形态观察 出芽短梗霉是一种多形态真菌，俗称黑酵母。具有酵母样和真菌菌丝体两种 形态，常具有节孢子、厚垣孢子、芽生孢子、酵母样孢子。在p d a 平板和斜面上， 菌落最初为透明、无色，继续培养4 8 h 后菌落中间转变为淡绿色，最后变为完全 黑色。菌落表面湿润，有光泽，边缘为放射状菌丝。采用载玻片培养观察法对 p 5 3 进行形态观察发现：p 5 3 生长初期产生大量的透明菌丝体( 大约1 2 h 左右) 如图1 所示。透明的菌丝体进行芽殖，并伴有厚垣孢子的形成，p 5 3 的繁殖方式 类似于酵母的出芽生殖方式，如图2 、3 。继续生长的p 5 3 在透明菌丝体的周围 以及成熟的孢子周围产生大量的透明酵母样孢子，如图4 。酵母样孢子成熟后产 生黑色素，自身变为黑褐色如图5 。成熟的酵母样孢子在生长后期生成成熟的菌 丝体，颜色为黑色如图6 。成熟的孢子和成熟的菌丝体通过出芽生殖进入下一个 生长周期。 图1p 5 3 载片培养初期的显微镜照片 f i g 1e a r l i e rm i c r o g r a p hi np 5 3s l i d ec u l t u r e 吉林农业大学硕士学位论文 茁霉多糖生产菌的复合诱变筛选及发酵条件研究 图2p 5 3 的厚垣孢子及出芽生殖 f i g 2c h l a m y d o s p o r ea n db u d d i n gi np 5 3 图3p 5 3 的厚垣孢子及出芽生殖 f i g 3c h l a m y d o s p o r ea n db u d d i n gi np 5 3 吉林农业大学硕士学位论文 茁霉多糖生产菌的复合诱变筛选及发酵条件研究 图4p 5 3 产生的大量酵母样孢子 f i g 4y e a s t 一k es p o r ef r o mp 5 3 图5 成熟的酵母样孢子 f i g 5y e a s t 一1i k em a t u r es p o r e 吉林农业大学硕士学位论文 茁霉多糖生产菌的复合诱变筛选及发酵条件研究 图6 成熟的菌丝体 f i g 6m a t u r em y c e l i u m 2 3 2 出发菌株p 5 3 的发酵动态曲线”1 采用发酵培养基，发酵后每隔2 4 h 取出三瓶发酵液进行测量，主要检测p h 值、色素、多糖、生物量、糖转化率，结果见表2 。 表2 不同发酵时间的结果 t a b l e 2t h er e s u l t so ff e r m e n t a t i o ni nd i f f e r e n tl i m e m*m_”_“_hhm_h_”。 时间( d )p h 值 色素生物量( g l ) 粗多糖糖转化率 0 6 0 l2 5 2 3 0 33 2 43 2 ( o d 6 5 4 n m )( g l ) o 0 0 4 8 0 0 6 2 o 1 0 2 0 1 7 5 0 5 4 0 6 1 5 0 5 4 1 5 8 3 2 1 5 5 2 8 o 1 3 5 2 2 5 3 3 5 ( ) o 5 5 8 7 0 8 8 9 2 4 91 4 8 3 53 3 0 2 5 4t 5 1 0 2 5 4 51 5 7 5 一一 1 3 吉林农业大学硕士学位论文 茁霉多糖生产菌的复合诱变筛选及发酵条件研究 6 7 3 5 3 3 0 3 3 9 0 4 0 7 1 5 4 6 2 1 4 3 2 l 8 1 5 7 2 2 5 2 5 1 5 3 3 7 6 5 趔4 吾3 2 1 0 o 5 ，、0 4 重 基o 3 i n2 吕o 1 o 23456 时间( d ) 图7 不同发酵时间的p h 值变化曲线 f i g 7c u r v eo fp hv a l u ei nd i f f e r e n tf e r m e n t a t i o nt i m e 2 34 5 67 时间t i m e ( d ) 图8 不同发酵时间色素含最变化盐线 f i g 8c u r v eo fc o n t e n to fp i g m e n ti nd i f f e r e n tf e n m e n t a t i o nt i m e 1 4 吉林农业大学硕士学位论文茁霉多糖生产菌的复合诱变筛选及发酵条件研究 123456 7 时间t i m e ( d ) f 碉 l ! 匕塑圭蕉i 图9 不同发酵时间生物量和多糖产量的变化曲线 f i g 9c u r v eo fy i e l do fb i o m a s sa n dp o l y s a c c h a r i d ei nd i f f e r e n t f e r m e n t a t i o r lt i m e 从图7 结果可以看出，发酵液的p h 值在培养2 4 h 后迅速从6 0 降到4 0 ， 继续培养的发酵液的p h 值几乎不变。发酵液的颜色随着培养时间的延长，颜色 逐渐变深，从无色的培养基到微黄、黄再到最后的黑绿色如图8 。而从图9 中的 生物量和粗多糖的产量变化曲线可得知，出发菌株p 5 3 在4 8 h 之前为对数生长期， 其生长速度快。而4 8 h 之后该菌株进入生长的稳定期，生物量变化不大。到第七 天生物量有所下降，可能此时该菌株发生了自溶现象。粗多糖的产量随时间延长 而增加，在第六天达产量最大。从生物量与粗多糖的曲线中还可以发现多糖主要 在出发菌株p 5 3 的生长稳定期中产生，在生长稳定后期达粗多糖产量高峰。 因此，出发菌株p 5 3 的发酵状态曲线的研究表明：若p 5 3 的发酵以生产多糖 为目的，其发酵周期应选择6 d 。 8 6 4 2 o 8 6 4 2 o 暑)pi_!。如咖k 吉林农业大学硕士学位论文 茁霉多糖生产菌的复合诱变筛选及发酵条件研究 3 1 前言 第三章茁霉多糖的纯化 研究生物大分子的结构、组成和物理化学性质，需要纯的均一产物。因而， 将发酵产物进一步纯化处理是十分必要的。茁霉多糖是一种胞外多糖，可直接由 发酵液提取获得。茁霉多糖是微生物多糖中具有重要应用价值的一类多糖。在发 酵过程中，出芽短梗霉在合成胞外多糖的同时会产生黑色素、黄色、褐色、绿色、 和粉色等色素，污染多糖。目前采用多步活性炭脱色及过滤手段去除色素，造成 产品回收率大大降低。本课题所用的p 5 3 发酵得到的发酵液为土黄色至黑褐 色，黏度高并包含不同物质的混合物。经离心、多次沉淀分离、去蛋白、柱层析 可获得纯的均一产物一茁霉多糖“。 3 2 材料与方法 3 2 1 材料 3 2 1 1 菌种：原始菌种p 5 3 。 3 2 1 2 试剂 表3 茁霉多糖分离纯化试剂 t a b l e3 r e a g e n t so fp u l l u l a ni ni s o l a t i n ga n dp u r l l y i n g 厂。 3 2 1 3 设备 表4 茁霉多糖分离纯化设备 t a b l e4 e q u i p m e n to fp u l l u l a ni ni s o l a t i n ga n dp u r i f y i n g 一丝坌堂堂墓丝、 薄层层析板 高速台式离心机 些麴查坌堑堡矍 德国m e r c k 北京医用离心机厂 分析天平b s 一2 1 0 s 北京赛多利斯有限公司 螟迢查煎笾，凹：i 兰! ! ：盟i i ! 塞壹篓垦垡量垡塞垒望 吉林农业大学硕士学位论文 茁霉多糖生产菌的复合诱变筛选及发酵条件研究 透析袋 恒温磁力搅拌器8 5 2 层析柱 电热鼓风干燥箱 旋转蒸发仪 真空干燥箱z k 一8 2 b 型 红外光谱仪v e r t e x 7 0 型 北京鼎国生物公司 上海仪表( 集团) 供销公司 自制 上海实验仪器有限公司 上海亚荣生化仪器厂 上海市实验仪器总厂 德国布鲁克 3 2 2 方法 3 2 2 1 粗糖的制备 将本实验室保存的p 5 3 ，在含6 蔗糖，0 2 的蛋白胨，0 。0 4 ( n h 。) 。s o , 0 o i m g s o 。7 h 。0 ，0 2 k h ：p o 。，0 2 n a c l 的液体培养基中培养，以5 的接种 量将3 6 h 的一级种子接种到液体培养基中，装液量1 5 ，于2 8 。c ，1 8 0 r p m 发酵6 d ， 发酵液在8 0 0 0 r m i n 的转速下离心l o m i n ，去沉淀，上清液加入2 倍9 5 7 , 醇，搅 拌、放置过夜，使茁霉多糖充分沉淀沉淀液以8 0 0 0 r m i n 离心l o m i n ，得茁霉多 糖沉淀，沉淀依次用丙酮、乙醚洗涤，置于7 5 烘箱干燥至恒重，即得茁霉多糖 粗品。 3 2 2 2 多糖及蛋白质含量的测定 多糖含量测定苯酚一硫酸法 以葡萄糖为标准制作标准曲线，吸取样品液1 o m l ，然后加入6 苯酚1 o m l ， 浓h 。s 0 , 5 o m l ，摇匀静置l o m i n ，在2 5 - 3 0 。c 水浴中放置2 0 m i n ，于4 9 0 n m 波长处 测光吸收值。 多糖含量( g l ) = 葡萄糖浓度 样品稀释倍数木0 9 蛋白质含量测定考马斯亮兰法 以牛血清白蛋白为标准蛋白制作蛋白标准曲线，取样品液0 1 m l 加入考马斯 亮兰5 o m l ，摇匀，然后在5 9 5 n m 处比色。 3 2 2 3 茁霉多糖的纯化 s a v a g e 法“蜊将5 o g 茁霉多糖粗品稀释成5 的水溶液l o o m l ，加入等体积 氯仿正丁醇混合液( 体积比4 ：1 ) ，充分振荡后静置过夜，将有机相除去，重复 操作3 次。测定多糖液中蛋白质的含量。 透析经除蛋白处理的多糖液放入透析袋中，置于大烧杯中，放在恒温磁力 搅拌器上，透析2 4 h ，每4 h 换一次蒸馏水。 吉林农业大学硕士学位论文 茁霉多糖生产菌的复合诱叠筛选及发酵条件研究 沉淀分离利用旋转蒸发仪将得到的多糖液减压浓缩至原体积的一半，加入 2 倍体积9 5 z , 醇，充分搅拌，放置过夜，使茁霉多糖沉淀，沉淀液以8 0 0 0 r m i n 离 心l o m i n ，将沉淀用丙酮、乙醚依次洗涤。 d e a e 一纤维素柱层析经上述处理得到的多糖粉末1 9 溶于l o m l 蒸馏水中 ，进行d e a e 一纤维素柱层析( 3 3 c m x4 0 c m ) ，洗脱速度为2 5 m 1 h 。用蒸馏水洗脱， 分部收集( 每管5 m l ) ，用苯酚一硫酸法比色测定多糖含量，收集多糖峰，减压浓缩、 真空干燥制得纯化多糖。 阴、阳离子大孔树脂混合床将d 0 0 1 一c c 强酸大孔阳离子树脂和d 2 9 6 r 强 碱大孔阴离子树脂按照常规方法处理，阴、阳离子树脂以2 ：1 的比例混合装柱。 取1 0 多糖溶液l o m l 上样，洗脱速度为0 5 m l m i n ，用蒸馏水洗脱。分部收集( 每 管5 m l ) ，用苯酚一硫酸法比色 贝8 定多糖含量。 3 2 2 4 多糖的定性 薄层层析法“3 采用的是高效薄层层析板，展开剂为正丁醇：吡啶：水= 1 5 ： 5 ：3 ；显色剂为硫酸：甲醇= l ：4 ；点样量为1ul ； 将茁霉多糖标准品配成溶液与多糖样品溶液各0 1 m l ，加入0 7 m l 磷酸氢二 钠一柠檬酸缓冲液( p h 5 o ) ，再分别加入0 2 m l 普鲁兰酶( 1 u m 1 ) ，2 5 。c 酶解l o m i n 。 然后进行薄层层析定性。 红外光谱法“将茁霉多糖标品与p 5 3 的纯化产物在同样条件下用k b r 压 片法进行红外光谱检测。 3 2 3 结果与讨论 3 2 3 1s t l v s g o