（细胞生物学专业论文）类sorcin蛋白的表达、纯化、抗体制备及免疫组化研究.pdf

类s o r c i n 蛋白的表达、纯化、抗体制各及免疫组化分析 学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中除特别 加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其他同 志的研究成果对本人的启示和所提供的帮助。均己在论文中做了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者签名：孑k 荡诱 日 期：上。i 15 、爿 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权辽宁 师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名：张 绣 指导教师签名 日期 类s o r c i n 蛋白的表达、纯化、抗体制各及免疫组化分析 摘要 本实验从日本七鳃鳗( l a m p e t r aj a p o n i c a ) 口腔腺中调取出编码类s o r c i n 蛋 白的目的基因l 2 4 9 ，克隆到p e t 2 3 b 载体中后，对类s o r c i n 蛋白进行原核及真 核诱导表达，利用亲和层析进行蛋白纯化，以纯化后的类s o r c i n 蛋白作为抗原， 制备兔抗七鳃鳗多克隆抗体。用e l i s a 的方法测出效价后，应用该多克隆抗体， 在七鳃鳗的主要免疫器官中进行类s o r c i n 蛋白的免疫组化定位，以便研究免疫 器官的结构和类s o r c i n 蛋白的分布情况，为进一步研究免疫器官在类s o r c i n 蛋 白活性中的作用和应用类s o r c i n 蛋白研制药用新靶点奠定理论基础。 类s o r c i n 蛋白的诱导表达结果表明：类s o r c i n 蛋白在大肠杆菌b l 2 1 菌株 和r o s e t t a - b l 2 1 菌株中均为包涵体过表达形式。并且，类s o r c i n 蛋白在 r o s e t t a b l 2 1 菌株中的表达量要比在b l 2 1 菌株中大。另外，在酵母中尚未看 到类s o r c i n 蛋白的真核表达形式。 用b c a 法测定所得的诱导表达蛋白浓度的结果表明：纯化后的类s o r c i n 蛋 白的浓度可达到1 1 6m g m l 。用e l i s a 方法检测兔抗七鳃鳗多克隆抗体的结果 表明：所制备的抗体效价值比较高，可达到1 ：1 2 0 0 0 。用w e s t e r n b l o t 的方法 对类s o r c i n 蛋白进行定位分析的结果表明：从口腔腺中提取出的天然蛋白的条 带位置和纯化后的重组蛋白的位置并不完全一致。 对类s o l m 蛋白进行免疫组化研究的分析结果表明：日本七鳃鳗消化系统 组织形态结构特点与其特殊的进食方式和进化地位密切相关。类s o r c i n 蛋白在 日本七鳃鳗的肠、心脏、肝脏、生殖腺及口腔唾液腺等免疫器官中均有分布， 并且分布的表达量各不相同。其中在心脏中的分布量很丰富，这与s o r c i n 蛋白 的主要活性之一：影响心肌细胞的兴奋一收缩偶联是相关的。正常心肌细胞 中，s o r c i n 与细胞内钙释放通道r y r 能广泛协同定位，而在心肌病的心肌细胞 中，这种协同定位的能力被破坏。目前研究人员通过对心肌蛋白进行协同定位 和体外结合实验。已经明确s o r c i n 能够完全抑制心肌r y r s 通道的开放，并且这 种抑制作用会因p k a 催化亚单位磷酸化而减弱。因而，s o r c i n 通过激活钙离子 j t p 酶，恢复肌浆网中钙离子浓度，可能在维持钙离子动态平衡和调节心肌病 心肌功能紊乱中起着重要的代偿作用。 本实验为研究类s o r c i n 蛋白的细胞活性和蛋白功能奠定一定的理论基础。 关键词：日本七鳃鳗：类s o f f c i n 蛋白；诱导表达：抗体制备；免疫组化 4 类s o r c i n 蛋白的表达、纯化、抗体制备及免疫组化分析 a b s t r a c t w es e l e c t e dt h et a r g e tg e n el 2 4 9o f e n c o d i n gs o r c i np r o t e i nf r o mt h eo r a l # a n d o fl a m p e t r aj a p o n i c ac d n al i b r a r y , n e x tg e n el 2 4 9w a sc l o n e di n t op e t 2 3 ba n d e x p r e s s e di ne c o l ib l 2 1 ，r o s e t t ab l 2 1a n dy e a s t ，t h e ns o r c i np r o t e i nw a sg e n e m t e d a n dp u r i f i e d t h ep u r i f i e ds o r c i np r o t e i nw a su s e dt op r e p a r er a b b i t a n t i - z 鲫哗，曲诅 j a p o n i c ap o l y c l o n a la n t i b o d y a f t e ru s i n ge l i s at od e t e r m i n et h ep o t e n c y , t h e p o l y c l o n a la n t i b o d yo fr a b b i t - a n t i - l a m p e t r aj a p o n i c aw a su s e da sam a r k e rf o r i m m u n o h i s t o c h e m i c a ld e t e c t i o no ft h el o c a l i z a t i o no fo v e r e x p r e s s i o no fs o r c i ni nt h e m a i ni m m u n eo r g a n so fl a m p e t r a j a p o n i c a p r e f i m i n a r i l ya n a l y s e dt h em e c h a n i s mo f d r a gr e s i s t a n c e t h ee x p r e s s i o no fp r o t e i ns h o w e dt h a ts o r c i nw a so n l yo v e r e x p r e s s e di n e s c h e r i c h i ac o i lb l 2 1a n dr o s e t m - b 1 2 1a si n c l u s i o nb o d y i na d d i t i o n , t h ea m o u n t o fe x p r e s s i o ni nr o s e t t a b l 2 1w a sm u c ht h a ni nb l 2 1 f u r t h e r m o r e ，s o r c i nw a sn o t e x p r e s s e di ny e a s t t h ec o n c e n t r a t i o nd e t e r m i n e d b y b c aw a s1 1 6 m g m l t h ep o t e n c y d e t e r m i n e db ye l l s aw a s1 ：1 2 0 0 0 w e s t e r n b l o ta n a l y s i so fl a m p e t mj a p o n i c at i s s u e sw i t hs o r c i nr e v e a l e dt h a t t h e r ei sc l o s ec o r r e l a t i o nb e t w e e nt h ec h a r a c t e r i s t i co f h i s t o l o g ys t r u c t u r e o f d i g e s t i v es y s t e ma n dp a r t i c u l a rf e e d i n gb e h a v i o r m e a n w h i l e ，s o r c i nw a sp r e s e n ti na w i d ev a r i e t yo ft i s s u e s ，i n c l u d i n gi n t e s t i n e , h e a r t , l i v e r , g e r m e n , o r a lg l a n d , e s p e c i a l l yt h ea b u n d a n c eo ft h ec a r d i a cm y o c y t e s t h i sw a sr e l 砒i v ew i t hs o r c i nt h a t i tc o u l dm o d u l a t ee x c i t a t i o n - c o n t r a c t i o n c o u p l i n g i nt h eh e a r t i nn o r m a l m y o c a r d i u m ，s o r c i ne x t e n s i v e l yc o - l o c a l i z e dw i t hr y a n o d i n er e c e p t o r s ，w h e r e a si n m y o p a t h i ch e a r t s t h ed e g r e eo fc o l o c a l i z a t i o nw a sm a r k e d l yd i s r u p t e d s e v e r a l s t u d i e sh a v es h o w nt h a ts o r c i ni sa s s o c i a t i o nw i t ht h ec a r d i a cr y a n o d i n er e c e p t o r ( r y r ) d u r i n gt h ee co fm y o c a r d i a lc e l l s o u rr e s u l t ss u g g e s t e dt h a ts o r c i na c t i v a t e s c a 2 + - a t p a s e m e d i a t e dc a 2 + u p t a k ea n dr e s t o r e ss rc a 2 + c o n t e n t a n dm a yp l a y c r i t i c a lr o l e si nc o m p e n s a t o r ym e c h a n i s m si nb o t h c a “h o m e o s t a s i sa n dc a r d i a c d y s f u n c t i o ni nf a i l i n gh e a r t s t h er e s u l t sa r es i g n i f i c a n tt of u r t h e ru n d e r s t a n d i n gm u c hs o r c i n - i n v o l v e d b i o l o g i c a l l ye s s e n t i a la c t i v i t ya n dw i l lp a v et h ew a yf o rs t u d y i n gt h ef u n c t i o no f 5 类s o r c i n 蛋白的表达、纯化、抗体制备及免疫组化分析 s o r c i ra n da s s o c i a t e dp r o t e i n k e yw o r d s ：l a m p e t r a j a p o n i c a ；s o r c i n ；e x p r e s s i o n ；p r e p a r a t i o no fa n t i b o d y ； i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y 6 类s o r c i n 蛋白的表达、纯化、抗体制备及免疫组化分析 第一章综述 1 1 日本七鳃鳗 日本七鳃鳗( l a m p e t r aj a p o n i c a ) 系圆口纲( c y c p o s t o m a t a ) 、七鳃鳗目 ( p e t r o m y z o n i f o r l l m $ ) 、七鳃鳗科( p e t r o m y z o n t i d a e ) 、七鳃鳗属( l e t h e n t e r o n ) 动物，主要分布于太平洋北部，南至日本、朝鲜沿岸，北至阿纳德尔和阿拉斯 加。在我国主要分布于黑龙江、松花江、乌苏里江和图门江水系。1 ，是我国现 存唯一的海淡水洄游七鳃鳗。在海水中营半寄生生活，以吸食宿主血肉为食。 长久以来，七鳃鳗在进化上因连接着脊椎与无脊椎动物而具有极高的研究价值。 它不仅是研究脊椎动物起源与进化的关键物种，同时也是研究脊椎动物胚胎发 育、器官分化的最佳模型。由于七鳃鳗特殊的生态特性和进化地位，它在世界 动物学研究史上一直占据着重要地位0 1 。 1 1 1 日本七鳃鳗的特征简介 1 1 1 1 七鳃鳗的形态特征 图1 1 七鳃鳗形态图 七鳃鳗体呈长圆柱形，尾部侧扁。头的两侧各有眼一个，在眼睛之后有一行 7 个分离的鳃孔，鳃孔与眼睛排成一直行共8 个象眼睛的点，故通称八目鳗。 鼻孔单个，位于头背面两眼的中间；鼻孔后方有一个白色的能感光的松果眼。 头前腹面有一个呈漏斗状的口吸盘，张开时呈圆形，闭合时为纵裂缝状，口吸 类s o r c i n 蛋白的表达、纯化，抗体制备及免疫组化分析 盘的周缘的皱皮上有许多细软的乳状突起。口在漏斗的底部，口的两侧有许多 黄色角质齿，口内有肉质呈舌形的活塞，其上亦有角质齿。皮肤柔软光滑，无 鳞，皮内有很多腺体，分泌粘液使体表粘滑，侧线不发达。无胸鳍和腹鳍。背 鲳2 个，其长约相等，后面的背鳍与尾鳍相连，鳍条软而细密。全身的骨骼为 软骨和结缔组织，尚无硬骨。脊索终生保留，仍是身体的主要支持结构“1 。脊 索背面出现了一系列软骨弧片，代表着雏形脊椎骨的开始。生活时背呈青色带 绿，腹部灰白色略带淡黄，尾鳍及后背鳍的边缘黑色。 1 1 1 2 七鳃鳗的生活史 七鳃鳗为典型的洄游性鱼类，部分时期在海中生活。秋季由海进入江河， 在江河下游越冬，翌年5 - 6 月，当水温达1 5 左右时溯至上游繁殖“1 。七鳃鳗 选择水浅、流快、砂砾底的水域进行挖坑筑巢产卵，雄鱼以吸盘吸着雌鱼头部， 同时排卵、受精。卵极小，每次产卵8 - 1 0 万粒，卵粘在巢中砂砾上。产卵后亲 鱼全部死亡。卵孵化后不久即成为仔鳗。仔鳗营泥砂中生活，白天埋藏在泥砂 下边，夜晚出来摄食。此阶段的仔鱼与成鱼很不相象，口吸盘不发达，呈三角 形，称为沙隐幼鱼，过自由生活。七鲤鳗的寿命约为7 年，幼鱼在江河里生活 4 年后，第5 年变态下海，在海水中生活2 年后又溯江进行产卵洄游嘲。 1 1 1 3 七鳃鳗的食性 幽1 1 七鳃鳗捕食豳 类s o r c i n 蛋白的表达、纯化、抗体制备及免疫组化分析 七鳃鳗为肉食性鱼类。既营独立生活，又营寄生生活，经常用吸盘附在其 它鱼体上，用吸盘内和舌上的角质齿锉破鱼体，吸食其血与肉有时被吸食之 鱼最后只剩骨架。营独立生活时，则以浮游动物为食。仔鳗期以腐植碎片和丝 状藻类为食。生殖时期的成鱼停止摄食”1 。 1 1 2 七鳃鳗的研究价值 七鳃鳗是迄今所知最原始的无颌脊椎动物，自从七鳃鳗在3 5 0 0 万年前出现 以来，它的外观几乎没有发生变化”1 。七鳃鳗是颌口类脊椎动物的近亲，与颌 口类脊椎动物不同的是，它的体内缺乏活动的上下颌，终生保留脊索。无成形 的脊椎骨和成对的附肢等伽。但是，七鳃鳗与颌口类脊椎动物又存在着一些共 同的特征：如开始出现复杂的脑的分化，出现心脏及肝脏等由于七鳃鳗特 殊的进化地位和存在多个与颌口类脊椎动物相同的特征，因此，七鳃鳗长期以 来被认为是现存最古老脊椎动物的代表，难得的活化石“”。 七鳃鳗是联系无脊椎动物与脊椎动物之间的重要动物，从遗传信息基础来 说，它印记了无脊椎动物的进化历史，同时作为脊椎动物最直接的祖先，七鳃 鳗又为脊椎动物的起源与进化提供了丰富的遗传信息基础。因此，- 深入开展以 七鳃鳗为基础的遗传发育研究，对于理解和揭示脊椎动物的起源和进化具有重 要的意义。 在进化过程中，越高等的脊椎动物，脑的内部结构越复杂，内部区划越精 密“”，其神经连接方式也不相同。在七鳃鳗的进化中首次出现了脑的基本结构， 所以七鳃鳗脑的结构应该与脊椎动物祖先脑的基本结构相同，并且七鳃鳗脑的 结构能够反映脊椎动物脑的精细结构变化，这些变化都是建立在七鳃鳗脑的结 构之上的。所以，七鳃鳗无疑是研究脊椎动物脑的最有价值的材科。 综上所述，七鳃鳗作为了解脊椎动物身体结构进化和发育的模式动物，在 进化上因为连接着脊椎与无脊椎动物而具有极高的研究价值。它不仅是研究脊 椎动物起源与进化的关键物种，同时也是研究脊椎动物器官分化的最佳模型。 1 2 可溶性耐药相关钙结合蛋白( s o r c i n ) 1 9 8 1 年，m e y e r s 等首次从长春新碱诱导的中国仓鼠多药耐药细胞株 d c 3 f v c r d 5 中发现了一种高表达的胞浆蛋白“”，即可溶性耐药相关钙结合 蛋白s o r c i n ( s o l u b l er e s i s t a n c e r e l a t e dc a l c i u mb i n d i n gp r o t e i n ) 。进一步研究发现 s o r c i n 不仅出现在多药耐药( m u l t i d r u g r e s i s t a n c e ，m d r ) 细胞中，而且与p 一糖 蛋白( p g p ) 一样广泛地分布于正常组织中，如：心脏、肺、脾、骨骼肌、肝、 9 类s o r c i n 蛋白的表达、纯化、抗体制备及免疫组化分析 大脑、肾以及肾上腺髓质，其中在心肌组织中的含量颇为丰富。s o r c i n 在哺乳 动物正常组织分布具有高度保守性“”，而在原生生物、真菌、线虫、果蝇、植 物的组织中并没有发现s o r c i n 的存在“”。 1 2 1 s o r c i n 的结构特点 同钙调蛋白( c a l m o d u l i n ) 和钙激活蛋白酶( c a l p a i n ) 类似，s o r c i n 有4 个典型的“e f - h a n d ”结构的钙结合位点“”，其中两个钙结合位点可被c a m p 依赖的蛋白激酶i i 识别并被磷酸化“，因此s o r c i n 是一个大的磷酸化的钙结合 蛋白。 s o r c i n 是一种胞浆蛋白，在细胞核中也有少量存在，胞浆中的s o r c i n 紧密 粘附在游离核糖体、粗面内质网、线粒体、核膜和微管上“”。s o r c i n 可以平截 出其n 端的疏水残基，截短的s o r c i n ( t s o r c i n ) 包括所有的e f 手臂结合区域， 这一点已经在心肌组织中用w e s t e r n 的方法加以证实，但并不是在所有的组织 中都能用w e s t e r n 的方法检测到t - s o r c i n ，例如在脾和肺中，只能检测到全长的 s o r c i n 町n 町。 1 2 2s o r e i n 的生物学特性 1 2 2 1s o r c i n 与心肌r y r 位于肌浆网上的细胞内钙释放通道r y r ( r y a n o d i n er e c e p t o r ) 即里安娜碱 受体，是心肌兴奋收缩偶联过程中所涉及的一种主要钙离子通道，在肌细 胞及非肌细胞中调节细胞内自由钙离子浓度。r y r 可以和许多大分子复合物相 互作用，包括大量的调节蛋白，而这些调节蛋白又能够调节r v r 的功能，s o r c i n 即为其中之一的功能蛋白汹1 。正常心肌细胞中，s o r c i n 与r y r 能广泛协同定位， 而在心肌病的心肌细胞中，这种协同定位的能力被破坏o “。目前通过对心肌蛋 白进行协同定位和体外结合实验。已经明确s o r c i n 能够完全抑制心肌r y r s 通道 的开放，并且这种抑制作用会因p k a 催化亚单位磷酸化而减弱嘧1 。患心肌病的 仓鼠肌浆网中s o r c i n 的量明显增多，但在整个心脏的组织匀浆中明显减少，因 而，s o r c i n 通过激活钙离子一a t p 酶，恢复肌浆网中钙离子浓度，可能在维持钙 离子动态平衡和调节心肌病心肌功能紊乱中起着重要的代偿作用“1 。另有文 献报导1 ：s o r c i n 的过表达能提高心肌收缩而不受b 一肾上腺素刺激的影响，这 有益于治疗心输出量减少( 比如一些心脏疾病) ，也就是说明s o r c i n 在病理条件 下( 比如糖尿病心肌症) 可提高心肌收缩功能“”。 1 2 2 2s o r c i n 与多药耐药 1 0 类s o r c i n 蛋白的表达、纯化、抗体制备及免疫组化分析 近年来国内外学者对s o r c i n 进行了大量的m d r 相关研究，s o l t i n 能在5 0 以上多种药物筛选的m d r 细胞中大量表达“，把m d r 细胞在无药物的培养液 中长期培养，s o r c i n 的表达量和细胞的耐药性会逐渐下降，因此推测s o r c i n 可 能参与耐药表型的形成，但s o r c i n 的表达量与耐药倍数无关“”。 s o r c i n 与钙离子结合后能够改变信号传导途径，进而影响m d r 细胞的交 叉耐药及其他方面作用。同时也有研究者观察到表达s o r c i n 的m d r 细胞生长 速度明显减慢，因此推测s o l c i n 可能具有调节细胞生长与分化的作用，从而使 细胞逃避化疗药物的损伤。 1 2 3 小结与展望 综上所述：s o r c i n 能与骨骼肌及心肌组织的r y r 结合，通过对心肌蛋白进 行协同定位和体外结合实验，明确了s o r c i n 可以调节r y r 通道的开放状态田1 。 随着研究的深入，s o r c i n 在正常组织中的生理功能已逐渐明确，尤其是s o r c i n 在心肌组织中的作用机制对于研究s o r c i n 在m d r 细胞中的作用有着不可忽略 的作用汹1 。s o r c i n 作为一种钙结合蛋白，通过参与细胞钙水平的调节和p g p 的 磷酸化状态影响了p - g p 的功能，从而与m d r 细胞的多药耐药有关，但目前 s o r c i n 引发和维持细胞耐药的作用机制尚未完全明确，一旦s o r c i n 被证实与 m d r 细胞之间存在因果联系，可为克服肿瘤耐药提供新的作用靶点，并以此设 计新的耐药逆转剂和抗耐药新药，从而为肿瘤患者的治疗开辟一条新的途径。 同时对s o r c i n 的r y r 活性抑制作用进行深入研究，有望通过转基因技术治疗心 力衰竭。 类s o r c i n 蛋白的表达、纯化、抗体制备及免疫组化分析 第二章目的基因( l 2 4 9 ) 的克隆 2 1 材料和方法 2 1 1 材料 实验用日本七鳃鳗于1 2 月中下旬捕自黑龙江省松花江流域同江地区。 2 1 2 方法 对已建立的日本七鳃鳗口腔腺c d n a 文库中有效的e s t 序列进行分析，得到 一条能够翻译s o r c i n 模体的开放阅读框，按要求设计合成下列p c r 用引物： c t a 2 4 9f ：5 稍ta c g t a gc g ta t cc a g g c ta c g g a ca g - 3 c t a 2 4 9r ：5 一1 1 陷c g gc c gc g tg g tg g tg g tg g tg g tg g at g ct c at g gt g c a c tg g at - 3 从七鳃鳗口腔唾液腺中提取t o t a lr n a 。 使用t a k a r ar n al ap c r t mk i t ( a m v ) v e t 1 1 ( c o d en o d r r 0 1 2 a ) ， 以t o t a lr n a 为模板，以o l i g od t 为反转录引物，反转录合成c d n a 。 以c d n a 为模板，以c t a 2 4 9f ，c t a 2 4 9r 为引物，使用t a l a r al a t a g z u ( c o d en o d r r 0 2 a g ) p c r 扩增目的基因片断。p c r 产物使用t a k a r a a g a r o s e g e l d n a p u r i f i c a t i o n k i tv c r 2 0 ( c o d e n o d v 8 0 5 a ) 切胶回收，命名 为c t a 2 4 9 ( p ) ，溶于1 2 u ld h 2 0 中，取l u l 进行琼脂糖凝胶电泳。 使用t a k a r a d n a l i g a t i o n k i t ( c o d e n o d 6 0 2 2 ) 中的s o l u t j o n i ，将c t a 2 4 9 ( p ) 和p m d l 8 - ts i m p l e 载体连接后，热转化至e c o ec o m p e t e n tj m l 0 9c e u ( c o d en o 1 3 9 0 5 2 ) 中，涂布平板，过夜培养菌体。 挑选阳性菌落，提取质粒。取l u l 进行琼脂糖凝胶电泳。 将提取出的质粒用b c a b e s tp r i m e rm 1 3 - 4 7 引物进行d n a 测序。 将提取出的质粒和p e t 2 3 b 用n d el h i n d m 双酶切，并使用t a l ( a 勋a g a r o s e g e ld n ap u r i f i c a t i o nk i tv c l 2 0 ( c o d en o d v 8 0 5 a ) 切胶回收，命名为 i n s e r ti 和v e c t o ri ，取l u l 进行琼脂糖凝胶电泳。 使用t a k a r a d n a l i g a t i o nk i t ( c o d e n o d 6 0 2 2 ) 中的s o l u t i o ni ，将i n s e r ti 和v e c t o ri 连接，热转化至e c o f fc o m p e t e n tc e l ld h 5 a ( c o d en o d 9 0 5 7 ) 中， 涂布平板，过夜培养菌体。挑选菌落，提取质粒。取l u l 进行琼脂糖凝胶电 泳。 2 2 结果 2 2 1c t a 2 4 9 的p c r 扩增 1 2 类s o r c i n 蛋白的表达、纯化、抗体制备及免疫组化分析 一：蹦 i h r k e rn l 2 0 0 0 1 ：p c g 产物 2 2 2 重组质粒2 4 9 的p c r 鉴定 m ：删 h a r k e rd l 2 0 0 0 1 ：c t a 2 4 9 - 3 1p c r 产物 2 ： 2 4 9 - 3 1p c r 产物 3 ：c t a 2 4 9 - 3 1p c r 产物 4 ：c t a 2 4 3 lp 傀产物 2 2 3 测序结果 经宝生物公司测序后，符合要求，谓取的目的基因( l 2 4 9 ) ，成功克隆至 p e t 2 3 b 载体中。 ( 以上实验由t a r a k a 公司协助完成) 类s o r c i n 蛋白的表达、纯化、抗体制备及免疫组化分析 第三章类$ o g o i n 蛋白的诱导表达 3 1 材料和方法 3 1 1 材料 3 1 1 1 实验材料 b l 2 1 表达菌、d i i s a 克隆菌、r o s c t t a b l 2 1 表达菌、酵母表达菌、质粒、 p e l 2 3 b 。 ( 以上均由本实验室保存) 3 1 1 2 实验仪器 转移电泳仪：大连竞迈公司产品； 高速台式冷冻离心机：b i o f u g cs u a t o s ( h e r a c u s ) ； 离心机、摇床：江苏金坛仪器厂； p c r 仪：p e r k i ne l m e rc c t u s ； t a n o ng i s 1 0 0 0 凝胶成像系统； 紫外分光光度计：l l _ - 2 8 ，t o k y o j a p a n ； 细胞破碎仪：v c x 一1 3 0 ，u s a ； 空气浴恒温摇床：江苏太仓市实验设备厂t h z - c 型； h i s b i n dc o | u t a h 购于n o v a g e n 公司。 3 1 1 3 实验药品 i p t g 、低分子量蛋白m a r k e r 购于t a r a k a 公司； 质粒提取试剂盒购于t a r a k a 公司； b c a 蛋白浓度测定试剂盒购于碧云天生物技术研究所； b s a 购于s i g m a 公司： 咪唑购于北京经科宏达生物技术有限公司( 美国进口) ； n a c l 、d m s o 、t h s 、t w c c n 2 0 购于美国a m r e s c o 公司； 胰化蛋白胨购于b i o b a s i c l n c 公司； 酵母提取物购于o x i d 公司； 酵母氮源( 呵b ) 购于g i b c o 公司； 其它试剂均为国产分析纯试剂产品。 3 1 1 4 主要试剂的配制： l b 培养基：( l u r i a b e r t a n im e d i u m ) 1 0 0 m l 胰化蛋白胨( t r y p t o n e ) l g ； 1 4 类s o r c i n 蛋白的表达、纯化、抗体制备及免疫组化分析 酵母提取物( y e a s textract)059) n a c li g ； 加去离子水定容至 1 0 0 m l 。 琼脂培养基： 1 0 0 m l 胰化蛋白胨( t r y p t o n e ) i g ) 酵母提取物( y e a s te x t r a c t ) 0 5 9 = n a c l i g ) 琼脂粉i g = 加去离子水定容至 1 0 0 m l 。 w d 培养基：( y e a s te x t r a c tp e p t o n ed e x t r o s em e d i u m ) 酵母提取物( y e a s te x t r a c t ) 1 ； 蛋白胨( p e p t o n e ) 2 ； d _ 葡萄糖( d e x t r o s e ) 荔； 其余用去离子水补齐至总体系，若配制固体培养基，则另需加入 2 9 i 琼脂粉。 b m g y 培养基：( b u f f e r e dm e t h a n o l c o m p l e xm e d i u m ) 酵母粉1 ； 蛋白胨 嬲； 磷酸钾b u f f e r ( p h = 6 o ) 1 0 0 删= y n b1 。3 4 - b i o t i n 4 l o 、： 甘油1 ； 其余用去离子水补齐至总体系。 b m m y 培养基： 将b l i g y 培养液中的甘油换为o 5 的甲醇即为b m m y 培养液。 旧 酵母氮源1 3 4 9 ，用( n h | ) 。s o , 溶于1 0 0 0 m l 心o 中，过滤后4 保存。 b i o t i n ， 0 4 m g 生物素溶于1 0 0 0 m lh ：o 中，过滤后4 c 保存。 氨苄( a l i l p ) ： 称0 5 9a m p 溶于5 m l 去离子水中，分装后一2 0 保存。 类s o r c i n 蛋白的表达、纯化、抗体制备及免疫组化分析 i p r r g ( 终浓度l m m o l l ) ： 称2 5 9i p t g ，灭l o m l 去离子水，凉透后加入i p t g ，分装，一2 0 保存。 tae(5x)looml 。 t r i s2 4 2 9 ； 0 s m o l le f f r a ，p h ：8 0 l o o m l ； 冰醋酸 5 7 5 m l ； 蒸馏水定容至looml。 1 琼脂糖凝胶： 2 5 m l 称0 2 5 9 琼脂糖粉于2 5 m lt a e 中，混匀后放入微波炉中加热至透 明溶液后，稍凉时加入3 5 滴e b ，晃匀。 s o s - p a g e 电泳试剂配制： 3 0 凝胶缓冲液： looml 称2 9 9a c r ，l gb i o ，加热至6 0 x 2 后，溶于l o o m lh z o 中，存于棕 色瓶中，4 保存。 1暇sos：looml 称l o gs o s 溶于l o o m lh 2 0 中，常温放置。 1 0 9 6 过硫酸胺： 5 m l 称0 5 9 过硫酸胺溶于5 m lh 2 0 中，3 0 0 u l 分装，一2 0 x 2 保存 t r i s - 甘氨酸电泳缓冲液：l o o m l t r i s 1 f i g ； 甘氢酸 9 4 9 ； 1 0 s o s5 m l ； 去离子水定容至l o o m l 。 1 5 m o l lt r i s - h c l ，p h = 8 8 ：( 分离胶b u f f e r ) l o o m l 称1 8 1 7 1 9t r i s 溶于1 7 2 4 m lh c l 中，去离子水定容至i o o m l ，4 x 2 保存。 1 o m o l lt r i s h c l ，o h = 6 8 ：( 浓缩胶b u f f e r ) 1 0 0 吐 称1 2 1 1 4 9t r i s 溶于l o o m lh 2 0 中，用纯h c l 调p h = 6 8 ，4 x 2 保存。 2 l o a d i n db u f f e r ：4 保存 t r i s h c ld h = 6 81 o m l ； 1 6 类s o r c i n 蛋白的表达、纯化、抗体制各及免疫组化分析 1 0 0 甘油 1 0 s d s 2 一巯基乙醇 1 溴酚蓝 分子量m a r k e r ： 将粉末溶于2 0 0 u lh ：0 后，加2 0 0 u l 中5 m i n ，2 0 u l 分装，一2 0 1 2 冻存。 染色液： 0 2 5 9 考马斯亮蓝溶于4 5 m l 甲醇+ 脱色液： 甲醇 冰乙酸 h 2 0 1 0 s d s 分离胶： h 2 0 3 帆凝胶缓冲液 t r i s - h c l ，p h = 8 8 1 0 过硫酸胺 1 0 s d s t e m e d 1 5 s d s 分离胶： h , o 3 0 凝胶缓冲液 t r i s h c l p h = 8 8 1 0 过硫酸胺 1 0 s d s t e m e d s d s 浓缩胶： h , o 3 0 凝胶缓冲液 t r i s h c l ，d h = 8 8 1 7 0 8 m l ： 3 2 m l ： 0 4 m l ； 2 6 m l 。 2xl o a d i n db u f f e r ，1 0 0 水 1 0 0 l i l l 4 5 m lh 2 0 + l o m l 冰醋酸。 3 0 ： 1 0 9 ： 6 0 。 1 5 m l 5 9 m l ： 5 0 l ： 3 8 m l ； 1 5 0 u l ； 1 5 0 u l ； 2 0 u l 。 1 5 m l 3 4 m l ： 7 5 m l ： 3 8 m l ： 1 5 0 u l ； 1 5 0 u l ； 2 0 u l 。 l o m l 6 8 m l ； 1 7 m l ： 1 2 5 m l ： 类s o r c i n 蛋白的表达、纯化、抗体制备及免疫组化分析 1 0 过硫酸胺 1 0 s d s t e m e d 纯化过柱试剂： 8xb i n d i n gb u f f e r t i m i d a z o l e n a c l t r i s 2 n i c l 去离子水定容至 8 w a s hb u f f e r ： i m i d a z o l e n a c l t r i s 2 nh c l 一 去离子水定容至 4xe l u t eb u f f e r ： i m i d a z o l e n a c l t r i s 2 nh c l 去离子水定容至 3 1 2 方法 1 0 0 u l ： 1 0 0 u l ； 1 0 0 i l 0 2 7 9 ； 2 3 3 7 6 9 ； 1 9 3 8 9 ； 5 1 2 m l ； l o o m l 。 1 0 0 l l 3 2 6 7 9 ： 2 3 3 7 6 9 ； 1 9 3 8 9 ； 5 。1 2 m l ； 1 0 0 口也。 1 0 0 l 2 7 2 3 2 9 ； 1 1 6 6 8 9 ； 0 9 6 9 ； 2 5 6 m l ； l o o m l 。 从d i - l s a 中提取含有目的基因片断的质粒序列。( 采用t a l ( a r a 试剂盒) ( 1 ) 配l b 培养基5 0 m l 灭菌后待培养基凉至6 0 c 以下，加入3 0 u l 氨苄，使终 浓度为1 u g m l 。 ( 2 ) 加3 0 4 0 u l d h 5 a - 2 4 9 菌种于培养基中，在3 7 摇床中8 0 - 1 0 0 r p m ，过夜 培养。 ( 3 ) 取l m l 过夜培养菌液于1 5 m l 的离心管中，5 0 0 0 r p m ，离心5 m i n ，弃上清。 ( 连续重复此操作3 - 4 次，以多集菌体沉淀) ( 4 ) 用2 5 0 u l 的s o l u t i o ni 充分悬浮细菌沉淀。 类s o r c i n 蛋白的表达、纯化、抗体制备及免疫组化分析 ( 5 ) 加入2 5 0 u l 的s o l u t i o n ，轻轻地上下翻转混合5 - 6 次，使菌体充分裂解， 形成透明溶液。 ( 此步骤不宜超过5 m i n ) ( 6 ) 加入4 0 0 u l4 预冷的s o l u t i o nh i ，轻轻地上下翻转混合5 6 次，直至形成 坚实的凝集块，然后室温静置2 m i n 。 ( 7 ) 室温离心，1 2 0 0 0 r p m ，5 m i n ，取上清。 ( 8 ) 将试剂盒中的s p i nc o l u m n 置于c o l l e c t i o nt u b e 上。 ( 9 ) 将上述操作中( 7 ) 的上清液移至s p i nc o l u m n 中，1 2 0 0 0 r p m ，离心l m i n ，弃 滤液。 ( 如s p i nc o l u m n 中有液体残留，可适当提高离心速度，再离心l m i n ) 将5 0 0 l l l 的r i n s e a 加入s p i nc o l u m n 中，1 2 0 0 0 r p m ，离心3 0 s ，弃滤液。 o d 将7 0 0 u l 的r i n s eb 加入s p i nc o l u m n 中，1 2 0 0 0 i p m ，离心3 0 s ，弃滤液 凹重复步骤a d 。 凹将s p i nc o l u m n 安置于新的1 5 m l 的离心管上，在s p i nc o l u m n 膜的中央处 加入6 0 u l 的e l u t i o nb u f f e r ，- 室温静置l m i n 。 ( 将e l u t i o n i m f f c r 加热至6 0 使用时，有利于提高洗脱效率) 0 01 2 0 0 0 r p m ，离心l m i n ，洗脱d n a 。 制备感受态细胞。 ( 1 ) 将宿主菌b l 2 1 在琼脂培养基平板上四区划线，放在6 0 - 7 0 r p m 的摇床上， 3 7 过夜培养1 6 - 2 0 h ，以便复苏菌体。 ( 2 ) 从平板中选取出1 个2 - 3 m m 大小的单菌落，移至装有5 0 m ll b 培养基的 2 0 0 m l 的三角瓶中，在3 7 、1 2 0 r p m 的摇床中强烈振荡培养3 h ，使细菌浓 度达到5 x1 0 7 个c e l f m l ，用紫外分光光度计测o d 值，在o d 6 0 0 值达到对 数生长期( 0 4 - 0 6 ) 时从摇床中取出培养基。 ( 3 ) 将培养物于冰上放置1 0 r a i n ，然后转移到两个5 0 m l 的离心管中，4 0 0 0 r p l n ， 4 c 离心1 0 m i n 。 ( 使用s o v a i l g s3 0 转头) “) 弃上清，倒置离心管l m i n ，尽量流尽剩