临床研究方法课题申请书

扬 州 大 学大学生创新创业训练计划项目/学术科技创新基金项目申 报 表 推荐学院：扬州大学医学院 （盖章）项目名称：叶酸相关基因多态与唐氏综合征的关系的研究项目类别： 自然科学类学术论文 科技发明制作 社哲论文及调查报告 文史体艺设计等所属一级学科名称：基础医学项目负责人：秦佳睿联系电话导教师：武辉联系电话： 填表日期： 2016 年 12 月 5 日项目名称叶酸相关基因多态与唐氏综合征的关系的研究项目所属一级学科基础医学项目实施时间起始时间：2016 年12 月 完成时间：2017 年 6 月申请人或申请团队姓名年级学号所在院系/专业联系电话E-mail主持人秦佳睿大四132203118临床医成员于淼大四132303140临床医指 导 教 师第一指导教师姓名武辉单位扬州大学年龄53专业技术职务副教授主要成果 扬州大学医学院医学遗传学教研室主任、副教授。2000年华西医科大学研究生毕业，获博士学位。主要研究方向是人类基因组疾病的相关的基础研究。第二指导教师姓名单位年龄专业技术职务主要成果一、申请理由1、成员为大四学生，已经学习过医学遗传学学科，已掌握基本的实验技术与方法，具备基本的实验素养，能比较独立地完成科研项目。2、小组成员热爱探索，坚持不懈，思考灵活，不怕困难，在知识和挑战面前永不退缩，能够很好得完成课题研究。3、组员对遗传学以及21三体综合征有着浓厚的兴趣，并希望在此方面有自己的研究历程和成果，为以后走向临床积累经验。二、项目方案1、项目研究背景、研究现状及研究意义 James【1】等提出，叶酸代谢障碍和DNA低甲基化可能增加染色体减数分裂不分离的风险，并经初步研究证实出生过DS患儿的母亲有不正常的叶酸代谢与DNA低甲基化，其血浆中有轻度升高的HCY水平和MTHFR基因677位点的CG多态。Rosenblatt【2】等的研究也表明，叶酸与HCY代谢障碍及相关基因多态和DS的发生有关。Hobbs【3】等报道蛋氨酸合成酶还原酶基因A66G多态也可能与DS发生有关，同时有MTHFR和MTRR纯合变异的母亲分娩DS患儿危险性增加了4.08倍，因此MTRR市目前发现的叶酸代谢途径中第二个与DS有关的基因。Hassold【4】等研究表明MTHFR与MTRR多态，除与DS发生有关外，也与18三体相关，而与其他的染色体三体的发生无明显相关性。近年对MTHFR基因相关的多态性研究，除677C/T多态外，发现另外5个有关位点的多态分别为1298A/C、1084C/T、1711C/T、983A/G、1027T/G，但这些位点的多态与DS发生关系的研究未见文献报道。由于上述基因多态的分布在种族、地域中变异频率差异较大【5-6】，且与DS发生相关性的研究在不同种族中报道也有差异【7】。本研究选择分娩过DS患儿的母亲，对其进行MTHFR两个位点677和1298与MTRR基因66位点多态性分析，与相应对照组进行比较，以了解中国汉族女性中上述MTHFR基因及MTRR基因多态与DS发生的关系，即可能对染色体减数分裂不分离的影响，同时选择通过传统的二联筛查，筛查出DS高危孕妇与相应对照组的孕妇进行MTHFR基因677位点基因型的分析，为今后对育龄妇女进行孕前叶酸代谢相关基因多态性筛查及DS综合征的叶酸预防提供依据。参考文献【1】James SJ,Pogribna M,Pogribny IP, et al. Abnormol folate metabolism and mutation in the methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene may be maternal risk factors for Down syndrome J. Am J Clin Nutr,1999,70(4):495-501.【2】RosenblattDS.Folate and homocysteine and gene polymorphisms in the etiology of Down syndromeJ. Am J Clin Nutr,1999,70(4):429-430.【3】Hobbs CA, Sherman SL,YI P,et al.Polymorphisms in genes involved in folate metabolism as maternal risk factors for Down syndromeJ.Am J Hum Genet,2000,67(3):623-630.【4】Terry J,Hassold,Lindsay C,et al.Maternal folate polymorphisms and the etiology of human nondisjunctionJ.Am J Hum Genet,2001,69:434-439.【5】Lorenzo D,Botto LD,Yang Q. 5,10-methylenetetrahydrofolate Reductase Gene Variants and Congenitial Anomalies: A Huge ReviewJ. Am J Epidemiol,2000,151(9):862-877.【6】Rady PL, Szucs S,Grady J,et al.Genetic polymorphisms of methylenetetrahydrofolate reductase and methionine synthase reductase in ehhnic populations in Texas:a report of a novel MTHFR polymorphic site,G179AJ. Am J Med Genet.2002,107(2):162-168.【7】Chango A,Fillon-Emerry N,Micher C,et al.No asssociaion between common polymorphisms in genes of folate and homocysteine metabolism and the risk of Downs syndrome among French mothersJ.Br J Nutr,2005,94(2):166-169.2、项目研究目标、研究内容和拟解决的问题研究目标： 酸代谢中的关键性酶：亚甲基四氢叶酸还原(Methylenetetrahydrofolate reductase)基因677C/T、1298A/C及蛋氨酸合成酶还原酶(Methionine Synthase Reductase，MTRR)基因66A/G的遗传多态性是否与唐氏综合征(Down syndrome，DS)的发生相关。研究内容： 100例生育过DS患儿的汉族母亲为病例1组，100例相匹配的汉族母亲为对照1组，使用PCR-RFLP和MGB-Taqman实时PCR方法检测MTHFR 677，MTHFR 1298，MTRR 66的基因型，化学发光法检测血浆中同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)的水平。选择100例通过二联筛查（检测孕妇血清中的甲胎蛋白和人绒毛膜促性腺亚基作为DS筛查的指标）筛查出的DS高危孕妇为病例2组，100例正常的单胎孕妇为对照2组，进行MTHFR677基因检测，以提高筛查实验的特异性和灵敏性。拟解决的问题: 1、MTHFR 677C/T、MTHFR 1298A/C、MTRR 66A/G的多态是否可以增加生育DS患儿的风险。 2、DS发生是否存在基因间的协同作用。 3、HCY的代谢异常是否可以显著增高生育DS患儿的风险。 4、结合叶酸/HCY代谢相关基因多态性的检测和二联筛查，能否提高产前筛查试验的灵敏性和特异性。3、项目创新特色概述传统的TaqMan荧光探针是在扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和淬灭荧光基团。本实验采用的荧光探针是一种新型TaqMan-MGB探针，与传统的TaqMan探针相比，有以下优势：（1）可以使探针的长度缩短，尤其对AT含量高的序列的MGB探针的设计有很大的帮助。（2）提高配对与非配对模板间的Tm值差异。（3）由于在探针的3端的Quencher基团为不发光的荧光基团，并且与Report基团在空间的位置更接近，使杂交的稳定性大大提高，实验的结果更精确，分辨率越高。（4）新探针实验优化步骤简单，杂交的稳定性大大提高，重复性大大提高。TaqMan-MGB探针具有荧光背景低、分辨率更高、杂交特异性更强、探针比通常的探针更短一些，对单个碱基错配更敏感等优点，而且单管操作的方法免除了PCR反应后的样本处理以及可能的残留物污染，并且具有高通量检测的特征，已成为目前国际上公认的核酸分子定性，定量的检测方法。本研究中对于MTHFR677位点采用了传统的PCR-RFLP分析结合DNA测序，对MTHFR1298和MTRR66位点采用了TaqMan-MGB探针检测。前者费时费力，易污染；后者具有快速、准确、能够避免污染等优点，是检测已知点突变的良好技术平台，应应用于临床，更适合大规模人群的筛查。4、研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析研究方法：通过对100例生育过游离型DS患儿的汉族母亲及100例相匹配的正常对照组母亲，检测MTHFR 677CT，MTHFR 1298AC，MTRR 66AG的基因型和血浆中HCY的水平以及通过HCG与AFP二联查出的100例筛查单胎孕妇及相匹配的正常对照组孕妇进行MTHFR 677基因型检测。实验步骤：（1）人全血DNA快速提取（参照大量血液基因组DNA抽取试剂盒说明书）。（2）MTFHR基因677位点多态性分析。（3）MTHFR基因1298位点多态性分析。（4）MTRR基因66位点多态分析采用MGB-TaqMan实时PCR检测法。实时定PCR分析使用ABI 9700型PCR仪和ABI 7900型荧光定量PCR仪。（5）血浆HCY浓度测定。（6）用MTT（四甲基偶氮唑盐）检测法进行MTX细胞毒实验。（7）统计学处理可行性分析：（1）叶酸与HCY代谢障碍及相关基因多态和DS的发生有关这一假设已相继在