（遗传学专业论文）生物转化法生产天然手性γ癸内酯.pdf

内容摘要 y 一癸内酯具有桃子的香气，存在于多种食品中，是香精香料行业广泛应用的 种香原料。过去，y 癸内酯主要是从水果中提取或是化学合成的，随着消费者 对天然产品需求的上升，研究人员开始使用生物技术制取y 一癸内酯的方法。 微生物法是生产较安全的、高生物活性的香味化合物及其复合物最有前途的 方法。有许多专利和文献报道关于微生物法合成y 癸内酯的工艺，使用如 $ o r i d i o b o u sr u i n e n i i 、印o r i d i o b o l u ss a j m o n i c o l o r 、y a r r o w i a i p o l y t i c a 、 s p o r o b o l o m y c e so d o r u s 等菌种，均能利用蓖麻油、蓖麻油酸或蓖麻油酸甲酯生 产t 一癸内酯。由于微生物法生产的t 癸内酯大多具有旋光活性，在香料行业有 特殊的用途，本研究选择了采用微生物转化法生产t 癸内酯的路径。 本研究的工作包括： 1 对文献报道的产内酯菌株进行了筛选，得到_ 株较为适宜的菌株 y a r r o w i a1 0 1 ，t i c aa s 2 1 4 0 5 作为出发菌株，并确定了初筛培养基 配方和条件，初始摇瓶平均产量为0 6g l 。 2 y a r r o w l al o 抄t i c aa s 2 1 4 0 5 连续经过紫外诱变、n t g 诱变、d e s 诱 变和钴6 0 诱变，最终筛选得到一株高产内酯菌种1 6 7 “，摇瓶平均产量 为1 4g l ，遗传稳定性良好。 3 对培养基配方中的碳、氮源以及一些维生素和无机盐离子浓度进行了优 化试验。经过培养基配方优化，确定了最优组合配方。其工艺条件经优 选为：装液量5 0m l 5 0 0m l ，p h6 5 ，培养温度2 8 ，摇床转速2 0 0 r p m ，发酵4 8 小时，癸内酯平均产量2 0 4g l 。 4 研究了y 癸内酯及其相应羟基酸一4 一羟基癸酸( 4 - h y d r o $ y d e c a n o i c a c i d ，m ) 对y a r r o w i al y p o l y t i 菌株生长的影响，8 0m g l 的癸内酯 就已对菌体生长产生了强烈的抑制作用，癸内酯浓度达到2 0 0m g l 以 上时，菌体完全不生长，说明癸内酯对y a r r o w i al y p o 口t i c a 菌体细胞 有较强的毒性。羟基酸浓度低于2 0 0m g l b 寸基本不影响菌体的生长， 羟基酸浓度达到4 0 01 1 1 9 l 时才开始对菌体生长出现抑制。比较7 癸内 酯和4 一羟基癸酸对菌体最太生长速率的影响可以看出4 羟基癸酸对 y a r r o w i az y p o j y f ，菌株的生长电有一定的影响，但毒性相对于铲癸 内酯要小得多。因此在发酵生产y 癸内酯的过程中，应尽量控制产物以 羟基酸的形式存在，以减小产物对细胞的抑制。 5 经过摇瓶发酵条件的优化后，利用5l 和5 0l 自控发酵罐进行放大试 验。试验表明溶氧、转速以及蓖麻油的添加方式对于发酵产率有较大的 影响。在适宜的溶氧和转速的条件下，在发酵初期种子生长阶段不添加 蓖麻油或添加少量蓖麻油进行诱导，种子生长旺盛后再加入大量蓖麻油 进行转化，癸内酯产量达到3 2g l 以上，有效提高了蓖麻油的转化 率，癸内酯产量比原始出发菌种提高了5 倍。 6 对发酵液后处理进行了摸索，确定了后处理工艺：发酵结束后发酵液经 酸化、加热、离心、有机溶剂萃取、溶剂回收、粗馏、精馏等一系列操 作最终得到y 癸内酯产品，并确定了各操作单元的工艺参数。最终产品 纯度：9 8 3 ，旋光度a 1 ：+ 3 8 1 2 度( 理论值为+ 4 8 5 度) ，对映体 过量率( e e ) ；9 3 4 2 ，产品质量指标达到国际水平。 由于粗馏和精馏过程温度较高，时间较长，终产品中易混有焦糊昧，因 此探索了利用超临界二氧化碳萃取来替代高温减压蒸馏过程。试验结果 表明超临界二氧化碳萃取和分馏过程联用，对癸内酯进行粗提，可以取 得较好效果。 7 在5 0l 自控罐的试验数据基础上进行了1 吨罐的线性放大设计，完成 了对年产1 0 0 公斤y 癸内酯产品的扩大初步设计，进行了生产成本核 算、设备选型和设备设计。 关键词：天然丫一癸内酯，y a r r o w i a i p o l i t i c a 菌株，蓖麻油，旋光，扩大初 步设计 a b s t r a e t g a m m a - d e c a l a c t o n ec o u l db ei s o l a t e df r o mf r u i t s ，m e a t sa n dd a i r yp r o d u c t sa n db e c o m m o n l yu s e di n t h ef l a v o u r i n d u s t r y b e c a u s eo fi t s s t r o n gp e a c ho d o u r p r e v i o u s l y , i tw a sd i r e c t l yo b t a i n e df r o mf r u i t se x t r a c t i o no rb yc h e m i c a ls y n t h e s i s ， h o w e v e ri n c r e a s i n gd e m a n df o rn a t u r a lf l a v o u rc o m p o u n d sh a se n c o u r a g e dt h e s c i e n t i s t st os t u d ya n dp r o d u c et h en a t u r a l7 - d e c a l a t o n eb yam i c r o b i a lp r o c e s s ac o m p a r i s o no fs e v e nm i c r o b i o s t r a i n sw i t hr e s p e c tt ot h e i ra b i l i t yt op r o d u c e l a c t o n ef r o mc a s t o ro i ll e d t ot h es e l e c t i o no f o n es t r a i n ，y a r r o w i al i p o i y t i c aa s 2 1 4 0 5 a sas t a r t i n gs t r a i n a n da l s o ，ao p t i m u mp r o c e s sw a so b t a i n e ds u c ha sf e r m e n t a t i o n c u l t u r ea n df e r m e n t a t i o nt e c h n o l o g yp a r a m e t e r s t h ey i e l do f t d e c a l a c t o n ew a s0 6 e e lu n d e rt h ea b o v ec o n d i t i o n s t h eo r i g i n a ls t r a i nw a sm u t a n t e db yu l t r a v i o l e t ( u v b ) ，n t g , d e sa n dc 0 6 0 s u c c e s s i v e l y , a n dt h e nan e wi n d u s t r i a ls t r a i n1 6 7 4w h i c hc o u l dp r o d u c e1 4 lo f 7 - d e c a l a c t o n ew a so p t i m i z e d t h ef i n a lo p t i m i z e ds t r a i nw a su s e di nm yf e r m e n t a t i o n t h ep r o c e s sc o n d i t i o n s w a sc o n f i r m e da s ：5 0m lm e d i u mw a sc u l t i v e di n5 0 0m lf l a s ka t2 8 o nar o t a r y s h a k e r ( 2 0 0r p m ) f o r4 8h o u r s t h ea c c u m u l a t i o no f t - d e c a l 4 c t o n ew a s2 0 4g 凡 t h et o x i c i t yo ft d e c a l a c t o n ea n d4 - h y d r o x y d e c a n o i ca c i dt oy a r r o w i al i p o l y t i c aw a s c o m p a r e di nm yl a b o r a t o r y t h et o x i c i t yo f8 0m g ，lo ft d e c a l a c t o n ew a ss t r o n g e r t h a n4 0 0m g lo f4 - h y d r o x y d e c a n o i ca c i d ，i n d i c a t i n gt h a t4 - h y d r o x y d e c a n o i ca c i d w a sm u c hl e s st o x i ct oy a r r o w i al y p o l i t i c at h a nt - d e c a l a c t o n e t h et o x i c i t yo f y - d e c a l a c t o n ew a sc o n s i d e r e da so n co f m a i nd r a w b a c k sf o ri n d u s t r i a l i z a t i o n i nt h e s y s t e m ，p hs h o u l db ek e p ti nac e r t a i nd o m a i nt oa v o i d4 - h y d r o x y d e c a n o i ca c i d t u r nt o7 - d e c a l a c t o n ew h i c hw a sf a rm o r et o x i ct h a na b o v ed u r i n gf e r m e n t a t i o n t h e5la n d5 0lo fa u t o c o n t r o l l e df e r m e n t o r sw e r eu s e di nt h ea m p l i f i e d e x p e r i m e n t s i tw a sf o u n dt h a tt h et i m ep o i n to ff e e d i n gc a s t o ro i la n da l s op hw e r e p r o v e dt ob eag r e a te f f e c tt ot h et r a n s f o r m a t i o nf r o mr i c i n o l e i ca c i dt ot - d e c a l a c t o n e t h r o u g ht h ef c r r n c n t a t i o n g a m m a - d e c a t a c t o n ec o u l dl i t t l eb ca c c u m u l a t e ds i n c et h e s t r a i nn o to n l yp r o d u c e d7 - d e c a l a c t o n eb u ta l s oc o n s u n - l ei ta sn u t r i t i o na tt h es a m e t i m e t h et d e c a l a c t o n ey i e l dw a s3 2g lf i n a l l y , _ 5f o l do f t h es t a r t i n gs t r a i n a f t e rf e r m e n t a t i o n ，t h eb r o t hw a st r e a t e db yas e r i e so fp r o c e s s ：a c i d i z a t i o n ，h e m i n g ， c e n t r i f u g a t i o n ，e x t r a c t i o na n dd i s t i l l a t i o n t h ec h e m i c a lp u r i t yo f f i n a lp r o d u c tw a s 9 8 3 ( g c ) ，r o t a t i o nw a s + 3 8 1 2 ( t h e o r e t i c a lv a l u e + 4 8 5 ) ，e n a n t i o m e r i c c x c e s s ( e e ) w a s9 3 、4 2 a d e s i g no fm a n u f a c t u r eo f10 0k g y e a ro fy - d e c a l a c t o n ew a sd o n eb a s e do nt h e p a r a m e t e r so f5 0lo ff e r m e n t o r t h ef e r m e n t a t i o n w a so p e r a t e db yb a t c h w i s ew i t h 4 3h o u r so ff e r m e n t a t i o n i tt o o k3 0h o u r st ot r e a tt h er e s u l t a n tc u l t u r eb r o t h t h e c o s t o f1k go f 7 一d e c a l a c t o n ew a sa r o u n d4 , 0 2 4y u a n ( r m b ) k e y w o r d s ：n a t u r a lg a m m a - d e c a l a c t o n e ，y a r r o w i al i p o l y t i c a ，c a s t o ro i l ，r o t a t o r y a m p l i f i e dd e s i g n 图目录 第一部分 r 、s - 异构体结构示意图2 蓖麻油酸转化成t 一癸内酯示意图4 4 - 羟基癸酸转化为3 一癸烯4 一内酯和2 癸烯4 内酯5 乙酸丁酯萃取y 癸内酯标准曲线1 0 摇床转速对菌体生长的影响1 1 装液量对菌体生长的影响1 2 蓖麻油浓度对t 癸内酯发酵产率的影响1 3 玉米浆浓度对丫- 癸内酯发酵产率的影响1 3 葡萄耱浓度对y 癸内酯发酵产率的影响1 4 橄榄油对内酯产量的影响j 1 5 不同无机氮源对菌体生长的影响2 3 v b 2 添加量对g d l 发酵产率的影响2 5 不同浓度y - 癸内酯对y a r r o w i a l i p o l y t i c a 菌株生长的影响3 0 不同浓度4 一羟基癸酸对y a r r o w & l i p o l y t i c a 菌株生长的影响3 0 种子生长曲线3 3 5l 自控罐发酵曲线图a 一3 4 5l 自控罐发酵曲线图b 3 5 5l 自控罐发酵曲线图c 3 5 5l 自控罐发酵曲线图d 1 3 6 5 0l 白控罐发酵曲线图a - 3 7 5 0l 自控罐发酵曲线图b 3 7 5 0l 自控罐发酵曲线圈c 3 8 5 0l 自控罐发酵曲线图d 3 9 3 5l 发酵液的后处理工艺流程图4 4 发酵产物的g c m s 图谱4 4 精馏产品的手性色谱分析图谱4 6 超临界二氧化碳萃取流程图4 7 超临界二氧化碳萃取和分馏过程耦合流程图4 8 图1 菌种诱变方法 图2 工艺流程幽 图31 吨发酵罐示意图 图4 离心机示意图 图5 萃取塔年n 回收装置示意图 图6 粗馏塔示意幽 幽7 精馏塔示意图 图8 萃取塔尺寸示意图 幽9i 号冷凝器示意图 第二部分 m川心粥埘撕撕纠牝“钾川他粥图图图圈图图图图图图图图图图图图图图图图图图图图图图图图 弼舶邡劢垃砸船m拍 】号冷凝器的列管示意图 2 号冷凝器示意图 2 号冷凝器的列管示意图 3 号冷凝器示意图 3 号冷凝器列管示意图 4 号冷凝器示意图 4 号冷凝器的列管示意图 o 0 0m 车间平面布置图 7 7 7 8 7 9 7 9 8 1 引 8 3 8 4 0 2 3 4 5 6 7 图图图图图图图图 表目录 第一部分 表1 - 1t 癸内酯的理化性质 表2 1 各菌种产y 。癸内酯实验结果比较， 表2 - 2 表面活性剂对g d l 发酵产率的影响 表2 - 3 蓖麻油预水解物添加试验， 表3 - 16 2 3 4 传代稳定性实验结果 表3 - 2c 9 传代稳定性实验结果 表3 3d e s 浓度与致死率的关系 表3 - 4s 1 5 传代稳定性实验结果 表3 - 5 钴6 0 剂与致死率的关系 表3 - 6a s 2 1 4 0 5 诱变图谱 表3 7 】6 7 4 的稳定性试验 表4 - 1 培养基配方正交试验的因素水平表 表4 - 2 蓖麻油和表面活性剂浓度试验的因素水平表 表4 3 无机盐配方正交试验的因素水平表， 表4 - 4 添加不同无机氮源对g d l 发酵产率的影响 表4 5 培养基配方正交试验结果的分析 表4 - 6 蓖麻油和表面活性剂浓度试验结果分析 表4 7 无机盐配方的正交结果分析 表4 - 81 6 7 4 追加试验 表5 - 11 ，癸内酯和4 羟基癸酸对菌体最大生长速率的影响 表7 1 不同有机溶剂的萃取效果比较 表7 - 2 二氯甲烷萃取比例对内酯提取的影响 表7 3 酸化和加热对内酯提取率的影响 表7 - 4 盐析对离心效果的影响 表7 - 5 发酵液中主要成分的含量和性质 表7 - 6 产品检测指标 第二部分 表1 缩写符号一览表 表2 发酵前进入物料 表3 发酵后流出物料 表4 发酵单元的成本核算 表5 絮凝前进入物料 表6 离心后流出物料 表7 发酵液后处理单元的成本核算 表8 苇取前进入物料 表9 溶剂同收后流出物料 表i o 萃取和回收单元的成本核算 表1 l 粗馏前进入物料 表1 2 粗馏后流出物料 。川川川棚棚棚棚呈棚棚忽拢忽m埘捌脚脚埘垅棚棚棚m舶 弘卯弛引配以舛酷：合 表j 3 届界常数基团贡献参数 表1 4 粗馏单元的成本核算 表1 5 精馏前进入物料 表1 6 精馏后流出物料 表1 7 精馏单元的原料和动力成本核算 表1 8 生产l k g 丙位癸内酯的成本核算 表1 9 主要技术经济指标表 表2 0 设备一览表 表2 1 1 号冷凝器设计计算步骤 表2 22 号冷凝器设计计算步骤 表2 33 号冷凝器设计计算步骤 表2 44 号冷凝器设计计算步骤 表2 5 所需仪表一览表 稻酊勰能w记弛娩嘶 第一部分生物转化法生产天然手性r 癸内酯 1 绪论 1 1 研究背景 1 1 1 生物技术在香料合成中的应用 香料可分为天然香料、天然等同香料和人造香料三种。长期以来，动植物是天然香料 的主要来源；然而，其中有效成分通常含量甚微，或以结合态存在，一方面给分离带来了 困难，另一方面，随着人们对于天然香料物质的需求不断增加，导致天然资源的严重短缺。 由于昂贵的天然香料已无法满足需求，合成香料便应运而生了；合成香料工业是从1 9 世纪7 0 年代起始的至今已有1 0 0 多年历史。目前在所生产的香味化合物中，8 4 的产 品由化学合成法生产【l j ，但较之天然产品，在使用安全性、旋光活性、香气品质方面都有较 大的差距，且合成产品多为消旋混合物，易造成香味的改变。 近年来，人们发现以石油化工产品为主要原料的合成香料含有毒性，甚至有致癌成分， 这造成人们对化学合成的添加剂用于食品、化妆品和其他日用产品日益反感。当今世界潮 流的返璞归真趋势，使天然香料产品更多地被采用。天然香料和合成香料的价格差别是非 常大的，如合成的香兰素价格1 2 美元k g 而从香豆荚中提取的香兰素价格4 0 0 0 美元k g j ， 价格上的巨大差异刺激研究人员开始寻找其他生产天然香料的方法。 美国联邦法规对天然风味物质作了如下描述p j ： 香精油、含油树脂、香精或其提取物、蛋白质水解物、蒸馏物或任何经焙烤、加 热和酶水解的产品为天然风味物质。这些产品来源于含有风味成分的香料、果汁、蔬菜或 蔬菜汁、食用酵母、香草、叶芽、树皮、根、叶或类似的植物原料、肉、海味、家禽、蛋、 乳制品或发酵产品等。在食品中，这些产品的主要功能是作为调味剂而不是作为营养物( 联 邦法规，2 1 c f r l 0 1 2 2 a 3 ) 。 这个定义，包含了活细胞及其发酵产品，也就是说微生物或植物细胞合成的风味物质 可认为是天然风味物质。 进入2 0 世纪以来，生产风味化合物的主要研制方向就是利用生物技术；即通过植物组 织细胞培养、微生物发酵或酶来完成生物合成过程n “。风味物质的生物合成主要有两条途 径 3 1 ：一是利用适当的前体物通过酶进行生物转化，酶可以是从微生物或其他生物中提取的 纯酶，也可以利用微生物培养过程中分泌到培养基中的混合酶，通过酶转化可将低附加值 的前体物转化成具有高附加值的目的产物：二是从简单、便宜的营养物质开始，如葡萄糖 和氨基酸等，经微生物发酵生产出目的风味物质。 微生物发酵或转化技术生产风味物质，克服了长期以来植物作为天然风味物质唯一来 源而存在的有效成分含量低，分离困难，受气候和植物病害影响等缺陷。随着生物技术的 不断发展，微生物基因工程和植物基因【程技术在风味物质的合成方面表现出很大的潜力。 尽管已有许多微生物生产香味化合物的报道，但能达到j ：业化应用的还很有限。通常 发酵液中香味化合物的浓度很低，许多香味物质的挥发性和较低的水溶性使其雉以回收， 致使提取过程的费_ | r | 较高：另外，产物对微生物本身具有抑制和毒害作川，常需使发酵液 中终产物的浓度维持在较低水平。近年来，研究人员已研究开发出了些特殊的发酵芹| j 回 收技术用以解决这些问题，如利用非极性溶剂或树脂进行随程连续萃取、吸收或吸附。 尽管存在种种困难，但有些香味化合物己由微生物法生产，并达到了工业生产规模。 由于消费者对用于食品、饲料、化妆品的“天然”舔加剂的需求不断增加，采用生物技术 生产香味化合物在商业上的重要性在不久的将来将会与日俱增。 1 1 2 内酯类化合物在香料行业的重要性 内酯是环状酯的化学统称，是羟基脂肪酸分子经过分子内酯化形成的化台物1 6 j 。内酯具 有许多种类，是广泛存在于自然界中具有生物活性的一类化合物。内酯不光应用于香精香 料中，还可用于聚合物材料，医药以及农业化学品还是合成天然产物的有用中间体。有 许多具有香气特征的重要天然内酯现在都已经被合成并应用于香糖香料中。 脂肪族内酯的香气特征主要包括：油性，桃仁味，奶油味，果汁味，胡桃味，椰子味， 蜂蜜味等，在食物香味成分中有着重要作用。内酯通常具有很高的香料价值。 饱和和不饱和的y 一内酯和6 - 内酯是香精香料中应用最广泛的pj ，它们能产生类似牛油 和许多水果的香气。y 内酯和6 内酯广泛存在于食品和饮料中，是1 2 0 多种食物的香气组 成成分，桃子中就含有9 种y 一内酯和6 种6 一内酯。 t 或6 内酯的直接前体是十或6 羟基脂肪酸。不同的脂肪酸底物先要经过微生物体内 酶的作用转化成这些直接前体，然后才能转化成相应的内酯。对于不同链长的4 一或5 一羰基 脂肪酸，经过细菌，酵母或真菌的还原形成相应的羟基脂肪酸，再经简单的加热即可形成 内酯。通过不饱和脂肪酸的光氧化或自氧化，或脂氧化酶对它的作用，或通过微生物对不 饱和脂肪酸的水合而获得的羟基脂肪酸可以代替天然的羟基脂肪酸作为生物转化的底物i ”。 在羟基脂肪酸的转化中，羟基位置决定了内酯的结构：羟基位于1 0 或1 2 位的脂肪酸 转化成7 - 内酯，而羟基位于1 1 或1 3 位的转化成6 内酯p l 。 从香料的角度看，既能通过生物技术得到又最具有经济潜力的内酯是y 癸内酯( 又名丙 位癸内酯。y - d e c a l a c t o n e ，g d l ) 。y - 癸内酯天然存在于桃子、杏仁、草莓等水果中。具有 强烈的果香香气，稀释时有桃子香气，在成熟的果实中，含量可达到1 5p p b ，其中8 9 是 ( r ) 异构体pj 。十癸内酯的理化性质见表1 - 1 。大量研究发现限) 异构体和( s ) 异构体具有不同 的香气特征【j o “j ( 结构式见图1 1 ) ，手性内酯的生产在香精香料行业得到了重视。很多的 香料公司将兴趣投向了这一潜在市场，并且开始进行研发，十癸内酯的生产有了飞速的发展， 天然y 癸内酯的售价也由2 0 0 0 0 美元千克降至1 2 0 0 美元千克( 1 9 9 5 年) 1 2 1 但目前市 场上销售的y 癸内酯仍主要是由化学合成的无旋光活性的外消旋混合物，如日本s o d a 公司 以及国内一些香料公司均有化学合成的1 一癸内酯出售。化学法合成y 一癸内酯主要由辛醛与丙 二酸缩合，再脱羧和环化而成。普通环境中的有机合成只能产生无旋光的外消旋混合物， 而用微生物法则可以生产得到具有旋光活性的相对较纯的产物，且可以一次完成由化学台 成需要许多步骤的生产过程，具有很高的实用价值。 o r ( + ) 吖一癸内酯 r h q 卜l 声。 s - ( ) y 癸内酯 图1 1r 一、s - 异构体结构示意幽 2 表1 - 1y 癸内酯的理化性质 o r g a n e o l e p t i ca n dp h y s i c o - c h e m i c a lp r o p e r t i e so f y - d e c a l a e t o n ea t2 5 。c m o l e c u l a rw e i g h t t 7 0 2 5 m o l e c u l a rf o r m u l ac 1 0h 1 80 2 a p p e a r a n c e c o l o i l l e s st op a l ey e l l o w t r a n s l u c e n tl i o u i d s e n s o r yp r o p e r t i e sf r u i t y p e a c h y c r e a m y , 0 i l y s p e c i f i cg r a v i t y 2 5 0 9 2 7 5 0 9 7 7 5 r e f t a c t i v ei n d e x 国2 0 1 4 4 7 0 - 1 4 5 1 0 e b u l l i t i o nt e m p e r a t u r ea ta t m o s p h e r i cp r e s s u r e2 8 0 。c s a t u r a t e dv a p o u rp r e s s u r e ( p i 、t = 2 5 q ) o 3 9 s o l u b i l i t yi nw a t e rg l 0 6 h y d r o p h o b l cc o n s t a n t ( t o gp ) 、 3 5 r e l a t i v ev o l a t i l i t y ( a i w a t e r f t 5 m ) 1 8 ( r ) - 【碟( c1 5 2 5 ，c h 3 0 h ) = + 4 8 5 ( s ) 一纠2 。o ( c1 5 2 5 ，c h 3 0 h ) 一4 8 1 s t r o n gf a t t y - s w e e tf r u i t yn o t e ，s o m e r e m l 。n i s c e n c et oc o c o n u t ，c a r a l t l e l s o f t ，s w e e tc o c o n u tn o t ew i t hf r u i t y f a t t y a s p e c t s 1 2 生物合成天然丫- 癸内酯的国内外研究现状 1 9 3 0 年，d e r x 从感染的桔子树叶中分离和培养得到一株粉红色的微生物“，并且描述 了培养基中具有桃子气味。d e r x 将该菌株命名为s p o r o b o l o m y c e so d o z 7 1 s ，现称之为 s p o r i d i o b o l u ss a l m o n i c o l o r 。1 9 7 2 年，其中的香味组分被证实为是t 一癸内酯和t 一十二内酯”“。 至今，已有许多关于微生物法生产y 癸内酯的专利和文献报道，如s p o r i d i o b o l u sr u i n e n i i 、 s p o r i d i o b 。l u sj a i m o n i c 。l o p 6 1 、y a r r o w 妇l i p o l y t i e a ! 8 、t r i c h o d e r m 们洳蜊拉0 12 1 1 、 p i p t o p o r wj 。l o n i e n s i s l 2 2 1 以及c b r 川p 胁c 招一的某些菌株均能转化蓖麻油、蓖麻油酸或 蓖麻油酸甲酯生产十癸内酯： s p o r o b o l o m y c e so d o r u s 能以果糖、丙氨酸培养基发酵生产y 一 癸内酯口；f u s a r i u m 聊p 可从葡萄糖培养基发酵生产t 不饱和内酯 2 5 1 ；m o r t i e r e l l ai s a b e l l i n a 能将癸酸转化成t 癸内酯l “1 ；m u c o 哟某些菌株能从4 一 ) j 2 0 一碳的羧酸形成y 或6 内酯口7 j ： 用t y r o s p o - r u m 的一些种能将卵磷脂、油酸、或脂肪转化成y 内酯( 6 1 1 碳) ：h a f f n e r 和 t r e s s l 28 】报道，s p o r o b o o m y c e so d o ： u s 能转化亚油酸，合成y 癸内酯。另外在麦芽威士 忌酒的生产过程中发现乳酸菌先将不饱和脂肪酸( 亚油酸、棕榈酸) 转化成y 内酯的前体( 1 0 一 羟基硬脂酸、1 0 一羟基棕榈酸) ，这些羟基脂肪酸再在酵母菌的作用下转化为丫- 癸内酯和丫 十二内酯，从而产生了威士忌酒的香甜口味口。 s e r r a n e c a r r e o n l 等人i 驯在1 9 9 7 年第一次报道应用t r i c h o d e r m 肋期，啪以蓖麻 汕为唯一碳源发酵生产7 天，y 癸内酯产量2 6 0m g l 。而k a l y a n i 等人在2 0 0 0 年报道“， 通过改变发酵条件，经过9 6 h 和4 8 h 的表面和深层发酵可以分别获得4 5 5 乖ii 6 7m g l 的 y 癸内酯。 b o o g 等人p ”报道s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 可将蓖麻油酸发酵为v 癸内酯，每千克发 酵液产率达2 0 3 7 5 克y 癸内酯。 由于y 癸内酯的发酵产率较低，研究人员开始对r 癸内酯的合成途径进行研究。周氆等 人p ”使用有油脂水解活性的地霉属菌株戌与有内酯合成能力的棒状杆菌属菌株r s l 吐5 进 行协同发酵转化蓖麻油生产t 癸内酯。使用有较高脂酶活性的微生物进行蓖麻油水解，可以 使水解产物羟基脂肪酸在培养一段时间厉大量寓集。而这时接种具有内酯化活性的微生物 进行内酯合成将不再受蓖麻油水解能力这一冈素的抑制，从而获得较高的合成效率。 w a c h e 等人【l ”通过对y a r r o w i al i p o t i c a 菌株中脂酰辅酶a 的基因缺失突变型同功酶 的研究发现，在y a r r o w i al i p o 仃t i o a 菌株将蓖麻油酸甲酯生物转化为y 癸内酯的过程中， 脂酰辅酶a 同功酶起了重要的作用。 n i c a u d 等人口”认为由于菌体在转化蓖麻油酸为y 一癸内酯的过程中仍然生& ，导致了转 化率的低下。为了使微生物代谢的效率达到最大，就必须使香味物质的产量最大，而新菌 体细胞的生长最少。菌体细胞在培养基中不能生长，可以使蓖麻油酸的一个旁路代谢途径 ( 细胞生长) 受到抑制，从而转回内酯的合成途径。因此他们采用了一株尿嘧啶缺陷型的 基因工程菌y a r r o w i a i p o 抄t i c a 菌株在不含有尿嘧啶的培养基中进行生物转化蓖麻油酸甲 酯【1 菌体生长受到抑制，转化率比原菌株提高了1 0 2 0 倍。 关于微生物代谢蓖麻油酸形成y 癸内酯的代谢途径一般认为是蓖麻油酸首先经历了3 个 b 氧化循环，形成6 羟基3 一十二烯酸，然后在酵母的作用下，将碳碳双键加氢还原，形成 6 一羟基十二酸，接着第四个b 氧化过程将6 羟基十二酸变为4 羟基癸酸，最后成环，形成 p 癸内酯p “( 见图1 2 ) 。从蓖麻油酸脂酰辅酶a 经1 3 一氧化至乙酰辅酶a ，共有2 7 个中间体形 成，酵母中通常进行的过氧物酶体b 氧化不像线粒体1 3 一氧化那么高效和组织化，因此0 。 氧化的中间体根据底物和辅酶a 的浓度可以进行一定的积累”。 o h 八八k a 八八c 。h 蓖麻油酸 b 氧化 甲h , 、 c o o h 6 一羟基3 ，十二碳烯酸 i 早h i还原 糕c o o h6 - 羟基十二烷酸 。 _ _ _ _ - ， 1 、，o 一o 4 羟基癸烷酸4 - 癸内酯 图1 - 2 蓖麻油酸转化成y - 癸内酯示意图 3 ，癸烯一4 一内酯是蓖麻油发酵生产y 一癸内酯的副产物。蓖麻油中的主要脂肪酸一蓖麻油酸 经b 氧化形成y 一癸内酯的直接前体物质4 一羟基癸酸，4 - 羟基癸酸进一步b - 氧化就会形成 3 ，4 二羟基癸酸，环化形成3 羟基y 癸内酯，脱去一分子水形成3 一癸烯4 内酯和2 癸烯- 4 内酌( 见圈1 - 3 ) 。这种不饱和内酯可以通过焙烤酵母将其生物氢化为相应的y - 癸内酯，且为 4 一 _ 手性( + ) 一r - y 癸内酯1 。 o h 环化 o h 4 羟基癸酸 o “ 3 , 4 二羟基癸酸 o h 脱水 3 一羟基y - 癸内酯 2 一癸烯4 内酯 o 3 一癸烯4 内酯 图1 - 34 - 羟基癸酸转化为3 一癸烯4 内酯和2 一癸烯一4 一内酯 由于手性对于内酯化合物的生物活性十分重要，人们发现不同微生物转化脂肪酸形成 的内酯具有不同的手性。比如，s p o r o b o o m y o e so d o r u s 可以将1 3 一羟基一9 ，1 1 一十八碳二烯 酸转化成( r ) 一6 一癸内酯，而c l a d o s p o r i u ms d s 却将它转化成( s ) 一6 一癸内酯。同样 的，c l a d o s p o r i u ms u a v e o e n s 可将消旋的蓖麻醇酸转化成( r ) 一7 - 癸内酯，而一株 勋o r o b o o m y c e s 菌株转化产物中以( s ) 构型为主。 从报道上看，能发酵产生y 一癸内酯的菌株较多，但能用于工业化生产的却较少，研究人 员认为从蓖麻油或蓖麻油酸甲酯转化为y 一癸内酯的转化率普遍较低? ，主要是由于( i ) 蓖麻油酸酯( c 1 8 ) 不完全转化成y 一癸内酯的前体( c 1 0 ) ；( i i ) 其他内酯( 如3 一羟基1 一 癸内酯，2 一癸烯4 内酯和3 一癸烯4 内酯) 的积累；( i i i ) 7 - 癸内酯的进一步被代谢。另外， 由于发酵产物丫- 癸内酯是一种对菌体有较大毒性的物质，t - 癸内酯在发酵液中的积累会造成 菌体的大量死亡，这也是发酵产率较低的原因之一，因此目前的研究较倾向于采用对 癸内 酯有较大耐受力的酵母类。同时研究人员也对一些降低y 癸内酯毒性的方法进行了研究，如 发酵液中添加油类物质使十癸内酯溶于其中，减少内酯与菌体的接触p “；膜分离与有机溶 剂萃取相结合的p e r t r a c t i o ni j “方法；i s p r 方法”( i ns i t up r o d u c tr e m o v a l ) 将具 有很高产物吸附能力的朊藻酸基质悬浮于发酵液中与油相底物形成乳浊液，产物可及时被 吸附在这种基质上并定期更换，这些方法均取得了较好的效果。 在所有的专利和文献报道中，比较值得注意的是德国的h & r 公司的r a b e n h o r s tj ，等人i j w 使用y a r r o w i al i p o l y t i c ah r l 4 5 ( d s m1 2 3 9 7 ) 菌株，以蓖麻油为前体分别进行1 0l 和3 0 0l 规模的发酵试验，2 7 下发酵5 0 7 0h ，发酵液中t - 癸内酯的浓度分别达到了1 2 9 ，l 和1 2 3 g l ，已具备了工业化生产的条件，因此，通过微生物转化生产丫癸内酯在商业上是可行的。 以 一 1 1 3 研究的意义 美国、英国、德国、日本、法国等国家利用生物技术生产风味物质开始于本世纪三十 年代，最初是通过对香味的描述来对风味物质进行分类。随着分析化学领域中些仪器分 析手段的应用和改进如：气相色谱法和质谱分析法，越来越多的微生物风味挥发物质得 以鉴定。 当代香料已广泛涉及到工农业、日常用品、食品饮料、生物化工、医药卫生，乃至国 防科技等诸多领域【4 “。人类生活离不开香料，随着生活水平的不断提高，人类对香料及其 延伸产品的需求日益增加。据统计，如今全球每年纯香精香料总产值为1 4 0 多亿美元，主要 掌握在像美国i f f ( 1 8 亿) 、瑞士g i v a u d a n ( 1 4 亿) 和f i r m e n i c h ( 1 2 亿) 、英国q u e s t ( 1 0 5 亿) 、德 国d r a g o c o 、日本t a k a s a g o 和h a s e g a w a 、法国m a n e 以及丹麦d a n i s c o 、s c m 等国际十大香精 公司，占全球市场份额的2 3 ，达1 0 0 亿美元年。我国现有香精香料企业约8 0 0 家，年产量仅 1 5 万吨，产值1 3 亿美元【4 “。虽然传统的化学合成和天然提取方法是目前生产香料产品的主 要手段，但利用生物技术生产生物香料具有独特的优势，且能迎合人们回归自然的理念， 是未来发展的趋势。许多国