（发酵工程专业论文）敲除3磷酸甘油脱氢酶基因gpd对工业酒精酵母发酵的影响.pdf

摘要 摘要 目前，燃料乙醇作为新型清洁燃料，正无可争议地成为世界各国的研发重点。酿 酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 发酵产生乙醇的过程中，甘油的生成所消耗的碳源约占 总碳源的4 - - 1 0 。减少甘油合成量可提高乙醇产率与碳源利用率。其主要策略是修 饰或切除一步或多步代谢反应，或引入外源相关基因以改变碳流方向与碳流量，从而使 反应向有利于生成更多乙醇而少生成甘油的方向进行。甘油是经由糖酵解途径( e m p ) 的 中间物磷酸二轻丙酮引出的一条支路。磷酸二经丙酮经加氢还原为3 磷酸甘油后再脱去 磷酸形成甘油。其中第1 步反应由合成甘油的关键酶( g p d ) 所催化。g p d 有2 个同功酶， 分别由基因g p d l 和g p d 2 编码。 以工业酒精酵母s a c c h a r o m y c e sc e r e v 西i a ey 为出发菌株，首先通过产孢率比较，选 定m c c l a r y 培养基为产孢培养基。通过生孢法获得6 株单倍体，再与模式菌株w 3 0 3 1 a 的 杂交鉴定出此菌株的两个不同类型的单倍体t i t 型和a 型。 以p u c l 9 质粒为载体，构建含有g p d l 同源基因的重组质粒p u c g p d l ：f 2 k m ，线 性化后整合到s c e r e v i s i a e y ( a ) 的染色体，获得了突变g p d l 基因的重组菌s c e r e v i s i a e y ( a , a g p d l ) 。将重组质粒p p i c g p d 2 b g l h y g 用限制性内切酶h i n d l i i 线性化后，电击 转化进入感受态工业酿酒酵母s c e r e v i s i a e y 的a 型单倍体和a 型单倍体中，获得重组菌 s c e r e v i s i a e y ( a , a g p d 2 ) 和s c e r e v i s i a e y ( a ，a g p d 2 ) 。借鉴酵母双杂交技术原理，将 s c e r e v i s i a e y ( a , a g p d l ) 和s c e r e v i s i a e y ( 叻，s c e r e v i s i a e y ( a , a g p d 2 ) 和s c e r e v i s i a e y ( a ，a g p d 2 ) 分别进行群体杂交，通过产孢法和p c r 的方法鉴定出分别全突变掉g p d l 和g p d 2 基因的双倍体菌株s c e r e v i s i a e y ( a g p d l ，a g p d l ) ，s c e r e v 括i a e y ( a g p d 2 ， a g p d 2 ) 。 以葡萄糖为底物的发酵实验表明重组菌s c e r e v i s i a e y ( a ，a g p d l ) ，s c e r e v 括i a e y ( a ， a g p d 2 ) 分别与s c e r e v i s i a e y ( a ) 和s c e r e v i s i a e y ( 比较甘油产量则是下降了2 4 8 3 和 2 2 3 5 ，而酒精产量则都略有所提高。而重组菌s c e r e v 括i a e - y ( a g p d l ，a g p d l ) ， x c e r e v i s i a e y ( a g p d 2 ，a g p d 2 ) 与宿主菌s c e r e v i s i a e y 比较，它们的生长速率比较缓 慢，葡萄糖的利用消耗速率也有所下降，同时它们的葡萄糖转甘油率分别较宿主菌下降 了1 1 6 6 和2 0 7 1 ，而葡萄糖转酒精率分别较宿主菌增加了5 9 0 和1 3 2 0 。同时 考察了发酵的次要副产物丙酮酸和乙酸的产量，发现这两株重组菌的丙酮酸和乙酸量都 有所减少。 关键词：酒精酵母；乙醇；甘油；甘油代谢 a b s t r a c t a b s t r a c t f u e le t h a n o l ，a sac l e a ne n e r g yt or e p l a c ef o s s i lf u e l s ，h a sb e c o m eah o t - s p o tf o r r e s e a r c h e r sw o r l d w i d e am a j o rp r o b l e ma b o u te t h a n o lp r o d u c t i o nb ya n a e r o b i cf e r m e n t a t i o n o fs a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ei st h a t4 t o10 o ft h ec a r b o ns o u r c em a yb ec o n v e r t e dt o g l y c e r 0 1 s t r a i n si m p a i r e dg l y c e r o ls y n t h e s i sw o u l dl e a dt o i n c r e a s ey i e l do fe t h a n o la n d e f f i c i e n c yo fu t i l i z a t i o no ft h ec a r b o ns o u r c e t h em a j o r s tr a t e g yi st oi n t e r d i c to rm a n i p u l a t e t h em e t a b o l i s m ，o rt oe x p r e s sa n o t h e rg e n ei ns c e r e v i s i a et or e d i r e c tt h ec a r b o nf l u x w i t h g l u c o s ea s t h ec a r b o ns o u r c e ，g l y c e r o li sf o r m e db yc o n v e r s i o no fd i h y d r o x y a c e t o n e p h o s p h a t et og l y c e r o l - 3 一p h o s p h a t e ( g 一3 一p ) a n ds u b s e q u e n td e p h o s p h o r y l a t i o no fg 一3 一pt o y i e l dg l y c e r 0 1 t h ef i r s tr e a c t i o ni sc a t a l y z e db yg l y c e r o l - 3 - p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e ( g p d ) t h e r ea r et w oi s o g e n e se n c o d i n gd i f f e r e n tf o r m so fg p d ，g p d la n dg p d 2 f i r s t l y ，w ec h o o s et h em c c l a r y m e d i u mw h i c hr e a c h e dam a x i m u ms p o r u l a t i o nr a t ef o r s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a eo fo p t i m u ms p o m l a t i o nm e d i u m s i xh a p l o i ds t r a i n sw e r eg o ta f t e r s p o r u l a t i o no fs a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e t a k et h e s e l e c t e d6s t r a i n sa n dw 3 0 3 1 aa s h y b r i d i z a t i o ns t r a i n s ，a n dm a k eg r o u ph y b r i d i z a t i o n ，w ef o u n dt w od i f f e r e n th a p l o i ds t r a i n s ( a t y p ea n d0 【t y p e ) b a s e do nh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n ，ar e c o m b i n a n tp l a s m i dp u c19 - g p d l ：q 弛【i lw a s c o n s t r u c t e da n di n t r o d u c e di n t oh a p l o i d ( at y p e ) b ye l e c t r o p o r a t i o na f t e rl i n e a r i z e d t h e h a p l o i dm u t a n ts c e r e v i s i a ey ( a , a g p d l ) w a sg e n e r a t e da n dc o m f i r m e db yt h em e t h o do f p c r t h er e c o m b i n a n t p l a s m i dp p i c g p d 2 - b g l - h y gw a sd i g e s t e db y h i n d l i ia n d t r a n s f o r m e di n t ot n et w od i f f e r e n th a p l o i ds t r a i n s ( at y p ea n dat y p e ) b ye l e c t r o p o r a t i o n ，t h e n t h eh a p l o i dm u t a n t ss c e r e v i s i a e y ( a , a g p d 2 ) a n ds c e r e v i s i a e y ( a ，a g p d 2 ) w e r eg e n e r a t e d y e a s t - t w o h y b r i d t e c h n i q u e u s e df o r r e f e r e n c e ， a f t e r h y b r i d i z a t i o n b e t w e e n s c e r e v i s i a e y ( a ，a g p d l ) a n ds c e r e v i s i a e y ( a ) ，s c e r e v i s i a e y ( 毛ag p d 2 ) a n d s c e r e v i s i a e y ( a ，a g p d 2 ) ，t h ed i p l o i dm u t a n t ss c e r e v i s i a e y ( a g p d l ，a g p d l ) a n d s c e r e v i s i a e y ( 印龙，印龙) w e r eg e n e r a t e da n dc o m f i r m e db yt h em e t h o do fs p o r u l a t i o n a n dp c r i ne t h a n o lf e r m e n t a t i o no fg l u c o s ec a r b o ns o u r c e ，t h er e c o m b i n a n t ss c e r e v i s i a e - y ( a ，a g p d l ) a n ds c e r e v i s i a e y ( a ，印龙) sg l y c e r o lp r o d u c t i o nd e c r e a s e db y2 4 8 3 a n d2 2 3 5 t h a nt h e i rp a r e n ts t r a i n s a n dt h er e c o m b i n a n t sb o t hs h o w e das l i g h ti n c r e a s ei ne t h a n o l f o r m a t i o n t h er e s u l to fa n a e r o b i cf e r m e n t a t i o ns h o w e dt h a tt h er a t eo fg r o w t ha n dg l u c o s e c o n s u m p t i o no ft h es c e r e v i s i a e y ( a g p d l ，a g p d l ) a n ds c e r e v i s i a e y ( a g p d 2 ，a 印d 2 ) r e c o m b i n a n t sw e r es l o w e rt h a ns c e r e v i s i a e - y o nt h eo t h e rh a n d ，w h e nc o m p a r e dt ot h e o r i g i n a l s t r a i n ，t h e r ew e r e1 1 6 6 a n d2 0 7 1 r e d u c t i o ni ng l y c e r o lf o r m a t i o nf o r s c e r e v i s i a e - y ( a g p d l ，a g p d l ) a n ds c e r e v i s i a e y ( a g p d 2 ，a g p d 2 ) ，r e s p e c t i v e l y e t h a n o l p r o d u c t i o n i n c r e a s e d b y 5 9 f o rs c e r e v i s i a e y ( ag p d l ，ag p d l ) a n d1 3 2 f o r s c e r e v i s i a e y ( 印比，a g p d 2 ) d r a m a t i cr e d u c t i o n i na c e t a t ea n dp y r u v i ca c i dw a sa l s o o b s e r v e di nb o t hr e c o m b i n a n t sc o m p a r e dt ot h eo r i g i n a ls t r a i n s 一k e y w o r d s ：s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ey ；g l y c e r o l ；e t h a n o l ；g l y c e r o lm e t a b o l i s m i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是泰人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 羝! 盈囊 日 期： 迎8 ：& ： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存，汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签 名：狐! 叠羹 导师签名： 2 1 兰竺! ! 2 7 日 期：沙纩8 - 争6 第一章绪论 第一章绪论 1 1 发展燃料酒精的意义和现状 乙醇，俗称酒精，化学式c 2 h 5 0 h 。它主要以玉米、小麦、薯类、糖蜜或植物等为 原料，经发酵、蒸馏而制成。1 8 9 6 年，亨利福特制造的第一辆汽车就设计成以酒精为 燃料。作为替代汽油用于内燃机的燃料酒精，要求乙醇的浓度达到9 9 5 ，因此将9 9 5 浓度的酒精称为燃料酒精i l j 。 由于石油、煤炭等矿物燃料的使用增加大气中二氧化碳的含量，引发所谓温室效应， 成为众所周知的严重的环境问题。因此为解决传统能源的枯竭和环境问题，保证经济以 可持续的方式发展，世界上许多国家都在积极研究和开发新的能源，以减少矿物燃料的 用量，从而减少温室气体在大气中的积累量，有效缓解温室效应。特别是自2 0 世纪6 0 年代第一次能源危机以后，许多发达国家和部分发展中国家即根据各国具体资源情况着 手燃料酒精的开发和应用【2 j 。酒精完全燃烧只产生二氧化碳和水，其产生二氧化碳本质 上是由植物通过光合作用固定，所以并不会加重温室气体浓度而升高全球温度。另外， 酒精生产还可带动相关农业产业升级换代。目前世界上普遍应用燃料酒精有两种：变性 酒精和含水酒精。变性酒精是无水酒精( 9 9 3 ) 与汽油以一定比例混合作为车用燃 料，酒精在混合物中比例不超过2 5 时，可使用原有汽车发动机；而含水酒精是纯度 为9 3 2 0 6 酒精，能直接作为车用燃料，但需使用专门设计的具有高压缩比发动 机【3 1 。 地球石油进入枯竭期，最多可以继续使用1 0 0 年左右。中国是石油资源相对贫乏的 国家，据专家测算，中国石油稳定供给不会超过2 0 年。所以，在社会主义改革推进的蓬 勃阶段，能源短缺有可能成为制约我国经济发展的瓶颈。1 9 9 3 年，我国开始变为石油进 口国，随后以年递增6 6 的速度增加进口量。2 0 0 4 年进口原油1 2 3 亿吨、成品油3 7 8 8 万吨，占国家石油总供给量的4 0 。至0 2 0 1 0 年，我国石油消费总量将达到4 亿吨，而国 内生产能力仅为1 6 1 7 亿吨。 用于生产酒精的原料很多，其中淀粉类、糖类物质生产乙醇的技术基本成熟，作物 秸秆纤维生产乙醇还有几项关键技术需要研究。目前国内外用化学法生产酒精的较多， 但用浓酸、浓碱带来的污染问题，酸、碱回收成本问题都没解决好，因此生产规模不能 扩大；用酶法生产酒精，各国都在研究，但都没进入生产阶段，主要问题是没有研究出 高活性的木质素降解酶，糖化率不高，生产周期长，成本高等。在农业机械化不发达的 国家，秸秆收集也是很大的障碍。但是其巨大的潜力是存在的，有1 1 亿多吨的潜力，规 模化开发仅是时间问题。用纤维素类原料生产乙醇的主要是农作物的秸秆。作物秸秆一 般含纤维素和半纤维素7 0 左右，南方还有大量香蕉叶和干皮纤维含量也在6 5 7 2 。 另外中国农科院已发现并培育了一种高纤维植物，纤维含量达9 0 以上。我国是一个农 业大国，每年的农作物秸秆产量达到6 亿多吨。目前，我国的秸秆用途大致为每年o 8 亿 吨用于工业，1 2 亿吨用作饲料，l 亿吨还田，两亿吨作为生活能源消耗，另外有1 5 2 亿 江南大学硕士学位论文 吨荒烧，废弃。也就是说，我国每年尚有2 亿吨秸秆可以用于生产酒精，或制作成型燃 料替代煤炭【4 l 。 1 2 酒精与甘油的内在联系 1 2 1 酒精与甘油在代谢途径中的联系 酒精发酵主要由酵母菌在厌氧条件下通过e m p 途径将葡萄糖降解为丙酮酸，然后在 丙酮酸脱氢酶的作用下脱羧形成乙醛，再在乙醇脱氢酶的作用下生成乙醇。 在酿酒酵母假c e r e v i s i a e ) 发酵中将葡萄糖或其它易发酵的糖转化为乙醇时的主要代 谢副产物是甘油。甘油形成的主要作用是使细胞内达到氧化还原的平衡和调节细胞内的 渗透压【5 喝j 。当环境渗透压升高时，酵母细胞将合成并在胞内累积甘油以便维持细胞内 外渗透压的平衡；当在缺氧条件下生长时，酵母细胞将合成并在胞内累积甘油以便维持 细胞的氧化还原平衡。 甘油是经由糖酵解途径( e m p ) 的中间物磷酸二轻丙酮引出的一条支路。磷酸二经丙 酮经加氢还原为3 磷酸甘油后再脱去磷酸形成甘油。这两步反应分别由3 磷酸甘油脱氢 酶( c tg p d ) ，3 一磷酸甘油酯酶( g p p ) 催化。这一途径为酵母甘油合成的唯一途径。用于甘 油合成的磷酸二轻丙酮可由糖酵解途径提供，也可由以非发酵碳源生长时的糖异生途径 提供。 磷酸二羟丙酮 g l y e e 2 ：0 1 3 一p h o s p h a t elg d p h y d x o g e n a s e 善 3 一磷酸甘油 g l y c e r o l 3 - p h o s p h a t e 喜g p p 甘油 + 3 一磷酸甘油醛 1 3 一磷鼍甘油酸 丙酮酸 上 乙芋 图1 - 1 酵母的酒精合成途径【9 l f i g i - 1m e t a b o l i cp a t h w a yo fp r o d u c t i o ng l y c e r o l i ny e a s t 1 2 2 酒精与甘油在呼吸链中的联系 酒精酵母在氧充足的环境中，在由胞内n d e l 、n d e 2 基因编码的n a d h 脱氢酶的作 用下，通过呼吸链将n a d h 氧化为n a d + ，产生足够的能量推动细胞物质代谢，细胞生 长较为迅速，培养基中细胞数增长快。研究表明，在含高浓度糖的培养基和供养不足的 乙醇发酵中，酿酒酵母的有氧呼吸作用受到一定程度的抑制，降低了酿酒酵母细胞氧化 过剩的n a d h 的能力，从而使胞内还原型n a d h 有所积累。酿酒酵母选择甘油合成途径， 消除胞内过剩的还原型n a d h ，每合成l m o l 甘油将会氧化l t o o ln a d h 。胞内甘油的合成 2 第一章绪论 反应是酿酒酵母细胞在无氧和高浓度糖环境条件下代替呼吸链氧化n a d h 为n a d + 的替 代途径，使酵母消耗在合成生物量和形成诸如琥珀酸、醋酸和丙酮酸等有机酸的过程中 伴随n a d h 的生成，以解除胞内n a d h 与n a d + 的失衡，维持细胞能量与物质代谢的平 衡l lo 。研究发现，酵母胞内一定浓度甘油的积累，使酵母细胞对环境中因高糖浓度而产 生的高渗透压的抵御能力有所提高【1 1 , 1 2 】。酿酒酵母在含高浓度糖培养基中，以及在无氧 条件下利用可发酵性糖产乙醇、c 0 2 、生成生物量与甘油等不同代谢途径之间的关系及 参与反应的相关重要分子的质量平衡见图1 2 。 g l u c o s e a t p a d p 图1 2 酿酒酵母在厌氧条件下的主要代谢通路和辅酶因子与a t p 的需求平衡【1 3 1 f i g 1 - 2 o v e r v i e wo fm a i nf l u x e su n d e ra n a e r o b i cc o n d i t i o n si ns c e r e v i s i a ea n dt h e i rc o - f a c t o r r e q u i r e m e n t 甘油是乙醇生产中主要副产物之一，甘油的生成因菌株、原料与工艺的不同会消耗 4 1 0 的总碳源1 1 4 1 ，如果这些碳源用来生成乙醇，每年全球无需增加原料投入可多 产乙醇约1 3 亿升1 1 5 1 ，这将大幅度提高乙醇生产的效率，产生可观的经济与社会效益。 1 3 甘油合成途径中关键酶基因分析及其在发酵过程中的作用 1 3 1 甘油合成途径中关键酶基因分析 在酿酒酵母中己发现甘油合成途径中的c t g p d 和g p p 各具有两个同工酶。c t g p d 由 g p d l 和g p d 2 编码 1 6 , 1 7 】，g p d l 基因产物( g p d l p ) 为最主要形式，受渗透压胁迫的诱导极 为明显，g p d l 基因缺失突变株表达低水平的c t g p d 活性。g p p 也具有两个同工酶，分别 由两个高度保守的等位基因g 尸尸1 和删编码【1 8 , 1 9 】，g p 尸l 基因产物是3 。磷酸甘油酯酶的 主要形式。 以酿酒酵母为对象研究分析了是否在细胞中存在限制甘油合成代谢流的甘油合成 或运输步骤。研究结果表明，提高甘油合成的最直接的办法就是过量表达编码3 磷酸甘 油脱氢酶g p d h 的同工酶g p d l p 的基因g p d l 。过量表达另一同工酶g p d 2 p 的编码基因 g p d 2 对甘油合成具有相同的功能。与此相反，过量表达3 磷酸甘油酯酶g p p l p 的编码基 因卯p 1 并不能提高甘油的合成。进一步研究表明，同时过量表达g p d l 和g 即1 的菌株 并不能比仅仅过量表达g p d l 的菌株生产更多的甘油。这表明g p d ，而不是g p p l p ，为甘 油合成的限制因素1 2 0 】。 3 江南大学硕士学位论文 1 3 2g p d 在酒精发酵过程中的作用 g p d 有2 个同功酶，分别由基因g p d l 和g p d 2 编码，它们催化甘油的合成并伴随辅 酶n a d h 氧化生成n a d + 。虽然这2 个同功酶基因有很高的序列同源性，但它们的表达调 控模式并不相同。g p d l 主要由高渗透压诱导表达，它的作用是在高渗透压的条件下启 动甘油的合成途径，以调节细胞内外的渗透平衡【2 啦2 1 。g p d 2 在厌氧条件下被诱导，它 对厌氧条件下的氧化还原反应的代谢平衡调控起到一定的作用i l l 】。 随着环境渗透压的升高，酵母细胞内的水份将流向环境，同时一些浓度过高则对细 胞有害的溶质像矿将进入细胞内，细胞质膜上的离子梯度将受到破坏，细胞的生存能力 将下降，甚至死亡。细胞通常对策是提高胞内一种或多种相容性溶质的累积。这些相容 性溶质能在胞内以高浓度存在而不对胞内的酶产生抑制或失活作用，甘油是包括酿酒酵 母在内的多种酵母细胞的最主要的相容性溶质。g p d l p 不仅是酵母细胞内甘油合成代谢 途径中的关键酶，而且受高渗诱导表达，因此在维持细胞内外渗透压平衡的过程中发挥 了关键性作用。细胞内的氧化还原平衡则是维持细胞正常代谢的另一重要因数。在有氧 条件下，酵母细胞存在几种不同的还原调节机制，比如3 磷酸甘油穿梭作用。然而 s c e r e v i s i a e 在缺氧条件下维持该平衡的唯一途径是生成甘油。缺氧条件下野生型酿酒酵 母细胞中，g p d 2 p 被诱导过量合成，甘油合成速度加快，有效地氧化细胞代谢过程中因 其他还原调节机制的缺乏而产生的过量n a d h ，相反g p d 2 a 菌株生长缓慢。这种生长抑 制伴随着细胞内n a d h 的严重累积。这种因为缺氧造成的生长抑制也可以通过添加 n a d h 氧化剂，比如乙醛、3 羟基丁酮来缓解，另外，g p d 2 在有氧条件下可以通过在培 养基中添加重亚硫酸盐而被诱导，在此重亚硫酸盐抑制酒精发酵过程最后一步还原反应 隹n a d h 积累。 1 4 基困敲除技术在工程菌构建中的应用 基因敲除是2 0 世纪8 0 年代发展起来的一项重要的分子生物学技术，利用微生物体内 的同源重组系统，在一定选择压力下使体外改造的某功能基因与受体细胞染色体上的功 能基因之间发生同源重组，从而改变细胞的遗传特性。利用基因敲除技术可阻断细胞的 代谢旁路，或通过引入突变位点改变目的产物的产量或质量，从而达到微生物育种的目 的。 1 4 1 基因敲除的操作步骤 基因敲除的一般流程见图1 3 ，基本程序是：用p c r 技术扩增目的基因序列，在体外 插入卡拉霉素、四环素等受体菌原先不具有的抗性标记，使目的基因失活，再将失活的 目的基因构建至一环状载体上，用电转化、显微注射等方法将构建好的载体转化人受体 细胞内，以抗性标记初步筛选阳性菌或进行目的基因功能的失活检测，再以p c r ， s o u t h e r n 杂交等做进步验证。现在，为了更好地区别单交换与双交换造成的重组，通 常使用两个抗性标记，在发生单交换时，阴性和阳性抗性标记都会整合至基因组，而发 生双交换时，第二次同源重组会导致基因回复至野生型或敲除目的基因，在前一种情况 下，。两种标记都不存在：在后一种情况下，基因组上只有阳性标记；因此这样的敲除子 4 第一章绪论 可以通过正负筛选鉴别出。但如果载体构建时在同源序列内部引入一些突变，就不会回 复至野生型，这样，既能实现基因的失活，基因组上又不会带有抗性标记，这对构建“食 品级的安全菌株是有益的。 在了解微生物代谢途径相关基因的基础上，通过构建合适的敲除载体，利用微生物 原有原因与构建的同源重组系统发生交换，进行代谢旁路的阻断，防止副产物或有毒产 物的形成，促进目的产物积累，从而达到调节代谢流，优化代谢途径的目的。基因敲除 技术既对敲除载体的要求不高可用于原核细胞，也可用于真核细胞，用途广泛。 1 4 2 敲除策略的选择 基因敲除过程中，敲除载体的设计及构建是非常重要的。同时，在载体构建的过程 中要考虑建立合理、可靠的筛选方法。同源重组的效率较低，故对重组子的筛选和检测 是基因敲除的关键步骤。目前根据不同的目的和要求，基因敲除的策略主要有以下几种。 1 非复制型质粒载体敲除法 对野生茵做基因敲除，可以先考虑用非复制型载体。由于构建好的敲除载体在受体 菌中是不复制的，因此转化之后，在选择压力下，未发生重组的转化子由于敲除载体不 能复制随着菌体生长而被稀释。丁晓明等【2 3 】利用在地中海拟无枝菌酸菌中不复制的敲除 质粒p d k l1 0 ，成功地用一淀粉酶基因取代了地中海拟无枝菌酸菌u 3 2 染色体上的3 一氨 基5 一羟基苯甲酸合成酶基因。此法的主要缺点是整合几率低，需要数千碱基的同源序 列，且对受体菌的感受态效率要求较高。 2 不稳定型质粒载体敲除法 若受体菌感受态较难制备，可考虑采用不稳定型敲除载体。例如：2 一酮基一古龙 5 江南大学硕士学位论文 酸( 2 一k l g ) 是维生素c 合成的重要前体，但发现存在高水平的2 一酮基醛糖还原酶( 2 - k r ) 活力。由于2 k r 能够利用n a d p h 或n a d h 辅酶将v 生产菌代谢中重要的中间产物2 ，5 一二酮基一d 一葡萄糖酸( 2 ，5 - - d k g ) 及2 一k l g 转化为其他副产物，陈芳等【2 4 j 将失活的 2 一k r 基因构建至u p b r 3 2 2 衍生质粒上，这种质粒在受体菌中分配不稳定，在无压力选择 或低磷条件下培养5 1 0 代会出现很多质粒丢失的细胞。因此转化后可先控制培养条件 使敲除载体随细胞复制以增加转化子的数目，然后再在无压力选择或低磷条件下让质粒 丢失，最后在选择压力下筛选敲除子。目前已成功敲除2 k r 基因。 3 温度敏感型( t s 型) 质粒载体敲除法 1 9 9 3 年，b i s w a s 等t 2 5 j s u 用t s 型质粒建立了革兰氏阳性菌高效的基因敲除系统。 b i s w a s 所用质粒p g + h o s t 5 在3 7o c 时不复制，而2 8o c 时以滚环模式进行复制。因此转化 后在选择压力下3 7o c 培养会导致第一次同源重组s c o ( s i n g l e - - - c r o s s o v e r ) ，之后将温度降 至2 80 c ，会促使质粒发生滚环复制，这种复制机制会导致发生第二次重组d c o ( d o u b l e - - - c r o s s - - o v e r ) 。重组后，目的基因或是被敲除，或是回复成野生型。由于使用了t s 型质粒， 因此转化后可先在复制温度下培养促进转化子的生长及繁殖。即使外界无抗性选择压力 重组机率也会增加。该技术可避免使用抗生素抗性标记，可用于构建“食品安全级的 菌株。由于质粒是以滚环机制复制，重组效率高。b i s w a s 的研究表明在有抗性选择压力 时，5 0 以上的菌发生了替换重组；无抗性选择压力时，替换重组的效率为l 4 0 。 此外，t s 型质粒宿主谱广，可在很多草兰氏阳性菌中使用。 4 线形转化敲除法 1 9 9 8 年，m u r p h y 笔f 1 2 6 】报道了利用噬菌体的线性r e d 同源重组系统获得高重组率。r e d 系统主要包含3 种蛋白质分子，分别称为e x o 、b e t a c - 和g a m 。e x o 蛋白具有d n a 外切核酸 酶活性，从双链d n a 末端按5 3 的方向消化单链d n a 。b e t a 蛋白可结合在由e x o 消化产 生的3 单链d n a 末端，促进该单链d n a 末端与互补链退火和体内重组。g a m 抑制宿主 菌的重组蛋白r e c b c d 的线性双链d n a 外切酶活性，协助e x o 和b e t a 完成同源重组。r e d 系统相对于宿主菌来说是一个外来的功能单位，因此必须对其表达进行调控。y u 掣2 7 j 将部分噬菌体的基因整合至e c o l i 染色体上，e x o ，b e t a 和g a m3 个基因受c 2 8 5 7 阻遏蛋白 的调控表达；d a s e n k o 等【2 8 】将r e d 系统构建在一个a r a c p a r a b 为启动子的t s 型质粒上， 在阿拉伯糖的诱导下可进行有效表达，而在温度控制下可快速去除此质粒。王恒棵等1 2 9 j 利用此类质粒快速敲除了痢疾杆菌中的a s d 基因，之后又利用编码f l p 重组酶的t s 型辅助 质粒去除了抗性基因，为r e d 系统在e c o i l 以外的微生物中的应用进行了尝试。利用噬菌 体的r e d 同源重组在大肠杆菌中做基因敲除的优点在于其所需的同源序列只需3 0 5 0b p ， 如此短的核酸序列完全可以人工合成，从而避免了繁琐的酶切及连接过程。通过p c r 产 生的两端带有同源臂的d n a 片段即可在r e d 系统指导下快速实现基因敲除。 在链霉菌中，廖军等1 3 0 j 利用含缺v i 的变性双链d n a 敲除了葡萄糖异构酶的基因， 推测可能是单链d n a 的构型有利于其与链霉菌染色体序列的同源重组，而碱变性后的双 链d n a 中的部分氢键的断裂，造成部分单链区域成为同源重组的较佳底物。在酿酒酵母 中，由于双链d n a 缺口修复途径十分有效，也可直接用由p c r 产生的两端带同源序列的 6 第一章绪论 线形d n a 转化，b a u d i n 等1 3 l 】通过同源重组用酵母筛选标记基因( 如h i s 3 ) 替换酵母中的目 的基因，可快速产生大量的基因缺失突变体。采用线形基因不需采用特定的载体，这使 构建过程得以简化，并且可以避免采用环形载体时非同源片段的干扰。 5 结合转化敲除法 芮贤良等 3 2 , 3 3 j 利用宿主一载体平衡致死系统筛选致贺氏3 价疫苗候选株。首先使目 的基因体外失活，将其克隆到“自杀转移载体 p x l 2 7 5 上获得质粒p x l 3 1 2 ，转化大肠 杆菌受体菌s m l o x p i r 。以s m l 0 x p i r 为供体菌，与受体菌t 3 2 进行固相滤膜交配，由于重 组质粒p x l 3 1 2 含有r k 2 的m o b 位点和特殊的r 6 k 复制予，不仅可被供体菌内的r p 4 系统 诱导转移至受体菌1 3 2 ，而且在1 3 2 菌内不能复制，是一自杀型质粒。因此，当用载体的 抗生素抗性进行选择时，可筛选到转移质粒和染色体发生同源重组形成的共整合结合 子。因此，如果要进行基因敲除的目标菌不易制备感受态或感受态效率很低，则可以通 过寻找“中介菌”来完成基因转移的过程。 作为一项新兴的微生物育种技术，基因敲除克服了传统诱变方法的盲目性和偶然 性，敲除后被改变的基因会随染色体d n a 进行复制，改良的菌种可稳定地用于后续的研 究和生产。随着大量模式生物及重要功能微生物全基因组的解明以及功能基因的定位， 人们从基因水平上更加清楚的认识微生物代谢的规律，同时敲除载体及相关技术的完善 可进一步推动代谢工程的广泛应用，通过基因敲除手段改变微生物细胞的代谢流向，阻 断有害代谢产物积累，可望降低成本，大幅度提高生产水平及产品纯度。除了微生物代 谢工程，基因敲除技术还可用于基因结构与功能研究、细胞生活周期调控机制研究、无 毒活体疫苗的制备研究以及遗传病的基因治疗等诸多方面。随着人类基因组计划的完成 以及疾病分子机理的解明，基因敲除技术还可有效用于遗传病及癌症的基因治疗。该技 术可望在发酵，医药，轻工食品等多项领域作出重大贡献。 1 5 工业酵母茵争实验室酵母菌的差异 酵母( y e a s t ) 是一类单细胞低等真核生物，它既具有类似原核生物的生长特性( 易培 养、繁殖快、便于遗传操作等) ，又具有典型真核生物的分子和细胞生物学特性。酵母 作为人类利用最早的微生物，和人类的生活极其密切，是酿造、食品、饲料等领域应用 最广泛的工业微生物。酵母生物学研究的最显著特点是基础理论研究与应用实践研究的 内在统一，酵母不仅是研究真核细胞各种生命过程的有用模型和重要工具1 3 制，而且也是 外源真核生物基因表达的适宜宿主生物，对现有工业酵母菌种遗传改良和重组基因工程 酵母生产外源蛋白显示出广阔的前景1 3 5 】。 绝大部分实验室酵母菌是从工业酵母菌衍生而来的。但经过单倍体分离、诱变处理 后，使得实验室酵母菌具有了以下特征：( 1 ) 通常是单倍体，具有a 或0 【交配型；( 2 ) 具 同源基因型；( 3 ) 二倍体化时具有生孢能力；( 4 ) 具有营养缺陷标记，! t t l e u 2 、t y s 2 、u r a 3 、 h i s 3 、m e t l 5 、t r p l 等。实验室酵母菌的上述特征是进行酵母菌遗传学、分子生物学及 基因克隆和表达研究所必需的。而工业酵母菌的特征是：( 1 ) 一般是二倍体或多倍体， 只产生少量孢子或不产生孢子；( 2 ) 具异源基因型；( 3 ) 不具有营养缺陷标记，即原养 7 江南大学硕士学位论文 型。正因为工业酵母与实验室酵母存在着以上诸多不同之处，在对它们进行遗传改良之 后也就可能会存在遗传性状上的差异。 1 6 阻断甘油的合成提高乙醇发酵产率的尝试 各方面研究显示如果通过分子克隆等技术手段将甘油途径的关键酶基因敲除，阻断 该途径，则原有用于甘油合成的代谢流有可能更多地流向酒精合成途径i 提高出酒率， 对降低酒精工业成本具有重要的研究意义。根据酿酒酵母菌株、培养基与工艺流程的不 同，乙醇发酵过程中会有4 1 0 的碳源用于合成甘油。因此，研究者首先针对的是 甘油合成途径的关键酶，通过构建g p d l 、g p d 2 单基因敲除或2 者均敲除的缺失突变体， 开展了部分或全部阻断甘油的合成，以改变碳流方向与碳流量，从而提高乙醇发酵的产 率的尝试。 1 6 1 阻断实验室酵母甘油合成途径的尝试 b j o r k q v i s t 等1 1 4 】用葡萄糖浓度为2 的培养基在5l 发酵罐中研究了缺失g p d l 或 g p d 2 基因与该2 种基因双缺失的模式酿酒酵母w 3 0 3 1 a 菌株的突变体在有氧条件下的 生理学反应。研究结果表明，在有氧培养条件下，缺失g p d l 或g p d 2 ( 且p 单基因缺失) 的 菌株与亲本比较，生长速率略低，甘油产量较亲本分别减少了6 9 和5 4 ，生长发酵在 3 0h 被完成，亲本与2 种单基因缺失突变体的乙醇产率分别为0 3 8 、0 3 8 与0 3 7 ( g 乙醇儋 葡萄糖) 。而g p d l 和g p d 2 双基因缺失突变体在有氧条件下的生长速率只有亲本的5 0 左右，且未检测到甘油，发酵5 0h 后的残余还原糖高于单基因缺失菌株，乙醇产率为0 3 6 ( g 乙醇儋葡萄糖) 。由此可见，3 种缺失突变体的乙醇产率均未超过亲本。 v a l a d i 等1 3 6 1 毛e b j o r k q v i s t 的基础上，在葡萄糖浓度为2 的培养基中，对亲本与3 种 缺失突变体进行了厌氧连续发酵研究。2 种基因双缺失的酿酒酵母突变体无法在厌氧条 件下生长，原因是没有可选择的途径将n a d h 氧化为n a d + ，从而造成胞内n a d h 的大 量累积。对单基因缺失体与亲本的比较显示：缺失g p d l 基因的突变体菌株的甘油产量 略低于亲株，而缺失g p d 2 突变体菌株的甘油产量较亲本减少了4 0 。亲本与2 种单基因 缺失突变体的乙醇产率分别为0 3 4 、0 3 4 与0 3 7 。缺失g p d 2 突变体菌株的乙醇产量虽然 提升了约8 ( 相对于底物的消耗) ，但是生长速率则较亲本下降了4 5 ，在厌氧条件下 生长缓慢，延长了生长周期。也有研究者在2 基因双缺失突变体中引入其它的代谢途径来 消耗n a d h 再生n a d + ，以求胞内n a d h n a d + 的平衡的同时提高乙醇的发酵产率，但 结果并未达到预期目标 3 7 , 3 8 】。 1 6 2 阻断工业酵母甘油合成途径的尝试 为了提高酿酒酵母的酒精产量，天津大学孔清学等 3 9 - 4 1 】以从工业菌株t h a a d y 上 分离得到的单倍体菌株为出发菌株，构建了缺失g p d l 的突变株k a m 4 ，同时又在突变 株k a m - 4 上插入g l t l 基因( 编码谷安酸合成酶) 得到突变