（生物医学工程专业论文）一次性使用葡萄糖传感器的载酶材料选择.pdf

次性使用葡萄糖传感器的载酶材料选择 s i 0 2 一a u 复合纳米颗粒的增强作用比单独使用时大很多，电流响应约为未加纳米 颗粒时的4 倍。纳米s i 0 2 颗粒强烈的吸附作用是葡萄糖传感器响应性能增强的 重要原因。 通过选择水溶性高分子材料和纳米颗粒增强，制得了响应时间为2 0 秒、灵 敏度大于8 5n a ( r e t 0 0 1 l 4 ) 的一次性葡萄糖传感器，并掌握了传感器制作中的 关键控制因素，为进一步的微观机理研究和实用化研究打下了良好基础。 关键词：葡萄糖传感器水溶性高分子葡萄糖氧化酶纳米颗粒一次性 i i 巍j 夫掌磷圭掌莅谂燮 s e l e c t i o no fe n z y m ec a r r i e rm a t e r i a l su s e di n g l u c o s es e n s o r sf o r s i n g l eu s e b i o m e d i c a le n g i n e e r i n g p o s t g r a d u a t e ：y a n gl i n as u p e r v i s o r ：g o ul i a b s t r a c t d i a b e t e sm e u i t u si sam e t a b o l ye n d o e r i n o p a t h yw h i c hi sr e s u l t e df r o mt h e i n t e r a c t i o no fh e r e d i t a r ya n de n v i r o n m e n t a lf a c t o r s d u et od i f f i c u l tr e c o v e r y , i t w o u l dd oag r e a td e a lo fh a r mt op e o p l ei fi ti sn o tw e l lc o n t r o l l e d s e v e r ed i a b e t e a m e l l i t u sp a t i e n t sp r o b a b l yw i l ls u f f e rf r o mv a r i o l l sa c u t es y n d r o m e sa n dh a v et h e i r l i v e si nd a n g e r d u r i n gt h ed i a b e t e sm e l l i t u sd i a g n o s e sa n dt r e a t m e n t , i ti sv e r y i m p o r t a n tt oh l s p e c tt h eb l o o ds l u c o s e d i s p o s a b l eg l u c o s es e n s o rc a n 殛恻t h e b l o o d g l u c o s e c o n c e n t r a t i o no fd i a b e t e s m e l l i t u s p a t i e n t sc o n v e n i e n t l y a n d s e n s i t i v e l ) ；t h e r e f o r e , i ti sv e r yn e e e s m r y 括p r e p a r eg l u c o s es e n s o rf o r 颤u g l e 蹴 w i t hh i g hs e n s i t i v i t ya n dl o wc o s t m a n ye x p e r i m e n t si n c l u d i n ：gf i l mp r e p a r a t i o n , w a t e r - s o l u b i l i t ya n a l y s i sa n d c u r r e n tr e s p o n s em e a s u r e m e n th a v eb e e nd o n e ab e t t e rc a r t i e rm a t e r i a li sc h o s e na s e a r b o x y lm e t h y lc e l l u l o s e ( c m c ) 。a n dt h ee f f e c to f d i f f e r e n te o n c e m r a f i o n so f c i v i c 0 1 1r e s p o n s ec u r r e n to fg l u c o s es e n s o rw a ss t u d i e dt o o c o n s i d e r i n gv a r i o u sf a c t o r s s u c ha sf i l m q u a l i t y , w a t e r - s o l u b i l i t y a n dc u r r e n tr e s p o n s e , t h ea p p r o p r i a t e c o n c e n t r a t i o no fc i v i ci su n d e rl r e s p o n s ec u r r e n to f t h ep r e p a r e dg l u c o s es e n s o r i sl k n e a tf r o m5 0 喇t o4 0 0 螂w i t h t h es e n s i t i v i t yi s5 & 5 7 蒯( m m 0 1 u 1 ) w h e nt h ea p p l i e dp o t e n t i a li s0 a v a c c o r d i n gt ot h en a t u r eo fc m c , i ts h o u l db e n e w l ym a d e a n dt h et e m p e r a t u r ed u r i n gp r e p a r a t i o ns h o u l dk e e pr e v e r s e l yc o n s t a n t o w i n g t ou n i q u ep r o p e r t i e so f n a n o p a r t i c l e ，a u 、a g 、s i 0 2 、a 1 2 0 3n a n o p a r t i e i e s f r o m1 0 r i mt o4 0 r i mw e l em a d e t h ee f f e c to fe n z y m ee l e c t r o d e sm a d eo fd i f f e r e n t - m 一袭鳇徨麓篱骛糖搀感器塾载簿耩鞋连撵 n a n o p a r t i e l e s0 1 1r e s p o n s ec u r r e n to fs e n s o r sw a si n v e s t i g a t e d 。t h er e s u l t ss h o wt h a t a 取a ga n ds i ( hn a n o p a r t i c l e s e r t h a n c et h e r e s p o n s ec u r r e n t , w h i l ea 1 2 0 3 n a n o p a r t i c l eh a sn oo b v i o u sc o n t r i b u t i o nt ot h er e s p o n c u r r e n t a m o n gt h e s e n a n o p a r t i e l e s , s i 锡n a n o p a r t i c l es h o w s o b v i o u se n h a n c e m e n t ，t h er e s p o n s e s e n s i t i v i t yi n c r e a s e sf r o m5 6 5 7h a ( r e t 0 0 1 l 1 ) w i t h o u tn a n o p a r t i c l et o8 5 。3 7h a ( m a n o l 。o 罄y 受确错i n v e s t i g a t i o n , i e s p o r i s ee t a r e n to fg l u c o s es e n s o r 弱峪 e n h a n c e d 诵也t h ea d d e da m o u n to fs i 0 2n a n o p a r t i c l e t h ec o m b i n e de f f e c to fs i o a n da un a n o p a r t i c l e si sb i g g e rt h a nt h a to ft h es o l er e l i a n c eo ns i 0 2o ra u n a n o p a r t i c l e t h er e s u l t i n gr e s p o n s ec u r r e u ti sa b o u t4t i m e sa sm u c ha st h a to n e w i t h o u tn a n o p a r t i e l e s 。t h es t r o n ga b s o r p t i o ae f f e c to fs i 0 2n a n o p a a i c l el e a d st ot h e e n h a n c e dr e s p o n s ec u r r e n to f g l u c o s es e n s o r , b ym e a no ft h es e l e c t i o no fw a t e r - s o l u b l ep o l y m e r sa n dt h ee n h a n c e m e n tb y n a n o p a r t i c l e s ，ag l u c o s es e n s o rf o rs i n g l el m ew i t hs e n s i t i v i t yh i g h e rt h a n8 5h a ( r e t 0 0 1 o ) w a sp r e p a r e d , a n dt h er e s p o n s et i m ei s2 0 s t h ek e yf a c t o r so f g l u c o s e s e n s o rp r e p a r a t i o nw e r ef o u n d , w h i c hi sh e l p f u lt of u r t h e rt h e o r e t i c a la n a l y s i sa n d p r a c t i c a lu s e k e yw o r d s g l u c o s eb i o s e n s o rw a t e r - s o l u b l ep o l y m e r g l u c o s eo x i d a s e n a n o p a r t i e l e s i n g l eu s e 四川大学硕士学位论文 第一章文献综述及论文设想 糖尿病( d m ，d i a b e t e sm e l l i t u s ) 是一种多病因的代谢疾病，特点是慢性高 血糖，伴随因胰岛素( i n s u l i n ) 分泌及或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代 谢紊乱。 正常人的体内有一定浓度的葡萄糖，为我们的日常活动提供能量。当进食 后，血液中的葡萄糖浓度会升高，在胰腺中的胰岛1 3 期胞分泌的胰岛素的作用 下，血液中的葡萄糖进入细胞内，经过一系列生物化学反应，为人类活动提供 所需能量。当人体中缺乏胰岛素或者胰岛素不能有效发挥作用或者靶组织细胞 对胰岛素敏感性降低时，血液中的葡萄糖不能按正常方式进入细胞内进行代谢， 导致血液中的葡萄糖浓度异常增高，发生糖尿病。正常的血糖含量为 8 0 1 2 0 m g d l ，而糖尿病患者的血糖含量会远远高于这个水平，可高达4 0 0 、甚 至5 0 0 m g d l 以上。 糖尿病是以高血糖为主要特征，是一种终生疾病，不可能完全治愈，因此 一旦控制不好会给人体各个脏器带来病变，严重者可发生急性并发症，如酮症 酸中毒、乳酸酸中毒和高渗性昏迷而威胁生命。慢性并发症以大、微血管的并 发症最为严重，大血管的并发症表现为动脉硬化、冠心病、心肌病、脑中风等， 微血管的并发症临床主要表现为眼底血管病变及白内障等导致患者失明，有的 还会带来肾功能衰竭的严重后果。此外，还包括神经血管病变、合并肝脏病变 及合并免疫系统病变等，对人的危害是巨大的。 随着人们生活水平的提高，糖尿病的发病率在逐年增加，它是现代疾病中 的第三杀手，其对人体的危害仅次于癌症和心脑血管疾病。在许多发达国家， 糖尿病的患病率已高达2 - 5 ”。发展中国家的糖尿病患病率也在迅速上升。在 我国就有3 0 0 0 多万糖尿病人，且以每年1 0 的速度增长，患病率高达3 2 1 1 2 】， 占全世界糖尿病患者的五分之一。据世界卫生组织( w h o ) 预计，糖尿病患者 人数在2 0 2 5 年可能增加到两亿三千万以上。所以血液葡萄糖的测定对于糖尿病 以及许多代谢紊乱的诊断来说，是不可缺少的。 一次性使用葡萄糖待感嚣的载酶材料选耩 1 1 体内葡萄糖浓度的检测方法 鉴于糖尿病对人体健康有着巨大的危害，体内葡萄糖浓度的检测就显得尤 为重要，它成为了糖尿病诊断、治疗以及随访的必要簪段。近几十年来除原来 的实验室瓶糖测定以外，融开展了家用微詹全血糖测定，现又研究其他体液以 及无创伤颤糖测定。从体内葡萄糖浓度的检测方法可分为两大类：非介入性测 量方法和介入性测量方法。 1 1 1 非介入性测量方法 非介入性测量方法即近红外光谱法、凭损透皮取样方法以及对身体体液进 行分析的方法，这些方法主要的优点是血糖检测不给患者带来创期，避免了由 于刨口带来的感染的可能，提高了患者的生活水平。 对于无创舰糖检测的研究近年来一直没有间断，主要的方法有：偏振测定 法( p o l a r i m e t r y ) t 3 1 、近红外光谱法【稍、远红外光谱法、中红外振荡熟梯度光谱法， 黜m a n 光谱镜测寇法( s p e 曲r 0 $ c o p ) 矿1 、激光衰减全反射吸收光谱对活体的血糖 检测方法 6 1 等，还有超声波血稽仪等方法1 7 。还有人将纳米技术用于血糖的无刨 测定。 美国桑迪娅国家实验室和新受西哥大学医学院翻成功汗发出了一种利用红 外光测定疯糖的无刨羹葡萄糖传感器。其原理是基于红外光谱学和用于处理光 谱数据的先迸统计技术。肖散射光线照射通过塞入盗视区的一个手指时，处予 各种波长的光一部分被组织和血液中的组分( 包括葡萄糖) 所吸收。然后，光 被分散成光谱，再把光谱解析为葡萄祷特性吸收数据，以确定葡萄稽浓度。这 些方法无刨的血糖检测方法主臻蔑裣溯手指或其德容易接触的部位如潴蘑、耳 朵等。总的说宋，这类仪器检测速度较快，使焉较方便，侵用场禽随意，可避 免对机体组织的伤害和矫伤感染等。讴这类仪器存在酌主要闯题怒灵敏度和准 确往较低，尚不能作为精确定蓬溘溯靛用。这类产品鬣密色的是加拿大的c m e 公葡豹t e l e m e t r i x 先谱式焱糖靛，运用一垫新技术后箕盔耱佼豹s e p ( s t a n d a r d e r r o ro f p r e d i c a t i o n ) 可以扶1 3 m m o l l 提高弱1 0 m m o 托，已经接近了一些有剖 式血糖仅的测蓬精度掰。 m a s k a iy 等【| 站1 l 缀遂了一释葡萄糖传惑器奔j 于测定蹊液葡萄糖系统( o r a l g l u c o s et o l e r a r t c et e s t ，o c t l 3 ，溺定一份标本约孺 o 分铸，僮w 进行连续溺 2 四川大学硕士学位论文 定，测定灵敏度和准确性较高，另外孙晶华【1 2 1 等人也研究出了一种通过唾液监 测葡萄糖浓度的传感器。这些监测唾液、尿、汗、眼泪的方法目前均较成熟。 然而节食、运动等都会影响这些体液中葡萄糖的含量，体液中的葡萄糖和血液 中的葡萄糖并不呈现准确的一一对应关系，导致这些检测方法也不能很好很准 确的体现病理变化【1 3 j 。 以上这些方法有一定优势，但由于检测内容非血糖本身，以及血液与其他 分泌液中葡萄糖浓度间迟滞很大，故这些方法对于用于血液中的葡萄糖浓度的 测量是比较不准确的，有待进一步研究。这些方法都还在探索阶段，但总的来 说无创测定是葡萄糖检测的重要研究方向。 1 1 2 介入性测量方法 介入性测量方法即透皮取血检测方法、植入检测方法等，这些方法会给患 者身体带来创口，但是由于其检测对象为血液，可以实现葡萄糖浓度的直接测 定，因此可以更为准确的得出病人身体中的血糖浓度，从这一点来讲，介入性 测量方法有着显著的优势。 介入性血糖测量主要的检测方法有：( 1 ) 静脉血浆糖( v p g ) 和血清糖测 定。原来是使用还原糖试剂( 如邻甲苯胺) 测定即比色法，这种方法由于邻 甲苯胺对葡萄糖无特异性，且酸性溶液会对测定管道有所破坏，已经逐渐被淘 汰。现在主要发展的方法是用一些“真”糖试剂测定，如己糖激酶、葡萄糖- 6 磷酸脱氢酶、葡萄糖氧化酶等，这些酶对葡萄糖都有特异性，而葡萄糖氧化酶 到目前为止是使用最广的，对血液中的其他物质的抗干扰性强。( 2 ) 毛细血管 全血糖( c b g ) 测定。从2 0 世纪7 0 年代发明的袖珍血糖仪，可用一滴毛细血 管全血测定血糖并能快速得到测试结果，其原理是利用葡萄糖氧化酶接触葡萄 糖，将葡萄糖氧化成葡萄糖酸及过氧化氢，过氧化氢使氧接受剂氧化二产生颜 色改变，后用反射光度计或吸收光度计测定。后来是利用电化学方式检测反应 过程中产生的电流，从而得出血糖值。电化学葡萄糖传感器测试结果较为可靠 准确，测量所需时间较短。根据采血方式划分，介入式葡萄糖传感器主要有针 刺采血式血糖检测仪和激光采血式血糖仪1 2 】。 一次性使用葡萄糖传感器的载酶材料选择 1 2 葡萄糖生物传感器 生物传感器( b i o s e n s o r ) 是指通过埋入或简单结合的途径将由生物的活其 派生的分子识别物质组成的感受器( r e c e p t o r ) 与理化换能器( t r a n s d u c e r ) 结 合在一起的小型分析器件，可以有选择性地、连续和可逆地对某一化学量和生 物量产生响应，将生化信号转换成可定量的电或光信号，从而实现对特定底物 的快速检测。它具有选择性好、响应快、样品用量少、成本低、可以实现连续 在位检测、应用广泛等优点。 图l i 生物传感器示意图 f i g 1 1 s c h e m a t i cf i g u r eo f b i o s e n s o r 从图1 1 我们可以知道，被分析物( a n a l y t e ) 接触到生物感受器( b i o r e c e p t o r ) ， 通过换能器处理后，可以定量检测信号( s i g n a l ) 。 生物传感器以其专一的识别功能，可在复杂的有机、生化样品中进行快速 分析检测，甚至生物活体测定，具有独到的优势。 生物传感器产生于二十世纪六十年代，c l a r k 和l y o n s 最先提出生物传感器 的设想，在诞生后大约十五年中，经历了一个稳定的发展期，到现在为止，国 际上研究成功的酶传感器有几十种，如葡萄糖传感器、乳酸传感器、胆固醇传 感器和氨基酸传感器等等【1 4 1 。由于微电子学和微型计算机的发展，以及生物工 程的发展等原因，人们对生物传感器的兴趣日渐高涨，到8 0 年代初期，这一概 念已经在国际上得到公认。1 9 9 1 年，国际权威机构i u p a c ( 国际理论化学和应 用化学联合会) 发表了化学、生物传感器的名称、术语的文件，这标志着生物 传感器的研究和开发进入了新的阶段。 生物传感器研究的全面展开是在2 0 世纪8 0 年代，这2 0 多年来发展迅速， 4 四川大学硕士学位论文 不仅在医学方面取得了长足的进步，另外在食品工业、环境检测、发酵工业、 军事领域等多方面得到了高度的重视和广泛的应用。现在生物传感器现在能对 许多过去难以测定的生物物质进行定量分析，已经在实践中开始应用的各种固 定化酶酶电极( 包括葡萄糖、酶氨酸、乳酸、乙醇等) 具有以下特征【1 5 】：( 1 ) 采用固定化生物活性物质作催化剂，价值昂贵的试剂可以实现多次使用。克服 了过去酶法分析试剂费用高和化学分析烦琐复杂的缺点；( 2 ) 专一性好，只对 特定的底物起反应；( 3 ) 分析速度快；( 4 ) 准确度高；( 5 ) 操作系统比较简单， 容易实现自动分析；( 6 ) 成本低，连续使用时，每例测定仅需要几分钱；( 7 ) 有的生物传感器能够可靠地指示微生物培养系统内的供氧状况和副产物的产 生。虽然目前己发展了许多种生物传感器，但生物传感器的稳定性、再现性、 和批量生产性还不理想，故生物传感器技术尚处于幼年期，生物活性膜的固定 化技术和生物传感器的固定化技术值得进一步研究1 1 6 。 虽然生物传感器的发展已经有4 0 多年历史，但是由于生物单元的引入，生 物结构固有的不稳定性、易变性，生物传感器实用化还存在着不少问题，所以 现在商品化的生物传感器还很少【1 7 1 。生物传感器的开发依赖于生物技术，生物 电子学和微电子学最新成果的不断渗透和发展。未来的研究重点以生物感受系 统水平为主要目标，以期开发出像人类嗅觉器官、味觉器官那样更灵敏、更新 颖的生物传感器。未来的生物传感器将具有以下特点【培l ： ( 1 ) 拗能多样化：未来的生物传感器将进一步设计医疗保健、疾病诊断、 食品检测、环境检测、发酵工业等各个领域。 ( 2 ) 体积小型化：随着微电子机械系统技术和纳米技术的不断深入到传感 器技术领域，生物传感器将不断微型化，各种便携式生物传感器的出现使人们 在家中进行疾病诊断，在市场上直接检测食品成为可能。 ( 3 ) 智能化和集成化：未来的生物传感器必定与计算机紧密结合，自动采 集数据、处理数据，更科学、更准确地提供结果，实现采样、进样、结果一条 龙，形成检测自动化系统。 ( 4 ) 成本低、高灵敏度、高稳定性和高寿命：生物传感器技术的不断进步， 必然要求不断降低产品成本，提高灵敏度、稳定性和延长寿命。这些特性的改 善也会加速生物传感器的市场化、商品化的进程。 葡萄糖传感器是用于检测葡萄糖浓度的生物传感器。由于葡萄糖氧化酶具 一次性便用葡萄糖传感嚣的载酶材辑选择 有稳定性较好的特点，以及用葡萄糖氧化酶和各种物理化学传感器相结合可以 构成备式各样的葡萄糖传感器。 基于使用的换能器( t r a n s d u c e r ) 的物理化学原理，可以将葡萄糖传感器分 为电化学传感器、压电传感器、热电传感器、声学传感器以及光学传感器。目 前压电传感器和声学传感器尚处予较早期的发展阶段，光学传感器和热电传感 器已经有了一定发展，但是这两种方法还达不到在实际生理体液中，准确测麓 葡萄糖浓度的累求。电化学测量方式其测量原理相对比较简单，故其在各种葡 萄糖传感器中，吸引了众多研究人员的眼球，故其发展也颇为迅速。 生物传感器中研究得最多的是酶电化学传感器。电流型葡萄糖电化学传感 器是其中应用的典型例子之一。 1 2 1 电流型葡萄糖电化学传感器 电化学葡萄糖传感器输出的电流信号与检测物的浓度成厩比，具有选择性 高、简捷、快速等特点，是葡萄耱浓度检测的最常用的方法。 1 2 1 1 电流型电板 制备电流型葡萄糖传感器的换能器酶电极中的生物识别成分通常有两种， 一种是葡萄糖氧化酶( g o d ) ，另种是葡萄糖脱氯酶( g h d ) 。由于葡萄糖氧 化酶对b - d 葡萄糖具有商度专一的催化氧化作用，使用葡萄糖氧化酶作为分子 识别成分的报道很多 1 9 蛐4 l 】，使用葡萄糖脱氢酶的也有报道田矧。s i l b e r t 2 s 等 人采用葡萄糖脱氢酶( g d h ，g l u c o s ed e h y d r o g e n a s e ) 测定葡萄糖浓度。此系统 采用辅助因子n a d + 作为电子接受体，经过电化学氧化产生n a d h ，检测其电 流响应。 电流型电极( 以g o d 为例) 的催化过程可由以下方稳式袭示： 蚤- d - g l u c o s e + g o d ( f a d ) 一番o s e - l a c t o n e + g o d ( f a d h 2 ) ( 1 。1 ) g o d ( f a d h 2 ) + 0 2 一g o d ( f a d ) + h 2 0 2 g 2 ) g l u c o s e 6 - l a c t o n e + u 2 0 一一g l u c o n i ca c i d ( 1 3 ) 姿葡蕊糖与裁莓糖氡他酶接触黠，首先发生的反应是由酶弓l 起的蔼莓糖的 6 四川大学硕士学位论文 氧化，同时辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸( f a d ) 被还原，, b ( f a d h 9 ，即反应方程式 ( 1 1 ) 。在( 1 1 ) 式中被还原的g o d ( f a d h 2 ) 被分子氧氧化，生成过氧化氢，实 现生物催化剂的再生的过程，即方程式( 1 2 ) 。反应式( 1 1 ) 中生成的葡萄糖 酸内酯在水环境中水解为葡萄糖酸，即反应式( 1 3 ) 。 所以总的反应方程式即为： 1 3 - d - g l u c o s e + 0 2 + h 2 0 一g l u c o n i c a c i d + h 2 0 2 ( 1 4 ) ( 1 ) 氧电极葡萄糖传感器 电流型葡萄糖传感器是使用氧电极作为葡萄糖检测的基本换能器。铂电极 ( - 0 6 v ) 作为阴极，a g a g c l 电极( + o 6 v ) 作为阳极，电极就能对氧响应产 生电流。反应式如下： 0 2 + 2 扩+ 2 c lh 2 0 2 ：h 2 0 2 + 2 h + + 2 e i ：土+ 2 h 2 0 p t ( 1 5 ) ( 1 6 ) ( 2 ) 过氧化氢电极葡萄糖传感器 一如果反过来使用铂电极( + o 6 v ) 作为阳极，a g a g c l 电极( - 0 6 v ) 作为 阴极，电极就能对h 2 0 2 响应产生电流。反应式如下： p t 毋1 - 1 2 0 2 ：一0 2 + h 2 0 + 2 e ( 1 7 ) 氧电极和过氧化氢电极制备的葡萄糖生物传感器各有其优缺点。氧电极主 要是传感器的电流响应与氧浓度相关，检测过程将受溶解氧的影响，实际检测 过程中需要检测空间氧( 背景氧) 的浓度，如需准确测量则需要将传感器的复 杂化作为代价，不利于实现传感器的小型化；过氧化氢电极避免了这个问题， 但这种传感器施加的是正电压，会造成检测溶液系统中其他物质的电氧化，从 而干扰检测电流。有研究t 2 6 , 5 5 1 通过引入具有特殊传递性质的半透膜减少干扰， 提高传感器的抗干扰能力。 1 。2 1 2 酶的固定化 一次性谩用葡萄糖传感嚣的载酶材料选择 酶的固定化技术怒指在维持酶的镁化活性的前提下，用物理的或者化学方 法将酶束缚在一定空间内。由于生物传感器最主要的一个元件是阍定化的生物 敏感膜，酶的圃定化质量煎接影响到酶生物传感器的使用效果，故酶的固定一 直是生物传感器研究的一个关键环节。 通常的酶固定化方法生要有包埋法、吸附法、共价键法和交联法豳大类。 ( 1 ) 吸附法 吸附法分为物理吸附法和化学吸附法，吸附法操作简单，容易在许多材料 上进行，可以有效的保留分子识别物酶的活性。缺点是负载量低，制备的生物 传感器电流响应较低。 ( 2 ) 包理法 包埋法是将酶包埋在载体分予格子内，在这个过程中酶分子只是被包埋， 不参与化学反应，固定化条件温和，可以保留大量的活性酶，故电流响应高。 其缺点是厢于包埋的膜通常较脆，用于制备长寿命葡萄糖传感器时膜容易破裂， 导致活性酶的流失，从而导致响应电流的降低，影响传感器的使用寿命。较常 用的包理荆有聚丙烯酰胺渊、明陂n 9 蠲聚乙烯醇 2 9 1 、再艇丝索蹦，以及石墨 粉【3 l 】等。在一次往使用的葡萄糖传感器中，包埋法有着狠众多的优点：固酶条 件温和，酶活性受损少，电流响瘦高，萁缺点是包堙材料的成膜性能和永溶靛 要求较高。 ( 3 ) 共价固定法 共价阋定法燕将酶与聚合物载俸通过筵价键结合的酶固定方法。这释方法 实现了酶与载体的牢阐结合，敖酶的脱落损失少，僵由予实现共价键结合的条 件较为恶劣，酶的活住损失较大，敌制备的酶电板灵敏度较低。这种方法适宠 用于翻备长寿命葡萄糖传感器。据报道的有烷基化法、高磷酸氧纯法渊、迭氮 法、卣纯氯法1 3 3 j 等。倒鲡王顺先溯等入采甭共价法将g o d 黼定在醋酸纤维素 膜上，与氧电狡缀装得到线毪范围为5 0 8 0 0 m g d l 的葡萄蓿生钫传感器，与过 氧纯氢电极组装 蕃至n 线性范围为1 0 2 0 0 m g d l 酌葡萄耱传感器。 ( 4 ) 交联法 交联法是稠蹋双葫能或多功麓试绢在酶分子瀚、酶分子每惰性蛋自麓或酶 分子与载体简进移交联反应，把酶蛋白分子被虼交叉连接起来，形戒鼹终结梅 静西定亿海。能越交联终魇翁试勰缀多，但嚣兹常孀豹交联试荆是戊二酸1 3 铝6 l 四川大学硕士学位论文 和双耦联苯胺- 2 2 二磺酸，另外有胶原蛋白膜、肠膜、尼龙布、透析膜、聚酰 胺膜、蚕丝蛋白膜口7 捌、环糊精p 卅等。例如姜梅与王善荣 4 0 1 等人研究了以壳聚 糖膜为载体、戊二醛为交联剂的固定化葡萄糖氧化酶的特性。交联法常与吸附 法结合使用，或者与包埋法配合，目的是为了使酶紧紧地结合于载体上。 1 2 2 2 电流型葡萄糖传感器的发展 1 9 2 8 年m u l l e r 发现了葡萄糖氧化酶。1 9 6 2 年英国学者c l a r k 和l y o n s 首次 提出了酶电极的概念，研制出了世界上第一只电流计型葡萄糖氧化酶电极。1 9 6 7 年u p d i k e 和h i c k s 根据c l a r k 的设想，采用酶生物固定化技术把g o d 固定在疏 水膜( 即聚丙烯酰胺p a m ) 上并与氧电极结合，组装成了第一个能重复使用的 葡萄糖氧化酶电极。在此之后电化学葡萄糖传感器经历了众多变革。由第一代 以氧为中继体的电催化发展到第二代的基于人造中继体的电催化，以及现在的 第三代的直接电催化，实现电子的直接传递。 ( f ) 第一代酶电化学传感器为基于溶解氧为电子媒介体的电催化过程： 层：g o d o x + 西u c o s e g l u c o n o l a c t o n c + g o d r e d g o d r e d + 0 2 。g o d o x l1 4 2 0 2 ( 1 8 ) ( 1 9 ) ；电极：h 2 0 2 0 2 + 2 矿+ 2 e ”反应进行，0 2 浓度减小，h 2 0 2 浓度增加，通过检灏i 产物h 2 0 2 浓度的变化 或氧的消耗量来测定底物。其缺点有：( a ) 溶解氧的变化会引起电极响应的变 化；( b ) 由于氧的溶解度有限，当溶解氧贫乏时，响应电流明显下降，从而影 响检测极限；( c ) 生物传感器的响应性能受溶液中p h 值及温度影响大。 ( 2 ) 第二代酶电化学传感器为基于人为修饰的具有电化学活性物质为电子媒介 体的电催化过程； 酶层：g o d o x + g l u c o s e g l u c o n o l a c t o n e + g o d r e d 修饰层：g o d r e a + m o x g o d o x + m r e a 电极：m r c d m o x 慨 ( 1 1 0 ) ( 1 1 1 ) ( 1 1 2 ) 第二代酶电化学传感器为了扩大基体电极可测化学物质范围，并提高测定 一次性使用葡萄糖传感嚣的载酶材辩选择 。 灵敏度，增加了化学修饰层。基体电极经过修饰以后，可看成是一个改进了的 信号转换器，电予媒介体的作用是促进电子传递过程，降低工作电位，从而达 到减少其他电活性物质的干扰的耳的 3 3 1 。常见的媒介体主隳有二茂铁【4 1 i 及其衍 生物例，羔茂铁及其衍生物( f e c p 2 r ) ( 如四硫甲叉茂，简称r r f ) 是酶和电极 间的良好电子传递体。它们具有氧化还原的可逆悭质，可作为葡萄糖氧化酶的 辅助因子，二茂铁离子一恩被还原，即在电极表面氧化，并产生电流，电流藏 比于葡萄糖浓度。另外还有钌及其化含物、铁氰酸盐、有机染料( 如聚旺甲基蘸 嗣) ，有机介质和裔机导电盐等。 ( 3 ) 第三代酶电化学传感器为基于酶与电极之间赢接电予传递的电催化过程； 酶翳：g o d o x 十g l u c o s e g l u c o n o l a c t o n e + g o d r e d 龟极：g o d r c d g o d o x + n e ( 1 1 3 ) ( 1 1 4 ) 直接电子传递的第三代酶电化学传感器中酶与电极间电子交换不经过动态 媒质参加而直接进行，是基于酶与电极之间直接进行电子交换从而完成催化循 环，即直接电催化。直接电化学( d i r e c t e l e c t r o c h e m i s t r y ) 酶电极( 简称直接酶 电极) 被认为是新的发展方向，它强调的是减少酶与电极乏间的反应的中间环 节，即酶赢接与电极“对话”，这预示了酶电极性能的全面提升。第三代电化 学传感器的工作电势较低( 通常4 0 2 - - - + 0 4 v ) ，具有媒质传感器的所有优点。 在理论上，酶与电极之间直接电予传递更接近生物氧化还原系统的原始模型。 现在葡萄糖传感器的相关研究主要集中在增强葡萄糖传感器的响应电流。 吴宝艳【4 3 】等制备了纳米金颗敝，用以修饰葡萄糖生物传感器，并选用丝网 印刷金电极得到了增强的响应电流，并缩短了响应时间。唐芳琼哪! 等人借助纳 米颗粒的吸附浓缩效应、吸附定向和羹子尺寸效应等，通过复合纳米金颗粒和 纳米二氧化硅颗粒得到了响应电流增强的葡萄糖传感器。盖宪伟 4 5 1 等用二氧化 硅和金或铂组成的复合纳米颗粒制备葡萄糖生物传感器，大嚼度地提高了葡萄 糖生物传感器的电流响应。而且其效果明显优于这三种纳米颗粒单独使用时对 葡萄糖生物传感器的增强作用。 1 3 一次性葡萄糖传感器及其国内外的发蕊 鉴于糖尿病对人类健康存在的巨大威胁，使准确、快速的检测入体肉葡萄 1 0 四川大学硕士学位论文 糖浓度成为必要。而一次性葡萄糖传感器的快速发展使众多糖尿病病人随时监 测自己的血糖浓度成为可能。在实际应用中，长寿命( 或反复使用) 的葡萄糖 传感器得到了不少发展，长寿命的葡萄糖传感器需要将聚合物载体与酶牢固的 结合起来，作用力较强，通常需要加入交联剂作为辅助酶膜基质，从而避免反 复使用过程中固定化酶的大量渗漏。这种传感器主要应用于适用于医院和家庭 护理的床边仪器、固定在病人身体上的长期监测装置和体内植入装置。一次性 葡萄糖传感器是糖尿病监测的另一个方向，具有方便、快捷等特点。 一次性葡萄糖传感器一般采用包埋法作为固酶技术，利用水溶性高分子材 料遇水快速溶解、释放出包埋的酶的特点，因而包埋法可保留大量活性酶，而 且酶的释放迅速，电流响应高。一次性葡萄糖传感器由于避免了长期或者反复 使用的问题，从而避免了使用过程酶的渗漏，这样在酶电极制各过程中就不涉 及需将酶牢固的固定在载体上，相反一次性葡萄糖传感器采用的能快速将酶释 放入反应体系的材料作为酶的载体，这些材料通常为溶解性好的水溶性高分子 材料，包埋材料与酶之间的作用力弱。再结合现代的丝网印刷技术，使得制备 大批量的性能优异的一次性葡萄糖传感器成为可能。 k d o p a i m 等人制备了一种葡萄糖传感器，其印刷油墨含有葡萄糖氧化酶和 聚合物多吡咯。首先在涂有乳胶的铂电极上进行吡咯的聚合，并把此聚合 物的电极浸入葡萄糖氧化酶( g o d ) 中几个小时以固定酶，干燥后取下乳胶- 聚合物g o d 膜并碾碎，过滤后与石墨油墨混合，将浑厚的石墨油墨印刷在碳工 作电极上。这种方法可以在0 3 5 v 电压下检测葡萄糖浓度，检测范围为1 5 r a m 以内。 g i l m a r t i n 和h a r t 【4 7 】开发了一种一次性的生物传感器测试条，该测试条包含 一个a g a g c l 参比电极和一个工作电极。工作电极含有电催化剂c o 酞菁( c o p c ， c o b a l tp h t h a l o c y a n i n e ) ，并在其上覆盖一层含有葡萄糖的醋酸纤维。此葡萄糖传 感器当葡萄糖浓度在1 0 , - - 1 9 4 m m 时响应成线性关系，响应时间为5 7 s 。基本接 近测试血糖的水平。 m r oh a l l o r a n 4 8 等人基于普鲁士蓝口b ，p r u s s i a nb l u e ) 修饰的丝网印刷碳 电极测定过氧化氢，将其用于葡萄糖生物传感器。使用此种方法可以得到很低 的检测极限( o 2 2 r a m ) ，线性范围直到3 0 m m 。此外，这种装置还可以用于检 测氧气、抗坏血酸、尿酸盐及扑热息痛等。 一次性使用葡萄籍传惑嚣的载酶材料选群 c h c n g x i a oz 舯1 等使用薄膜技术，用水溶性高分子聚乙烯7 _ , - - 醇包埋含锷电 予中继体的g o d ，并使用双电极测试系统，制得一种一次性葡萄糖传感器，这 种传感器具有很宽的线性响应范尉( o 1 n 2 5 m m ) 、响应迅速并有良好的储藏稳 定性。 h i r o a k is u z l l k i l 5 1 等人研究了一种葡萄糖传感器装鼹，一次性试条中的酶膜 层是通过将聚( n - 异丙基丙烯酰胺) 和丙烯酸的拱聚凝胶固定g o d 得来的，系统 先使用葡萄糖标准溶液进行矫正，然厢进行取样测量，其中的取样装置模仿蚊 予，取血鬃少，可以实现葡萄糖的即时检测。 丝网印刷技术由于有制作简单、价格优廉、易微型化等众多优点，它的发 展促避了一次性葡萄糖生物传感器的发展。与丝网印刷技术结合，可以制备出 大批爨生产的、廉价的、性能优良的次性葡萄糖传感器。其主簪的产品便携 式血糖酶电极已经拥有大约5 0 的份额。 与国外相比，阐内关予一次性使用葡萄糖传感器的报邋相对较少，徐肖邢灞l 等人制备了一次性使用的无介质丝耐印利传感器，线性范围为 3 0 x 1 0 - s _ 4 0 x 1 0 4 m 0 1 1 ，检出限为1 0 x 1 0 4 t 0 0 1 l 1 。 冉瑗辫l 等入采用葡萄糖氧化酶作为分子识剐成分，工作电压0 4 3 ，加入铁 氰化钾制备的次性葡萄糖传感器在葡萄糖浓度5 0 - 4 0 0m g d l 范阐内有良好的 线性，灵敏废为2 n a m g d l 。 来明智，蒋庄德t s 4 等人采用电聚合的方法将葡萄糖氧化酶( g o d ) 和晚洛 ( p p y ) 固定予d a 电极上，j i ：一次性超徽基俸电极可检测葡萄糖浓度，稔溺范 围为：2 0 - 7 0 m m o 班，传感嚣晌成时简为1 0 s ，灵敏度为1 4 6 ( n a m m o l l ) 。 裔波箨l 等使用水溶性商分子材料蒙丙烯酰胺( p a m ) 爸髯葡麓糖筏纯酶翻 备酶嘏极，研究了p a i d 静浓度以及纳朱金颡粒的加入璧辩电极响应静影确，褥 到了晌应箍著增强了的一次经葡萄糖传感器。降低了一次往葡萄糖传感器静互 作电舔 o 4 v ，传感器嫡斑对闻惹 2 0 s 。 箕孛瘫奔l 最为成功的楚下面两个专弱。 qj o h n p r i t c h a r d 5 6 1 等入在1 9 9 8 年牵请了一项荧国专耩，这是灌纯学生裙传 懑器试条，苞含稻两电传游奉孝科制备的、尺寸大体福闻静个工榫电极和对电 稷。两电极敖在一层绝缘树赢上，主丽秀放置了另一蔟买有昴臼豹绝缘衬赢。 开叠溺做试帮井。然稀焉一层浸透了表瑟活幢赉j 静分散瓣覆盏在试麓劳上，并 四川大学硕士学位论文 在干燥前粘在第二层绝缘衬底上。这种电化学生物传感器试条灵敏度高，最小 需血量为9 微升。 w i l l i a mec r i s m o r c 册等人在1 9 9 9 申请了一个关于电化学生物传感器的美 国专利这种测试条包括一个在处决上用于定位进样口的缺口，这个进样口同 乡一个含有测试试剂的毛细管的测试室。这种湿的实际包含一种占总重量 o 2 2 ，平均分子量在十万到九十万道尔顿聚乙烯氧化物组成。毛细管测试室 的项部有一透明或半透明窗口，提示能够完成一次精密测试的试样量。这种测 试条在进样口有一个v 字形凹槽，可以减少“剂量延迟”现象。 上面两项专利都已有产品投入市场，检测灵敏度高，结构设计比较先进， 但是用酶量大，系统中加入的物质比较多，制作过程相对比较复杂。 1 4 水溶性高分子材料 与长期使用葡萄糖传感器不同。一次性使用传感器中固定化酶的材料必须 是水溶性的。水溶性高分子化合物又称水溶性树脂或水溶性聚合物，是一种亲 水性的高分子材料，在水中能溶解或溶胀而形成溶液或分散液。其亲水性来自 于分子中含有的亲水基团，最常见的有羧基、羟基、酰胺基、胺基、醚基等。 这些基团不仅能给高分子材料带来亲水性，还能够带来成膜性、成胶性、分散 性、润滑性、增稠性等，使水溶性高分子化合物具有了很多特殊的性质和用途。 茹 1 4 1 水溶性高分子化合物的性质 溶解性是水溶性高分子化合物具有的一个相当重要的性质，这是因为水溶 性高分子化合物的应用绝大部分是以水