（植物学专业论文）石斛类原球茎体增殖及aba对其耐脱水性的诱导.pdf

博( 硕) 士学位论文授权书 本授权书所授权的论文为本人在华南师范大学蝓生立学院( 系、所) 兰! 丝 学年度第学期取得圭茔_ 士学位的学位论文。 论文名称 ： 孑黼麦l t 乖宅砗首，缸段 侧越耐月免6 j z 帆凶；最夸 口同意。不同意 本人具有著作财产权的论文全文资料，授予中国科技信息研究所、中国社会科学院文 献情报中心、国家图书馆、中国学术期刊电子杂志社论文合作部及本人毕业学校图书馆， 司不限地域、时间与次数以微缩、光碟或数位化等各种方式重制后散布发行或上载网路。 本论文为本人向申请专利的附件之一，请将全文资料在本授 权书签订两年后公开。( 请注明文号：) d 同意口不同意 本人具有著作财产权的论文全文资料，授予教育部指定送缴的图书馆及本人毕业学校 图书馆，为学术研究之目的以各种方式复制，或为上述目的再授权他人以各种方法复制， 不限地域与时间，每人以一份为限。 上述授权内容均无须签订转让和授权契约书。依本授权的发行权为非专属性发行权利。 依本授权所为之收录、重制、发行及学术研究利用均为无偿。上述同意与不同意栏若没有 选，则本人同意视同授权。 指导教师姓名：滋蜘她叶诹它 研究生本人签名；卅h 韦 学号： 9 7 驴9 ( 务必填写) 授权日期：口p2 一年i z 月f 占，k t 注：本授权书请用钢笔填写并影印装订二f 封面后的第2 页。 ( 金钗) 石斛( d p n d r o b i u mn o b i l el i n d l ) 2 0 0 2 年3 月摄于华南师范大学兰花中一l 铁皮石斛( d p 小6 ，mc a n d d u mw a l l “l i n d l ) 图片摘自中国野生兰科植物图鉴 陈心启等，1 9 9 9 ，科学出版社 缩写词表 6 一b a a b a a p a p s a r p a s p c d n a c p p u d d d d e p c e b f w h l e a m i n n a a p c r p g r p l b s p r p r t s o d t d z t e 6 - b e n z y l a d e n i n e ， a b s c i s i ca c i d a n c h o r e d p r i m e r s a m m o n i u m p e r s u l f a t e a r b i t r a r yp r i m e r s a s c o r b a t ep e r o x i d a s e c o m p l e m e n t a r y d n a n - f 2 一c h l o r o - 4 - p y r i d i n e ) 一n p h e n y l t h i o u r e a d a y d i f f e r e n t i a ld i s p l a y d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e e t h i d i u mb r o m i d e f r e s hw e i g h t h o u r l u t ee m b r ，o g e n e s i sa b u n d a n tp r o t e i n r a i n u t e a - n a p h t b a l e n e a c e t i ca c i d p o l y m e r a s cc h a i n r e a c t i o n p l a n tg r o w t hr e g u l a t o r p r o t u c o r m l i k eb o d y s p r o l i n e - r i c h p r o t e i n r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n s u p e r o x i d ed i s m u t a s e t b i d i a z u r o n t t i e d t a t e m e d m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e 6 一苄基嘌呤 脱落酸 锚定引物 过硫酸胺 随机引物 抗坏血酸过氧化物酶 互补1 3 n a 吡效隆 天 差异显示 焦碳酸二乙酸 溴化乙锭 鲜重 小时 胚发育晚期丰富蛋白 分钟 蔡乙酸 聚合酶链式反应 植物生长调节剂 类原球茎体体 富含脯氨酸蛋白 反转录 超氧化物歧化酶 瞳苯隆 三羟甲基氨基甲烷一乙 二胺四乙酸 四甲基乙二胺 摘要 本论文对金钗石斛和铁皮石斛的组织培养和a b a 对铁皮石斛类原球茎 脱水耐性的诱导及其机理研究进行了研究，主要结果如下： 一铁皮石斛和金钗石斛的组织培养 l 利用铁皮石斛成熟的种子为外植体，在无激素培养基上获得了无菌苗， 在含有t d z 和n a a 的i 2 m s 培养基上，诱导了铁皮石斛类原球茎，而 6 - b a 的使用会导致材料进一步的分化。铁皮石斛类原球茎的增殖，以 1 2 m s + 0 1 m g l n a a + 3 蔗糖为佳，尽管在不含n a a 的培养基上也有高 的增殖率，但类原球茎的质量却较差。 2 金钗石斛的外植体以幼茎基部效果最好，腋芽易萌发，但材料数量少；以 老茎为外植体时，接种前严格的清洗和预处理，能够有效地提高消毒效 率，降低材料的污染。通过正交试验，对老茎腋芽萌发的研究表明，n a a 和b a 对腋芽的萌发都有一定促进作用，以o 1 m g ln a a 和l m g lb a 混用效果最好，而g a 抑制腋芽萌发。 二a b a 对铁皮石斛类原球茎脱水耐性的诱导及机理研究 1 5 0 um o l l 以下浓度的a b a 预培养，都能够在一定程度上提高铁皮石斛 类原球茎对脱水的耐性，其中以5um o l la b a 的效果最佳，预培养时 间以2 4 h 为好，经2 h 快速脱水后，成活率较对照提高1 0 倍左右。 2 保护性溶质含量的测定结果表明，在2 4 h 内，a b a 预培养并不能明显引 起蔗糖、脯氨酸等物质的积累，但可溶性多糖的含量有一定程度的增加。 因此，认为脱水耐性的增强，可能与可溶性多糖含量的增加有关。 3显微结构观察发现，a b a 预处理过程中，淀粉粒逐渐降解。证实a b a 诱导的脱水耐性，可能与石斛多糖的积累相关。 4 超显微结构的观察发现，a b a 预培养不会引起叶绿体、线粒体及液泡的 明显变化，但脱水后，经a b a 预培养的抗性类原球茎，其膜系统的完 好性明显强于未经a b a 预培养的敏感性类原球茎。虽然在结构上，抗 性类原球茎细胞中线粒体、叶绿体及液泡都出现一定程度的皱缩，但内 外膜均保持较好，而在敏感材料的细胞中，线粒体、叶绿体膜的降解则 较为严重。此外，预处理引起了细胞大范围的轻度质壁分离，对照中则 未见。脱水后，抗性材料中质壁分离现象严重，但细胞结构基本保持完 好，细胞膜完整，而对照细胞已经严重损伤，结构破坏，细胞膜已无法 清晰辨认。因而，我们认为这种由a b a 引起的轻度的质壁分离，很可 能与细胞生理状态的调整及对脱水的耐性相关。 5 通过d d - r t p c r 技术，在a b a 预培养6 h 和1 2 h ，共筛选出1 1 6 个差异 条带，通过r e v e r s en o r t h e r n 筛选及对部分差异片段的n o r t h e r n 检验， 从中得到了三个阳性片段，一个由a b a 诱导表达，一个增加表达还有 一个表达降低。 6 在进行同源性分析时，发现以上阳性片段都无可以进行比较的同源基 因，因此我们难于推断其可能的功能，但由于其与a b a 对脱水耐性的 诱导相关，进一步的研究很可能会获得非常有意义的结果。 关键词：铁皮石斛，金钗石斛，组织培养，脱水，耐性，超显微结构，a b a ， d d r t p c r 2 a b s t r a c t i nt h i s t h e s i s ，t i s s u ec u l t u r eo fd e n d r o b i u mn o b i l el a n dd e n d r o b i u m c a n d i d u mw a l le xl i n d l a sw e l la st h ed e s i c c a t i o nt o l e r a n c eo f p r o t o c o r ml i k e b o d y ( p l b 、o fd c a n d i d u m i n d u c e d b y a b aa n di t sm e c h a n i s mw e r e s t u d i e d t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1t i s s u e c 、n n 魁【疆d n o b l l e l a n d d c a n d l d u m w a l le x l i n d l w eh a v eg o tg e r m - f r e es e e d l i n g so fd c a n d i d u ma tm sm e d i u mw i t h o u t a n yp h y t o h o r m o n eb ym a t u r es e e d i tw a sb e t t e rf o rp l bi n d u c t i o no nm e d i u m o f1 2 m sw i t ht d za n dn a 八6 - b aw o u l dr e s u l ti nd i f f e r e n t i a t i o na tt h es a m e t i m e t h er e p r o p a g a t i o nr a t ew a sa l m o s tt h es a m ew h i l ep l bw a st r a n s f e r e dt o 1 2 m s + 0 1 m # t , n a a + 3 s u c r o s ea n di 2 m s + 3 s u c r o s e ，b u tt h ep l b o n m e d i u mw i t h o u tn a as h o w e dw o r s ei nq u a l i t y t h eb e s tr e s u l tw a so b t a i n e dw h i l ey o u n gs t e m sw e r eu s e da se x p l a n t a l t h o u g hi tw a se a s yt oi n d u c et h eg r o w t ho fa x i l l a r yb u d s ，t h es m a l lq u a n t i t y m i g h tr e s t r i c ti np r a c t i c eu s e t h e r ew e r em a n yd i s a d v a n t a g e sw h e n o l ds t e m s w e r eu s e da se x p l a n t ，b e c a u s eo f t h ed i f f i c u l t yi ns t e r i l i z i n ga n dt oi n d u c i n gt h e g r o w t h o fa x i l l a r yb u d sb u tt h e q u a n t i t ya d v a n t a g e w a ss h o w e d u p b y p r e t r e a t m e n ta n di m p r o v e ds t e r i l i z i n gm e t h o d t h e g r o w t hr a t eo fa x i l l a r yb u d s w a sr o s ew h i l eam e d i u mc h o i s e df r o mac r o s st e s t ，c o n t a i n e d0 1m g mn a a a n da m g a 。6 - b aw a su s e d 2 s t u d s0 fd e s i c c a t i o nt o l e r a n c e i n d u c e db ya b a a n di t sm e c h a n i s m d e s i c c a t i o nt o l e r a n c eo f d c a n d i d u mp l bw a si n d u c e d b y a b a p r e c u l t u r ea t ac o n c e n t r a t i o nb e l o w5 0um o 儿t h eb e s tr e s u l tw a so b t a i n e d w h i l ea b ac o n c e n t r a t i o ni s5um o l la n dt h ed u r a t i o no fp r e c u l t u r ew a s 2 4 h p l b v i a b i l i t yr a t ew a s 1 0t i m e s h i g h e r t h a nt h ec o n t r o la t t e r2 hd e s i c c a t i o n d e t e c t i o nr e s u l t so fc y t o p l a s m i co s m o t i c u m ss h o w e dt h a ta b ap r e c u l t u r e c o u l dn o ti n d u c et h ea c c u m u l a t i o no fs u c r o s ea n dp r o l i n ee t c b u tt h ec o n t e n to f p o l y s a c c h a r i d e r o s e c o n s p i c u o u s l y s o w et h i n kt h a tt h ea c c u m u l a t i o no f p o l y s a c c h a r i d em a yp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nd e s i c c a t i o nt o l e r a n c ei n d u c e db y a b a p r e c u l t u r e s t a r c hg r a i nd e g r a d a t i o nw e r eo b t a i n e di nm i c r o s t r u c t u r er e s e a r c hd u r i n g a b a p r e c u l t u r e i t m a yr e l a t et ot h ea c c u m u l a t i o no fs u b s t a n c e sw h i c ht a k e r o l ei nd e s i c c a t i o nt o l e r a n c e a sd e t e c t i o nr e s u l t so fc y t o p l a s m i co s m o t i c u m s s h o w e dt h a t o n l yp o l y s a c c h a r i d e w a sa c c u m u l a t e di t s u g g e s t e d t h a tt h e a c c u m u l a t i o no f p o l y s a c c h a r i d em a y t a k er o l ei nd e s i c c a t i o nt o l e r a n c ei n d u c e d b y a b a t h e m i t o c h o n d r i o n ，c h l o r o p l a s t a n dv a c u o l u sm e m b r a n eo fa b a p r e c u l t u r e dp l bk e p t ab e t t e rs t a t u st h a nc o n t r o la f t e rd e s i c c a t i o n a l t h o u g h s l i g h tp l a s m o l y s i sw a so c c u r r e d ，t h e y h a v ea l m o s tn oc h a n g e si n s h a p ea f t e r a b a p r e c u l t u r e t h ec e l l s t m c t u r er e t m n e db e t t e ra f t e rd e s i c c a t i o nb u t p l a s m o l y s i sb e c a m em o r es e r i o u s l y i ns p i t eo f t h e p l a s m o l y s i s w a sn o to b t a i n e d i nc o n t r o lp l b ，p l a s m am e m b r a n ew a ss e r i o u s l yd e s t r u c t e da f t e rd e s i c c a t i o n t h i sr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep l a s m o l y s i sd u r i n ga b a p r e c u l t u r em a y b er e l a t e d t ot h ed e s i c c a t i o nt o l e r a n c ei n d u c e db ya b a 11 6d i f f e r e n t i a le d n af r a g m e n t sw e r ec h o i c e df r o md dg e l s a f t e r e x a m i n i n gb yn o r t h e r nb l o to f s o m ed i f f e r e n t i a lf r a g m e n t s ，3e d n a f r a g m e n t s w e r ep r o v e dt ob ep o s i t i v eo n eo fw h i c hw a si n h i b i t e db ya b 九a n o t h e rw a s p r o m o t e d a n dt h et h i r dw a si n d u c e d b ya b ap r e c u l t u r e h o m o l o g o u sa n a l y s i ss h o w e dt h a tn o n eo f t h i st h r e ee d n a f r a g m e n th a s h o m o l o g o u sg e n e s o i ti sd i f f i c u l tf o ru st os u g g e s t i o ni t sp o s s i b l ef u n c t i o n a s i t m a yr e l a t et od e s i c c a t i o nt o l e r a n c ei n d u c e db ya b a ，f u r t h e rs t u d i e sw o u l d g i v e u sm o r er e s u l ts i g n i f i c a n c e k e y w o r d s ：d e n d r o b i u mn o b i 如l ，d e n d r o b i u mc a n d i d u mw a l l e xl i n d l ，t i s s u e c u l t u r e ，d e s i c c a t i o n , t o l e r a n c e ，u l t r a s t r u c t u r e ，a b 气d d r t p c r 第一章文献综述 石斛泛指兰科石斛属( d e n d r o b i u m ) 植物，在我国有着悠久的栽培历 史，文献记载已有1 5 0 0 年以上了。在北宋出版的证类本草( 唐慎微， 1 0 8 3 ) 中，有我国最早栽培的兰科植物木刻图，其中有一幅便是春州石 斛( 陈心启等，2 0 0 0 ) 。在本草经中，石斛就已经被列为中药1 2 0 种 上品药之一。石斛属中有相当多的种类，不仅花形、花色美丽、鲜艳，且 具有迷人的香味，在观赏兰花中也被列为上品( 卢思聪，1 9 9 4 ) ，导致一些 野生的石斛种类进入花卉市场。中药材市场的需求增加和长期的采挖；加 f 之石斛种子细小，萌发需要共生菌( 李铭宗，1 9 9 9 ) 等限制，自然繁殖率极低， 致使野生资源消耗殆尽( 王家玉，1 9 9 4 ) 。1 9 8 7 年我国第一册中国珍稀濒 危保护植物名录中，黑节草( 铁皮石斛) 就已经作为濒危物种，被列为 国家3 级保护植物。 第一节石斛属概述 石斛属为兰科最大的属之一，全球约有1 0 0 0 种( 中国植物志，第1 9 卷，1 9 9 9 ) ，分布极为广泛，西起斯里兰卡，东至太平洋塔希提岛，北至印 度的西北部及尼泊尔、锡金、不丹和喜马拉雅山一带，缅甸和我国的南方 以及朝鲜和日本，南达大洋州南边的塔斯马尼亚岛；垂直分布从海拔 1 0 0 3 0 0 0 m 的高度都有( 吉占和，1 9 8 0 ) 。但主要分布于亚洲的热带、亚热 带及大洋州。新几内亚分布有大约3 5 0 个种而被认为是石斛属的分布中心 ( b a k e r 等，1 9 9 6 ) 。我国分布有7 6 种2 变种( 陈心启，2 0 0 0 ) ，主要分布 在云南、广西、贵州、广东和台湾，为该属在我国的分布中心( 吉占和， 1 9 8 0 ) 。 石斛属除个别地生外，均为附生，生境较为独特，对小气候环境要求 极为严格，主要生长于高温、高湿的阴坡、半阴坡微酸性岩层峭壁及丛林 树e 或林下岩石上( 吉占和，1 9 8 0 ) ；常群居分布，上有林木遮阴，下有溪 沟水源，常与地衣、苔藓植物以及其他一些生境要求相似的植物混生( 彭 锐等，2 0 0 1 ) ；相对湿度8 5 9 5 ，折射光光照强度6 0 0 0 0 8 0 0 0 0 i x ( 赵天榜 等，1 9 9 4 ) 。 尽管对生境的条件要求苛刻，石斛属植物在一些方面的抗性仍然相当 突出，有报道石斛4 4 4 的高温条件下，不发生灼伤，一2 0 c 的低温条件下， 不发生冻害，在年降水只有6 2 22 m m 的情况下，能以裸茎度过干旱( 赵天 榜等，1 9 9 4 ) 。 石斛属最早是由j l o u r e e i r o 氏于1 7 9 0 年创立的，0 s w a r t z l 7 9 9 年采用 d e n 西 o b i u m 。为本属属名，1 9 5 9 年通过的国际植物命名法规，把0 s w a r t z 的属规定为保留属名。1 9 1 0 年，e k r i t n z l i n 在他的专著中，将石斛属分为 1 0 个亚属，2 7 个组。 1 9 8 0 年，吉占和总结了我国石斛属植物的初步研究结果，将其分9 个 组，共5 7 种，1 1 个特有种。1 9 9 9 年中国植物志第1 9 卷，将我国的石 斛属植物分为1 2 个组，共7 6 种和2 变种，产秦岭以南诸省区，尤以云南 南部为多。其后，又有新种梵净山石斛( d e n d r o b i u m f a n j i n g s h a n e n s e z h t s i e x x h j i ne t y w z h a n g ) ( 金效华等，2 0 0 1 ) 的报道。 石斛属植物主要有两方面的应用价值。其一是观赏用，与蝴蝶兰、万代 兰、卡特兰并列为观赏价值最高的四大观赏兰类。观赏石斛分为秋石斛和 春石斛两大类；秋石斛多为切花品种，主要是原产于南太平洋岛屿的 d p h a l a n o p s i s 及其杂交种，由于其花形酷似蝴蝶，亦称蝴蝶石斛；春石斛 是原产于印度、缅甸、中国南部等地的一类在春季开花的石斛，其中金钗 石斛及其杂交种是最为常见的品种。 第二方面便是药用。关于石斛的药用，在本草经中，石斛就已经 被列为中药的上品，也是我国栽培历史最悠久的兰科植物之一，本草纲目 中，李时珍认为石斛为“本经上品，甘，淡、微咸。主治：伤中，除痹下 气，补五脏虚痨赢瘦，强阴益精。”；中药大辞典( 昭人出版社，1 9 8 0 ) 认为石斛“生津益胃，清热养阴。治热病伤津，口干烦渴，病后虚热，阴 伤目暗”。中华人民共和国药典( 化学工业出版社，2 0 0 0 ) 对石斛功能与 主治的描述为：益冒生津，滋阴清热。用于阴伤津亏，口干烦渴，食少干 呕，病后虚弱，目暗不明。 从古至今，石斛一直是中药的上品。现代的研究( 马国祥等，1 9 9 4 ； 王康正等，1 9 9 7 ) ，还发现石斛具有抗癌、提高人体的免疫力、防止衰老等 一系列诱人的功效，导致石烈的采挖量越来越大。如何将石斛资源的保护 和开发利用结合起来，让古老的中药石斛造福人类，也让我们的子孙也能 享受自然的资源，将是应该解决的问题。 第二节药用石斛研究概述 在我国，对于药用石斛的研究和应用，已经经历了上千年的历史。近 年来，由于需求增加与资源枯竭矛盾的日益尖锐，国内对药用石斛的研究 进入了一个高潮，论文数量和专利技术迅速增加，研究范围也愈加广泛。 1 药用石斛的种荚： 李时珍在本草纲目中，将入药的石斛分为石斛和木斛；本草正 也记载了二种药用石斛；唐本草中，亦有麦斛与雀髀斛之分a 而且，各 书中都记载了不同种类的石斛，在药效上的明显差异。可见，在我国的中 药古籍中，作为中药石斛的原植物种类已经相当复杂了。 近年对我国药材市场药用商品石斛的调查研究，商品石斛的原植物共 4 5 种之多( 李满飞等，1 9 8 6 ，1 9 9 1 ，马国样等，1 9 9 5 ) ；且不同植物种所含 的化学成分差异也较大。因此，不同植物源的商品石斛，可能在成分和药 效方面存在相当的差距，这使得药用石斛原植物的鉴定显得更加重要。 中华人民共和国药典( 国家药典委员会，2 0 0 0 ) ，对药用石斛原植 物的描述如下：本品为兰科植物环草石斛d e n d r o b i u ml o d d i g e s i ir o l f e 、马 鞭石斛d e n d r o b i u mf i m b r i a t u mh o o kv a t o c u l a t u mh o o k 、黄草石斛 d e n d r o b i u mc h r y s a n t h u nw a l l 、铁皮石斛d e n d r o b i u mc a n d i d u mw a l le xl i n d l 和金钗石斛d e n d r o b i u mn o b i & l i n d l 的新鲜或干燥茎。 2 药用石斛的栽培 石斛是我国最早栽培的兰科植物之一，已经有1 5 0 0 多年的栽培历史。 明代有将石斛栽于砂上或挂在屋檐下培养的记载( 王康正等，1 9 9 8 ) 。八十 年代以后，我国对药用石斛的研究明显加强，许多方面都有了新的突破和 进展。 2 1 石斛对生长环境的要求 目前应用于中药的所有石斛属植物，都为附生植物，经过长期的适应， 已经形成了对其生活环境的特殊要求。石斛在春、夏生长旺盛阶段，需要 一定程度的遮阴，一般需要遮阴5 0 6 0 0 , ，秋冬季节可以少遮光或不遮光。 在生长季节，一般日温2 0 3 0 ，夜温1 6 2 2 较为适宜，1 0 左右的昼夜 温差，对石斛的生长是必要的。石斛对水分的要求可以总结为喜湿润，忌 过多的水份滞留，并且以p h 52 6 0 微酸性水为佳。由于在热带雨林区夏季 的空气湿度一般在7 0 9 0 ，我国的亚热带地区也达到6 0 一8 0 ，而这些 地方正是石斛生长的环境。因此，在石斛的生长季节，要求8 0 以上的空 气湿度。此外，从石斛及其他兰科植物中分离得到的一些共生菌，如微囊 菌属( m i c r o a s c u sz u k a l ) 等，都被证明对细叶石斛( d h a n c o c k i ir o l f e ) 、 罗河石斛( d i o h o h e n st a n ge tw a n g ) 和铁皮石斛种子的萌发有显著促进作 用( 郭顺星，1 9 9 0 ) ，用菌丝拌种还有助于形成原球茎后的继续发育( 郭顺 星，1 9 9 0 ) 。 22 石斛的栽培 石斛的栽培方式因地区和种类的不同而有一定的差异，常见的栽培方 式有树上栽培，岩石栽培，高垄栽培，盆栽等( 王正康，1 9 9 8 ) ；栽培基质 可以选用石块、碎瓦片、木屑、泥炭土、水藓、碎木炭、椰粒、蕨根等， 以吸水强、透气好的基质为佳。 石斛的栽培水肥管理相当重要，施肥以有机肥最好，复合肥也可以。 施肥的方法要做到薄肥勤施，还要注意不同季节的差异，在春季到初秋， 石斛处于生长旺盛期，施肥要勤些、多些，冬季就要减少或停止旖肥。 3 药用石斛的有效成分和药理作用 王宪楷等( 1 9 8 6 ) 曾对石斛属植物的化学成分研究进行了综述，主要 内容集中在生物碱类成分。陈晓梅等( 2 0 0 1 ) 再次总结了石斛属植物的化 学成分研究情况，并将重点放在了多糖类成分和s t i l b e n o i d s 类成分上。目 前中外学者已经对3 5 种石斛属植物的化学成分和药理作用进行了研究，总 的情况是石斛属植物所含的化学成分类型多样且各类成分的化学结构又各 不相同。 3 1 有效成分 铃木秀干等于1 9 3 2 年首次从中药金钗石斛中获得生物碱( 王宪楷等， 1 9 8 6 ) ，并命名为石斛碱( d e n d r o b i n e ) 。王宪楷等( 1 9 8 6 ) 对石斛属植物生 物碱类化学成分进行了综述，在当时对1 9 种石斛属植物的化学成分进行研 究的结果，只有5 种含有石斛碱类生物碱，8 种含有其他类型且彼此间无共 同基核的生物碱，其他几种植物仅测出生物碱反应，未能得到生物碱。到 目前为止，共从1 3 种石斛属植物中分离获得2 9 种生物碱，其中5 种植物 含有石斛类生物碱1 6 种，8 种植物含有其他生物碱1 3 种。 对于中药石斛的质量，传统的标准为：“质重，嚼之粘牙，口甜，无渣 者为优”。李满飞等( 1 9 9 0 ) 对2 5 种石斛属植物的3 6 个样品的多糖含量进 行了测定，发现凡达到传统优品的样品种类，多糖含量均高于3 0 ，而广 两产级风斗的多糖含量高达4 5 9 8 。因此，多糖应是药用石斛的重要有 效成分。赵永灵等( 1 9 9 4 ) 从兜唇石斛的茎中提取到3 种多糖；王世林等 ( 1 9 8 8 ) 从铁皮石斛中也分离得到了3 种多糖。 s t i l b e n o i d s 类成分是中药石斛中具有抗癌作用的活性成分( 陈晓梅等， 2 0 0 0 ) 。马国祥等( 1 9 9 4 ) 测定了1 8 种石斛类生药中 c h r y s o t o x e n e r i a n i n e ，c h r v s o t o x i n e 的含量，发现几乎所有的种类都含有 c h r y s o t o x e n 和e r i a n i n e 或其中之一，而不含c h r y s o t o x i n e 或含量极微。郑卫 平等( 2 0 0 0 ) 从迭( 叠) 鞘石斛( d c h r y s e u mr o l f e ) 的茎中分离出8 种单 体化合物。毕志明等( 2 0 0 1 ) 从流苏石斛中分离得到9 个化合物，已鉴定 出其中六种。 3 2 药理作用 除传统的应用以外，研究还发现药用石斛具有增强机体免疫力等多种 药理作用。赵永灵等( 1 9 9 4 ) 用从兜唇石斛l b a p h y l l u m ( r o x b ) c ef i s c h e r 中提取到的多糖进行试验，发现能够明显增加小鼠抗体细胞数量、t 细胞和 b 细胞的增殖，而认为具有免疫增强作用。菲类和联苄类物质被认为是石 斛中抗肿瘤作用的活性成分。l e e ( 1 9 9 5 ) 研究了金钗石斛乙酸乙酯提取物 对肿瘤细胞株有显著的细胞毒作用，进一步分离得到了两种化合物，并发 现与乙酸乙酯提取物具有相同的药理作用。马国祥等( 1 9 9 4 ) 从鼓槌石斛 ( n c h r y s o t o x u m l i n d l ) 中分离到5 种化合物，进一步的研究发现三种化合 物具有不同程度的抗肿瘤活性，并且其毒副作用可能远低于肿瘤化疗药物。 还发现石斛对人的胃酸分泌有明显的促进作用，这是由于石斛能使血中胃 泌素浓度升高，胃泌素刺激壁细胞，使胃酸分泌增加( 陈少夫等，1 9 9 5 ) 。 第三节药用石斛的种质保存和开发应用前景 1 0 l 药用石斛的种质保存 1 9 8 8 年，世界卫生组织国际自然和自然资源保护联盟和世界自然基金 会联合在泰国召开联合会议，特别强调了药用植物种质保护的重要意义。 我国尽管具有使用药用植物历史悠久，药用植物种类丰富等条件，但由于 环境及其他一些因素，造成目前资源破坏严重，因此有必要进行积极的、 有系统的药用植物资源研究工作( 潘映红等，1 9 9 0 ) 。 药用石斛的种质保存，具有更为迫切的需要。石斛属植物在自然条件 下繁殖率低，生长缓慢，并且对环境条件要求苛刻，加之人为的大量采挖， 已经受到了严重地威胁。铁皮石斛已经被列入我国濒危保护植物，而其他 多数种类也同样面临着严重的生存压力，保护药用石斛植物资源，也就更 显得紧迫和重要了。 史永忠等( 1 9 9 9 ) 对铁皮石斛种质进行了室温离体保存研究，通过在 培养基中添加低浓度的n a a ，4 0 9 l 的蔗糖和活性炭，在室温下保存铁皮 石斛试管苗1 2 个月，存活率为1 0 0 。张治国等( 1 9 9 7 ) 研究了铁皮石斛 种子超低温保存成活率的影响因素，包括种子的含水量、解冻的方法，恢 复生长的方法及保存时间等，发现铁皮石斛种子的含水量降低到8 一1 8 时，直接投入液氮保存，4 0 c 水浴快速解冻后，种子的萌发率为9 2 - 9 5 ， 与未经冻存的种子无明显差异。其中以种子的含水量最重要。该项研究还 发现，尽管铁皮石斛的种子只是一个有9 0 多个细胞的球形胚，却具有较强 的脱水耐性，将自然条件下含水量4 1 左右的种子，直接脱水( 9 6 h ) ，含 水量降低到8 左右，萌发率并没有降低。由于种子的采集不仅时间性强， 采摘方法也相当困难，王军辉等( 1 9 9 9 ) 、陈勇( 2 0 0 0 ) 研究了铁皮石斛原 球茎、类原球茎及原生质体的超低温保存，采用了玻璃化保存的方法，各 种材料都能达到6 0 8 0 的存活率，但也发现玻璃化保护剂处理时，会对材 料产生较大的伤害，活性明显低于未处理材料( 陈勇，2 0 0 0 ) 。 2 药用石斛研究展望 石斛是直接入药的一类中药，由于经济价值高，采挖量大，加之生长 环境要求苛刻，在自然环境下生存压力很大，指使野生资源面l 睫枯竭。目 前对此类植物的人工引种、栽培，在某种意义上保护了种质资源。因此研 究的重点收集种质资源，培育出质量好、产量高、抗病虫害能力强、易于 栽培的新品种( 潘映红等，1 9 9 0 ) 。顾月华等( t 9 9 8 ) 已经报道了包括石斛 在内的多种中药植物卫星搭载诱变效应，在我国药用石斛育种工作中，走 出了可喜的一步。 2 1 组织培养物直接药用 由于石斛属植物大多生长缓慢，一直都存在着栽培难度高、产量低、 进入盛产期的年限长等一系列问题。黄民权等( 1 9 9 8 ) 比较了铁皮石斛组 织培养物与原植物之间多糖含量及其单糖化学组成的差异，并在药理学方 面对一些免疫指标进行了试验，结果表明组织培养物在多糖含量及单糖组 分上与原植物都明显相似，对小白鼠白细胞数的提升及移动抑制指数也与 原植物相似，因而提出以组织培养物代替其原植物直接药用的可能，并认 为具有诱人的保护生态环境和商业前景。 2 2 基因工程育种 利用根癌农杆菌介导法获得转基因植物的关键是毒性基因的诱导表 达，而在单子叶植物中常常由于这种诱导物质的缺乏而使通过该法获得转 基因植物困难。n a n 等( 1 9 9 7 ) 发现石斛属植物在p l b 发育早期有大量的 松柏醇产生，可以诱导毒性基因的表达。这使透过农杆菌介导法将一些基 因转入石斛的p l b 成为可能，同时也为药用石斛的基因工程育种奠定了良 好的基础。此外，利用基因枪法，c h i a 等( 1 9 9 5 ) 己经成功的将荧光索酶 基因导入p l b ，并在由p l b 培养成的小植株中表达。尽管药用石斛基因工 程方面的研究还相当少，但已经有了一个良好的开端，我们可以期望，在 药用石斛品种改良的工作中，基因工程将发挥极大的作用。 1 2 由于在自然条件下，石斛属植物尤其是几种重要的药用石斛，授粉和 结实率较低，因此种子的获得不仅受到季节的严格限制，而且相当困难。 在目前的研究中，药用石斛离体快繁体系的建立，通常是以成熟或未成熟 的种子以及幼嫩的茎为外植体，尽管种子作为外植体具有操作简单、成活 率高，数量扩增迅速等优点，但外植体材料获得的困难，却又成为极大的 限制因素；以幼茎为材料，又会对植株的生长产生极为不良的影响，同时 也受到季节的限制。以2 3 年生的老茎为外植体材料，同时克服了上述两 种外植体材料的缺陷，不仅材料量大，而且在任何季节均可取材，尽管存 在消毒困难、腋芽萌发率较低等问题，但由于材料充足，加之在方法上的 改进，完全能够满足药用石斛离体快繁体系建立的需要。 本论文在建立了金钗石斛和铁皮石捧i 离体快繁体系的基础上，以铁皮 石斛类原球茎为材料，研究了其脱水耐性的诱导条件、细胞学变化及相关 基因。一方面为种质资源的超低温保存和人工种子的制造提供技术和理论 支持；另一方面，由于石斛属植物在自然条件下具有较强的脱水耐性，该 研究也为植物脱水耐性的机理研究提供参考。 尽管石斛属植物具有较强的脱水耐性，而对其脱水耐性的人为诱导以 及进一步的研究目前还未见报道。脱水耐性诱导体系的建立和条件、效果 的稳定，为其脱水耐性机理的进一步研究奠定了基础。利用d d - r t p c r 技 术，研究脱水耐性和敏感性类原球茎基因表达的差异，为类原球茎脱水耐 性的产生机制，提供分子水平的依据，也为目前植物脱水耐性研究提供有 益的参考。 第二章铁皮石斛和金钗石斛的组织培养 第一节研究概述药用石斛的组织培养 在自然条件下，石斛的繁殖率极低，主要有两方面的原因：其一是种 子细小，粒重仅为o3 0 4ug ，种胚存在后熟现象，果实成熟时，种胚的发 育不超过球型期，而且种子缺乏胚乳( 张明等，2 0 0 0 ) ；其二是需要共生菌 的存在。因此，利用种子进行人工播种，存在萌发率过低的问题。在生产 中往往采用分株、扦插等营养繁殖的方法，但繁殖系数低的问题却难以解 决。 利用组织培养技术，对药用石斛进行离体快速繁殖，是目前解决生产 中种苗问题的最佳方法。利用石斛茎尖作为外植体，进行离体繁殖的技术， 是由法国人g m o r e l 在1 9 6 0 年创立的，此后得到了广泛的应用。我国石斛 离体繁殖技术的研究，始于1 9 8 4 年徐云目g 对霍山石斛( 1 ) h u o s a n e n s e c z t a n ge t s jc h e n g ) 试管苗的研究报道。之后，关于药用石斛离体快繁的 研究报道急剧增加，不仅对铁皮石斛( 易明林等，1 9 9 3 ) 、叠鞘石斛f d d e n n e a n u m k e e r ) ( 刘骅等1 9 8 9 ) 、美花石斛( d 1 0 d d i g e s i ir o l f e ) 、密花石斛 ( d d e n s 妒o r u ml i n d l ) 等( 曾宋君等，1 9 9 8 ) 不同石斛种的组培快繁已经获 得成功，而且在培养条件，培养基的选择，激素的使用等一系列技术问题 都得到了迸一步的优化，总结起来，主要包括以下几方面的工作： 1 种子的试管萌发： 尽管石斛种子在自然界的萌发和成苗率极低( 一般只有1 5 ) ( 李铭 宗，1 9 9 9 ) ，但在培养基上却有很高的萌发率，多数的报道都在9 0 以上， 并且只要培养条件适宜，多数都能在无菌条件下成茁。赵天榜等( 1 9 9 4 ) 用铁皮石斛和曲茎石斛种子进行的实验表明，种胚成苗最佳的培养基是n 6 ， 其次是s h 、k n 和m s 最差的是1 2 m s 靼1 2 v w ；曾宋君等( 1 9 9 8 ) 以5 1 4 种石斛属植物为材料，在s h 、改良n 6 、m s 、k s 、v w 和k u n d s o nc 六种 培养基上播种，观察对种子萌发和成苗的影响，结果是除个别种类在m s 培养基上难于萌发成苗外，石斛的种子在其他几种培养基上都能正常的萌 发并成苗，其中以s h 和改良n 6 的效果最好，而m s 、k s 等效果稍差。同 时还发现低浓度的n a a 对萌发和成苗均起促进作用；低浓度的6 - b a 能够