（应用化学专业论文）毛细管电泳研究致癌物3氯12丙二醇.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名： 日期：扣吖年，) ，月谚日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 导师签名：坠鱼 日期：一砗f 明谚日 摘要 摘要 本课题旨在运用毛细管电泳电化学检测法研究致癌物3 氯1 ，2 一丙二醇 ( 3 一m c p d ) 。课题研究主要包括三部分。1 、建立酱油中3 一m c p d 含量的测定方法： 2 、研究3 一m c p d 水解反应的物化常数一水解反应的活化能和速率常数：3 、实验室小 试，探索在生产酸水解植物蛋白中控制和消除3 一m c p d 的最佳工艺条件。 第一部分，主要是研究毛细管电泳电化学检测法测定酱油中3 m c p d 含量的最佳 实验条件。酱油中存在多种干扰因素，实验选取与3 一m c p d 结构性质相似的丙二醇和 丙三醇为干扰物加以考虑。实验结果表明，在3 0 m m o l l 、p h 9 2 4 的硼砂缓冲溶液中， 施加1 2 k v 的分离电压，三种物质有较好的分离效果；用0 4 5 m m 铜电极在o 6 5 v f w s c d 的电极电位下，三种物质有较好的响应，从而能够实现定量检测酱油中3 一m c p d 的含 量。该法对3 一m c p d 的线形范围为2 0 l o 。4 m l 至6 6 1 0 4 咖l ，检测限( s n = 3 ) 为1 3 l o 。7 咖l ，实际样品测定3 一m c p d 的平均回收率为9 3 8 1 0 7 7 。 第二部分，主要研究了3 一m c p d 的水解反应，并推算了水解反应的物化常数。在 8 0 ，8 5 ，9 0 的条件下恒温水浴加热，用毛细管电泳电化学检测法监测不同的反应 时间段水解液中3 一m c p d 的含量。结果表明，3 一m c p d 的水解反应遵循一级反应的 规律，随着温度的升高反应速率增大。在8 0 ，8 5 和9 0 ，算得水解反应速率分别 为3 8 1 0 。m i n - 1 ，7 1 1 0 。m i n 。和1 1 5 1 0 。m i n - 1 ，水解反应的活化能为1 1 8 1kj m o l ， 结果与文献资料吻合。 第三部分，主要探索酸水解植物蛋白调味液生产中控制和消除3 一m c p d 含量的最 佳工艺条件。在不同的水解温度( 8 5 、9 0 ) 、p h 值( 5 0 - 8 o ) 和水解作用时间( 1 h 6 h ) 下，分别进行水解反应实验，用毛细管电泳电化学检测法测定不同时段3 一m c p d 的含 量，选取控制3 一m c p d 含量在允许范围内的最佳水解条件。最佳水解条件下，在自制 的酸水解植物蛋白调味液中进行实验，考察最佳工艺条件的选取可靠性。结果表明，在 p h 8 0 、9 0 下水解1 h 能有效的控制3 一m c p d 的含量在国家允许的限量标准以内。 关键词：毛细管电泳电化学检测3 氯一l ，2 一丙二醇 江南大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h em e s i si n c l u d e st h r e ep a n s ：1 d e t e n l l i n a t i o no f3 一c h l o r o l ，2 p r o p a n e d i o l i ns o y s a u c e sb yc a p i l l a d re l e c t r o p h o r e s i sw i me l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n 2 d e t e 矾i n a t i o no fr a t e c o n s t a l l t sa 1 1 da c t i v a t i o n e n e r g y o f3 一c h l o r o l ，2 p r o p a i l e d i o l h y d r o l y s i sb yc a p i l l a r y e l e c t m p h o r e s i s 、i t l l e l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n3 s t u d y o nt 1 1 e e l i m i l l a t i o no f 3 c h l o m l ，2 一p r o p a r i e d i o li nh y d r o l y z e dv e g e t a b l ep r o t e i nb yc a p 川a r ye l e c t m p h o r e s i s 埘t 1 1 e l e c t m c h e l l l i c a ld e t e c t i o n i nc h 印t e r1 ，t h e c a p 1 l a r ye l e c t r o p h o r e s i st e c l l l l i q u ew i t l le l e c 仃o c h e m i c a ld e t e c t i o n ( c e e d ) f o rd e t e 咖i n a t i o no f3 一c h l o m l ，2 p m p a n e d i o l ( 3 一m c p d ) i ns o y s a u c e sw a s d e s c r i b e d ，e 行b c t so fs e v e r a if a c t o r s ，s u c ha st h ep hv a l u ea n dt h ec o n c e n t r a t i o no ft l l e r u r u l i n gb u 髓r ，s 印a r a t i o nv 0 1 t a g e ，i n j e c t i o nt i m e 柚dt h ep o t e n t i a la p p l i e dt ot 1 1 ew o r k i n g e l e c t r o d e ，w e 陀i n v e s 魄a t e dt o 矗耐t h eo p t i m u r nc o n d i t i o n s ，w 洫a5 0c mi e n g mo f2 5 恤m d “l m e t e r 缸s e d s i l i c ac a p i l l a r y ，w e l l 一d e f i n e ds e p a r a t i o no f3 一c h l o r o 一1 ，2 一p r o p a n e d i o lf b m p r o p a l l e d i o la n dg l y c e r o lw a sa c k e v e di n3 0m m o l 咒b o r a ) ( ( p h9 2 4 ) 晰m i n1 3m i n 0 p e r a t e di naw a l i _ j e tc o n f i g u r a t i o n ，ao 4 5m mc o p p e 卜d i s ke l e c t r o d eu s e da sm e 、v o r l ( i n g e l e c t m d ee x h i b i t sg o o dr e s p o n s ea to 。6 5v ( v s s c e ) f o rt h ea n a l ”e si no ，0 5m o l ，ls 。d i 啪 h y d r o x i d es o l u t i o n t 1 l el i n e a rr a n g ef o r3 一m c p dw a s 疗o m2 0 l0 _ 4 m lt o6 6 lo b 咖1 n o t a b l y ，d e t e c t i o ni i m i t ( s 小= 3 ) o f1 3 l o 叫咖lf o r3 一c h l o m l ，2 一p r o p a n e d i o lc o i n c i d e s w i t hm ec r i t e r i o no ff o o ds a f e t y t h i sm e t h o dw a ss u c c e s s 向l l yu s e di nt h er a p i da i l a l y s i so f 3 一m c p di n s o ys a m p l e s t h ea v e r a g e r e c o v e r i e so f9 3 _ 8 1 0 7 7 i n d i c a t e dt h a tt h e e x p 甜m e n t a lr e s i l l t sw e r es a t i s f a c t o r y i nc h a p t e r2 ，山em e t h o db a s e do n c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sw i t i le l e c t r d c h e m i c a l d e t e c t i o n ( c e e d ) t oc a l c u l a t et h er a t e c o n s t a n t sa n da c t i v a t i o n e n e r g yo f3 一m c p d h y d r o l y s i sv ，a sd e s c r i b e d 0 p e r a t e di nt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，w h i c hw e r es t u d i e di nc h a p t e r 1 ，t h er a t ec o n s t a l l t so f3 一m c p dh y d r o i y s i sa td i f r e r e n tt e m p e m t u r e sw e r ed e t e n 】1 i n e db y m o n i t o r i n gt l l ec o n c e n t r a t i o nc h a i l g e so f3 一m c p d a t8 0 ，8 5 a i l d9 0 ，t h em e a s u r e d r a t ec o n s t a n t so f 3 一m c p dh y d r o l v s i sw e r e3 8 1 0 3m i n - ，7 1 1 0 3m i n 1a n d1 1 5 1o 3m i n 一， r e s p e c t i v e l y t 1 1 ea c t i v a t i o ne n e 唱yf o r3 一m c p dh y d r o l y s i sw a sc a l c u l a t e dt ob e1 18 1 k j m o l ，w h i c hi si ng o o da g r e e m e mw i t ht h ev a i u ei nm ei i t e m t u r e i nc h 印t e r3 ，t h em e t h o dt oe l i m i n a t e3 一c h l o r o l ，2 一p r o p a n e d i o li nh y d m l y z e dv e g e t a b l e p r o t e i nb yc a p i l l a ye l e c t r o p h o r e s i sw i t he l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o nw a ss t u d i e di n 山i sw o r k t h eo p t i m 啪c o n d i t i o nt od e t e 姗i n e3 一m c p di n h y d r o l y z e dv e g e t a b l ep r o t e i n 、v a s i n v e s t i g a t e d 0 p e r a t e d 曲t i l eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，w h i c hw e r es n 】d i e di nc h a p t e rl ，t h ee f c t s o fp hv a l u e ，t e m p e r a t u r ea 1 1 dh y d r o l y s i st i m eo ne l i m i n a t i o no f3 一c h l o m l ，2 p r o p a i l e d i o li n 2 摘 要 h y d r o l y z e dv e g e t a b l ep r o t e i nw e r es t u d i e d b ya d j u s t i n gh y d r 0 1 y z e dv e g e t a b l ep r o t e j nt op h v a l u eo f8 0a i l dh e a t i n gu pf o rlh o u ra t9 0 ，t | l ec o n t e n to f3 一m c p di nh y d m l y z e d v e g e 曲l ep r o t e i nc o u l d b ec o n 昀l l e du n d e rt h el e v e lo f1 om 啦舀w h i c hc o i n c i d e dw i t ht h c c r i t e r i o no f f o o ds a f e t y k e yw o r d s ：c a p i l l a r ye l e c t f o p h o r e s i s 周e c 仃o c h e m i c a ld e t e c t i o n ；3 c h l o 给l ，2 一p r 叩a n e d i o l 3 c e ： c z e ： 狂! c c ： c g e ： c i e f ： c i t p ： i c e c ： c e c ： e d ： c d ： 3 d c p ： 2 3 d c p ： 3 m c p d ： 2 m c p d ： h p ： h v p ： h a p ： 符号与缩写 毛细管电泳 毛细管区带电泳 胶束电动毛细管色谱 毛细管凝胶电泳 毛细管等电聚焦电泳 毛细管等速电泳 集成毛细管电泳芯片 毛细管电色谱 电化学检测器 电导检测 1 ，3 一二氯一2 一丙醇 2 ，3 一二氯一l 一丙醇 3 氯1 ，2 丙二醇 2 一氯一1 ，3 丙二醇 水解蛋白 水解植物蛋白 水解动物蛋白 江南大学硕士学位论文 1 1 毛细管电泳概述 第一章绪论 毛细管电泳( c a p i l l a d ，e l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 是离子或荷电粒子以高压电场为驱动 力，以毛细管为分离通道，依据样品中组分之间的淌度或分配系数的差异，而实现高 效、快速分离的一类电泳新技术。仪器装置包括高压电源、毛细管、检测器以及供毛 细管两端插入且和电源相连的两个储液瓶。毛细管电泳的分离过程是典型的差速运动 过程。混合物在迁移过程中，各样品分子因自身的速度不同，将逐渐分成不同的方阵( 区 带) ，快者前，慢者后。时间或距离越长，方阵越小、数目越多、距离越开，即分离越 好。在分离通道的终点安装一种检测器，把分子通过终点的情况记录下来，即可得到 电泳图谱。以最常用的毛细管区带电泳为例，毛细管和电极槽内充有相同组分和相同 浓度的背景电解质溶液。样品从毛细管一端( 进样端) 导入，当毛细管两端加上一定的 电压后，荷电质朝与其电荷极性相反的电极方向移动。同时，由于毛细管内壁与缓冲 溶液接触的界面形成双电层，导致毛细管内的溶液在外加电场的作用下整体朝一个方 向运动。即电渗流现象。由于电渗流的速度比电泳速度快5 7 倍，因此毛细管电泳利 用电渗流可将正、负离子和中性分子一起朝一个方向移动，而离子或荷电粒子迁移速 度是电泳和电渗流速度的矢量和。由于样品各组分间迁移速度的不同，经过一定时间， 各组分按其速度大小依次流出毛细管到达检测端进行检测，得到按时间分布的电泳谱 图。用谱峰的迁移时间作定性分析：按其谱峰的高度或峰面积进行定量分析。 1 1 1 毛细管电泳的分离模式 毛细管区带电泳( c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ，c z e ) 吲是毛细管电泳的最基本的工 作方式。它采用均一的、组成不因电场作用而发生变化的电解质体系，通常是缓冲溶 液作为背景电解质( b g e ) ，其作用是为电流的通过提供介质，建立恒定电场，并影响样 品组分的有效淌度。当被分离组分从毛细管一端引入后，各组分在电场力和电渗流的 双重作用下以恒定但不同的速度向另一端迁移，经过一定时间以后，分离成若干谱带。 分离主要依赖于组分之间有效淌度的差异。c z e 可以实现阴阳离子同时分离。但对中 性组分无分离效果。对c z e 中的毛细管和b g e 进行修饰可以衍生出许多其它的分离 模式。迄今，它也是应用最多的模式，可用于【3 叫氨基酸、肽、蛋白质、简单离子和对 映体等分析，但c z e 仅适合于荷电粒子的分离分析。 胶束电动毛细管色谱( m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i cc l l r o m a t o g r a p h y ，m e c c ) 【5 】是采用表面 江南大学硕士学位论文 活性剂在运行缓冲液内形成动态胶束，利用样品各组分在水相、胶束楣两相问分配行 为上的差异进行分离，是色谱技术和电泳技术的结合。此模式不仅能分离带电离子， 而且能分离中性分子，主要用于手性拆分、药物分析等。 毛细管凝胶电泳( c 印i l l a r yg e le l e c t m p h o r e s i s ，c g e ) 忡j 是将凝胶充入毛细管中作支持 物，样品中各组分不仅受电场力的作用，而且还受凝胶的尺寸撂阻效应( 分子筛效应) 的影响，不同体积的溶质分子在起分子筛作用的凝胶中得以分离。凝胶粘性大。抗对 流，能减少溶质扩散，柱效高。c g e 是分离度极高的一种电泳分离技术。后来出现了 无胶筛分，用粘度低的线性聚合物溶液代替高粘度的聚丙烯酰胺，同样起到了分子筛 的作用，而且比凝胶柱便宜，寿命长。但是c g e 制备困难，易产生空泡。c g e 对荷 质比接近但分子大小形状不同的样品如蛋白质、r n a 、d n a 及其碎片具有很高的分离 能力，现已广泛用于d n a 片段的分析1 7 。 毛细管等电聚焦电泳( c 印i l l a r yi s o e l e 砸cf o c u s i n g ，c i e f ) ”j 是在毛细管内形成p h 梯度，样品组分因其等电点的不同而分离。通常使用等电点有一定分布的同系的混合 两性电解质溶液作为b g e 。在外加电场的作用下，b g e 的组成沿毛细管轴向发生变化， 各种两性电解质按其等电点大小顺序依次排列，形成稳定的p h 梯度。当两性样品被 引入后，在电场作用下。各组分均向等于其等电点值的p h 处移动，到达此点后因失 去净电荷而停止移动从而实现分离，再通过改变电解质体系或压力驱动的方式，进行 洗脱检测。c i e f 可用于测定蛋白质的等电点】、分离异构体等。 毛细管等速电泳( c a p i l l a r yi s o t a c h o p h o r e s i s ，c i t p ) 是一种不连续介质电泳技术。 两极浸入不同的电解质溶液中，为前导和终末电解质缓冲液，记作l e 和t e ，前导电 解质中含有淌度大于样品中所有离子淌度的前导离子，尾随电解质中则含有淌度小于 样品中所有离于淌度的尾随离子，样品加在两电解质的界面处，电泳达稳态后，各区 带依次相随，界面清晰，以前导离子领先，尾随离子随后，分析物按淌度大小的顺序 排列向一端移动。c i t p 中可使用较大内径的毛细管，在微制备中很有用途，可作为柱 前浓缩方法用于富集样品。 集成毛细管电泳芯片( i n t e g r a t e dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sc h i p s ，i c e c ) 【1 3 】是将毛细 管缩微移植到很小芯片上，将样品进样、反应、分离、检测等过程集成在一起的多功 能快速、高效、低耗的缩微实验技术。即在硅、玻璃、塑料等基体上刻蚀毛细管槽， 用盖板封闭好后，利用电场分离物质，它使c e 分离物质的整个过程在一块几平方厘 米的基片上得以实现。再用激光诱导荧光、电化学、化学等多种检测系统检测以及与 质谱等分析手段结合进行样品分析，广泛用于生物生化、d n a 、氨基酸的分离等方面。 毛细管电色谱( c a p i l l a r ye l e c t r oc h r o m a t o 伊a p h y ，c e c ) 1 ”】是结合毛细管电泳和 h p l c 的优势发展起来的新型电分离液相色谱技术。c e c 一般采用熔硅石英毛细管柱， 在柱内填充或管壁键合固定相，用高压电源( 或加一定的压力) 代替高压泵，以电渗流驱 动流动相，溶质依据它们在两楣分配系数的不同和自身电泳淌度的差异得以分离。c e c 把c e 的高效和h p l c 的高选择性有机结合，形成了独特的高效、微量、快速的特点。 6 江南大学硕士学位论文 毛细管电泳的多种分离模式，给样品分离提供了不同的选择机会，这对复杂样品 的分离分析非常重要。 1 1 2 毛细管电泳检测器 c e 以其高效、微量、快速等特点引起了广泛的重视，因为毛细管内径极小( 通常 为2 5 1 0 0 微米) 和纳升级的进样量，对检测器的灵敏度要求很高。检测接口是c e 中的 关键问题。经过多年的科学研究，已有多种检测器能够用于c e 中。但已商品化的只 有u v 、l i f 和m s 。 c e 检测器的检测限和特点如下表1 1 示。 表1 1 c e 检测器的检测限和特点 检测器 检测限( m o l 几) 特点 紫外可见吸收 1 0 1 0 一6 近似通用，常规应用 激光光热 1 0 - 一1 0 s 灵敏度高，受激光波长限制 荧光 非相干光诱导 l o 一l o 一8 灵敏度高 激光诱导 1 0 1 0 一1 0 。1 2 灵敏度高，价格高 折射指数 1 0 一一1 0 7通用，简单，灵敏度低 电化学 电导 1 0 一1 0 。7通用 安培 1 0 一一1 0 9 灵敏度高，选择性好，微量 质谱 1 0 _ 。一1 0 9 仪器复杂，可获得结构信息 放射 l o 一一l o l l 灵敏度高，特殊操作 间接法 间接紫外 1 0 - 4 一l o 。5 间接安培法 1 0 _ 。1 0 6 毛细管电泳中应用最广泛的是紫外可见( u v ) 检测器，其通用性好，结构简单， 加上商品化检测器已有较高性能，u v 是目前应用最广泛的一种c e 检测器。它主要由 7 垩塑查兰堡主兰竺笙垄 光源、光路系统、信号接受和处理系统构成。但是其灵敏度低，较难适合于痕量分析。 激光诱导检测器( l i f ) 是所有检测方法中灵敏度最高的一种方法，其检测限达 到1 0 。o l o 。2 m o i ，l 。c e 荧光检测系统主要由激光光源、激发和收集光学系统、信号检 测、显示或记录系统组成。但是大多数化合物本身不发荧光，在荧光检测时需要进行 衍生化处理，所以此法使用范围狭窄，操作较为繁琐。 质谱( m s ) 法灵敏度高，专属性强，能够提供分子信息，是c e 理想的种检测 器。c e 的高效分离和m s 的高鉴定能力相结合，使得能用n l 级样品进行分子结构分 析和分子量的准确测定，成为微量生物样品分析的强有力工具。近年来，该方法己在 多肽和蛋白质的分离分析中广泛使用。但是此方法造价昂贵，大多数样品需要衍生化， 操作复杂，难以广泛使用。 电化学检测器( e d ) 可避免光学类检测器遇到的因光程太短导致的灵敏度低的问 题。c e 的电化学检测有三种基本的模式：安培法、电导法和电位法。电导法和电位法 是测量两极间由于离子化合物的迁移引起的电导率或电位的变化。安培法测量化合物 在电极表面受到氧化或还原反应时，失去或得到电子，产生与分析物浓度成正比的电 极电流而进行检测的一种方法。 电化学检测器是较灵敏的检测器之一，其中安培检测具有灵敏度高、选择性好、 线性范围宽、设备简单、仪器造价低廉，易于普及。安培检测对于大多数易于氧化还 原反应物质的浓度检测限可达到1 0 母m o i l ( 质量检测限可达f m o i 柚o i ) 常用电极多为碳 纤维电极、铂丝、金丝、铜丝等金属电极。安培检测法的缺点在于它仅能检测具有电 活性的物质，重现性尚不理想。历年来。已有多篇论文评述了c e 中电化学检测方法 ( 1 s 吲。 安培检测主要采用离柱安培检测和柱后安培检测来隔离高压的干扰。结构示意如 下图1 1 示。 离柱型检测最简单的接口设计是在端口处不作任何处理【20 1 。为了增加接口的稳定 性，减少样品在接口处流失，通常在毛细管断口处加上导电接口。接口材料通常用多 孔玻璃、n a f i o n l 2 1 2 3 1 、t e n o n 【2 4 1 、醋酸纤维素接口【2 5 2 6 1 和毛细管蚀刻【2 7 】等。离柱型检 测虽然降低了检测噪音，但是接口制作繁琐、存在区带变宽现象、分离电压和电流难 以达到完全接地的状态。 柱端型检测不采用任何接口，直接将工作电极置于毛细管出口位置进行检测。l u 、 c a s s i d y 【2 8 】和l i u 【2 9 】等分别研究了毛细管内径和电极对测定灵敏度的影响。叶建农h l 】等 提出了用大直径的圆盘电极进行射壁式安培检测，改善了检测方法的稳定性和重现性。 近年来国内科研人员对柱端安培检测法进行了改进【3 0 3 4 】。 江南大学硕士学位论文 本实验室建立的毛细管电泳一电化学检测系统自组装装置，正是基于柱端检测这 一技术。 a b 图1 1 离柱型和柱端型c e 安培检测示意图a ：离柱型b ：柱端型 1 高压电源；2 缓冲液池；3 。毛细管；4 安培检测器；5 柱端型安培检 测池；6 离柱型安培检测的接口处溶液池；7 离柱型安培检测的检测池 1 1 3 毛细管电泳装置及其特点 毛细管电泳系统的基本结构包括进样、填灌清洗、电流回路、毛细管温度控 制、检测记录数据处理等部分，如图1 2 所示 3 5 】。 9 江南大学硕士学位论文 图1 2 毛细管电泳系统的基本维构 l 一裔压电毂稽与避样机梅i2 一填澄清洗钒拇i3 一毛缨臂i 4 一捡潞器5 铂丝电授，6 一低压电彀槽，7 一恒温钒挎 8 一记录数据处理 毛细管通常使用内径为2 5 一1 0 0 牡m 的弹性熔硅石英毛细管，标准外径为3 6 0 脚， 因此毛细管具有容积小、侧面截面面积比大有利于散热且可承受高电场、可使用自由 溶液和凝胶等支持介质、能产生平流形状的电渗流等特点。毛细管的这些特性决定了 毛细管电泳具有以下特点： l 、高效效率在1 0 5 1 0 6 塔板m ，c g e 效率可达1 07 塔板m 以上。 2 、快速几十秒十几分钟能完成分离任务。 3 、微量进样体积仅需几个n l ，消耗运行缓冲液在1 5 0n l 之间。 4 、多模式可根据不同需要选择不同的分离模式，且只需一台仪器。 5 、分析对象广从无机离子到有机大分子，乃至整个细胞。 6 、经济实验消耗仅几个m l 的缓冲溶液，费用极低。 7 、洁净通常使用水溶液，对人和环境无害。 同时，毛细管电泳也存在着一些问题： l 、制备能力低。 2 、光路检测时，由于光路太短，需要高灵敏检测器联用。 3 、毛细管内壁存在吸附，影响电渗流，容易影响分离的重现性。 4 、制备凝胶管需要专门的灌制技术。 1 23 一氯一1 ，2 丙二醇概述 随着二嗯英、“酱油风波”、农药、兽药残留，以及苏丹红和对位红等有毒物质在 食品中的发现，食品安全问题已经成为政府部门、科技界和消费者高度关注的重要领 域。食品安全涉及到了食品卫生检验中有相当多的检测项目，如防腐剂、色素、有害 1 0 江南大学硕士学位论文 金属、毒素以及生产过程中产生的有毒物质等。由于食品成分的复杂，干扰因素多， 因此除对样品的前处理有非常严格的要求外，对检测方法也有较高的要求。 氯丙醇是继二嗯英之后食品污染领域又热点，被列为食品添加剂联合专家委员 会( j e c f a ) 优先评价项目，是食品安全的五大热点问题之一。1 9 9 9 年欧盟检测出我国出 口酱油中氯丙醇超标，从而使我国部分企业产品被禁止进口，为此我国开展对氯丙醇 调查和研究，以帮助企业改进生产工艺，建立统一国家标准，利于与国际接轨，馒我 国酱油工业能长期健康发展。 1 2 1 来源 氯丙醇( c 1 1 l o m p r o p a l l o l s ) 是丙三醇上羟基被氯取代1 至2 个所产生的一类化合物， 所构成的一系列同系物、同分异构体的总称，主要包括l ，3 二氯一2 - 丙醇 ( 1 ，3 一d i c h l o r o - p r o p a l l e o l ，3 一d c p ) ，2 ，3 一二氯一1 丙醇( 2 ，3 一d i c h l o r o p r o p a n e o l ，2 ，3 一d c p ) ， 3 一 氯一l ，2 一丙二醇( 3 - m o n o c h l o r o p r o p a i l e l l ，2 一d i o l ，3 一m c p d ) ， 2 一氯一l ，3 一丙二醇 ( 2 m o n o c h l o m p r o p a n e l 1 ，3 一d i o l ，2 一m c p d ) 四种丙三醇的氯取代物。结构式如下图1 3 所示： h ，c c l l h c o h l h 2 c o h 3 一m c p d2 一m c p d1 。3 d c p2 ，3 一d c p 图1 - 3 四种丙三醇氯取代物的结构式 按传统方法生产的发酵酱油中并不会产生氯丙醇。而随着经济发展，应运而生的 酸水解植物蛋白质调味液，由于成本低，且具有氨基酸系列物质和呈鲜味性成分。能 增加食品中营养成分，而成为近年来蓬勃发展起来新型调味品原料。酸水解植物蛋白 质液制备的常用水解工艺是【3 7 3 8 i ：将植物蛋白用浓盐酸在1 0 5 1 1 0 下回流酸解，在这 过程中，为了提高氨基酸得率，常常加入过量盐酸。此时若原料中还留存油脂，则其 中三酰甘油就同时水解生成丙三醇，并进一步与盐酸中氯离子发生亲核取代反应。生 成一系列氯丙醇类化合物。张思群等研究了酸解反应机理，甘油二油酸在水相反应介 质中溶解度低，但能与盐酸反应，带有酯基的部分甘油酯能形成环状离子中间体，使 反应得以切实进行，生成的氯丙二醇的量反而比丙三醇高。而且，由于区域专一性强， h c d o 一 一 一 clicic 叱 h 也 h c o c 一 一 一 ciicic h ， h h h o c o 一 一 一 cilcic 叱 h 也 江南大学硕士学位论文 3 一m c p d 2 一m c p d 之比可达到1 0 ：l 。因此，在实际的酸水解植物蛋白调味液中，四 种氯取代物中3 一m c p d 含量最多的。 ；一m c p d 主要和首先发现在酸水解植物蛋白调味液中，2 0 0 1 年以后，英国相继 对其他食品中3 一m c p d 进行了调查，最可能含有的3 m c p d 的5 类食品为包括谷物、 汤料、肉制品和乳制品，其中在焙烤食品口、面包和烹调和腌制肉鱼中，3 一m c p d 的含量相对较高。 同时，一些饮用的自来水也发现受到了污染。主要是由于自来水厂和某些食品厂 采用阴离子交换树脂进行水的纯化，而交换树脂采用1 ，2 环氧3 一氯丙烷 ( e i c h l o r o h v d r i n ，e c h ) 作为交联剂，而e c h 水解产生3 一m c p d 造成了污染。同样， 用e c h 作交联剂强化树脂生产的食品包装材料( 如茶叶包装袋、咖啡滤纸和纤维肠衣等) 也是食品中3 一m c p d 来源之一。此外，某些发酵香肠中发现有氯丙醇的存在，这可能是 脂肪与盐发生反应的结果，或是肠衣中使用的强化树脂发生迁移而产生的。 1 2 2 毒性及使用限量标准 氯丙醇的毒性很久以来就有报道，第5 7 次j e c f a 会议( 2 0 0 1 年) 对3 一m c p d 的毒性已 进行了全面的评价，包括其致癌性、肾毒性和生殖毒性。动物实验研究表明可引起肾 体比增大、肾小管增生和变性，肾肿瘤增加生殖能力下降等。j e c f a 采用肾小管增 生作为确定3 一m c p d 耐受摄人量的最敏感毒性终点。 据长期动物试验的相关研究报道【4 ”，肾和睾丸是3 一m c p d 的主要毒作用靶器 官。经口灌胃给予大鼠或经水给予雄性大鼠不同剂量的3 一m c p d ，不同的时间段后，大 鼠肾体比增大，动物体重显著降低，并出现程度不等的肾毒性病理改变，精子数目降 低，存活率也降低，睾丸和附睾出现病理改变，生殖能力明显降低。经过多位学者的 致癌性研究发现：3 m c p d 用量达到3 0m g 蚝会使大鼠肾小管产生扩张和坏死；饮 水中3 m c p d 的剂量水平为2 8m g 蚝时即可致癌。 因此，在食品安全体系中建立3 一m c p d 允许限量标准很有必要，我国于2 0 0 0 年6 月 2 0 日对酸水解植物蛋白调味液中氯丙醇的含量明确规定s lm g k 。各国在纷纷加大相 关产品的管理力度同时，也纷纷制定了3 一m c p d 的允许限量标准，部分国家的标准如 下表示f 4 甜。 江南大学硕士学位论文 国家 3 一m c p d 中国s b l 0 3 3 8 2 0 0 0 标准 lm g ，k g 美国f c c 法规( 以干物质计)lm g k g 二 英国，欧盟f a c 规定 0 0 lm g ，k g 日本hp企业 lm g ，k g 澳大利亚- 新西兰 f s a 】忆 o 3m g k g 1 2 3 测定方法 3 一m c p d 的存在引起了世人的关注，如何对3 m c p d 的进行快速精确的定量分析 也引起了科研工作人员的兴趣。 目前，较多使用的是气相色谱、液相色谱以及薄层层析等方法，其中色谱法是用 来检测的经典方法。 由于3 一m c p d 结构中存在羟基，通过液液分配1 4 3 i ，直接由有机溶剂提取效率较差。 e x t r e l u t2 0 具有强吸水性，但样品与之混合后，样品中的水分易被其吸附，因此，用 e x t r e l u t 2 0 为吸附柱的柱层析可适当提高提取效率。亦有报道【4 4 】。采用索氏提取器提取 与萃取相结合方法提取氯丙醇，经n ，o 一双( 三甲基硅烷) 三氟乙酰胺( b s t f a ) 衍生，用f i d 作测试器的气相色谱法进行测定。结果令人满意。该法用于膨化食品中氯丙醇检测， 检出限为0 o l m g l ( g ，回收率达8 5 9 5 。 目前除使用电子捕获检测器( e c d ) 和火焰离子化光度检测器( f i d ) 检测以外， 气一质联用( g c m s ) 由于其高效、高灵敏度的特点，而成为分析酱油中3 m c p d 含 量的经典方法。国际上通用的测定食品中3 一m c p d 的方法，是英国科学中心实验室 ( c s l ) 推荐和建立的正式检验方法( a o a c 2 0 0 0 0 1 ) ，采用d 5 3 m c p d 氘代同位素稀 释技术、以七氟丁酰基咪唑为衍生化试剂，采用g c m s 联用检测3 一m c p d 。张思群【4 5 l 等亦论述了较成熟的三种气相色谱与不同的检测器联用测定3 一m c p d 的方法：( 1 ) 衍 生化气相色谱电子捕获检测法测定酱油中3 一m c p d ；( 2 ) 衍生化气相色谱质谱法测定酱 油中3 m c p d ；( 3 ) 衍生化气相色谱双串联质谱法同时测定酱油中3 m c p d 。检出限为 o o l m g m g 。目前，常规使用的3 一m c p d 的检测法多采用衍生化一气相色谱法。但是采 用七氟丁酰咪唑衍生、气相色谱电子捕获检测调味品中的氯丙醇，操作环节多，试剂 消耗量大，分析成本高，操作时间长( 至少需3h ) 。 化学传感技术【4 6 】是较为新兴的分离技术，具有较高的灵敏度和选择性，检测限低。 但是其传感的接收器是很容易被污染的，因此对复杂样品的检测存在易被污染的问题。 江南大学硕士学位论文 酱油中成分很复杂，其中的一些固体颗粒等成分容易使传感器堵塞而失效。 谢天尧【4 7 j 等运用了毛细管电泳高分离度的优点，采用毛细管电泳的分离模式，结 合电导( c d ) 检测技术的通用性，研究了酸水解植物蛋白中致癌物3 一m c p d 的检测 方法。c e c d 检测法中，利用硼酸能与3 一m c p d 上的2 个邻位羟基进行键合生成配合阴 离子，从而增加多羟基化合物的负电荷的特性，在1 5m m o l l 的三羟甲基氨基甲烷 ( t r i s ) 1 0 咖o l lh 3 8 0 3 ( p h8 3 ) 电泳介质中，检出限为o 1 m g l ( s n = 3 ) ，但此法在 酱油这样成分复杂的体系中，干扰因素多，检测灵敏度降低。不便于在实际样品中检 测使用。 1 3 本论文研究工作设计 本论文的研究工作主要基于毛细管电泳一电化学检测技术的分离、检测特点，结 合在3 一m c p d 具有物化特性，采用c e e d 方法对3 一m c p d 进行以下几方面的研究。 1 、探索最佳实验条件，主要从分离电压、运行缓冲液浓度和p h 值、进样时间 以及施加在工作电极上的电极电位几方面加以考察，建立一种分离测3 一m c p d 的快 速、简捷、经济实用的方法，并应用于市售酱油中3 一m c p d 的含量进行检测运用。 2 、根据3 一m c p d 在碱性溶液中不稳定的特性，研究3 一m c p d 水解反应的动 力学行为，计算3 一m c p d 水解反应的速率常数和活化能，对3 一m c p d 的物化行为 有进一步的了解。 3 、运用前面建立的c e e d 法监测在生产工艺中3 一m c p d 水解反应历程，探讨不 同的反应温度、反应体系的p h 值以及反应的作用时间长短对水解反应的影响，探索 出在酸水解植物蛋白液制备工艺中，控制3 一m c p d 的最佳操作条件。同时，在文献 报道的最佳制备工艺条件下，自制酸水解植物蛋白调味液前体，并在最佳的分离检测 条件下，试验前述选取的最佳工艺生产条件，监测对3 一m c p d 的控制情况，考察工艺 条件条件选取的合理性。 第二章毛细管电泳一电化学检测法测定酱油中3 氯1 ，2 丙二醇 2 i 引言 第二章毛细管电泳电化学检测法测定 酱油中3 氯1 ，2 - 丙二醇 氯丙醇是植物蛋白在浓盐酸中高温水解的产物，主要包括1 ，3 二氯2 丙醇 ( 1 ，3 d c p ) ，2 ，3 - 二氯一1 - 丙醇( 2 ，3 一d c p ) ，3 一氯一l ，2 一丙二醇( 3 。m c p d ) ，2 一氯一l ，3 一丙二醇 ( 2 m c p d ) 四种丙三醇的氯取代物。经研究表明，四种氯取代物均有不同程度的毒性， 其中3 一m c p d 是含量最多、毒性最大。 3 m c p d 是潜在的致癌性物质，毒理性试验表明，用量超过3 0 m g ，l ( g 就能引起大鼠 肾小管扩张而衰死。欧盟和f a 0 ，w h 0 都对3 m c p d 的安全用量进行了评估，规定 3 m c p d 的最大日允许用量为2 “g i 【g 【”】。各国都制定了3 一m c p d 的含量标准。中国、 日本以及美国均规定3 一m c p d 的最大含量为l m g k g 。3 一m c p d 在酸解植物蛋白调味液 中是含量最多的，但目前在其他的食品中也有发现，尤其是在经过烘烤的豆类食品中含 量也甚多。尽管对3 一m c p d 等研究已经引起了世人的关注，但是还没有能对形成机理 等进行全面的阐述。因此，对3 一m c p d 的研究将很有意义。 据文献报道，毛细管气相色谱质谱联用( g c m s ) 、化学传感、毛细管电泳一电 导检测( c e c d ) 等技术业已用于3 一m c p d 的检测。但是该g c m s 法通常需要浓缩， 耗时、繁琐，而且运作成本高，难以广泛使用。化学传感技术是较为新兴的分离技术， 具有较高的灵敏度，但是其传感接收器很容易被酱油中复杂的成分堵塞而失效。毛细管 电泳技术已成为一种重要的分