（环境科学与工程专业论文）石油污染土壤中固定化微生物降解性能研究.pdf

s t u d yo nt h eo i ld e g r a d a t i o na b i l i t yo f i m m o b i l i z e d m i c r o o r g a n i s m si no i l c o n t a m i n a t e ds o i l at h e s iss u b m i t t e df o rt h ed e g r e eo fm a s t e r c a n d i d a t e ：x un a n a s u p e r v i s o r ：p r o f z h a n g x i u x i a c o l l e g eo fc h e m i s t r y & c h e m i c a le n g i n e e r i n g c h i n au n i v e r s i t yo fp e t r o l e u m ( e a s tc h i n a ) 5 m耵耵i_帅95堇兰7舢8 iiiiy 关于学位论文的独创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在指导教师指导下独立进行研究工作所取得的 成果，论文中有关资料和数据是实事求是的。尽我所知，除文中已经加以标注和致谢外， 本论文不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得中国石油 大学( 华东) 或其他教育机构的学位或学历证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对研究所做的任何贡献均已在论文中作出了明确的说明。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。 学位论文作者签名：脚 吼期年占月日 学位论文使用授权书 本人完全同意中国石油大学( 华东) 有权使用本学位论文( 包括但不限于其印刷版 和电子版) ，使用方式包括但不限于：保留学位论文，按规定向国家有关部门( 机构) 送交学位论文，以学术交流为目的赠送和交换学位论文，允许学位论文被查阅、借阅和 复印，将学位论文的全部或部分内容编入有关数据进行检索，采用影印、缩印或其他复 制手段保存学位论文。 保密学位论文在解密后的使用授权同上。 学位论文作者签 指导教师签名： 日期：汐，f 年 f t 期：知c f 年 否月o 日 6 月f ，日 摘要 本文针对石油污染土壤修复，利用实验室己筛选的石油降解单菌s m 1 、s m 一3 及其 复配菌、混合菌m m 7 ，以天然有机材料y j 0 7 或y j 0 5 为载体，吸附法制备固定化微 生物。考察不同环境因素对固定化微生物和游离微生物降解性能的影响，比较最佳降解 条件下不同菌株和不同载体固定化微生物降解性能，并将游离与固定化微生物应用于室 内花盆模拟修复石油污染土壤，对c n p 、接种量、石油含量、氧化剂和表面活性剂设 计5 因素4 水平正交实验，探讨不同修复时期各影响因素的重要性顺序，最佳条件下各 菌株的修复效果以及土壤理化性质、生物多样性变化。 固定化微生物降解石油的影响因素研究结果表明，菌株s m 1 、s m 3 、m m 7 、复 配菌固定前后适宜的p h 范围为7 0 8 o ；盐浓度范围为5 9 l - 7 9 l ；初始油浓度范围为 3 8 , l o g l ；接种量范围为1 0 - 3 0 ；且固定化菌较游离菌能较快的适应环境。固定 化菌的石油降解率比游离菌高7 3 0 ；以材料y j 0 7 为载体的固定化菌的降解率比材 料y j 0 5 高4 - - 4 2 ；较单菌，混合菌的降解效果普遍较好，复配菌次之。在p h 为8 o ， 盐浓度5 9 l ，石油浓度3 9 i n ，接种量2 0 的最佳降解条件下，固定化菌s m 3 的降解率 最高达7 3 5 。 固定化微生物模拟修复石油污染土壤实验结果表明，不同微生物在不同降解时期， 各影响因素的重要性会发生变化；经过2 1 d 的修复，固定化混合菌m m 一7 效果最好，降 解率为2 7 1 2 ，修复过程中，接种量是最重要的影响因素，降解初期表面活性剂影响 较大，中后期土壤石油含量为重要影响因子；在接种量2 0 ，表面活性剂0 0 5 ，c n p 1 0 0 ：5 ：1 ，土壤石油含量3 ，氧化剂o 5 的条件下，固定化菌m m 7 ( y j 0 7 ) 的降解率最 高为2 2 3 ；生物修复过程需要调节土壤有机质、总氮、p h 、细菌数量且固定化菌较游 离菌改善环境的周期长( 除总氮) ，在修复石油污染土壤过程中具有明显优势；土壤香 农一威纳指数与d g g e 图谱条带的分析表明，固定化微生物修复土壤的种群多样性先增 加后减少，种群多样性水平较游离菌高，而游离微生物是先减少后增加再减少。 关键词：石油污染土壤，固定化菌，游离菌，石油降解率 s t u d yo nt h eo i ld e g r a d a t i o na b i l i t yo fi m m o b i l i z e d m i c r o o r g a n i s m si no i l - - c o n t a m i n a t e ds o i l x un a n a ( e n v i r o n m e n t a ls c i e n c ea n de n g i n e e r i n g ) d i r e c t e db yp r o f z h a n gx i u x i a a b s t r a c t a i m i n ga tt h er e m e d i a t i o no fo i l - c o n t a m i n a t e ds o i l ，h i 曲一e f f i c i e n c yo i l d e g r a d i n gs t r a i n s w h i c hh a ds c r e e n e di nt h el a b o r a t o r yi n c l u d i n gs i n g l es t r a i ns m - 1a n ds m - 3 ，c o m p o u n d s t r a i na n dm i x e ds t r a i n sm m 一7w e r ee l e c t e da se x p e r i m e n t a ls t r a i n s t h en a t u r a lo r g a n i c m a t e r i a l sy j 0 7a n dy j - 0 5w e r ed e s i g n e da sc a r r i e r st oo b t a i ni m m o b i l i z e dm i c r o o r g a n i s mb y a d s o r p t i o nm e t h o d t h e e f f e c to fd i f f e r e n te n v i r o n m e n t a lf a c t o r so nt h eo i ld e g r a d a t i o na b i l i t y o ff r e ea n di m m o b i l i z e dm i c r o o r g a n i s m sw a ss t u d i e d t h eo i ld e g r a d a t i o na b i l i t i e so fd i f f e r e n t s t r a i n sa n di m m o b i l i z e dm i c r o o r g a n i s m sw i t hd i f f e r e n tc a r r i e r su n d e ro p t i m u mc o n d i t i o n w e r ec o m p a r e d f r e ea n di m m o b i l i z e dm i c r o o r g a n i s m sw e r ea p p l i e di nt h es i m u l a t i o n r e m e d i a i o no i l c o n t a m i n a t e ds o i li nt h ei n d o o rp o t t h eo n h o g o n a le x p e r i m e n to ff i v ef a c t o r s ， f o u rl e v e l sw a sd e s i g n e do nc n p ，i n o c u l a t e dq u a n t i t y ，o i lc o n c e n t ，o x i d a n ta n ds u r f a c t a n t t h ei m p o r t a n c es e q u e n c eo f e a c hi n f l u e n c i n gf a c t o ri nd i f f e r e n tr e p a i rp e r i o d ，t h er e p a i re f f e c t o fe a c hs t r a i nu n d e ro p t i m u mc o n d i t i o na n dt h ec h a n g e so fs o i lp r o p e r t i e sa n db i o d i v e r s i t y w e r ed i s c u s s e d t h er e s u l t so ft h es t u d yo ni n f l u e n c ef a c t o r so fi m m o b i l i z e d m i c r o o r g a n i s m s b i o d e g r a d a t i n go i l s h o w e dt h a tt h es u i t a b l ep hv a l u eo ff r e ea n di m m o b i l i z e ds t r a i n s i n c l u d i n gs m - 1 ，s m 一3 ，m m - 7a n dc o m p o u n ds t r a i nw a s7 0 8 0 ，t h es u i t a b l es a l i n i t yw a s 5 9 l 固l ，t h es u i t a b l eo i lc o n c e n t r a t i o nw a s3 9 l 10 9 l ，t h es u i t a b l ei n o c u l a t e dq u a n t i t y w a s10 - 3 0 a n di m m o b i l i z e ds t r a i nc a nm o r eq u i c k l ya d a p tt ot h ee n v i r o n m e n tt h a nf l e e s t r a i n t h eo i ld e g r a d a t i o nr a t e so fi m m o b i l i z e ds t r a i n sw e r eh i g h e rt h a nf r e es t r a i n sb y7 3 0 t h ed e g r a d a t i o nr a t eo fi m m o b i l i z e ds t r a i n sw i t hy j 一0 7a sac a r r i e rw a sh i g h e rt h a nt h a t w i t hy j 一0 5a sac a r r i e rb y4 4 2 c o m p a r e dw i t hs i n g l es t r a i n t h ed e g r a d a t i o ne f f e c to f m i x e ds t r a i n sw a st h eb e s t ，t h a to fc o m p o u n ds t r a i nw a sn e x t t h ed e g r a d a t i o nr a t eo f i m m o b i l i z e ds t r a i ns m 一3w a st h eh i g h e s t7 3 5 u n d e ro p t i m u mc o n d i t i o nt h a tw a sp hv a l u e w a s8 ，s a l i n i t yw a s5 9 l ，o i lc o n c e n t r a t i o nw a s3 9 l ，a n di n o c u l a t e dq u a n t i t yw a s2 0 1 4 微生物固定化技术5 1 4 1 微生物固定化技术的概念5 1 4 2 固定化微生物的制备方法5 1 4 3 固定化微生物的载体6 1 4 4 固定化微生物技术在污染土壤中的应用6 1 5 影响石油烃生物学降解的因素7 1 5 1 油的化学组成和浓度8 1 5 2 降解石油的微生物的种类和数量8 1 5 3 环境参数8 1 5 4 表面活性剂1 0 1 6 课题研究的目标和主要内容一1 1 1 6 1 研究目标一1 1 1 6 2 研究内容1 l 1 7 技术路线一1 2 第二章固定化微生物降解石油的影响因素研究1 3 2 1 实验目的13 2 2 实验仪器、药品与材料一1 3 2 2 1 实验仪器一1 3 2 2 2 实验药品1 4 2 2 3 实验材料14 2 3 实验方法15 i v 3 4 4 降解前后石油烃的四组分分析 3 5 结果与讨论 3 5 1 土壤理化性质测定 3 5 2 外源微生物修复石油污染土壤的考察 3 5 3 不同载体的固定化菌修复石油污染土壤 3 5 4 强化修复对微生物石油降解率的影响及各影响因素重要性研究 3 5 5 固定化微生物石油降解性能考察 v 1 1 中国石油大学( 华东) 硕七学位论文 1 1 课题来源与选题依据 第一章文献综述 随着石油工业的迅速发展，油气田开发对土壤的污染越来越严重。石油污染土壤已 经是石油及石化企业的重要污染之一，其中的石油污染物对人体及环境具有很高的毒害 作用。土壤污染不仅会破坏其自身结构、改变其物理化学性质，而且会影响作物的产量 和品质，并通过食物链危害人类的健康和生命。因此，修复污染土壤，保障人类健康， 己引起各国政府及环境学家的广泛关注，成为当前国内外环保研究的热点。 本课题来源于：中国石油科技创新基金研究项目( 2 0 0 9 d 5 0 0 6 0 7 0 1 ) 。 微生物修复技术由于不造成二次污染，对环境污染少，且效率高等特点被广泛应用， 其中微生物固定化技术由于固定化微生物生活在由固定化载体造成的微环境，可有效地 屏蔽外界不利因素对微生物的直接侵害；微生物被各种载体固定后，单位体积内有效浓 度大大提高，提高了污染物降解率；固定化后的成品再生性能好，可以长期反复使用。 就修复石油污染的土壤而言，固定化微生物技术具有明显的优势。 1 2 石油污染土壤的现状及危害 随着国民经济的迅速发展，人们对石油的需求不断增加，石油的勘探开发、运输及 炼制过程中，石油污染问题同益凸显，特别是土壤污染日趋严重。据报道，目前世晃石 油总产量每年约有2 2 亿t ，其中约有8 0 0 万t 石油进入环境已造成污染，我国石油年产量己 超过1 亿t ，每年新污染土壤1 0 万t ，其中每年有近6 0 万t 石油进入环境，污染了土壤、地 下水、河流和海洋【l 】。石油污染土壤主要由于石油的泄漏和排放引起的，一般集中在油 田、油库、炼油厂周围，对土壤的污染大多集中在2 0 c m 左右的土壤表层【2 】。我国许多油 区污染严重，例如陇东油区年产原油约2 0 0 万吨是中国第二大油田的中心区，石油污染 面积正在逐年扩大，目前石油污染面积5 0 0 1 0 0 0 h m 2 ，在重污染区，土壤原油含量高达 3 5 1 0 m g k g ，高出临界值( 2 0 0 m g k g ) 1 7 6 倍【2 】。因此，修复石油污染土壤，加快土壤的 修复和治理显得尤为重要。 石油是一种成分极其复杂的混合物，主要是由各种不同的碳氢化合物组成，还含有 少量的氧、氮、硫、氯、硅和磷等非金属元素以及少量的重金属元素成分。石油通常指 原油和石油初加工产品( 包括汽油、煤油、柴油、重油、润滑油等) 及各类油的分解产 物， 形成一层粘膜，阻碍植物根系的呼吸与吸收，引起根系腐烂，影响植物的根系生长，致 使农作物减产【5 】；3 ) 石油积累在土壤低等动物( 如蚯蚓等) 体内导致其死亡，生态平衡 遭到破坏【l 】；4 ) 土壤中的石油烃由植物根系吸收作用进入其体内并逐渐积累，再由食物 链进入动物和人体，使环境生态和人体生命健康受到威胁1 6 ，7 j ；5 ) 石油进入土壤在渗透 过程中沿着地表扩散、侵蚀土层，使土壤盐渍化、沥青化、板结化；没有被土壤吸附的 石油在重力作用下还沿土壤深部迁移，增加污染范围，渗入到地下污染地下水，从而对 环境的多个层面产生广泛影响1 8 j 。近年来的研究表明，石油和石油化工产品，经常以非 水相液体( n a p l ) 的形式污染土壤、含水层和地下水，若未被土壤吸附的n a p l 的密度 比水大，石油污染物将穿过地表的土壤层，进入含水层，在其底部扩散；而密度比水小 的则沿地下水面横向扩展，其可溶性成分逐渐扩散到水中，从而形成一种持久性污染源 1 9 】。n a y e f z a i m u t a i r i 等【lo 】使用毒性实验和蚯蚓来监测分析生物修复石油污染土壤过程， 发现旧污染的毒性比新污染的大，代谢产物的毒性有逐渐增大后减小最后不变的趋势。 油污染土壤的处 中国石油大学( 华东) 硕上学位论文 质而对环境造成二次污染；隔离法只是阻止石油烃在土壤中的迁移，没有改变石油烃的 结构，因此不能作为一种永久性的处理方法；换土法一般仅适用于小面积污染特别严重 的土壤的治理，特别是事故后的简单处理，并且换土法消耗的人工费用较高，难以应用 于大面积土壤污染的处理。 1 3 2 化学处理法 化学处理法也是目前修复石油污染土壤中比较常用的方法【坨】，主要包括：1 ) 萃取 法：根据相似相溶原理，利用有机溶剂萃取、分离、回收污染土壤中的石油烃，并实现 废物的资源化，比较适合于受石油烃污染较严重的土壤。2 ) 土壤洗涤法：破碎污染土 壤，混入足够的水和洗涤剂，过滤土壤、水和洗涤剂相互作用的浆液，将洗去石油烃后 的土壤重新归入环境。3 ) 化学氧化法：向被石油烃污染的土壤中喷撒或注入化学氧化 剂，使其与污染物质发生化学反应来实现净化的目的，该方法适合土壤和地下水同时被 石油烃污染的治理。这些化学处理方法除油效果较好，但是操作复杂，并且加入的化学 试剂很容易引起土壤的二次污染，破坏土壤环境的正常生态系统，因此其实际应用受到 了很大的限制。 1 3 3 生物修复法 物理法和化学法虽小范围内可以产生较好效果，但存在处理费用高，二次污染严重 以及不适合工业化推广等缺陷。因此从2 0 世纪8 0 年代末和9 0 年代初期，国外开始致力于 以物理化学方法为辅的生物修复技术，即物理化学法与生物修复法联合修复污染物。生 物修复技术由于具有安全，高效、无二次污染，经济效益好等优点，被人们认为是进行 污染土壤生物修复的最有效、最有前途的一种污染治理技术。石油污染生物修复技术 作为一种新兴的处理技术，目前还没有统一的分类方法，生物修复主要包括微生物修复、 植物修复和植物微生物联合修复。 1 3 3 1 微生物修复 微生物修复一般是指利用土壤中的土著微生物或向污染环境添加经驯化的外源高 效降解菌，有时也添加基因工程菌，在优化的环境条件下，加速其分解有机污染物，修 复被污染的土壤，具体可以分为原位生物修复和异位生物修复两部分【12 1 。 1 ) 原位修复是指不移动受污染的土壤，在原位投放氮、磷营养物质或供氧，促进 土著微生物的生长繁殖，或接种经驯化培养的高效微生物，利用其代谢作用有效的降解 土壤中的污染物，包括投菌法、生物培养法、生物通气法等【1 4 】。投菌法是向受污染的土 3 2 ) 异位生物修复是将受污染的土壤挖出，在污染场地以外或运送至专门的修复场 地进行处理的方法，主要包括【】：堆肥处理法、生物反应器法、预制床法等。土壤堆肥 处理法是将受石油污染的土壤与适当的材料相混合并堆放，依靠堆肥过程中微生物作用 来降解石油烃类的过程，同时加入了土壤调理剂以提高微生物的生长和石油生物降解的 能量。生物反应器法是将受污染土壤置于专门的反应器中进行处理，反应器可使土壤与 微生物及其它添加物如营养盐、表面活性剂等彻底混合，能很好地控制降解条件，因而 处理速度快、效果好。预制床法具有滤液收集和控制排放系统，使得污染物的迁移量降 到最小。 1 3 3 2 植物修复 植物修复技术是利用植物根系的吸收作用以及植物体内发达的酶系统对污染的环 境介质进行治理【1 5 1 。植物修复技术已被广泛应用到有机污染物的环境治理中【1 6 1 。目前已 报道有8 8 种植物能有效吸收和富集7 0 余种有机污染物【1 5 】。l i s t e 等1 7 1 用燕麦、羽扁豆、芸 苔、莳萝、胡椒、红萝卜、短叶松、红松和白松9 种植物研究对p a h s 中芘降解的影响， 结果发现9 种植物都明显加强了芘的降解；8 周内，有植物的土壤中芘的去除达7 4 以上， 而无植物的去除率少于4 0 ，芸苔的降解能力最强，胡椒和红萝b 在2 8 d 里可明显减少 芘的浓度。虽然植物修复污染物取得了良好的降解效果，但其仍然存在一定的不足【1 8 】： 1 ) 植物生长受到各种环境因素的影响，使得修复效果不稳定，很难达到工程化的要求； 2 ) 植物根系的长度有限，修复很大程度上只能限制在根区土壤范围；3 ) 存在污染物通 过垡植物一动物”的食物链进入自然界的可能；4 ) 同时受生长周期的限制，植物修复 的周期长；5 ) 最后是修复后植物处置困难的问题，而且引进的超富集植物等可能带来 巨大的生态风险和环境问题。 1 3 3 3 植物微生物联合修复 植物微生物系统的吸收和代谢能力是修复石油污染土壤的关键部分。目前研究较 4 中国石油大学( 华东) 硕上学位论文 多的是用植物来辅助石油污染土壤微生物修复技术，女h m i y a 等l l9 j 对植物和微生物联合作 用的机理进行了研究，发现植物根系分泌物有利促进细菌的生长，且根际区域的生物多 样性比其它区域小。李春荣等【2 0 】通过田间试验研究了玉米和向同葵两种植物对石油污染 土壤的修复作用，考察了外源菌( d x 9 ) 对植物修复的强化和协同效应，对“外源菌 植物”修复效果进行了初步评价，结果表明，1 5 0 d 玉米、向日葵试验区土壤中石油降解 率较对照区提高了1 0 0 5 和11 8 9 ；外源节细菌的施加可使生物修复速度显著加快；玉 米、向同葵与节细菌对石油污染土壤的联合生物修复效果显著，经过两年修复，污染土 壤恢复健康状态。尽管植物微生物联合修复在石油污染物降解中的重要性已经被充分 认识，但是由于植物根际环境的微域性、动态性和复杂性等特点，目前对石油污染物植 物微生物联合修复的研究还存在一定的困难，有关降解微生物的群落组成和变化动态 了解甚少。 1 4 微生物固定化技术 1 4 1 微生物固定化技术的概念 微生物固定化技术是2 0 世纪8 0 年代兴起的一种新型生物技术，是指通过化学或物理 方法将游离细胞( 微生物) 或酶定位于限定的空间区域内，并使其保持活性且能反复使 用的技术【2 l 】。高效降解菌对污染物的降解作用是微生物修复技术的核心【2 2 】，目前用于修 复污染土壤的降解菌主要分为土著菌、外来菌和基因工程菌，这些都是游离菌。由于降 解过程中污染物的成分更复杂，一些次生代谢物和中间降解产物的毒性更大【1 0 】，游离微 生物表现出单位体积内有效降解菌浓度低、与土著菌竞争处于弱势、抗毒性侵害能力差 等特剧2 3 1 。而固定化技术能够对完整的微生物细胞进行固定，避免人为破坏生物酶的活 性和生化反应的稳定性；提高单位体积介质中微生物细胞密度；固定化后的微生物能够 长期保持活性；固定化细胞颗粒的微环境有利于屏蔽土著菌、噬菌体和毒性物质对微生 物体的恶性竞争、吞噬和毒害，使其在复杂环境中也可稳定地发挥高效能【2 4 1 。 1 4 2 固定化微生物的制备方法 目前常用的固定化方法主要有吸附法、交联法、包埋法、共价结合法以及复合固定 化法，即上述几种方法的联合使用1 25 。 1 ) 包埋法是将微生物包埋在各种不同的凝胶网格和薄膜中，微生物被限制在有限 空间内，而底物可自由进入的一种固定方法。包埋法是目前细胞固定化中最常用的方法， 5 丙烯酰铵凝胶( p v a ) 、聚乙烯醇凝胶、光硬化树脂和聚丙烯酸凝胶等。复合载体一般 由无机和有机载体材料结合而成，两类材料性能互补，从而使复合载体材料具有优越性 2 7 , 2 s o 无机载体可以反复利用，但结合不牢固，细胞容易脱落；天然高分子凝胶一般对微 生物无毒，传质性能较好，具有生物相容性，能够大量分离提纯，其结构、物理、化学 等性质已经研究地比较深入，可制备成各种各样的形式，但机械强度较低，弹性差，在 厌氧条件下易被生物分解；有机合成高分子凝胶一般强度较好，但传质性能稍差，在进 行细胞包埋时对细胞活性有影响【2 9 1 。 1 4 4 固定化微生物技术在污染土壤中的应用 微生物固定化技术曾被广泛应用于修复受污染的流体介质( 如废水【3 0 。3 2 】) 和半流体 6 中国石油人学( 华东) 硕士学位论文 介质( 如泥浆【3 3 , 3 4 1 ) 环境中，目前将固定化微生物技术应用于修复非流体介质( 污染土 壤) 环境中，特别是石油污染土壤修复的研究，已引起环保工作者的广泛关注。c j c u n n i n g h a m t ”j 等利用p v a 制备固定化微生物在其适宜的环境条件下修复柴油污染的土 壤取得了良好的降解效果。沈齐英p 6 j 从天津大港油田受原油污染的土壤中筛选分离出四 株降油优势微生物，以聚乙烯醇为载体，采用包埋法制备固定化微生物实验，结果表明： 微生物固定化后的活性相对稳定，可以认为聚乙烯醇是一种比较好的包埋载体。张秀霞 等1 37 j 采用生物大分子仿生合成出的纳米多孑l s i 0 2 为载体，利用表面吸附固定化方法，将 固定化的2 株降解石油污染物的高效微生物菌株应用于石油污染土壤的修复，结果表明 该固定化微生物对石油污染物5 0 h 一次降解率高达9 6 2 ；通过8 次的反复实验，5 0 h 的原 油降解效果保持在8 5 以上，取得了良好的修复效果。王新等【38 】采用化学方法对微生物 进行固定化包埋，通过对3 株菌的单独固定及混合固定后来降解有机污染土壤中的芘及 苯并( 6 c ) 芘，实验结果显示，微生物经过固定后对污染物的降解效果明显好于游离菌，同 时混合固定菌的降解效率普遍高于单菌固定的降解效率。王新等【3 9 】为使引进菌在环境工 程中的利用成为可能，将引进菌用于有机污染土壤中芘和苯并( a ) 芘的生物修复，通过对 引进的3 株细菌进行固定化包埋，研究了它们对土壤中芘和苯并( a ) 芘的降解效果，结果 表明引进菌驯化固定后，无论是单株菌还是混合菌对污染物的降解都明显高于游离菌， 与土著固定菌相比，部分引进菌具有一定的优势，通过不同时间采样点的对比分析可以 看出，引进菌混合固定后对污染物的降解效果相对较好，在9 6 h 时b 6 1 8 6 7 对芘和苯并( a ) 芘的降解率分别为4 3 4 9 和3 8 5 5 。l i a i l g y m i n g 等【4 0 l 对石油污染土壤的修复进行研究， 结果表明用多孔性材料( 活性炭和沸石) 固定土著微生物，使降油效果达到4 8 9 而土 著游离菌自然衰减去除率为1 3 0 ，生物刺激( 添加氮源) 后去除率为2 6 3 ，添加生物 添加剂( 游离菌) 去除率为3 7 4 。m u f l a hh e 1 n a a s 等【4 l 】用p v a 包埋固定恶臭假单胞 菌构建固定化微生物，评价了在泡罩反应塔内不同反应条件对固定化微生物降解石炭酸 的影响，结果表明在温度3 0 ，p h 值为7 ，初始底物含量7 5m g l 时生物降解率最高。 1 5 影响石油烃生物学降解的因素 微生物物降解石油的过程中，影响降解的有关因素主要是：油的化学组成、微生物 的种类和数量以及影响生化过程的环境参数( 如温度、p h 、营养等) 。 7 第一章文献综述 1 5 1 油的化学组成和浓度 由于石油是一种成分极其复杂的混合物，因此石油的生物降解性能随其组分的种类 和结构复杂程度的不同而存在差异。有研究表明，各类石油烃被微生物降解顺序通常为： 饱和烃 芳香烃 胶质和沥青质，在饱和烃和芳香烃中，结构最简单的直链烷烃和含环少 的化合物烃类最容易被降解，胶质和沥青质等结构复杂，含环多的烃则极难被微生物所 降解【4 2 , 4 3 j 。另外，石油的物理状态对其生物降解性也有明显的影响。一般来说，油组分 分散到水中会形成油包水型乳化液，油滴表面积越大，细菌对烃的利用率越高；而土壤 系统中，石油被植物或土壤颗粒吸附，从而限制其扩散，使微生物不能与之充分接触， 影响其降解效果】。有研究表明，少量石油烃可作为土壤有机质为微生物提供碳源促进 微生物生长，有利于石油的降解；当石油浓度过高时，对其产生毒害，微生物的石油降 解率随着浓度的增大而有降低的趋势【4 5 。4 7 1 。 1 5 2 降解石油的微生物的种类和数量 据报道，能以烃类为碳源和能源生长，降解烃类的微生物大约有7 0 个属( 包括2 8 个 细菌属，3 0 个丝状真菌属，1 2 个酵母属) ，共2 0 0 多种微生物f 4 8 】。它们的细胞均含有较 多的核糖体且改变了的脂肪酸组分，常将烃类累积在细胞质膜上，同时也能合成较多的 磷脂【4 9 1 。降解石油烃的细菌菌属主要有：无色杆菌属、不动杆菌属、产碱杆菌属、节杆 菌属、芽孢杆菌属、黄杆菌属、棒杆菌属、微杆菌属、微球菌属、假单胞菌属、分枝杆 菌属等；降解石油烃的放线菌菌属主要有：放线菌属、诺卡氏菌属；降解石油烃的真菌 菌属主要有：金色担子菌属、假丝酵母属、红酵母属、掷孢酵母属、曲霉属、毛霉属、 镰刀霉属、青霉属、木霉属、被孢霉属掣5 0 1 。一般认为，细菌比真菌、放线菌更能有效 地降解原油。s a a d o u n l 5 u 对从长期受柴油污染的土壤中分离筛选得到的3 3 株石油烃降解 菌进行了生理生化特性实验鉴定，确定其分别属于芽孢杆菌属、不动杆菌属、放线菌属 和假单胞菌属。降解原油的微生物大量存在于污染地区，在严重油污染的水和底部沉积 物中，其数量可达n 1 0 2 - 1 0 6 个毫升【4 9 】。 1 5 3 环境参数 微生物修复污染物主要依靠微生物的新陈代谢来完成，为取得较好的修复效果，需 尽可能创造适宜微生物生长的环境条件。不同的环境条件( 如温度、p h 值、氧气含量、 营养物质比例、电子受体供给及氧化还原电位、盐浓度、表面活性剂等) 都会影响微生 物对石油污染土壤的修复效果。石油污染土壤的修复是涉及众多因素的综合复杂过程， 8 中国石油大学( 华东) 硕l 学位论文 因此通过探索微生物生长环境因素的最优化，有助于达到修复石油污染土壤的最佳效 果。 1 5 3 1 环境温度 温度能够影响降解酶的活性，是影响微生物生长的重要因素之一。它对微生物降解 的影响机理主要有两种：1 ) 一定程度上，温度的升高可以增加解吸常数和分配系数， 从而提高底物的生物有效性；2 ) 一定范围内，温度的增加可以提高微生物的繁殖能力 和活性，从而提高生物降解率。温度对石油的降解速率具有显著影响，不同微生物对石 油的降解具有特定的适宜微生物生长繁殖的温度范围，过高和过低的温度都不利于微生 物对石油的降解，一般来讲，对于中温微生物，2 5 3 5 为最佳降解温度。 1 5 3 2 氧环境 在生物降解过程中，许多石油烃类物质的降解过程实质上是石油烃的氧化过程，需 要有加氧酶和分子氧的参与，因此大多数的石油烃类物质都是在好氧的条件下被降解的 【5 2 1 。其中污染物氧化分解的最终电子受体的种类与浓度也极大地影响着微生物修复的速 度和程度。微生物氧化还原反应的电子受体一般为氧，但在厌氧条件下，也可以用硫酸 根离子和硝酸根离子为电子受体【5 2 1 。 1 5 3 3 营养物质 微生物的生长繁殖需要各种无机元素如碳、氢、氧、磷等，还包括其它各种矿物质 元素。大多数土壤类型的n 、p 的含量都较低，石油烃主要为微生物提供碳和氢，因此氮 源和磷源的不足很可能会限制微生物降解石油，因此在石油污染土壤的修复中常常添加 氮源和磷源。b o y da m c k e y 等人的研究表明微生物在氮磷等营养充足的情况下降解正构 烷烃、支链烷烃以及芳香烃的效果较不添加营养时好5 3 1 。有研究表明在c ：n ：p 为1 0 0 ：1 0 ：1 ， 油的降解率最高，单2 1 ：i n 或p 均不能提高降解率，也有研究表明，c ：n ：p 为1 2 0 ：1 0 ：1 的石 油降解效果最好，由于石油降解菌的种类繁多，目前最佳c ：n ：p 没有一个定量的标准。 m n i k o l o p o u l o u 等人的研究表明氮磷源的溶解及是否易于被微生物利用是生物修复的 限制因素，以尿酸和卵磷脂为氮源和磷源，n ：p 为1 0 ：1 对石油烃的降解取得了良好的效 果【5 4 】。就降解效果而言，研究表明无机氮比有机氮效果要好，硝酸氮比铵念氮要好【5 5 】。 1 5 3 4 盐浓度 无机盐类是微生物生长所必需的营养元素，在微生物生长过程中起着促进酶反应、 维持膜平衡和调节渗透压的重要作用。盐度是一个较复杂的影响因素，盐类浓度过高会 对普通微生物的生长产生毒性，降低微生物呼吸速率、使酶活性受阻，从而降低微生物 9 第一章文献综述 对有机物的去除率；盐类可以吸收水分，增强疏水键，导致构象变形甚至盐析，从而使 蛋白质对水分子的利用率下降，导致一些重要的生化反应不能进行；普通微生物不能耐 受高盐的冲击，高盐度将导致微生物种群不断减少甚至消失5 6 铘】。周乐等【5 9 】研究表明， 改变盐浓度显著影响菌株生长，在低于2 盐浓度环境中，菌株对芘的降解效能不受影 响，而盐浓度达到5 时，菌株的生长受到强烈的抑制。 1 5 3 5 土壤p h 土壤p h 的变化会影响微生物的活性，降解石油污染物的绝大部分细菌生长在p h 值 为6 8 之间的范围内，且中性最为适宜。实际的土壤环境，偏酸性或偏碱性的情况并不 少见，需要添加酸碱缓剂或中性调节剂等调节土壤p h 值。不同的p h 值影响微生物对营 养物质的利用、微生物的吸附作用、胞外酶的产生和分泌等，且每种微生物的最适p h 值不同，导致不同的p h 值对石油降解率影响不同，这也导致了在不同p h 值范围内微生 物在数量上存在一定差掣1 3 j 。 1 5 4 表面活性剂 微生物一般只生长在水溶性环境中，疏水的石油烃紧附于土壤颗粒表面，限制了微 生物对石油烃和氧气的摄取和利用。因此，生物修复前，向土壤中添加表面活性剂，可 以提高石油烃在水相中的分散能力，将石油由土颗粒表面洗脱下来转入水相，增大石油 与微生物的接触面积，促进污染物的生物可利用性。表面活性剂可以分为非离子表面活 性剂，阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、生物表面活性剂以及阴非离子混合表 面活性剂。表面活性剂的种类、性质、浓度等影响有机污染物的清洗效率。研究表明， 低浓度的离子型和非离子型表面活性剂都能促进微生物对石油烃的降解，但过高浓度的 表面活性剂会对微生物产生毒害作用，抑制石油烃的降解【俐。c h e n gs h e n gs h u n g 等1 6 1 】 为了找到适宜的生物降解条件对表面活性齐u ( t w e e n 8 0 或鼠李糖脂) 和表面活性剂浓度进 行考察，表明高浓度的表面活性剂石油降解率低。阴离子表面活性剂的效果明显优于阳 离子表面活性剂，非离子表面活性剂通常比离子型表面活性剂的毒性小，且具有易生物 降解、在固体表面不易发生较强吸附等优点，应用比较广泛。由于化学表面活性剂对微 生物毒害作用较大，因此生物表面活性剂成为石油烃污染治理过程中投加表面活性剂的 首选，但价格比较昂贵。 1 0 括单菌、复配菌和混合菌以及不同固定化载体的微生物) 与游离微生物( 包括单菌、复 配菌和混合菌) 的降解条件，考察各个影响因素对石油降解效果的影响，并将其应用于 石油污染土壤修复，形成游离微生物与固定化微生物修复石油污染土壤介质的理论，为 固定化微生物修复石油污染土壤作技术支持和理论支撑。 1 6 2 研究内容 针对石油污染土壤的微生物修复问题，评价游离微生物与固定化微生物对石油污染 土壤修复的效果以及混合菌与单菌的降解性能比较；形成固定化微生物修复石油污染土 壤的理论，为固定化微生物在石油污染土壤生物修复中的应用提供技术支持和理论支 撑。 ( 1 ) 优选出高效的石油降解菌； 利用实验室已从长久受石油污染土壤中筛选出的多株石油降解菌群，通过测定其石 油降解率，优选出降解率相对较高的单菌与混合菌，作为实验高效石油降解菌株。 ( 2 ) 研究环境因素对游离与固定化微生物石油降解效果的影响。 研究影响游离与固定化微生物降解石油的环境因素，包括p h 值，接种量，底物浓度 和盐浓度对降解石油效果的影响以及石油降解率随时间的变化，评价在最佳石油降解条 件下游离与固定菌、单菌与混合菌的降解性能。 ( 3 ) 研究游离与固定化微生物用于修复石油污染土壤的效果。 研究影响游离与固定化微生物修复石油污染土壤的因素，包括c n p ( 石油 o , l t - 1 4 ) 2 s 0 4 k h 2 p 0 4 ) ，微生物投加量，氧化剂( 3 h 2 0 2 溶液) 和表面活性剂( t w 8 0 ) 等对修复效果的影响以及土壤有机质、总氮含量、p h 、微生物数量和石油含量等随时间 的变化规律，评价了在最佳土壤石油环境下游离与固定菌、单菌与混合菌的降解性能以 及比较了不同固定化载体修复石油污染土壤的效果。 第一章文献综述 1 7 技术路线 技术路线如图1 1 所示： 游离与f 占l 定化菌降 解技术参 数及效果 的考察 最佳降解 条件卜固 定化与游 离菌对石 油降解率 的考察 不同载 体的固 定化菌 对彳i 油 降解率 考察 固定化与 游离菌修 复彳i 油污 染土壤影 响因素重 要性研究 【司定化与 游离菌最 佳降解条 件石油降 解效果考 察 不同载 体的同 定化菌 修复效 果的考 察 形成吲定化微生物修复石油污染土壤理论 图1 - 1 技术路线 f i g 1 - 1 t h et e c h n i c a lr o u t e 1 2 中国石油人学( 华东) 硕士学位论文 第二章固定化微生物降解石油的影响因素研究 2 1 实验目的 为研究以天然有机材料为载体的固定化微生物降解石油的效果，使其应用于修复石 油污染物成为可能，优选并驯化以石油为唯一碳源的高效石油降解菌，以天然有机材料 为载体，吸附法制备固定化微生物，考察不同环境因素条件包括p h 、初始油浓度、接 种量、盐浓度( n a c l ) 对游离菌和固定化菌的石油降解率的影响以及石油降解率随时间 的变化，并比较最佳降解条件下游离和固定化菌株的石油降解性能以及不同载体的固定 化微生物对石油烃的降解效果。 2 2 实验仪器、药品与材料 2 2 1 实验仪器 本实验中所用的实验仪器列于表2 1 中。 表2 - 1 实验仪器 t a b l e2 - 1 e x p e r i m e n t a li n s t r u m e n t s 设备名称 设备生产厂家 a b 2 0 4 l 分析天平 p b h - 1 型笔形p h 计 l d z x 一4 0 a 高压蒸汽灭菌锅 u v 210 0 紫外分光光度计 b c m 1 0 0 0 型生物净化工作台 s h p 2 5 0 型生化培养箱 g i l s o n 移液枪 d k $ 2 8 型电热恒温水浴锅 7 2 1 分光光度计 d h g 9 2 4 0 a 电热恒温鼓风干燥箱 1 0 x 1 0 石英比色皿 t g l 16 h 小型高速离心机 j y s p 3 型水平电泳槽 梅特勒托利多仪器( 上海) 有限公司 上