（海洋生物学专业论文）一株高产酵母突变株菊糖酶的生产和酒精发酵的研究.pdf

一株高产酵母突变株菊糖酶的生产和酒精发酵的研究 捅晏 菊粉( i l l u l i l l ) 是一种广泛存在于菊科植物如菊芋( j e m s a l e m 矾i c h o k e ) 等根 部或块茎中的一种贮存性多糖，自然界中储量非常丰富，是生产果糖糖浆、低聚 果糖、液体燃料酒精等的优质可再生原材料。 菊粉酶( i i l l l l i n a s e ) 是一种主要来源于微生物的一类水解酶，能够水解 b 一2 ，卜d 一果聚糖糖苷键，学名为b 一2 ，1 一d 一果聚糖酶( e c 3 2 1 ) ，能够将菊粉水解 为果糖和葡萄糖。但自然界中微生物所产的菊粉酶活力一般比较低，酶产量也不 高，不足以满足工业生产的需要。本实验以实验室保藏的一株季也蒙毕赤酵母 ( 尸砌扬g 锄埘j p ，聊d 砌f ) 菌株1 作为出发菌株，经过紫外线结合氯化锂诱变方法 得到一株高产菊粉酶的突变株m 二3 0 ，使其酶活力较原始菌株有了很大的提高。 同时还利用了表面响应法( s 骶e - a c er - e s p o n s em e d o l o g y ，s r m ) 对得到的 海洋季也蒙毕赤酵母突变株m 一3 0 的液体发酵条件进行了优化，得到的最终优化 条件为菊粉2 0 ( w v ) ，酵母粉o 5 ( w v ) ，接种量2 o ( v v ) ，2 8 培养，初始 p h 6 5 。在最优条件下，突变株m 一3 0 的液体发酵酶活力达到了1 2 7 7u “，远远 高于原始出发菌株1 在相同培养条件下的4 8 1 u i n l 。并且发现该突变株所产的粗 酶液能够有效的将菊粉转化为单糖。说明通过紫外线结合氯化锂诱变方法，使得 突变株的酶活力有了明显提高，并且具有较高的外切菊粉酶活性。 在上述实验的基础上，进一步利用突变株m 一3 0 所产的菊粉酶和本实验室保 藏的一株酿酒酵母w o 菌株，以菊粉和菊芋块茎提取液为底物，进行了糖化和发 酵生产酒精实验。以菊粉为底物的发酵培养基，发酵结束后得到的酒精浓度为 1 2 9 3 0 3 0 ( v ) ，而以菊芋块茎提取液为底物的培养基，产生的酒精浓度为 7 0 3 o 2 1 ( v v ) 。在目前能源危机和粮食危机的双重背景下，为液体燃料酒 精的非粮化生产做出了积极的探索和尝试。 关键词：菊粉酶，季也蒙毕赤酵母，诱变，表面响应法，酒精 s t u d yo ni n u l m a s eo v e 叩r o d u c t i o n 趾de m a i l o lf e h n e n t a t i o nb y am u t 枷o fm a r i l l ey e a s tp f c 乃勉栅f p r m o 刀旃f a b s 缸i a c t i n u l i l li sp r e s e ma sar e s e ec a r b o h y d r a t ei 1 1t h er o o t sa i l dt u _ b e r so fp l 雏t ss u c ha s j e m s a i e ma r t i c h o k e ，c 1 1 i c o 巧，d a h l i 鲫【dy i c o n t h ey i e i d so ft h er o o t sa 1 1 dt u b e r sa r e v e 巧l l i g h ni sag o o dr e n e w a b l er a wm a t e t i a lf o r m c t o s es y t 7 u p ，o l i g o f i m c t a n ，a n d e m a n o lp r o 洲o n n ei 舢1 h 粥e sa r ec l a s s i f i e d 锄o n g 也eh y d r 0 1 a s e sa n dt a r g e t0 nn l ep - 2 ，ll i n k a g eo f i 1 1 u l i na n d h y d r 0 1 ) ，z ei ti n t o 舳c t o s ea n dg l u c o s e ( e c 3 2 1 ) w eu s e dt l ：哈m a r i l l ey e a s t p f 如缸g w 川f p 聊z d 吼办z ，s 垭疽n1 ，a sp a r e n ts 砌n ；i t sa s c o s p o r e sw e r e 骶a t e db yu s i n g u vl i g h ta n dl i c l t h e 抛u 切n tm 一3 0 弛e n h a l l c e d 砌i n a s ep r o d u c t i o nw a s o b t a i n e d 觚dw a sf o u n dt ob e 妇b l e 撒e rc u l t i v a t i o n 矗w2 0g e n e r 撕o i l s su r ：f a c er e s p o i l s em e m o d 0 1 0 9 y ( s l 蝴) w a sl l s e dt oo p t i m i z em em e d i u mc o 瑚【p o s i t i o n s a i l dc u i t i v a t i o nc o i l d i t i o i l sf o ri n l l l i n a s ep r o d u c t i o nb ym em 1 i 切n tm 一3 0i 1 1l i q u i d f e 册1 e m a t i o n i l l u l i n ，y e a s te x m i c t ，n a c l ，t e m p e r a t l l r e ，p hf o rm a x 油u mi l l u l i l l a s e p r o d u c t i o nb y 也em l l 切n tm 一3 0w e r ef o u l l dt 0b e2 0 0 酊，5 o 舭，2 0 0 鱿，2 8 0 c 趾d 6 5 ，r e s p e c t i v e l y u n d e rm eo p t i m i z e dc o n d i t i o l l s ，l2 7 7u m lo fi n u l i n a s ea c t i v i 移 、a sr e a c h e di n 也el i q u i dc u l t u r eo f 也em u t a n tm 一3 0 u n d e rt h es a m ec o n d i t i o n s ，i t s p 锄e n ts t r a 证o i l l yp r o d u c e d4 8 1u m lo fi i l u l i m 峪ea c t i v i 锣w em s of o u n d _ 吐l a ti 1 1 u l i n c o l l l db ea c t i v e l yc o n v e r t e di n t om o n o s a c c h a r i d e sb yt h ec m d ei n u l i n a s e o n 也eb a s i so fr e s u l t so b t a j n e da b o v e ，w et o o ka d v a n _ t a g eo ft t l ei n u l i n a s ep r o d u c e d b ym - 3 0t ob y d r o l y s ei n u l i na i l dj e r u s a l e ma r t i c h o k et u b e r s ，矗】r t l l e r ；m eh y d r o l y s a t e 、a sf - 钮n e n t e di n t o e t h a l l o lb y 勋c c 办钟d 叨，c p sc p ，p v 西胁已w 一0 f i n a l l y ，让l e 甜l a n o l c o n c e n 饥m o n so b t a i l l e d 、v e r e12 9 3 士0 3 0 ( v v ) r o mi n u l i n 锄d7 0 3 士0 21 ( v v ) 丘o mt h e 酽o u n dt l l b e r sa f b e r12 0 ho ft h ef e 衄e n t a t i o n k e y w o r d s ：1 1 1 u l i n a s e ，尸纪办砌删以耙，m d ，2 讲m 呦g e n e s i s ，s 砌订，e t h a i l o lp r o d u c t i o n 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 或 其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名瞬签字日期垆卵年口钼口j 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公 众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：力讶亏。 导师签字： 签字日想弘明年。f 月。1 日签字胁1 年( 月如 一株高产酵母突变株菊糖酶的生产和酒精发酵的研究 第一章绪论 菊粉( i n l l l i l l ) 是一种广泛存在于菊科植物如菊芋( j e m s a l 锄a r t i c h o k e ) 、菊 苣( c h i c o r ) ，t u b e s ) 、大丽花( d a m i a ) 、牛蒡( 心c t i u m ) 和雪莲果( y a c o n ) 等根部或 块茎中的一种贮存性多糖，其含量非常丰富，能占到块茎干重的7 0 ( p a l l d e ye t a 1 1 9 9 9 ) 。 菊粉是由多个果糖分子通过b 一2 ，1 糖苷键连接成的多聚果糖，其还原性末端 有个葡萄糖残基以旷2 ，1 糖苷键与之相连，呈直链结构。菊粉能够作为生产果 糖糖浆、燃料酒精、低聚果糖的一种可再生原材料( s h e n ge t2 l 1 2 0 0 7 ) 。 菊粉酶( 酬i n a s e ) 是能够水解b 一2 ，卜d 一果聚糖糖苷键的一类水解酶，学名 为p 一2 ，卜d 一果聚糖酶( e c 3 2 1 ) ，能够将菊粉水解为果糖和葡萄糖。根据菊粉 酶对其底物的作用方式不同，可以将其分为菊粉外切酶( e x o m l i i l a s e ) ( e c 3 2 1 8 ) 和菊粉内切酶( e n d o i n u l i i 瑚e ) ( e c 3 2 1 7 ) 。外切酶可以从菊粉分 子的非还原性末端逐一的切下单个的果糖分子，产物为果糖和少量的葡萄糖，而 内切酶可以随机的切断菊粉分子中的p 一2 ，l 糖苷键，产物主要为低聚果糖。 微生物由于其易培养、产酶量高等特点，是生产商业用菊粉酶的最好来源。 相对于其他真菌和细菌而言，酵母菌株能够产生更多的菊粉酶。而在酵母菌中， 毕赤酵母属，两株脆壁克鲁维酵母，金黄色隐球假丝酵母，以及马克思克鲁维酵 母等具有较高而且稳定的产酶活性，存在着潜在的商业应用价值( g 0 n gc t a 1 2 0 0 7 ；s h e n ge ta 1 2 0 0 8 b ) 。 1 菊粉酶的微生物来源 菊粉酶的来源很广，自然界中的许多种微生物都可以产生菊粉酶。据不完全 统计，丝状真菌有1 7 个属4 0 余种，酵母菌有1 0 个属2 0 余种，细菌有1 2 个属1 0 余种能产生产菊粉酶。 1 1 酵母茵 如本实验室保藏的一株季也蒙毕赤酵母僻肋e ，加d ，2 历f ) 菌株l ( 中国海 洋微生物菌种库保藏编号：2 e 0 0 0 4 8 ) ，由一株海洋藻类的表面分离并鉴定保存得 到，可以分泌大量的菊粉酶到培养基中( g o n ge ta 1 2 0 0 7 ) 。在其最适条件下培 一株高产酵母突变株菊糖酶的生产和酒精发酵的研究 养，经过4 8 h 的摇瓶发酵，酶活力能够达到6 1 5 u m l 以上。 另外一株分离自中国南海海泥中的一株金黄色隐球酵母g 7 a 菌株 ( c ，即f d c d c c l l sa “r e 凇) ( 菌种保藏编号：2 e 0 0 0 0 2 ) ，同样能够产生大量的菊粉 酶。这是关于海洋隐球酵母产菊粉酶的首次报道( s h e n ge t2 l 1 2 0 0 7 ) 。g 7 a 菌株所 产的菊粉酶在p h5 o 以及温度5 0 0 c 时展现出良好的酶活性。在其最佳的产酶 条件下培养，摇瓶发酵4 2 h 后酶活力能够达到8 5 0 u m l 左右，值得注意的是， 在用人工配置的海水培养发酵过程中，添加4 0 ( w v ) 的n a c l 以及0 6 ( w v ) 的m g c l 。6 h 。o 非常有利于该酵母菊粉酶的产生。盛军还以p l a c k e t t b 眦l a n d e s i 印为基础应用表面响应法( s u r f a c er e s p o l l s em e t l l o d o l o g y ，s i u m ) 对g 7 a 菌株的固体发酵( s 0 1 i ds t a t ef e 姗e n t a t i o n ，s s f ) 产菊粉酶的产酶条件进行了优化， 在其最佳产酶条件下，经过1 2 0 h 的固体发酵培养，其酶活力能够达到4 2 0 9 1 3 u g 底物干重( u g d s ) ，与该软件预测的最高酶活力单位4 3 6 2 u g d s 相当接 j 丘( s h e n ge t2 l 1 2 0 0 8 a ) 。 据报道，两株分离自龙舌兰属植物汁液和发酵产物中的马克斯克鲁维酵母 ( 同砂w ，d ，砂c 口s 脚a 掰妇挖螂) a 1 和a 2 ，在液体培养条件下具有很好的产菊粉酶活 性( 低于3 2 u 血) ，且对代谢抑制有很高的耐受性( c m z g u e r r e r oe ta 1 2 0 0 6 ) 。 已报道的一株克鲁维属酵母菌株y 一8 5 ，仅经过2 4 h 的发酵，其酶活力能够 达到5 9 5 u i i d 。其培养条件为：菊芋浸出液8 0 ( w v ) ，尿素2 0 ( w v ) ，牛 肉浸膏o 2 ( w v ) ，以及玉米浸膏4 0 ( w v ) ( w 色ie ta 1 1 9 9 8 ) 。用甲基磺酸乙酯 ( e m s ) 处理此菌株，得到了一株能够耐受葡萄糖代谢抑制的突变株y 一8 5k 6 ( w - e i e ta 1 1 9 9 9 a ) 。 另据报道，一株马克思克鲁维酵母( 足聊口腻f 口聍螂v a l6 “? j 羿，f c 淞) ，当生长 在以菊粉，蔗糖，果糖和葡萄糖为碳源的培养基上时，会分泌大量的胞外菊粉酶。 当其在蔗糖作为限制性碳源的恒化器中培养时，其产生菊粉酶的水平决定于恒化 器的稀释率。当稀释率是0 0 5 h 时，其酶活力达到了最高的1 0 7 u 枷，表明在连 续培养过程中，菊粉酶的生产受培养基中残余糖量的调节和控制( k l l s b ie t a j 2 0 0 0 ) 。 另外一株马克思克鲁维酵母n 砒也y _ 7 5 7 1 菌株，当其生长在以甘蔗渣为碳 源，以玉米浸出液为氮源的固体培养基上时，其分泌的胞外菊粉酶活力能够达到 2 一株高产酵母突变株菊糖酶的生产和酒精发酵的研究 3 9 1 9 u g 甘蔗渣于重( b e n d e re ta 1 2 0 0 6 ) 。研究还发现，向培养基中添加豆皮能够 使n r r i ，y - 7 5 7 l 菌株出现最高酶活力所需要的9 6 h 缩减至2 4 h ，每小时内最高酶产 量能够达到8 8 7 u g d s ( m a z u t t ie ta 1 2 0 0 6 ) 1 2 丝状真菌 据n a k a m u r a 报道，一株青霉属( p 阴耙肋”所s p ) t n 8 8 菌株在以菊粉为碳源 的液体培养基中，在3 0 条件下经过4 d 的培养，展示了很高的菊粉内切酶活性 ( 9 9 u i m ) ( n a k a m u r ae ta 1 1 9 9 7 ) 。 一株黑曲霉( 彳印删刀淞刀妇，) n k 一1 2 6 菌株，在以4 0 ( v ) 菊科植物蒲 公英块根提取液( 5 0 9 干重) 和2 0 ( w ) 酵母粉混合2 0 0 r n l 水配制的培养基 中长势良好，在3 0 ，15 0 印m 条件下经过9 6 h 的液体发酵培养，其酶活力能够达 到5 5 u 枷。研究还发现，蒲公英块根的提取物能够诱导该菌株菊粉内切酶的合成 ( k a l l g o ，2 0 0 8 ) 。 1 3 细菌 尽管有报道称酵母菌能够比细菌和丝状真菌产生更多的菊粉酶，仍有研究发 现，一株链霉菌( 跏印幻彬g ss p ) g n d ul 菌株，在含有1 o ( w v ) 菊粉的液 体培养基中，p h 7 5 ，4 6 ，经过2 4 h 的发酵培养，能够产生很高的胞外菊粉酶活 性( 0 5 5 2 u m 1 )( g i l le ta 1 2 0 0 6 ) 还有人研究了利用葡萄球菌( 黝蝴淞s p ) 进行固体发酵来合成菊粉 酶。麦麸、稻壳、椰油饼、以及玉米粉等可以混合或者单独作为固体培养基使用。 在其最佳培养条件下，经过4 8 h 的培养，其胞外菊粉酶活力能够达到1 0 7 6 u 儋d s 。 而一株马克思克鲁维酵母( km 口掰妇玎淞) a t c c5 2 4 6 6 菌株，经过7 2 h 的发酵， 其酶活力能够达到1 2 2 9 u 触。这些结果再次表明，酵母菌能够比细菌产生更多 的菊粉酶( s e l v a k l 髓a ra i l dp a n d e y ，1 9 9 9 ) 。 表1 1 较全面的总结了能够产生菊粉酶的微生物来源，以及相对应的酶活力。 从表中可以看出，大部分被用来生产菊粉酶的菌株是酵母菌，尤其是克鲁维酵母 属( 砂v p 厂d 叼，c p ss p ) 、隐球酵母属( c ，弦幻c d c c 淞s p ) 和毕赤酵母属( 尸f 幽勉 s p ) 应用的最为广泛。酵母菌也能够比其他菌种产生更高的菊粉酶活性。上述 结果还表明，解除葡萄糖对酵母菌产生菊粉酶的阻遏作用，对提高菊粉酶的产量 意义重大。 一株高产酵母突变株菊糖酶的生产和酒精发酵的研究 表卜1 产菊粉酶的微生物及对应酶活力 菊粉酶微生物 培养方式酶活力 参考文毳 e x o - e ) 卜 e x o _ e x o e x 0 e x 伊 e x o e x 0 - c 口“阳淞 g 7 a 菌株 c 口计p 淞g 7 a 菌株 p g t d l l i e m o 砸n 菌株 1 液体发酵 固体发酵 液体发酵 8 5 o 士1 1u m l 4 2 0 9 士1 3u 儋d s s h e n ge ta 1 2 0 0 s h e n ge ta 1 2 0 0 j 6 1 5 士0 4u ，m l g o n ge ta 1 2 0 0 7 尸f 刀诧册d 磁fm 一3 0 液体发酵 12 7 7 士o 6u m l y ue ta 1 2 0 0 8 p 棚p 删d m 搬m 一3 0 固体发酵4 5 5 9 士1 2u 儋d sg u oe ta 1 2 0 0 8 k 聊口掰胁玎甜( a 1 锄d a 2 ) k 所口，x f 口，z z 岱a t c c 1 6 0 4 5 y 8 5 e x o 。 e x 0 e x o e x o - e n d o e x 0 e x 0 只：，咒瓣蛔玎z 博v a r 液体发酵 f i 值 0 o 0 0 1 ) ，说明该模型可 靠性极高。f 值为2 6 7 3 ，同时也证明了该模型是非常显著的。 回归模型的显著性分析见表3 4 ，模型的调整决定系数( a d jr - s q l l a r e d ) a d j r 2 = 0 9 1 3 1 ，说明该模型能解释9 1 3 1 应值的变化，预测决定系数( p r e dr s q 眦e d ) p r e dr 2 = o 7 6 4 3 与调整决定系数拟合度良好说明该模型拟合程度良好，实验误 差小，可以用此模型对菊粉酶的生产进行分析和预测。变异系数( c v _ 4 8 6 ) 较低，说明该实验有很好的精确度和可信度。 表3 3 各变量的回归分析 t a b l e3 3a n a l y s i so fv 撕a i l c e ( a n o v a ) f o rr e g r e s s i o n 表3 4 回归模型的显著性分析 t a b l e3 - 4t e s to fs i g n i f i c a n c ef o rr e 伊e s s i o ns q u a r e 对该回归方程各系数的显著性分析见表3 - 5 ，从表中可看出b ( p h 值) 对菊 粉酶生产的影响显著( p = 0 0 0 5 ) ，d ( 接种量) 对其影响的显著性极显著，超 过了9 9 ( p o o 0 0 1 ) 。而a ( 温度) 、c 菊粉含量( w ) 、e 酵母粉 含量( w v ) 对菊粉酶的液体发酵影响不显著。各不同因子之间的交互项，如 a b 等均不显著。而a 和a ，b 和b ，c 和c ，d 和d 以及e 和e 之间的交互作 3 9 一株高产酵母突变株菊糖酶的生产和酒精发酵的研究 用也对该突变株m 一3 0 的固体发酵产酶有极显著的影响。 表3 5 回归方程各系数的显著性分析 t a b l e3 5t e s to fs i g l l i f i c a n c ef o rr e g r e s s i o nc o e f f i c i e n t 各因素a 、b 、c 、d 和e 及其相互作用对菊粉酶活力的影响的三维立体图如 图3 1 所示。从图中可以看出，响应面的稳定点在所实验的范围之内。该软件预 测的最高酶活力为1 2 9 8u 伽，得到的最优培养条件是菊粉2 ( w v ) ，酵母粉 o 5 ( 、) ，接种量2 ( v v )( o d 6 0 0 咖= 2 0 0 ) ，p h 6 5 ，2 8 。 株高产酵母突变株菊糖酶的生产和酒精发酵的研究 l 国3 一l 菊粉酶液体发酵表面响应三维立体圈 为了验旺川归方程和真实宜验结粜的拟台性，在优化后的最佳发酵条件f 时 m 3 0 的液体发酵过程【 j 的实际，“酶水平进行了验证。如图3 2 所示，最后得到 的m 3 0 的实际酶活力为1 2 77 u m l ，与预测值非常接近，| 兑明此模型能够比较 i 株l 3 0 图3 2 突变株m 一3 0 和出发菌株1 的液体发酵菊粉酶活力比较 ( d m a a r e 9 1 v m e a n s s d ，n 2 3 ) 真实地反映并冈系对发酵产酶的影响对j ：液体发酵条件的优化研究具有重要的 意义，1 1 r 以节省大量的人力物力以及实验r t 阳j 。而在相同条件下，其出发菌株1 的酶活力h 有4 8l u 训。井月在柏钮的发酵时叫内( 4 8 h ) ，突变株m - 3 0 的菊粉 ；i 2二已h：?uu目ho岫 一株高产酵母突变株菊糖酶的生产和酒精发酵的研究 酶活力达到了最高的1 2 7 7 u m l ，这是目前己知产菊粉酶微生物中酶活性最高的， 说明此突变株有着非常大的生物技术应用潜力。 4 2 一株高产酵母突变株菊糖酶的生产和酒精发酵的研究 4 本章小结 利用表面响应法( s r m ) 对海洋季也蒙毕赤酵母突变株m 一3 0 的液体发酵 条件进行了优化，得到最终的培养条件为菊粉2 ( w ) ，酵母粉o 5 ( w ) ， 接种量2 ( v v ，o d 6 0 0 i l l i l _ 2 0 0 ) ，p h 6 5 ，2 8 。 在最优培养条件下，突变株m 3 0 液体发酵酶活力达到了1 2 7 7 u 1 1 1 l ，而 在相同条件下，其出发菌株1 的酶活力只有4 8 1 u 枷，说明通过诱变方法确实使 突变株的酶活力明显得到了提高。 对表面响应法设计液体发酵培养基的可靠性和可行性进行了回归方差分 析及拟合度的研究，在最优培养条件下，m 3 0 液体发酵得到的实际酶活力 ( 1 2 7 7 u “) 和软件所预测的酶活力( 1 2 9 8 u 血) 非常接近，说明该模型能够 很好的预测实际发酵情况。 4 3 一株高产酵母突变株菊糖酶的生产和酒精发酵的研究 第四章利用菊粉酶和酿酒酵母进行糖化和发酵 生产酒精的研究 1 前言 过去一段时期，国际粮食价格飞速上涨，包括燃料乙醇在内的生物燃料被普 遍认为是推高粮价的“罪魁祸首”之一，这导致全球燃料乙醇的发展面临异常尴 尬境地。生物燃料对全球粮食安全的威胁曾被比喻为“车轮子碾碎了穷人的饭 碗 。以美欧为首的农产品生产大国由于大力发展生物燃料，而被谴责为扭曲了 粮食市场，如美国三分之一的玉米被用来生产乙醇，欧盟近一半的植物油被用来 生产生物柴油。生物燃料的生产推动了对粮食的金融投机行为，导致粮价继续飙 升。 2 0 0 7 年我国粮食产量达到5 亿吨，经粗略统计，其中用于口粮消耗的在2 7 亿一2 8 亿吨，其余有2 亿吨主要用于饲料粮。我国2 0 0 7 年消耗汽油5 0 0 0 万吨， 如果按照1 0 的比例添加的话，共需要5 0 0 万吨燃料乙醇，折合成原料( 每3 3 吨的玉米可以产生1 吨乙醇) ，消耗玉米共1 6 5 0 万吨左右，占到了全国玉米消耗 量的1 0 。 不能忽视的事实是，能源需求日益增长，化石能源日渐稀少，发展可再生能 源是大势所趋。客观的讲，可再生的、清洁的、循环的燃料乙醇代表着未来，大 力发展本身无可厚非，重点在于对发展方向的把握和对粮食安全的兼顾。既要大 力发展可再生能源，又要保证粮食安全，这就要大力发展以非粮食作物为原料的 再生能源发展( 汤萌，2 0 0 8 ) 。 值得庆幸的是，除玉米之外，以木薯、秸秆、甜高粱等非粮作物为原料的燃 料乙醇正在大力推广之中。国家政策也在为行业把握方向，如我国对新批玉米乙 醇项目已经“叫停”，提倡乙醇原料的非粮化替代，布局全国根据不同地区的特 点，发展不同原料的燃料乙醇。以菊芋、雪莲果为原料生产高浓度燃料酒精的研 究工作也已经取得了可喜的开端。 菊芋是一种多年生草本植物，具有耐贫瘠、耐干旱、种植简易、适应性强等 优点，在我国很多省份均作为经济固沙植物而广泛种植。菊芋块茎中菊粉的含量 可占其干重的7 0 以上( p a n d e ye ta 1 1 9 9 9 ) 。菊芋块茎是生产燃料乙醇最好的原 一株高产酵母突变株菊糖酶的生产和酒精发酵的研究 材料之一，可以提取其中的菊粉或者将菊芋块茎捣碎之后，使用具有高菊粉酶活 性的微生物以及酿酒酵母进行糖化和发酵生产酒精，从而避免出现发展生物能源 而导致与人畜争粮的局面。 本实验室以海洋季也蒙毕赤酵母菌株l 为出发菌株，经过紫外线结合氯化锂 诱变，得到了一株高产菊糖酶的突变株m 一3 0 ，并通过表面响应法优化了其液体 和固体发酵培养条件后，其菊糖酶活性分别能够达到1 2 7 7u i i l l 和4 5 5 9u g d s 。 在上述研究的基础上，我们引入了酿酒酵母w o 来利用菊糖酶水解菊粉或菊芋 块茎提取液的产物进行发酵生产酒精。 2 材料与方法 2 1 菌株 海洋季也蒙毕赤酵母( 尸删姚口朋。拧硪f ) m 一3 0 ，由本实验室诱变得到并保 存； 酿酒酵母( 勋c c 向a r d 叼，c p ss p ) w 一0 ，由池振明等人通过原生质体融合和酵 母菌杂交技术构建的二倍体高产酒精酵母菌株，现保藏于本实验室。 2 2 培养基及试剂 固体发酵培养基：麸皮：稻糠= 0 4 2 ，湿度为6 0 5 ，p h 值为6 5 ，麸皮和稻 糠购买于青岛大连路农贸市场，麸皮用8 0 0 目的筛子筛过，取筛出物，置于8 0 烘箱烘至恒重，取出备用。在2 5 0m 1 锥形瓶中装入1 5 克固体培养基，接种后 静置培养，并间歇进行摇动，使底料利用和发酵更彻底。 液体y p d 培养基：葡萄糖2 0 ( w v ) ，蛋白胨2 0 ( w v ) ，酵母粉1 0 ( w v ) ，淡水，1 1 5 高温灭菌3 0 m i n 。 固体y p d ：在液体y p d 培养基中添加琼脂2 0 ( w v ) ，海水，1 1 5 高 温灭菌3 0 m i n 。 m 一3 0 种子培养基：菊粉4 ( w v ) ，酵母粉0 5 ( w v ) ，海水，p h 值8 0 菊芋，产自山东临沂，1 0 月采收，新鲜菊芋中的干物质含量为1 9 8 4 ( 新 鲜块茎8 0 烘干至恒重后称量) 。 发酵合成培养基( 2 5 0 m 1 发酵瓶，装液量为1 5 0 1 1 1 1 ) ，培养基各成分含量如下 ( “) ： 一株高产酵母突变株菊糖酶的生产和酒精发酵的研究 菊粉2 0 0 9 或菊芋( 2 0 0 9 干重) ，菊芋洗净称重后，削皮，加入适量蒸馏水， 蒸熟捣碎至匀浆，5 层纱布过滤。麦芽浸膏2 0 9 ，硫酸铵1 0 9 ， 维生素：b 11 m g ，b 24 0 肛g ，b 36 m g ，b 61 m g ，泛酸钙1 0 0 m g ，肌酸1 0 0 m g ， 叶酸4 0 烬，生物素4 0 p g ，对氨基苯甲酸l m g 。( 维生素b 2 ，叶酸，生物素， 对氨基苯甲酸均需要单独灭菌) 碱基：腺嘌呤1 0 m g ，鸟嘌呤1 0 m g ，尿嘧啶1 0 m g ( 浓h c l 溶解) ，黄嘌呤 1 0 m g ( n a 0 h 溶解) 盐类：磷酸二氢钾2 2 9 ，氯化钾1 7 9 ，氯化钙2 5 0 m g ，硫酸镁2 5 0 m g ，硫 酸锰1 0 m g ，硫酸锌1 0 m g ，硫酸铜1 m g ，三氯化铁( 单独灭菌) 1 0 m g 缓冲液用盐：柠檬酸钾4 9 ，柠檬酸o 8 9 2 3 固体发酵产菊粉酶 为了发酵方便，本研究采用固体曲作为菊糖水解的酶制剂，固体菊糖酶制剂 制备方法按照g u o 等人用方法： m 一3 0 在y p d 平板上划线，2 8 培养，4 8 h 后挑取单菌落接入y p d 液体培养 基中，作为固体发酵的种子液，过夜培养后测定种子液o d 6 0 0 姗。取 o 7 5 m l ( o d 6 0 0 砌= 2 0 0 ) 种子液转接至固体培养基中，固体基质组成( 麸皮：稻 壳= 0 4 2 ) ，湿度为6 0 5 ，p h 值为6 5 ，2 8 0 c 培养1 2 0 h ( g h l o ，e ta 1 2 0 0 9 ) 。 2 4 菊粉酶活力的测定 发酵结束后，向三角瓶中加入5 0m l0 1m 磷酸缓冲液( p h6 0 ) ，放入2 8 摇床，1 7 0r p m 的转速振荡培养3 0m i n 。将培养基混合物2 3 4 8 g 离心1 0m i n ， 收集上清液，即为粗酶液。酶活力测定方法见第二章2 4 3 。另取一瓶固体培养 基，分别取出1 0 、2 0 、3 0 、4 0 、5 o g 湿重的固体基质，8 0 烘干至恒重， 称重后制作标准曲线。计算相对于每克干重固体基质的酶活力( u g d s ) 。 2 5 发酵基础培养基中菊糖的初步糖化 在无菌条件下，分别称取相当于2 2 5 、4 5 0 、6 7 5 、9 0 0 、1 1 2 5 和1 3 5 0 u 酶活 力单位的发酵后固体曲，置于菊粉或菊芋块茎提取液为底物的发酵瓶中，用灭过 菌的玻璃棒充分搅匀。置于5 0 水浴锅中，水浴3 0 m i n ，间歇摇动。 2 6 发酵生产酒精 一株高产酵母突变株菊糖酶的生产和酒精发酵的研究 酿酒酵母( 鼢c 办舢m 弦嚣s p ) w 一0 菌株是由池振明等人通过原生质体融合和 酵母菌杂交技术构建的二倍体高产酒精酵母菌株，对高浓度酒精有很高的耐受 力，可以用来发酵生产高浓度酒精( 池振明等，1 9 9 3 ) 。挑取酿酒酵母菌株w 一0 单菌落接入种子培养基中，过夜培养，梯度稀释后用血球计数板计算菌液浓度， 然后将种子液转接至发酵基础培养基中，使得接种后发酵基础培养基中菌液浓度 达到2 1 0 7 c e l l s 枷。摇匀后置于2 8 温箱中静置培养，间歇摇动，使其发酵完全。 每隔2 4 h 称重一次。并于发酵4 8 、9 6 h 后分别补充6 9 和3 9 菊粉或者相当于6 9 和3 9 干重的菊芋块茎提取液。每组做3 个平行，取其平均值。 2 7 酒精蒸馏并测定比重 发酵结束后，将发酵瓶中培养液在4 ，8 4 5 g 离心5 m i n ，取1 0 0 m 1 上清液 混合1 0 0 m 1 蒸馏水，用酒精蒸馏装置蒸馏上述混合液，待馏出液为1 0 0 m l 时，用 酒精比重计测定酒精浓度。 2 8 还原糖和总糖的测定 2 8 1 还原糖的测定 以菊粉为底物的发酵培养基，其中还原糖的测定可直接用n e l s o n - s 咖o g y i 法( s p 衲，1 9 6 6 ) 进行测定，以蒸馏水作为空白对照。 以菊芋块茎提取液为底物的发酵培养基，其还原糖的测定方法为：将其充分 摇匀后，吸取1 m l 至3 0 m l 蒸馏水中，1 0 0 水浴3 0 m i n ，过滤并反复洗涤残渣2 3 次，合并滤液，待冷却至室温后，定容至5 0 m 1 ，然后按照n e l s o n _ s o m o g y i 法进 行测定。 2 8 2 总糖的测定 总糖含量是通过测定酸水解后发酵培养基中还原糖的含量换算得到的。 测定方法为：将发酵培养基摇匀后，吸取1 m 1 培养基至锥形瓶中，加入3 0 m l 1n 的盐酸，1 0 0 水浴l h ，冷却后过滤( 以菊粉为底物的发酵培养基不需抽滤) ， 蒸馏水反复冲洗残渣2 3 次，合并滤液至容量瓶，准确定容至5 0 m l ，然后按照 n e l s o n s o m o g ) r i 法进行测定。 3 结果与讨论 3 1 最适菊粉酶含量的确定 4 7 一株高产酵母突变株菊糖酶的生产和酒精发酵的研究 如图4 1 所示，在以菊粉为底物的发酵基础培养基中，没有添加菊粉酶的发 酵瓶几乎没有失重，随着添加菊粉酶总活力的增加，发酵瓶总失重随之增加，并 在添加的总酶活力为6 7 5 u 时( 发酵体系中菊糖酶含量为4 5 u 1 1 1 1 ) ，失重量达 到最大，这说明酿酒酵母不能直接利用菊粉来进行发酵，添加总的酶活力为6 7 5 u 时，菊粉的水解产物能够满足酿酒酵母发酵的需求。 而在菊芋块茎提取液为底物的发酵基础培养基中，在没有添加菊粉酶的发酵 瓶，也存在少量的发酵，这说明菊芋块茎中含有少量的果糖等其他糖类。在添加 的总酶活力为9 0 0 u 时( 发酵体系中菊糖酶含量为6 0 u “) ，失重量达到最大。 说明添加9 0 0 u 的酶活力能够满足发酵的需求。 图4 1 添加菊粉酶的总活力与发酵失重的关系 ( d a t a 眦g i v e n 笛m e a 璐士s d ，n 2 3 ) 3 2 酒精发酵过程失重量比较 在发酵初期，菊粉和菊芋块茎提取液培养基的发酵失重量相差不大，在发酵 刚开始的0 2 4 h ，菊粉培养基发酵失重量甚至要低于菊芋块茎提取液，这可能是 由于菊粉培养基经过发酵前的初步糖化之后，糖浓度比较高，会在一定程度上抑 制发酵过程。而在发酵4 8 1 2 0 h ，菊粉发酵培养基的失重量显著增加，明显要高 于菊芋块茎提取液培养基的失重量，这是由于菊粉发酵培养基中的总糖含量高于 以菊芋块茎提取液培养基，如图4 2 所示。 4 8 一株高产酵母突变株菊糖酶的生产和酒精发酵的研究 图4 2 发酵过程失重量比较 ( d a ：t aa r eg i v e n 罄m e a n s 士s d ，n = 3 ) 3 3 酒精发酵结果的分析 在以菊粉为底物进行酒精发酵的试验中，发酵前和发酵后的总糖浓度分别为 1 9 8 4 和0 2 9 ( w v ) ，在发酵期间共添加了5 9 5 ( w v ) 菊粉，最后总糖的消 耗率为9 8 8 3 ，说明添加的菊粉酶能够将绝大部分的菊粉水解掉。而发酵前和 发酵后的还原糖浓度分别为o 9 l 和0 0 8 ( w v ) 。 而以菊芋块茎提取液为底物的发酵瓶中，发酵前和发酵后的总糖含量分别为 9 0 5 和1 0 5 ( v v ) ，在发酵期间共添加2 7 1 ( w v ) 的菊芋块茎提取液( 相 当于9 9 干重的菊芋块茎) ，最后总糖消耗率是9 0 4 7 ，约有1 0 的总糖没有被利 用掉。发酵前后的还原糖含量分别为1 1 2 和0 2 7 ，还原糖还有一定的残留， 说明发酵并不是特别完全。以菊粉和菊芋块茎提取液为底物发酵生产酒精，得到 的酒精浓度分别为1 2 9 3 和7 0 3 ( v v ) 左右，见表4 1 。 表4 - 1 分别以菊粉和菊芋块茎提取液为底物进行酒精发酵的结果比较 4 9 一株高产酵母突变株菊糖酶的生产和酒精发酵的研究 ( d a t aa r e 9 1 v e n 笛m e a r 塔士s d ，n 2 3 ) 以上结果表明利用菊粉酶和酿酒酵母，能够以菊芋块茎提取液为底物进行糖 化和发酵生产酒精。虽然最后得到的酒精浓度并不高，日本的n 出锄u r a 也早在 1 9 9 6 年就利用黑曲霉8 1 7 菌株和一株耐酒精酿酒酵母菌株1 2 0 0 用来分别利用菊粉 和菊芋块茎进行同步糖化和发酵生产酒精，并且得到了非常好的结果，如在以菊 粉为底物进行同步糖化和发酵，经过3 d 的发酵，酒精浓度能够达到2 1 ( v v ) 。 在以菊芋浓缩汁为底物的试验中，经过3 d 的发酵，酒精浓度能够达到1 5 0 ( v ) ( n 出锄帆】r e ta 1 1 9 9 6 ) 。而本实验是首次尝试利用海洋酵母菌所产的菊粉酶和 酿酒酵母来发酵生产酒精。以菊粉或菊芋块茎提取液为底物进行酒精发酵，为液 体燃料酒精的非粮化生产做出了有益的尝试，为后续研究和将来的工业化生产打 下了一定的基础，并且在目前能源危机和粮食危机的时代背景下，其意义显得尤 为重要。 5 0 一株高产酵母突变株菊糖酶的生产和酒精发酵的研究 4 本章小结： 确定了分别以菊粉和菊芋块茎提取液为底物的发酵培养基，进行糖化发 酵时所需要的最适菊粉酶含量，发酵体系中菊糖酶含量分别为4 5 和6 0 u i i l l 。 分别利用菊粉和菊芋块茎提取液为底物配制发酵培养基，利用m 一3 0 所 产的菊粉酶和酿酒酵母进行了糖化和发酵来生产酒精，得到的酒精浓度分别能够 达到1 2 9 3 和7 0 3 ( v v ) 。 利用菊芋块茎提取液发酵生产酒精，虽然生产的酒精浓度并不高，只有 7 0 3 ( v v ) 左右，但是操作简单，成本较低，对生产条件要求不高，有利于在条 件不发达地区进行大规模生产。 在以菊粉和菊芋块茎提取液为底物的发酵培养基，一总糖的消耗率分别是 9 8 8 3 和9 0 4 7 ，发酵后还原糖的残留量分别为0 0 8 和o 2 7 ( w v ) 。说明以 菊粉为底物的发酵培养基酒精发酵比较完全，消耗了绝大部分的总糖；而以菊芋 块茎提取液为底物的发酵培养基中的总糖残留较多( 约1 0 ，w v ) ，还原糖也有 一定的残留，说明酒精发酵不是很完全。 一株高产酵母突变株菊糖酶的生产和酒精发酵的研究 总结 本文对海洋季也蒙毕赤酵母菊粉酶的诱变、液体发酵条件的优化，和利用菊 粉酶来生产酒精进行了研究。主要研究成果为： 以海洋季也蒙毕赤酵母菌株1 为出发菌株，利用紫外线结合氯化锂方法 对其所产的子囊孢子进行诱变，成功的得到了一株高产菊粉酶的突变株m 一3 0 ， 酶活力是出发菌株的2 倍左右。 利用表面响应法对季也蒙毕赤酵母菌株1 的高产菊粉酶突变株m 一3 0 的 液体发酵产酶条件进行了优化，得到最终的最优条件为菊粉2 ( w v ) ，酵母粉 0 5 ( w v ) ，接种量2 ( v v ) ( o d 6 0 0 n m = 2 0 0 ) ，初始p h 6 5 ，2 8 。在最优培养 条件下，突变株m 一3 0 的菊粉酶活力能够达到1 2 7 7 u 血，而在相同培养条件下 其出发菌株1 的酶活力只有4 8 1 u m l ，菊粉酶产量得到了明显提高。并且发现 该突变株所产的菊粉酶有很高的外切酶活性。 利用菌株m 3 0 所产的菊粉酶和酿酒酵母w 一0 ，分别以菊粉和菊芋块茎 提取液为底物进行了糖化和发酵来生产酒精，发酵结束后得到的酒精浓度分别为 1 2 9 3 和7 0 3 ( v v ) 。本实验是首次尝试利用海洋酵母菌所产的菊粉酶和酿酒 酵母来发酵生产酒精。以菊