（生物化学与分子生物学专业论文）ap2a与tes的相互作用.pdf

摘要 瀚、 a p 2 是一个功能重要的转录因子家族，在哺乳动物的胚胎发育 过程中，其表达受到严格的时空调控，参与多种组织和器官的细胞分 化和形态发生，如神经脊，颅面部，四肢，躯干部，心脏和肾脏的发 育。已经被克隆和研究的a p 2 家族成员有a p - 2 a ，a l p 一2 p ，a p 一2 t ， a p 2 6 与a p 2 8 ，都能以同源或异源二聚体的形式结合于保守的d n a 序列5 - g c c n n n g g c 。37 。a p 2 a 是a p 2 家族中最早被克隆和研究 最多的一个成员。其功能不仅表现为胚胎发育中的重要调控子，还通 过转录调控下游靶基因参与多个生理过程的调节，包括细胞生长，分 化，癌变和凋亡等。作为一个多功能的调控因子，a p 2 a 有多个协同 作用的蛋白伙伴。为了找到更多的与a p 一2 a 相互作用的蛋白因子，我 们用全长的a p 2 a 作为诱饵蛋白筛选了h e l ac d n a 文库。得到了一 个阳性克隆为人类的t e s t i n ( t e s ) 基因，另一个为a c t i n i n ( a c t n ) 基因。两者都是细胞骨架相关的蛋白，都能与a c t i n 相互作用。其中 t e s 具有p e t - l i m 结构，在其c 端有先后排列的3 个u md o m a i n ，可 能与癌症的抑制相关。 在本论文中，我们重点研究了t e s 与a p 一2 a 的相互作用以及 t e s 的功能。我们表达纯化了全长和多种分段的a p 2 a 与t e s 蛋白， 并制备了相应的抗血清。a p 2 a 与t e s 蛋白的相互作用通过体外 p u l l d o w n 与细胞裂解液中的免疫共沉淀实验得到了进一步验证。我 们用体外p u l l d o w n 实验将两者的相互作用定位于两个蛋白的c 端。 另外，我们还检测了t e s 蛋白的分子内相互作用，发现其n 端通过 c 端的l i m 3 在体外相互结合。在荧光素酶报告系统中，我们的结果 表明t e s 的过表达能够抑制a p 一2 a 对e r b b 2 启动子的转录活性，而 且除了全长，t e s 的c 端与n 端似乎都有一定的作用。在细胞免疫 荧光化学分析中，我们发现本底t e s 蛋白定位有多种模式，特别是 能位于内质网和细胞核中。我们的结果显示t e s 与a p 2 a 的表达在 细胞核中有部分重叠区域。有趣的是，我们还发现t e s 过表达引起 本底的a p 。2 a 表达水平降低。而对t e s 进行r n a 干扰可以大大提高 本底e r b b 2 基因的转录水平。 总的来说，我们的研究表明a p 2 a 与t e s 存在着体外相互作用， 在细胞内可能处于同一复合体中，两者的相互作用可能对a p 2 a 介导 的e r b b 2 转录激活起到抑制。同时我们的结果也为抑制癌症的功能 提供了新的机制通过抑制a p 2 a 的转录活性而起作用。而t e s 蛋白 新的细胞内定位表明其功能不仅与细胞骨架相关，还在细胞核等区域 内有一定的作用，a p 2 a 就是t e s 在细胞核中第一个相互作用的协助 伙伴。t e s 在细胞核中的具体功能将有待进一步深入研究和发现。 关键词：a p 2 a 基因，t e s 基因，蛋白相互作用，e r b b 2 启动子， 细胞定位 a b s t r a c t a p 一2i sac r i t i c a lt r a n s c r i p t i o n a lf a m i l yt e m p o r a l l ya n ds p a t i a l l y r e g u l a t e di nm a m m a le m b r y od e v e l o p m e n ti n c l u d i n gn e u r a lc r e s t ，c r a n i a l f a c e ，l i m b s ，h e a r ta n dk i d n e y t od a t e ，f i v em e m b e r so ft h ea p - 2f a m i l y o ft r a n s c r i p t i o nf a c t o r s ，a p 一2 a ，a p 2 p ，a p 一2 7 ，a p - 2 8a n da p - 2 sh a v e b e e ni d e n t i f i e da n da l lo ft h e mc a l lb i n d 嬲h o m o o rh e t e r o d i m e r st ot h e t y p i c a lc o n s e n s u ss e q u e n c eo f5 - g c c n n n g ( 把一37 a p - 2 ai st h ef i r s t g e n ec l o n e da n dt h er e l a t i v e l yb e s tc h a r a c t e r i z e da m o n gt h ea p 一2g e n e f a m i l y i th a sb e e ns h o w nt h a ta p - 2 ai s a l li m p o r t a n tr e g u l a t o rt h a t m e d i a t e se s s e n t i a le v e n t si ne m b r y od e v e l o p m e n ta n da l s op a r t i c i p a t ei n m a n yb i o l o g i c a lp r o c 懿s e s s u c ha sc e l l g r o w t h ，d i f f e r e n t i a t i o n ， c a r c i n o g e n e s i s ，o ra p o p t o s i st h r o u g h t h e t r a n s c r i p t i o n a l c o n t r o lo f m u l t i p l et a r g e td o w n s t r e a mg e n e s t ob eaf u n c t i o n a lr e g u l a t o r , a p 一2 ai s c o - o p e r a t o rw i t han u m b e ro fp a r t n e r s t oi d e n t i f ym o r eo ft h ei n t e r a c t i n g c o - a c t i v a t o r so fa p - - 2 a , ah e l ae d n al i b r a r yw a ss c r e e n e db yy e a s t t w o h y b r i da s s a yu s i n gt h ef u l ll e n g t hs e q u e n c eo fa p 一2 仅弱ab a i tp r o t e i n o n eo ft h ep o s i t i v ec l o n e sw a si d e n t i f i e db yt h ey e a s tt w o h y b r i da s s a ya s t h eh u m a nt e s t i n ( t e s ) g e n ea n dt h eo t h e rw a sa c t i n i n ( a c t n ) b o t h p r o t e i n sc a nb i n dw i t ht h ea c t i ni n v o l v i n gi nt h ec y t o s k e l e t o n t h et e s h a sap e td o m a i ni nt h en h 2 - t e r m i n u sa n d3t a n d e ml i md o m a i n si nt h e c o o h - t e r m i n u s ，w h i c hh a sb e e nr e p o r t e da s ac a n d i d a t eo ft u m o r s u p p r e s s o r i nt h i ss t u d y , w ep u te m p h a s i st ot h et e sf u n c t i o nr e s e a r c h a n dt h er e l e v a n c eb e t w e e nt e sa p - 2 仅t h ef u l l l e n g t ho rt r u n c a t i o n so f a p - 2 aa n dt e sp r o t e i n sw e r e e x p r e s s e d a n dp u r i f i e d ，a n dt h e n c o r r e s p o n d i n ga n t i s e r u m sa r ep r e p e a r e d t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt e s a n da p - 2 ap r o t e i n sw a sc o n f i r m e db yp u l l - - d o w na s s a y nv i t r oa n d m c o i m m u n o p r e c i p i t a t i o n nv i v o f u r t h e r m o r e ，w e f o u n dt h a tt h e i n t e r a c t i o nd o m a i n sb e t w e e nt e sa n da p 2 仅l i ei nt h ec o o h t e r m i n io f b o t hp r o t e i n s i na d d i t i o n , w ea l s od e t e c t e dt h ei n t r a m o l e c u l a ri n t e r a c t i o n b e t w e e nt h en h 2 一a n dc o o h t e r m i n a lo ft h et e s p r o t e i n s ，a n df o u n d t h e d e t a i l e dr e g i o nr e s p o n s i b l ef o rb i n d i n gw i t ht h en h 2 - t e r m i n u sw a sl i m 3 i nt h ec o o h t e r m i n u so ft e s i nt h el u c i f e r a s er e p o r t e r a n a l y s i s ， o v e r e x p r e s s i o no ft e ss u p p r e s s e dt h et r a n s c r i p t i o n a la c t i v i t yo fa p - 2 a o v e rt h ep r o m o t e ro fe r b b 2g e n e i ti sap u z z l et h a tt h et w ot e r m i n io f t e sa l s oh a ds o m ef u n c t i o nu p o nt h et r a n s c r i p t i o n a la c t i v i t yo fa p 一2 a i n t h ec e l l u l a ri m m u n o f l u o r e s c e n c e a s s a y s ，w e s h o w e dav a r i a b l e e n d o g e n o u st e s l o c a l i z a t i o ne s p e c i a l l yi nt h en u c l e u sa n de r f u r t h e r , w ed e m o n s t r a t e dt h a tt e sa n da p - 2 aw e r ep a r t i a l l yc o - l o c a l i z e di nt h e n u c l e u s m o r e o v e r , i ti si n t e r e s t i n gt h a tt h et e so v e r e x p r e s s i o nl e a d st oa d e c r e a s e dl e v e lo fa p 一2 a p r o t e i n w h i l et r a n s f e c t i o no fs i r n a s p e c i f i c a l l ya g a i n s tt e sg e n er e s u l t e di nas i g n i f i c a n ti n c r e a s eo f e r b b 2 t r a n s c r i p t i o n 瞄( e nt o g e t h e r , o u r s t u d i e sr e v e a l e dt h a ta p 一2 ai s p h y s i c a l l ya s s o c i a t e dw i t ht e s nv i t r oa n df o r m e dac o m p l e xw i t ht e s nv i v o a n dt h e i ri n t e r a c t i o nm a yb ei n v o l v i n ga ni n h i b i t o r ym e c h a n i s m o v e ra p - 2 一m e d i a t e dt r a n s a c t i v a t i o no fe r b b 2g e n e a tt h es a m et i m e ， w ea l s os u g g e s tan e wr o l eo ft e sa sat u m o r s u p p r e s s o rb ys u p p r e s s i n g t h et r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y o fa p - 2 a w h e r e a st h en o v e lc e l l u l a r l o c a l i z a t i o no ft e sp r o t e i ni m p l i c a t e st h a tt e sf u n c t i o n sm o r et h a na c y t o s k e l e t o na s s o c i a t e dp r o t e i n ，a n d i t sf i r s tp h y s i c a la n df u n c t i o n a l p a r t n e ri nn u c l e u sm a y b ea p - 2 a k e yw o r d s ：a p 一2 a ，t e s ，p r o t e i ni n t e r a c t i o n ，e r b b 2p r o m o t e r , c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n 目录 摘j l 瑟i a b s t r a c t i i i 第一章前言l 1 1a p 2 是具有转录活性和d n a 结合活性的蛋白2 1 2a p 2 在发育中表达与影响。4 1 3 转录因子与下游调控基因1 9 1 4 相互作用因子与转录共调控2 6 1 5a p 2 的上游调控因子3 3 1 6 基因功能研究的方法摸索3 4 1 7 本课题研究的背景和意义3 5 第二章材料与方法3 8 2 1 仪器3 8 2 2 菌种与细胞3 9 2 3 质粒载体。3 9 2 4 试剂与溶液3 9 2 5 实验方法4 3 第三章结果与分析5 2 3 1 蛋白表达纯化与抗体制备5 2 3 2 蛋白相互作用5 4 3 3t e s 过表达对a p 2 a 转录活性的抑制5 8 3 4t e s 过表达降低a p 2 a 蛋白的本底水平5 9 3 5t e s 基因的r n a 干扰6 2 3 6t e s 蛋白在细胞内的定位6 3 第四章讨论7 5 参考文献8 l 附录1 9 7 附录2 9 8 致谢9 9 湖南师范大学学位论文原创性声明1 0 0 a p 2 a 与t e s 的相互作用川s 新功能的发现 第一章前言 对生命物质的研究分类及中心法则将核酸与蛋白质不仅截然不同 又紧密联系的现象展示在大家面前之后，生物学家对起到联系作用的 d n a 结合蛋白，以及从核酸到蛋白质转化的基因转录与翻译调控产生 了强烈的兴趣。转录因子的发现和研究于是得到了充分的关注。 a p 2 作为一个转录因子家族，因为与特异性的d n a 序列结合而被 分离纯化出来1 。a p 2 a 是a p 2 家族的第一个成员，之后发现的同源基 因还有a p 2 p “，a p 2 矿，a p 2 6 6 ，7 和a p 2 8 ，9 以及关于a p 2 0 【的不同剪切 产物n 1 4 。从头索动物到各级脊椎动物的基因组中，a p 2 基因都有序列 和功能上的保守性1 5 。a p 2 的家族成员之间有较高的同源性和序列的 相似性，他们自身或相互之间形成同源或异源二聚体之后与d n a 序列 结合2 3 彩在多个家族成员皆有表达的细胞和组织中增加了a p 2 转录调 控的复杂性。原位的r n a 杂交以及组织免疫染色技术显示了a p 2 各家 族成员在胚胎发育和动物成体中的表达分布既有相关性又有独立性。 基因敲除为分别研究a p 2 各成员的基因功能提供了最直接而有效的手 段。基因敲除的结果显示a p 2 在胚胎发育中起着非常重要的功能，参 与调控神经系统，四肢，眼睛，骨骼，心脏，肾脏等等的发育与细胞 分化，而且不同的家族成员之间有着各自不同的功能和效果。 在不同的化学物质处理下，初步显示a p 2 参与两个重要的信号通 路蛋白激酶c 与c a m p 依赖的蛋白激酶a 途径，并且参与视黄酸 诱导的细胞分化，介导n r a s 基因造成的细胞转化1 2 6 刀。随着启动子与 转录调控基因表达研究的详细与深入，序列分析表明a p 2 识别的特异 位点广泛存在于多个重要基因的顺式调控( 启动子或增强子) 区域， a p 2 与多个基因调控序列结合的可能性都通过染色质免疫沉淀，d n a 酶足迹以及电泳迁移率变动实验得到了证实2 溯。 寻找下游的被调控基因一直是研究转录因子功能和信号传导通路 博士学位论文 的主要内容。受a p 2 下游调控的靶基因不断发现的同时，与a p 2 协作 起到调控转录作用的结合蛋白也不断被揭示，其中包括多种转录因子， 病毒蛋白；a p 2 与这些蛋白协同或竞争的与烈怕序列结合的方式造成 了基因转录调控的复杂性，a p 2 对其靶基因的调控既有可能是激活也 有可能是沉默其转录表达3 4 ，4 8 ，5 m 5 9 。 对于a p 2 靶基因功能的研究以及与a p 2 相互结合蛋白的研究深入 扩展了a p 2 本身功能的研究。通过调控一系列下游基因a p 2 在多种癌 症发生作用，如乳腺癌2 8 ，渊，黑素瘤3 5 4 7 ，诼7 4 ，卵巢癌7 5 一，前列腺癌7 7 一， 结肠癌8 0 ，8 1 ，肺癌8 2 ，神经胶质瘤8 3 ，生殖细胞瘤8 4 等。与多种蛋白协同 调控细胞生长，细胞周期舾，细胞分化8 6 ，细胞凋亡8 7 税等生理过程。 1 1a p 2 是具有转录活性和d n a 结合活性的蛋白 a p 2 作为转录因子，与大多数转录因子相似，既包含激活下游基 因转录的转录激活区又含有与d n a 特异结合的区域。 与d n a 结合的区域位于a p 2 的c 末端，a p 2 与d n a 序列结合是以 二聚体的形式，而且胶连后的免疫沉淀反应显示即使不存在d n a 时， a p 2 也是以二聚体的形式存在2 5 。正是导致形成二聚体的蛋白区域利于 形成了a p 2 与d n a 结合的结构域。a p 2 与d n a 的特异性结合除了需要 促成二聚体形成的区域还需要一个邻近的一个含净电荷的碱性区域。 形成二聚体的模体包含两个由两性分子构成的仅螺旋中间由一个较长 的横跨区域分开：称为h e l i x s p a n h e l i x ( h s h ) 结构域。与碱性区域分 开时，该h s h 区域不能与d n a 结合，但是保留形成二聚体的特性。h s h 区域通过导致二聚体形成而促进转录因子与d n a 的结合2 4 。更详细的研 究表明位于2 5 2 2 6 0 的氨基酸残基对于a p 2 与d n a 的结合是必须的，如 果替换2 5 3 ，2 5 4 ，2 5 5 ，2 5 7 或2 6 0 位的氨基酸残基可以使a p 2 与a p o e 启动子的结合完全消失9 3 。a p 2 基因家族成员在蛋白的d n a 结合域有 着很高的相似性，所以有着相对保守的d n a 结合序列，比较a p 2 a 与 a p 却的结合位点，与两者都能相结合的保守序列为 a p 2 a 与t e s 的相互作用1 r e s 新功能的发现 ( o ) ( c ) c c n n ( a o c ( o ) ( g ) ( a ) g ( g ) c ( t ) 。除了这一保守序列外，也有 报道a p 2 还可与另一保守序列5 t a g 丸a g n y c y n g 3 结合2 3 ，或者 g c cn 3g g c g c c n 4g g c 和g c cn 3 4g g g 9 4 。a p 2 蛋白与d n a 序列结合的亲和性高低直接影响其对下游基因的转录激活。a p 2 倾向 于结合亲和性更高的d n a 序列，激活下游基因的转录，但是在a p 2 蛋 白的丰度提高的情况下也有可能结合到低亲和性的d n a 序列上调控基 因转录9 5 。这也许是a p 2 在不同的细胞或组织中具有不同活性的原因之 。o a p 2 与d n a 的结合能够受到氧化还原条件的可逆性调节，a p 2 的 氧化与还原状态很有可能与a p 2 的d n a 结合域中存在的半胱氨酸残基 的氧化还原状态直接相关，二硫键的不同折叠引起a p 2 的d n a 结合域 构像发生变化，从而影响a p 2 与d n a 的结合。硫氧还蛋白是a p 2 与 d n a 的结合的潜在刺激物。体外重组表达的a p 2 蛋白被联胺或者过氧 化氢等物质氧化后，与保守d n a 序列结合的活性被抑制。过氧化物对 a p 2 与特异d n a 结合的抑制效应是剂量依赖性的，而这种抑制性可被 还原剂如p 巯基乙醇等可逆的消除。氧化剂的处理可引起a p 一2 蛋白在 非变性胶中的迁移发生变化，同样这种变化也可以通过还原剂可逆的 消除。 a p 2 的转录激活域位于蛋白的n 端，富含脯氨酸残基，该转录激 活域与g 6 必蛋白的d n a 结合域形成的杂交分子仍然具有转录激活的 特性2 5 。a p 2 家族成员在转录激活域的序列有很大不同，但是在编码的 某些氨基酸残基处如p y 或x p p x y 是保守的7 。对于a p 2 a 蛋白来说，位 于5 2 1 0 8 位的氨基酸残基对于转录激活是必须的，相似的序列也存在 于除了果蝇a p 2 a 蛋白的a p 2 家族成员序列中。其中不多于3 6 个氨基酸 残基是关键性的，在不同的a p 2 家族成员中，这些关键性残基被非关 键性残基间隔开，这些间隔的残基序列存在长短和位置的差异，表明 a p 2 的转录激活域在结构上存在着弹性。果蝇a p 2 a 蛋白的转录激活区 博士学位论文 也有类似的保守氨基酸残基分布，但是区域的分布的序列长度相当于 其他成员的两倍9 7 。 1 2a p 2 在发育中表达与影响 发育和细胞分化过程是受到多种因素调控的复杂过程，其正常进 行在很大程度上受到各基因的转录水平的影响。其中a p 2 就是在此过 程中起到重要调控作用的一个转录因子家族，在不同类型的细胞中具 有表达特异性，对于脊椎动物的发育和胚胎发生过程是必须的。 1 2 1a p 2 在胚胎中的表达 a p 2 家族对发育和细胞分化影响主要体现在神经脊及各种来源于 神经脊的衍生细胞与组织，颅面部器官和骨骼的发育，四肢和关节软 骨的发育，内脏( 心脏和肾脏) 的发育。 1 2 1 1a p 2 家族各成员在小鼠胚胎发育过程中的表达 a p 2 a 在小鼠胚胎发育过程中的神经脊细胞世系中表达，比较胚胎 形成的l o 5 。到1 5 5 天期间a p 2 am r n a 的表达显示，1 1 5 天时是其 m r n a 的最高峰，随后其表达平稳的减少。r n a 原位杂交分析表明在 妊娠8 5 到1 2 5 天的小鼠胚胎中发现a p 2 新的表达模式。其间a p 2 a 主要表达与神经脊细胞与其主要的衍生细胞中，包括头部和脊椎的感 觉神经中枢和面部的间叶细胞。a p 2 a 还表达于外胚层的表层，纵向分 布贯穿脊髓和后脑直到与神经脊细胞来源的感觉神经中枢相联系。另 # h a p 2 还表达于四肢的芽状顶端的间叶细胞和m e s o m e t a n e p h r i c 区域 2 2 在小鼠胚胎发育过程中分析比较a p 2 a 与a p 2 p 基因的表达显示， a p 2 a 与a p 2 p 基因在胚胎发育中的表达具有时间和空间上的差异。 a p 2 p 与a p 2 a 有7 6 的同源性，在小鼠胚胎发育的1 3 5 到1 5 5 天时可 以检测到两者共同的表达。胚胎原位杂交的结果表明两者的表达都起 始于胚胎发育的第8 天，位于头部侧面的间叶细胞和胚胎外滋养层细 胞。直到胚胎发育的第1 0 天，两者的表达模式都很相似，之后两者的 4 a p 2 0 t 与t e s 的相互作用t e s 新功能的发现 表达出现了显著的分歧，有各自的特异性的表达。从1 1 天起a p 2 d 特异 的表达于中脑，交感神经中枢，肾上腺髓质和角膜中。a p 2 a 贝t j 特异的 表达于肢芽，背根神经中枢，牙胚原基，雌雄生殖腺体中。而两者都 有表达的区域在皮肤，面部间叶细胞，脊髓，小脑，肾小管上皮粥。 a p 2 丫在小鼠胚胎中表达于滋养层，神经脊，外胚层细胞，调控 细胞分裂和分化的过程舛。 a p 2 8 有独特的d n a 识别序列，在其转录激活区不含p ym o t i f 等在 其他a p 2 蛋白中保守的序列。a p 2 6 与其他a p 2 基因相比有更严格的时 间和空间限制性，表达仅见于中枢神经系统，视网膜，还独特的表达 于发育中的心脏部位。在神经脊，面部间叶细胞，肢芽等其他a p 2 基 因有表达的组织中不能检测到a p 2 6 的表达。a p 2 8 的表达最先在e 9 5 的心脏和脑中检测到，在心肌膜中持续表达至j j e l 0 5 结束。a p 2 8 在脑 发育中的表达e 1 0 5 至e 11 0 开始弥散，从e 1 2 5 起其表达开始限于第三 囊泡顶部，并有两个窄的纵行表达沿着囊泡壁和前脑h e o p a l l i a l 的皮层 顶部。a p 2 5e 1 0 5 在脊髓中也有表达，e 1 3 5 至e 1 6 5 ，a p 2 8 在视网 膜上皮表达6 。 1 2 1 2a p 2 在其他模式动物胚胎发育中的表达 a p 2 在发育中的作用在多种动物模型上得到了充分的研究，我们 例举如下。研究得较早的是在x e n o p u sl a e v i s 中a p 2 a 的同源基因 x a p 2 a ，其氨基酸序列表明该蛋白在进化过程中十分保守，至少在脊 椎动物中是这样。n o r t h e r nb l o t 的结果表i 明x c n o p u s 胚胎中主要存在3 种形式的x a p 2m r n a ，只在m i d b l a s t u l at r a n s i t i o n ( 当胚胎自身的转录 被激活) 后能够检测到，其转录产物在原肠胚形成时出现表达高峰。所 以与x c n o p u s 的其他转录因子相比，x a p 2 a 的表达不是母源性的而是 受精卵的转录产物。与培养的人类畸胎瘤细胞系( n t 2 ) 不同，视黄酸的 处理不能诱导x e n o p u s 胚胎对x a p 2m r n a 的转录，虽然该试剂的处理 能引起x e n o p u s 胚胎发生显著的形态变化2 1 。在x e n o p u sl a e v i s 中， 博士学位论文 a p 2 p ，a p 2 丫与t f a p 2 c t 从原肠胚晚期到神经胚早期都能表达于神 经脊。a p 2 a 与a p 2 y 还表达于外部上皮细胞中，a p 2 1 3 贝j j 是神经脊特 异表达的。三者都能被w n t 1 3 c a t e n i n - - b m p 信号诱导，与a p 2 家族识别 的保守d n a 序列结合1 0 0 。a p 2 在x e n o p u s 中的表达与之相似，x a p 2 a 在m i d b l a s t u l at r a n s i t i o n 之后很快在整个动物半球的区域内表达，在原肠 胚形成的末期则限于上皮决定细胞中表达，受到b m p 信号的调控。在 将来形成神经脊的区域x a p 2 的表达提高也在此时开始1 0 1 。 果蝇中a p 2 a 同源基因d a p 2 a 的氨基酸序列与脊椎动物中的同源 蛋白相比有4 2 - 4 5 的相似性。其中与结合d n a 和形成二聚体有关的 1 0 7 个氨基酸序列在果蝇和脊椎动物中都高度保守，呈现9 0 9 2 的相似 性。细胞转染试验表明在果蝇和哺乳动物细胞内，d a p 2 都能通过a p 2 结合的保守序列激活转录。d a p 2 在果蝇的早期胚胎中有表达，在成 体中也可检测到。整体的原位杂交表明d a p 2 在果蝇胚胎发育的第9 期 开始表达，主要位于脑，眼触角盘，感光片， a n t e n n o m a x i l l a r y c o m p l e x ，以及腹部神经索的一些细胞中1 8 0d a p 2 还表达于第三龄幼虫 的脑，视觉叶，腹部神经索，a n t e n n o m a x i l l a r yc o m p l e x ，触角和腿的成 虫盘1 0 2 ，在吻突，腿部和脑中心复合体发育中有作用1 0 3 。d a p 2 与哺 乳动物a p 2 的相似表明a p 2 在多细胞动物的发育中有保守的功能。 鸡的a p 2 蛋白序列与人类和小鼠的相比存在9 4 的同源性，在其 胚胎发育的原始条纹期开始表达，直到2 8 期。a p 2 最显著的在头部的 表达模式是在神经脊细胞迁移的时期，a p 2 的转录表达紧随着先前神 经脊细胞的区域迁移。随后在面部的间叶细胞中表达，最强是在 f r o n t o n a s a lm a s sa n dl a t e r a ln a s a lp r o m i n e n c e s ，在上颌与颚的突起部位 有表达下调。一旦肢芽分化可见，a p 2 就在其末端间叶细胞中表达， 但是不包括顶端外胚层脊的部位。第2 0 期的表达模式表明a p 2 可能在 面部突起物和肢芽的出芽与长出过程中起重要作用。在第2 0 期的胚胎 的右鼻孔植入浸泡了视黄酸的珠子，导致前和侧向的鼻面的长出受到 6 a p 2 a 与t e s 的相互作用t e s 新功能的发现 特异性的抑制。a p 2 的表达在珠子植入8 小时几乎被完全抑制。而在正 常的鼻前壁中a p 2 表达的上调不会在视黄酸的诱导下产生。而在右鼻 孔周围伴随a p 2 表达的下调出现程序化的细胞凋亡增加的现象。在那 些形态发生不受视黄酸影响的面部突起物中a p 2 表达模式也不受影 响。在第2 0 期的胚胎中去除肢芽顶端的外胚层脊后4 小时，a p 2 的表达 部分被降低，8 小时后完全被抑制。植入浸泡了f g f 4 的珠子可以恢复 a f 2 的表达1 9 在斑马鱼中，a f 2 a 对于起始2 7 神经弓和躯干神经脊正常发育过程 是重要的。a p 2 a 不参与早期的神经脊细胞的规划和分裂，但是对于神 经脊细胞衍生为其他细胞的早期分化阶段是有重要作用的调控因子。 最后比较研究文昌鱼和七鳃鳗的a p 2 基因探讨了a p 2 从脊索动 物到脊椎动物中与神经脊的进化和迁移关系。神经脊是脊椎动物特有 的一群细胞，存在于最低等的脊椎动物中，头索动物中没有。分离和 比较文昌鱼，七鳃鳗，和蝾螈中的a p 2 表达，发现a p 2 不仅表达在神 经脊中，还表达于围咽神经弓中，在神经脊中表达a p 2 是脊椎动物的 共同选择。在非神经外胚层中表达a p 2 是脊椎动物和头索动物共有的 特征，表明a p 2 在此组织中的表达是其古老的功能。还有一个共同的 表达区域是神经管前部的腹外侧神经，与脑的最初发育一致1 6 。 1 2 2a p 2 表达缺失或下调后对动物胚胎发育的影响 1 2 2 1 在多种动物中先后对a p 2 家族成员进行的基因敲除试验 鉴定了其对胚胎发育的重要性 a p 2 a 敲除的小鼠有多种先天缺陷，一出生就死亡，a p 2 敲除的 小鼠呈现无脑畸形，颅面部缺损，胸腹腔打开t h o m c o - a b d o m i n o s c h i s i s 。 头部和躯干的骨骼多处发育不全或缺失。从更早期的小鼠胚胎发育分 析发现背神经管不能愈合，头部神经中枢发育缺陷2 0 。缺失a p 2d 的 小鼠由于肾脏上皮细胞的过度凋亡，在出生前后即死亡。a p 柳在植入 子宫前胚胎的所有细胞中均有表达，在植入时则特异的表达于胚胎外 博士学位论文 部的细胞系中。大多数t c f a p 2 c ( - - ) 的小鼠在发育的8 5 天后不能存活， 在7 5 天时t c f a p 2 c ( - ) 的胚胎发育停止或明显的比正常的迟缓，死于 滋养层的发育不完全和母体胎儿界面的迷路层不正常发育9 9 , 1 0 5 。 在斑马鱼中a p 一2 a 在神经脊的发育中有重要作用。缺失a p 2 a 的突 变体在神经脊细胞迁移前和迁移过程中的短暂时间内发生凋亡。在头 部神经脊中，颚弓中的基因表达不受影响，但在舌弓中d l x 2 与h o x a 2 的表达明显减少嗡。 1 2 2 2 鉴于a p 2 敲除后的严重袁型，对嵌合体或a p 2 部分被抑制 的模型用于研究其具体的功能和途径 a p 2 a 缺失的纯合子小鼠具有复杂的致死表型，表明a p 2 a 可能调 控多个形态发生的途径。由缺失a p 2 a 和野生型组合的嵌合体小鼠作为 研究对象有可能分开研究a p 2 a 可能调控的多个形态发生过程。从这些 嵌合体小鼠的表型可知a p 2 参与的神经管，体壁，颅面部骨骼的发育 是独立的过程。而且a p 2 a 在眼睛的发育中有重要的作用。新的发现是 嵌合体小鼠容易发生多指或多肢症状，这是用视黄酸诱导产生畸形的 代表特征，所以表明a p 2 a 也参与此种畸形的形态发生1 0 6 。w n t l c r e 介导的a p 2 a 条件敲除( 在神经脊处特异敲除a p 2 a ) 小鼠在出生前后 死亡，出现多种神经脊相关的缺陷神经管不能愈合，第二颚分裂。意 义重大的一小部分小鼠可以存活至成年，但是其颅面部的生长迟缓， 中耳发育不正常，色素缺乏。没有发现脑和心脏缺陷等在敲除鼠中所 具有的症状1 0 7 。前鼻特异性缺失a p 2 滚达会导致出生后面部中间部分 的发育不全，动脉发育异常，鼻孔缺陷1 0 8 。露脑现象仍然会出现在一 系列含有a p 2 a 突变杂和体中啪。 突变了一个等位基因的a p 2 丫杂合子小鼠出生时体形较小，但是有 繁殖能力。进一步的研究表明a p 2 丫还参与调控腺苷脱氨酶基因( a d a ) 的表达，此基因与母体胎儿界面的嘌呤代谢相关势。 斑马鱼a p 2 a 在神经脊的发育中有重要作用。利用细胞移植进行嵌 a p 2 a 与t e s 的相互作用盹s 新功能的发现 合体分析表明在突变体中的神经脊缺失会独立的自我调控并破坏周边 的中胚层发育1 5 。e n u ( n e t h y l n n i t r o s o u r e a ) 诱导的a p 2 a 突变在 d o a r a d b 鼠中导致中耳和眼睛的缺陷。在斑马鱼胚胎中注射与a p 2 a 互补的m o r p h o l i n o 反义寡核苷酸后，能够正常的完成早期胚胎发育并 含有神经脊细胞。在这些胚胎中，编码铁配基受体蛋白的c k i t 基因被 下调，所以与c k i t 基因突变的斑马鱼胚胎相似，胚胎载黑素细胞的数 目和迁移都减少。所以可以得知a p 2 a 通过c k i t 与其他靶基因来调节黑 素细胞的数目和迁移。这些胚胎的表型还包括其他神经脊来源的组织 和细胞的减少，包括颚骨，肠神经元，交感神经元1 1 0 。 a p 2 在x e n o p u s 中是上皮发育的重要的直接调控因子，外源表达 x a p 2 可以使神经外胚层重新表达上皮的特有基因。而消减x a p 。2 的表 达则可消减上皮相关基因的表达，引起神经基因的表达。这两种处理 都会导致原肠胚发育失败1 0 l 。 1 2 3a p 2 在多种器官形态发生和特异性细胞分化中的作用细节 和机制也得到了充分的研究 1 2 3 1 神经脊与脑部发育 ； 在小鼠神经外胚层细胞中，不同类型的细胞有不同的a p 2 表达模 式。在视黄酸诱导胚胎癌细胞系p 1 9 分化形成神经外胚层细胞类型( 带 有免疫组化特征的神经元细胞和星形胶质细胞) 的过程中，可以观察 到被高度诱导表达的a p 2 转录产物和蛋白水平。相比之下，在1 二甲 亚砜或低浓度的r a 分别诱导p 1 9 分化形成间叶内胚层细胞的过程中， a p 2m r n a 不会被诱导产生。神经元和星形胶质细胞表达a p 2 的潜能 在新生小鼠的小脑神经元和星形胶质细胞中得到了检验。与别的类型 的细胞不同，m i c r o g l i a l 细胞不表达a p 2 。在p 1 9 分化而来的星形胶质细 胞或原始星形胶质细胞中，加入带修饰基团的c a m p 都能够进一步诱导 增强a p 2 的转录水平，加入其他能够提高细胞i 为c a m p 水平的试剂( 如： 去甲肾上腺素，异丙去甲肾上腺素，f o r s k o l i n ) 都能得到同样的效果。 9 博士学位论文 这种c a m p 一依赖的a p 2 诱导表达能被蛋白激酶a 抑制消除。不同于在 p 1 9 细胞系中，r a 在原始星形胶质细胞中不能诱导a p 2 的转录表达。 所以a p 2 可能是作为r a 敏感的调控因子，调控胚胎的神经前体细胞分 化成为神经元和神经胶质细胞。而且a p 2 在成熟的神经元和星形胶质 细胞中也可能对某些基因的转录起到调控作用1 1 1 。 在小鼠背神经管愈合期间，a p 2 在外胚层细胞以及在头部神经褶 迁移发育而来的背神经脊细胞中有表达。头部神经脊细胞为颅面部的 形态发生提供模式信息，生成多数颅骨和p l a c o d a l 夕b 胚层，形成头部的 神经中枢。而a p 2 (