富贵竹内生细菌群落的生物效应研究＊.pdf

第 1 3卷 第 1期 2 0 0 5年 1月 中 国 生 态 农 业 学 报 C h i n e s e J o u r n a l o f Ec o Ag r i c u l t u r e V0 1 1 3 NO 1 J a n ，2 0 0 5 富贵竹内生细菌群落的生物效应研究 * 袁红旭 周立赖 周锦兰 郑向华 许 良珠 ( 湛江海 洋大学农学 系湛江5 2 4 0 8 8 ) 摘 要 试验研 究结果 表明 富贵竹 中广泛 存在具有 多种 生物效应 的 内生细 菌群 落。从 4个 品种 富贵竹 茎 叶 中分 离出 6 4个 内生细 菌 ， 以烟 草过敏 性反应和半 叶接种法测 定其 内生 细菌 中有 2 2个菌株 具 有潜 在致 病性 ； 采 用 抑菌 圈法 测定其 内生细 菌 中有 2 5个 菌株对 6个病原真 菌具 不 同拮抗作 用 ， 其 中分 别有 1 6个 、 5个 、 4个 菌株 对 1种 、 2 种和 3种 病原真菌有拮抗作 用 。有 1 6个菌株 可刺激水 稻或 绿豆 生长 ， 具 有刺 激 生长作 用 的混合 菌株 还 可促进 富 贵竹 生根。 关键词 内生细菌 致 病性 生物效应 富贵竹 Bi o l o g i c a l e f f e c t o f e n d o p h y fic b a c t e r i a i n Fo r t u n a t e Ba mb o o YUAN Ho n g Xu， Z HOU Li La i ， Z HOU J i n - La n， Z HENG X i ang Hu a ， XU L i a n g Z h u ( D e p a r t me n t o f A g r o n o my ， Z h a i a n g O c e a n Un i v e r s i t y ， Z h a i a n g 5 2 4 0 8 8 ) ， C J E A， 2 0 0 5 ， 1 3 ( 1 ) ： 9 5 9 7 Ab s t r a c t Th e e x p e r i me n t s s h o w t h a t t h e r e a r e man y e n d o p h y t i c b a c t e r i a wi t h d i ffe r e n t b i o l o g i c a l e f f e c t s i n F o r t u n a t e B a mb o o 6 4 s t r a i n s o f e n d o p h y t i c b a c t e r i a are i s o l a t e d f r o m t h e s y mp t o m f r e e l e a v e s a n d s t e ms o f 4 v a r i e t i e s o f Fo r t u n a t e Ba mb o o Th e r e a r e 2 2 s t r a i n s h a v i n g p a t h o g e n i c i t y wh e n t est e d b y t h e me t h o d s o f t o b a c c o s e n s t i v e r eac t i o n a n d h a l f l eav e i n o c u l a t i o n B e i n g t est e d i n p l a t e ， 1 6 s t r a i n s h a v e a n t i f u n g al e ff e c t o n o n e p l a n t p a t h o g e n f u n g i ( P P F ) ， 5 s t r a i n s h a v e a n t i f u n g a l e f f e C t o n 2 PP F a n d 4 s t r a i n s h a v e a n t i f u n g al e ff e c t o n 3 PP F Th e t o t a l n u mb e r o f a n t i f u n g a l s t r a i n s i s 2 5 1 6 s t r a i n s c a n s t i mu l a t e t h e g r o wt h o f ri c e o r g r e e n b ean Mi x e d s t i mu l a t i n g g r o wt h s t r a i n s a l so c a n s t i mu l a t e Fo r t u n a t e B a mb o o t O p r o d u c e r o o t s Ke y wo r d s En d o p h y t i c b a c t e riu m ， P a t h o g e n i c i t y， B i o l o g i c a l e f f e c t ， F o r t u n a t e B a mb o o 植物内生细菌与寄主植物在长期共同进化过程中形成密切关系， 是植物微生物生态系统的主要成员。近 年来一些 内生细菌被用作增产菌来调节作物生长发育 ， 促进了内生细菌在种群动态变化及其与寄主互作关系 等方面的研究【 1 - 5 。富贵竹有很强抗逆性和耐贫瘠性， 可能与其体 内特有 的微生物生态 系统有关。本试验研 究 了富贵竹内生细菌群落的生物效应 ， 为建立有利于富贵竹生长的内生细菌微生态环境提供理论依据。 1 试验材 料与方 法 供试 4个富贵竹品种为“ 大 叶富贵竹” 、 “ 广州绿 叶富贵竹” 、 “ 缅甸 富贵竹” 和“ 小叶富贵竹” 。采集大 田生 长势 良好健康的富贵竹根 、 茎和叶 ， 表面消毒后研磨 成匀浆 ， 取一定量稀释后匀浆与牛肉膏蛋 白冻培养基混 合于 2 8 黑暗培养 ， 挑取单菌落分离并纯化后获得富贵竹 内生细菌 。采用烟草过 敏性反应和半 叶接种法测 定富贵竹内生细菌 ( 潜在) 致病性 ， 半叶接种法测定致病性方法即用剪刀沾取浓度为 1亿 c f u mL菌悬液 ， 选 取富贵竹中部叶片剪掉半 叶， 每处理 3个重复， 以无菌水为对照( C K) 。剪 叶后置 2 8 、 1 2 h d光照保湿培养 1 4 d ， 半叶的坏死斑宽度2 0 mm时则该菌具有潜在致病性 。采用对峙培养法测定富贵竹 内生细菌对植物病 原真菌的拮抗作用 ， 以抑菌圈宽度为指标测定 内生细菌对植物病原 真菌 的拮抗作用 ， 所测试病原 菌为水稻 纹枯病菌( Rh i z o c t i o n a s o l a n i ) 、 辣椒 白绢病菌( S c l e r o t i u m r o l f s i i ) 、 辣椒炭疽病菌( C o l l e t o t r i c h u m c a p s i c i ) 、 富 贵竹根腐菌 ( F u s a r i u m o x y s p o r u m) 、 黄瓜枯萎病菌( Fu s a r i u m o x y s p o r u m f s p c u c u me r i n u m) 和辣椒枯萎病 菌( F u s a r i u m o x y s p o r u m f s p c a p s i c i ) 。水稻 和绿豆种子先经表面消毒后用清水浸泡 1 2 h ， 再用 1亿 c f u mL 菌悬液浸种 2 4 h， 将种子播人杯底铺有滤纸 的 1 5 0 mL容量塑料杯 中， 每处 理 1 0粒种子 ， 3个 重复 ， 以灭菌水 浸种为对照 ( C K) ， 置 2 7 ， 1 2 h d光照培养 1 0 d ， 测定其发芽率、 幼苗苗高及鲜物质量 ， 并对结果进行方差分 * 湛江 海洋大学 自然科学基金 项 目( 0 3 1 2 0 2 9 ) 资助 收穰 日期 ： 2 0 0 3 1 2 2 2改回 日期 ： 2 0 0 4 0 2 1 6 中 国 生 态 农 业 学 报 第 1 3卷 析。按对水稻和绿豆的生长效应 ， 将牛 肉膏蛋 白胨培养基培养 的具有促生作用 内生细菌 ( 共 1 6个菌株 ， 见表 2 ) 混合配成浓度为1 亿 c f u mL 促生 内生细菌混合菌悬液 ； 另将 6 4个 内生细菌混合配成浓度 为 1亿 c f u mL 混合菌悬液。取 2种菌悬液 2 0 mL并注入 5 0 0 mL烧杯 中， 扦播 5棵“ 大 叶富贵竹” ， 设 3个 重复 ， 以无 菌水 为 对照( C K) ， 浸泡 4 8 h后取出用清水浸泡 3 0 d ( 2 8 ， 室 内条件) ， 测定富贵竹根数及根重 ， 并对结果进行方差 分析。 2 结果 与分析 2 1 富贵竹内生细菌的分离及其潜在致病性 富贵竹根茎 叶中富含 内生细菌 ， 从 5个品种富贵竹 中分离经纯化获 6 4株 内生细菌 ， 其 中“ 大 叶富贵竹” 有 1 7株 。 “ 广州绿叶富贵竹” 2 5株 ， “ 缅甸 富贵竹 ” 1 5株 ， “ 小叶富贵竹” 7株。试验结果表明共有 2 2个菌株有 致病性 ， 为潜在病原 细菌 ， 可能在一定条件下导致病害 ； 半 叶接种法测定有 1 1个菌株导致富贵竹 叶片出现坏 死斑 ， 宽度 2 0 mm， 占总菌株 的 1 7 2 ， 烟草过敏性反应结果表明有 2 0个菌株可致烟草产生过敏性枯斑反 应 ， 占总菌株 的 3 1 2 。用半 叶接种法测定的 1 1 个致病菌株 中有 9株 同时具有烟草过敏性反应 。 表 1 抗植物病原 真菌活性 富贵竹 内生细菌菌株 数 Ta b 1 Nu mb e r s o f e n d o ph y t i c b a c t e r i a l s t r a i n s ha v i n g i nh ibi t i n g e f f e c t t o p l a n t p a t h o g e n f u n g i i n Fo r t u n a t e b a mb o o 2 2 富贵竹内生细菌的抗病原真菌活性 表 1表 明供 试 6 4株 内生细菌 中对 1 种或多种病原真菌具 抑制作用 的有 2 5个 菌株 ， 占总菌 株 的 3 9 1 ； 对水 稻纹 枯病 具抗 性 的 有 1 3个 菌 株 ，占 总 菌 株 的 2 0 3 ； 抗黄瓜枯萎病 的有 1 1个菌株 ， 占 1 7 2 ； 抗辣椒 白绢病及 富贵竹根 腐病 的 各有 3个菌株 ， 各 占 4 7 。拮 抗 内生细 菌多数仅对 1种病原 真菌有抗 生作 用 ， 只 有少数菌株对 2种 以上真菌有拮抗 作用 ； 其中有 5个菌株对 2种病菌存在拮抗作用 ， 4个菌株对 3种病原真菌有拮抗作用 ； 对 1种病原真菌有很强抗 生作用的菌株 ， 不一定对其他病 原真菌也存 在抗生作用 ， 即使 针对 同类 病害 的病 原真菌 ， 其拮抗作 用也不 同。如“ G3 4 ” 对黄瓜枯萎病有较强的拮抗性 ( 其抑制圈宽度为 9 mm) ， 但对另 2种镰刀菌却无拮抗作用 。 2 3 内生细 菌对植物 生长的影 响 表 2 内生细菌对水稻 与绿 豆生长 的影响 Ta b 2 E f f e c t s o f e n d o p h y t i c b a c t e r i u m o n t h e g r o wt h o f r i c e a n d g r e e n b e a n *“+” 表示对病 原真菌有 抗生作用 或有潜在致 病性 ； “ 一” 表示对 病原真 菌无抗 生作用 或无潜 在致病性 ； * *表示 与对 照存在 显著差 异 ( a=0 0 5 ) ， 下 同。 用内生细菌处理水稻种子结果见表 2 ， 供试菌株仅有 “ G1 8 ” 、 “ G 2 5 ” 可降低水稻发芽率 ， 其他 6 2个菌株 第 1 期 袁红旭等： 富贵竹内生细菌群落的生物效应研究 对水稻萌发率无明显影响。6 4个菌株中有 1 4株对水稻有 显著刺激生长作用 ， 表现为 内生细菌处理 的水稻 苗高或鲜物质量显著增加 ， 其中 4 个菌株处理的水稻株高显著增加但鲜物质量与对 照无显著差异， 7个菌株 处理 的水稻鲜物质量显著增加但苗高与对照无显著差异 ， 仅 “ D1 6 ” 、 “ G 2 5 ” 和“ X 5 8 ” 菌株处理 的水稻苗高和 鲜物质量均显著增加。用 内生细菌处理绿豆种子试验结果 表明供试菌株“ D 6 ” 、 “ G 2 0 ” 、 “ G 3 1 ” 和“ M5 2 ” 显著 影响绿豆发芽 ， 其发芽率分别为 5 0 、 7 0 、 2 0 和 6 3 3 ， 均显著低于对照( 9 0 9 ) ； 而“ D 3 ” 和“ G 2 8 ” 菌株 处理后绿豆幼苗鲜物质量较对照显著增加 ， “ G3 1 ” 、 “ M4 4 ” 、 “ M5 2 ” 和“ X 5 8 ” 菌株处理后却显著 降低绿豆幼苗 鲜物质量。试 验研究 结果表 明富贵竹 内生细 菌 对植物促生作用因不同植物而异。对 1种植物有 促生作用的内生细菌 ， 对另 1种植物却无 促生作 用 ， 甚至具有抑制生长作用 ， 如菌株“ M5 2 ” 和具有 潜在致病性菌株 “ G 2 0 ” 显著增加水稻 株高 ， 但 却 显著降低绿 豆发芽率 和鲜物质 量。内生细菌对 植物的刺激生长作 用较复杂 ， 内生细菌处理 的植 物发芽 率、 株高 和鲜 物 质量 变 化 未表 现相 关趋 势 ， 如菌株“ G 2 5 ” 处理水稻后其发芽率 降低 ， 但 株 表 3 内生细菌 混合菌剂对富贵竹 生根的影响 Ta b 3 Ef f e c t s o f mi x e d e n d o p h y t i c b a c t e r i a O i l t h e g r o wt h o f r o o t of F o r t u n a t e b a mb oo 高和鲜物质量显著增加。多个促生菌株混合菌液能刺激富贵竹生根( 见表 3 ) ， 主要表现为生根数量明显增 加。促生混合细菌处理 3 0 d后其平均株根数和根重均显著高于对照。而 6 4个 内生细菌 混合 菌悬液对富贵 竹生根无显著作用。 3 小结与讨论 研究结果表明富贵竹体内存在具有多种生物效应的内生细菌群落 ， 包括对不 同植物病原 真菌具有拮抗 作用的细菌群落和影响植物 生长 ( 具有刺激或抑制作用 ) 的细菌群落 ， 且广泛存在具有潜在致病性病 原细 菌， 这类细菌在特定条件下如植株受到伤害， 抗病力下降抑或当微生态平衡受到破坏， 某种有害种群数量增 加时可造成植物病害 ， 表现 出植物体内微生物生态系统的多样 性和复杂性 ， 而富贵竹 内生细菌存在的抗病 原真菌资源 ， 可用于病害防治。作为生防制剂的内生细菌 具有相对稳定 且对环境友好的特点 ， 但单一种类 内生细菌防