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缺失型s p i t - p 4 9 抗细胞凋亡活性的研究 缺失型s p i t p 4 9 抗细胞凋亡活性的研究 专业：生物化学与分子生物学 硕士生：罗尧 导师：杨凯教授 摘要 a c p 3 5 是第一个被发现的杆状病毒抗细胞凋亡蛋白，能抑制许多生物，如线 虫、昆虫和哺乳动物的细胞凋亡。c a s p a s e 是一类半胱氨酸类蛋白酶，是细胞凋 亡的主要执行者。p 3 5 是c 唧a s e 底物，能与c a l s p a s e 形成稳定的c a s p a s e - - p 3 5 复合物，抑制c 2 l s p a s e 蛋白酶活性。在一些杆状病毒中发现的p 4 9 蛋白是一个分 子量较大的p 3 5 同源物，其三维结构和作用模式与p 3 5 相似。通过序列比对发现 相对于p 3 5 ，在s p i t p 4 9 中间插入了一段长1 3 0 个氨基酸左右的片段。在本研究 中，通过引物重叠p c r 技术，针对该序列，先后构建了编码s p l t - p 4 9 但缺失了 1 3 6 个氨基酸的s p l t - a p 4 9 3 0 3 的d n a 序列和缺失了7 7 个氨基酸的s p i t a p 4 9 3 6 2 的d n a 序列。利用b a c t o b a c 技术，分别将这两段序列转座入已构建的缺失了 a c - p 3 5 的病毒v a c p 3 5 粕的多角体蛋白基因座位中，得到重组病毒 v a c p 3 5 - k o - a p 4 9 - 3 0 3 - p h 如f p 和v a c p 3 5 k o - a p 4 9 - 3 6 2 - p h 旬f p ，以研究s p l t - a p 4 9 3 0 3 和 s p l t a p 4 9 3 6 2 在a c m n p v 的受纳细胞s f 9 中的抗细胞凋亡活性。光学显微镜观 察和凋亡染色实验结果显示，重组后的s p i t a p 4 9 3 0 3 和s p i t a p 4 9 3 6 2 不能代替 p 3 5 的抗细胞凋亡能力，同时也失去了p 4 9 的抗细胞凋亡的能力，表明p 4 9 相对 于p 3 5 多出的一段氨基酸序列对于p 4 9 的抗细胞凋亡功能可能是必须的：为研究 筇5 和p 4 9 的起源与进化关系，对p 3 5 同源基因进行了初步的生物信息学分析。 关键词：细胞凋亡；抗细胞凋亡基因；杆状病毒；分子进化 中山大学硕士学位论文2 0 0 7 s t u d i e s0 1 1t h ea n t i a p o p t o t i ca c t i v i t yo fat r u n c a t e d s p i t - - p 4 9 m a j o r ：b i o c h e m i s t r y & m o l e c u l a rb i o l o g y n a m e ：l u oy a o s u p e r v i s o r ：p r o f y a n gk a i a b s t r a c t t h ef i r s tb a c u l o v i r u sa n t i a p o p t o t i cp r o t e i nf o u n di sa e p 3 5 ，w h i c hc o u l di n h i b i t a p o p t o s i si nm a n yb i o l o g i e s ，s u c ha sc a e n o r h a b d i t i se l e g a n s 、i n s e c t sa n dm a m m a l s 。 c a s p a s ei sak i n do fc y s t e i n ep r o t e a s e ，a n di ti st h em a i ne x e c u t o ro fa p o p t o s i s p 3 5i s s u b s t r a t eo fc a s p a s e a n di tc a nf o r ms t a b l ec a s p a s e - - p 3 5c o m p l e xw i 吐lc a s p a s e st h a t c a ni n h i b i tp r o t e a s ea c t i v i t yo fc a s p a s e p 4 9f o u n di nm a n yb a c u l o v i r u si sab i g g e r h o m o l o go fp 3 5a tm o l e c u l a rw e i g h t ，t h r e e d i m e n s i o n a ls t r u c t u r ea n dm o d eo fa c t i o n o fw h i c ha r es i m i l a rw i t hp 3 5 w ef o u n da13 0m o r eo rl e s sa m i n oa c i dr e s i d u ei n s e r t o fp 4 9c o m p a r e d 晰t 1 1p 35b ys e q u e n c eb l a s t i nt h i sr e s e a r c h ，b yp r i m e ro v e r l a pp c r , w ec o n s t r u c t e ds p z 印4 9e n c o d e dd n a s e q u e n c es p l t - a p 4 9 - 3 0 3i nw h i c h13 6a m i n o a c i dr e s i d u eo fp 4 9 w a sd e l e t e d ，a n ds p i t a p 4 9 - 3 6 2i nw h i c h7 7a n l i n oa c i dr e s i d u e w a sd e l e t e d a tt h ea i mo fs t u d y i n go na n t i a p o p t o t i ca b i l i t yo ft r u n c a t e ds p i t - p 4 9 ，w e d e l e t e dp a r t i a ls e q u e n c eo fp 4 9i nt h em i d d l e t h e n , b yb a c t o - b a c ，w et r a n s f e r e d r e c o m b i n e ds p i t - - a p 4 9 - - 3 0 3d n a s e q u e n c ea n ds p i t - - a p 4 9 - - 3 6 2d n as e q u e n c ei n t o a c m n p vb a c m i di nw h i c hp 3 5g e n ew a sd e l e t e dt h a tw ec a ns t u d ya n t i a p o p t o f i c a b i l i t yo fs p i t a p 4 9 3 0 3a n ds p i t a p 4 9 3 6 2i ns f 9c e l l sw h i c ha r ec o m p a t i b l e 、析n l a c m n p v l i g h tm i c r o s c o p y s h o w e dt h a tr e c o m b i n e d s p i t - - a p 4 9 - 3 0 3 a n d s p i t - a p 4 9 - 3 6 2c a nb o t hn o ti n s t e a dt h ea b i l i t yo fa n t i a p o p t o s i so fp 3 5a n d p 4 9 l a t e r s t u d yu s i n ga n n e x i nv a s s a yc o n f i r m e dt h i sr e s u l t t h er e s u l ta b o v es h o w e dt h e r e d u n d a n t s e q u e n c e i np 4 9c o m p a r e dw i t hp 3 5i se s s e n t i a lt o t h ea b i l i t yo f a n t i a p o p t o s i so fp 4 9p r o b a b l y i no r d e rt os t u d yt h eo r i n g i no f p 3 5a n dp 4 9 ，w ew e n t o np r i m a r yb i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i sa b o u tp 3 5h o m o l o g s k e y w o r d s ：a p o p t o s i s ；a n t i a p o p t o t i cg e n e ；b a c u l o v i r u s ；m o l e c u l a re v o l u t i o n i l 缺失型s p i t - p 4 9 抗细胞凋亡活性的研究 1 病毒 a c m n p v a d h o n p v a 驴咿v a m e p v b m n p v c f n p v c h o c g v c p g v c u n i n p v e9 0 n p v p _ ；p p o n p v h e a r n p v h y c u n p v l d n p v l e s e n p v 缩略词 a u t o g r a p h ac a l i f o m i c am u l t i c a p s i dn u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 苜蓿丫纹夜蛾多粒包埋型核多角体病毒 a d o x o p h y e sh o n m a in u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 茶小卷叶蛾核多角体病毒 a n t i c a r s i ag e m m a t a l i sn u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 黎豆夜蛾核多角体病毒 a m s a c t am o o r e ie n t o m o p o x v i r u s 桑灯蛾昆虫痘病毒 b o m b y xm o r in u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 家蚕核多角体病毒 c h o r i s t o n e u r a f u m i f e r a l l an u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 枞色卷蛾核多角体病毒 c h o r i s t o n e u r ao c c i d e n t a l i sg r a n u l o v i m s 水杉色卷蛾颗粒体病毒 c y d i ap o m o n e l l ag r a n u l o v i r u s 苹果小蠹蛾颗粒体病毒 c u l e xn i g r i p a l p u sn u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 库蚊核多角体病毒 e p i p h y a sp o s t v i t t a n an u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 苹浅褐卷蛾核多角体病毒 h e l i c o v e r p aa r m i g e r an u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 中国棉铃虫核多角体病毒 h y p h a n t r i ac u n e an u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 美国白蛾核多角体病毒 l y m a n t r i ad i s p a rn u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 舞毒蛾核多角体病毒 l e u c a n i as e p a r a t an u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 粘虫核多角体病毒 中山大学硕士学位论文2 0 1 0 m v n p v o p n p v p l x y n p v r o n p v s e 小m v s l n p v s p l t n p v 删p v 2 昆虫 蹴 砌 对 s p t t s l 3 其他 a m p b a c b p b v c d n a m a r u c av i t r a t an u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 豆荚螟核多角体病毒 o r g y i ap s e u d o t s u g a t an u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 黄杉毒蛾核多角体病毒 p l u t e l l ax y l o s t e l l an u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 小菜蛾核多角体病毒 r a c h i p l u s i ao un u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 苜蓿尺蠖核多角体病毒 s p o d o p t e r ae x i g u am u l t i c a p s i dn u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 甜菜夜蛾多粒包埋型核多角体病毒 s p o d o p t e r al i t u r a l i sn u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 海灰翅夜蛾核多角体病毒 s p o d o p t e r al b u r an u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 斜纹夜蛾核多角体病毒 t r i c h o p l u s i an in u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 粉蚊夜蛾核多角体病毒 s p o d o p t e r a f r u g i p e r d a t r i c h o p l u s i an i s p o d o p t e r a f r u g i p e r d a s p o d o p t e r al i t u r a s p o d o p t e r al i t t o r a l & 草地贪夜蛾 粉纹夜蛾 草地夜蛾 斜纹夜蛾 海灰翅夜蛾 a m p i c i l l i n 氨苄青霉素 b a c t e r i a la r t i f i c i a lc h r o m o s o m e 细菌人工染色体 b a s ep a i r 碱基对 b u d d e dv i r u s 芽生型病毒 c o m p l e m e n t a r yd n a 互补脱氧核糖核酸 缺失型s p i t - p 4 9 抗细胞凋亡活性的研究 c m d d h 2 0 d e p c d m s o d n a d n t p d t t e c o l i e d t a g e n g f p g v h h p i h p t i p t g k a n k b k d a m l n m o i n b t n c b i n p v n t o b o d v o f f p b s c h l o r a m p h e n i c o la c e t y l t r a n s f e r a s e 氯霉素乙酰转移酶， d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r 双蒸水 d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e - - 7 , 基焦碳酸盐 d i m e t h y ls u l f o x i d e 二甲基亚砜 d e o x y n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e 脱氧核糖核甘酸 d e o x y n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e 脱氧三磷酸核甘酸 d i t h i o t h r e i t o l 二硫苏糖醇 e s c h e r i c h i ac o l i 大肠杆菌 e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 g e n t a m i c i n 庆大霉素 g r e e nf l u c r e s c e n c ep r o t e i n 绿色荧光蛋白 g r a n u l o s i sv i r u s 颗粒体病毒 h o u r s 小时 h o u r sp o s ti n f e c t i o n 感染后 h o u r s p o s tt r a n s f e c t i o n 转染后 i s o p r o p h y lt h i o - p d g a l a c t o s i d e 异丙基硫代p d 半乳糖苷 k a n a m y c i n 卡那霉素 k i l o b a s e 千碱基对 k i l o d a l t o n 千道尔顿 m i n u t e 分钟 m u l t i p l i c i t yo fi n f e c t i o n 感染复数 n i t r o b l u et e t r a z o l i u m 氮蓝四唑 n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n 美国国立生物技术信息中心 n u c l e o p o l y h e d r o v i r u s 核多角体病毒 n u c l e o t i d e 核苷酸 o c c l u s i o nb o d i e 包涵体 o c c l u s i o n - d e r i v e dv i r u s 包涵体来源型病毒 o p e nr e a d i n gf r a m e 开放阅读框 p h o s p h a t eb u f f e r e ds a li n e 磷酸盐缓冲液 6 5 中山大学硕士学位论文2 0 1 0 p c r p o l h r n a g e r p m s d s s d s p a g e s e c t b s t c i d 5 0 t e t e m e d t e t 强s 、i | 、j w 、n | v w t x g a l p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 p o l y h e d r o n 多角体蛋白基因 r i b o n u c l e a s e 核糖核酸酶 r e v o l u t i o np e rm i n u t e 每分钟转数 s o d i u md o d e c y ls u l p a t e 十二烷基硫酸钠 s d s p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i ss d s - 聚丙稀酰胺凝胶电泳 s e c o n d 秒 t r i sb u f f e r e ds a li n e 三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水 5 0 t i s s u ec u l t u r ei n f e c t i o nd o s e 半数组织培养物发生感染的病毒剂量 t r i s e d t a ( b u f f e r ) ，t r i s e d t a ( 缓冲液) t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e 四甲基乙二胺 t e t r a c y c l i n e 四环素 t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m m o m e t h a n e 三( 羟甲基) 氨基甲烷 v o l u m e v o l u m e 体积体积 w a t t 瓦特 w e i g h t v o l u m e 重量体积 w i l dt y p e 野生型 5 - b r o m o 一4 - c h l o r o 一3 一i n d o l y l - p - d g a l a c t o s e 5 溴- 4 氯一3 吲哚d d 半乳糖苷 原创性及学位论文使用授权声明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究 工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集 体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期：2 口口年万月9 学位论文使用授权声明 罗免 日 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版，有权将学 位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室被查 阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其 他方法保存学位论文。 学位论文作者签名： 日期：乃9 年石月 罗乳 7 日 导师笔墨! 犹 日期：p 年g 月夕日 缺失型s p i t - p 4 9 抗细胞凋亡活性的研究 第一章研究背景和目的 1 1 杆状病毒和细胞凋亡 杆状病毒( b a c u l o v i r u s ) 是一类专性感染节肢动物的病原微生物，它们的宿 主主要是鳞翅目、双翅目和膜翅目的昆虫。目前己从超过8 0 0 种昆虫体内鉴定出 了6 0 0 多种杆状病毒。杆状病毒衣壳呈杆状，具囊膜，基因组为一个双链闭合环 状的d n a 分子。已完成测序的杆状病毒基因组的大小从8 0k b 到1 8 0k b 不等， 编码约8 9 1 8 1 种蛋白质( a d a m s & m c c l i n t o c k , 1 9 9 1 ；f e d e r i c i ，1 9 9 7 ) 。 杆状病毒的宿主特异性很高，宿主范围窄。最近的研究表明凋亡是限制杆状 病毒宿主范围的因素之一( z h a n ge ta 1 ，2 0 0 2 ；c l a r k e & c l e m ，2 0 0 3 ；f e n ge ta 1 ， 2 0 0 7 ) 。k e r r 等最早提出凋亡( a p o p t o s i s ) 的概念，凋亡又被称作细胞程序性死 亡( p r o g r a m m e d c e l ld e a t h , p c d ) ，是多细胞生物维持体内平衡( h o m e o s t a s i s ) ， 抵御不良环境的一种方法。细胞凋亡的一个重要特征是d n a 片段化和细胞核浓 缩，并且常常伴随有细胞质膜的出泡现象( k e ne t a l ，1 9 7 2 ；w y l l i ee l a l ，1 9 8 0 ) 。 有很多因素可以诱发细胞凋亡，例如放线菌素，紫外线，血清的去除等。许多凋 亡刺激因素都会水解并激活一个半胱氨酸蛋白酶家族( c a s p a s e ) ，激活的c a s p a s e 可降解各类细胞底物，完成细胞死亡过程( r o ye ta 1 ，1 9 9 7 ；t h o m b e r r y & l a z e b n i k ， 1 9 9 8 ) 。所有的c a s p a s e 都是以无酶活性的酶原形式存在，在凋亡过程中必须被水 解激活。一般情况下，按照c a s p a s e 执行抗细胞凋亡功能的阶段不同，可以分成 两类：起始c a s p a s e 和效应c a s p a s e 。不同的凋亡刺激因素激活起始c a s p a s e ，有 活性的起始c a s p a s e 随后裂解并激活效应c a s p a s e ( r i e d l & s h i ，2 0 0 4 ) 。 越来越多的研究结果表明，在病毒与宿主相互反应过程中，细胞凋亡扮演了 一个重要的角色，它很可能影响了病毒的发病机理。一方面，病毒的感染会导致 细胞凋亡，宿主通过细胞凋亡这种自杀性行为，限制了病毒的复制，即时清除被 损坏的细胞和病毒，以保证其他细胞和组织的生长；另一方面，在进化过程中， 有些病毒获得了凋亡抑制基因，通过抑制宿主细胞的凋亡而使自身获得了更多的 生长空间和生存机会。 1 2 杆状病毒凋亡抑制蛋白 目前的研究表明，在杆状病毒基因组中有两大类抗细胞凋亡基因家族，包括 中m 学顺+ 学位论i2 0 1 0 杆状病毒p 3 5 ( p 4 9 ) ( c l e me ta l , 1 9 9 1 ；z o o ge ta l ，2 0 0 2 ) 和凋t 2 抑制因子家族 ( i n h i b i t o r so fa p o p t o s i s ，卸) 。所有的鳞翅目杆状病毒基因组中部有i a p ，大部 分鳞翅日杆状病毒基因组中台有2 个以上的f d p ，只有其中一个却具有抗凋亡 能力，其他的a p 没有抗凋亡能力。含有邡j 同源基因的杆状病毒中的a p 没有 抗凋亡能力( g r i f l i t h se ta l ，1 9 9 9 ) ，或者以p 3 5 同源基因的抗凋亡能力为主( h u a n g e ta l ，2 0 0 1 ) 。相比于绝大多数杆状病毒都有i a p ( y u e f a ，2 0 0 8 ) ，仅在1 0 种杆状 病毒基因组中发现了椰j 同源基因。 首先发现的杆状病毒抗凋亡蛋白是苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒叫u t o g r a p h a c a l i f o r n i c a m u l t i p l en u e l e o p o l y h e d r o v i r u s ，a e m n p v ) p 3 5 ，它可以抑制线虫、昆虫 和哺乳动物等多种生物的细胞凋亡( c l e me ta l ，1 9 9 1 ；c l e m ，2 0 0 7 ) 。p 3 5 是 c a s p a s e 的底物，能与天冬氨酰特异性的半胱氨酸蛋白酶( c y s t e i n y la s p a r t a t e s p e c i f i cp r o t e i n a s e ，e a s p a s e ) 形成稳定的c a s p a s ep 3 5 复台物，从而抑制c a s p a s e 蛋白酶活性( b u m pe t a l ，1 9 9 5 ；x u e h o r v i l z ，1 9 9 5 ) 。在一些杆状病毒中发现的 p 4 9 是一个分子量更大的p 3 5 同源物，它的三级结构和作用机制与p 3 5 相似。但 是有些p 3 5 不能抑制的起始c a s p a s e 能被p 4 9 抑s u ( d u e t a l ，1 9 9 9 ；p e ie t a t ，2 0 0 2 ； z o o ge ta l ，2 0 0 2 ) 。另外在昆虫痘病毒，即桑灯蛾昆虫痘病毒( a m s a c t am o o r e i e n t o m o p o x v i r u s ，a m e p v ) 中也发现了p 3 5 的同源物桑灯蛾昆虫痘病毒p 3 3 ( m e a n s e ta 1 2 0 0 7 ) 。在三级结构和功能上，a m e - p 3 3 、海灰翅夜蛾核多角体病毒 ( s p o d o p t e r al i t u r a l i sn u c l e o p o l y h e d r o v i m s s i n p v ) s 1 - p 4 9 和a c - p 3 5 之间的相似 度也很高( m e a n se a ，2 0 0 7 1 ( 图1 - 1 ) 。 田1 - 1 p 3 3 、1 7 4 9 及1 3 5 的结构示意i t l ( 1 a e a n s e t a l ，2 0 0 7 ) f i g1 - ip r e d a t e ds t r u c t u r e so f a m e - p 3 3 、s l - p 4 9a a d a c - 1 7 3 5 c o m p u t e r - a s s i s t e d m o d e l i n g o f l 7 3 3a n d p 4 9 w a sp e r f o r m e db a s e do n t h es t r u c t u r e o f p 3 5u “n g t h e 3 d - p s s m w e b r a r r o w s i n d i c a t e t h e p o s s i b l e o f c a s p a s ec l e a v a g es i t e | _ 壁墨里! d ! 兰! 垫塑些塑圭垩壁塑堕塞 圈1 - 2p 3 5 蛋白结构示意田( f i s h e r “吐，1 9 9 9 ) f 唔l 五s 打q c h 件o f 一5p r o t e i n s t e r e or i b b o nd h w m g o fi 3 5m o b o m e rrt h ec o l o r s c h e m ev a r i e st h er a i n b o ws p e c t r u m s t a r t i n ga nr e df o r t h en - t e m i n u sa n de n d i n gw i t h v i o l e ta tt h ec - t e r m i n u s t h ep 3 5r e a c t i v es i t el o o p , w h k hi sc l e a v e db y1 h ec j s p a s e s , i st h e s o l v e n t - e x p o s e d l o o p a t t h e t o po f t h ep r o t e i na sv i e w e d t h es c i s s i l eb o n d i s m a r k e d w i t h a r r o w t h ec e l l u l o s e - b i n d i n gd o m a i nf o l de o r r 匹p o n d st ot h ep - b a r r e ls u b d o m a i na tt h el e f t p o r t i o n o f t h es t r u c t u r e 1 3 a c p 3 5 抑制细胞凋亡的作用机铷 从其中一个侧面可以看到，p 3 5 的三级结构( 图i - 2 ) 像一个茶壶，在它的 顶部有一个项环结构，c 髂p a s e 的切割位点就在这个项环上唧s h e re ta l ，1 9 9 9 ) 。 当c a s p a s e 接近并在a o - p 3 5 的d q m d ”0 ，第8 7 位的天冬氨酰处切割这个突环 时，p 3 5 被切割成1 0k d 和2 5l e d 的两个多肽片段，然后这两个片段通过排斥 溶剂改变构象，与c a s p a s e 的活性位点以酯键共价连接，形成紧密而稳定的复合 物，直接阻抑c a s p a s e 的硫酯键水解能力。从而抑制了细胞凋亡( x ue t a ，2 0 0 d 。 如果破坏顶环下层的* 螺旋或者小螺旋与b 折叠之间的连接，都有可能破坏p 3 5 的抗细胞凋亡功能( c l e m , 2 0 0 7 ) 。 p 3 5 、p 4 9 和i a p 在细胞凋亡通路中的作用位点各不相同。通过构建仅携带 p 3 5 、p 秽或 掣中的一种的重组病毒，两两组合后，一起感染草地贪夜蛾 ( s p o d o p t e r a f r u g i p e r d a ) s 1 2 1 细胞，推理出p 4 9 、声5 和卸在抑制病毒感染引起 的细胞凋亡过程中发挥作用的先后顺序( z o o ge ta 1 ，2 0 0 2 ) ，p 4 9 可以抑制起始 c o s l x t s e ，p 3 5 可以抑制下游的效应c a s p a s e ( 图1 - 3 ) 。 彳日；j以赞鸟 ，t ，一a凹)(- 。一岁，蕊 中山大学硕士学位论文2 0 1 0 vla p 呈 a 印螂一d e a t h - - 4 s c j n a je f f e c t o r s p 4 9 l p 3 5 王 c l a p - - - , 圈一圈一黜 o p - i a p l a p o p t o t i c r e 职o s f - s i g n a l g h r i d i m l a p - - g r i m p 4 9 i e f f e c t o r 下m ，g c d 互巴圆 p r ol a r e s m a l l ，_ 、 ls f - c a s p a s ex j 1 - 。_ j l n i t i a t o r 乃蜀 舯列t 电阳n1 , - - p 3 5 、，一一 图1 - 3 杆状病毒凋亡抑制基因调节细胞凋亡模型( z o o g e ta 2 0 0 2 ) f i g 1 - 3c e l ld e a t hr e g u l a t i o nb yb a c u l o v i r u sa p o p t o t i cs u p p r e s s o r s t o p ：g e n e r a lp a t h w a y b a c u l o v i r u sl a p ( v i a p ) a n dc a s p a s ei n h i b i t o r s1 4 9a n di 3 5 p r e v e n ts i g n a l i n d u c e d a p o p t a s i sa td i s t i n c ts t e p sr e l a t i v et oe n d o g e n o u sc e l l u l a rl a p ( c l a p ) al i n e a rp a t h w a yi s s h o w ni ss h o w nb u tc o n v e r g i n gp a t h sa r ep o s s i b l e b o t t o m ：m o d e lf o rc a s p a s ea c t i v a t i o ni n s p o d o p t e r a u p o na p o p t o t i es i g n a l i n g ，p r o d e a t he f f e c t o r s ( r e a p e bh i do rg r i mh o m o l o g s ) t r i g g e ra c t i v a t i o no fi n i t i a t o rs f - c a s p a s e - xb yi n h i b i t i o no fs f - l a p , s f - c a s p a s e - x p r o t e o l y t i c a l l ya c t i v a t e sd o w n s t r e a me f f e c t o rc a s p a s e s ，i n c l u d i n gs f - c a s p a s e - 1 ，b yc l e a v a g ea t t h el a r g e - s m a l ls u b u n i tj u n c t i o n a c t i v ee f f e c t o rc a s p a s p e sm a ya m p l i f yp r o c e s s i n g d i s t i n c t s t e p sa r ei n h i b i t e db yp 4 9a n dp 3 5 o p - i a pf u n c t i o n su p s t e a mb ya s s o c i a t i o nw i t hd e a t h e f f e c t o r s ，s f - c a s p a s e - xo rb o t h 4 缺失型s p i t - p 4 9 抗细胞凋亡活性的研究 a c m m ，v b m 舻v s p i t m ：，、 s i 舻v a c 晡m p v b m m p v s p i t 婿 v s i i l i p v a c m m p v b m i 1 p v s p i t p v 8 i i 巾v a c m n p v b m i 炉v s p i t l a v s i 即v a c m n p v b m 胪v s p i t n f ，、 s i 妒v a c m n p v b m f l i i p v s p i t 睁- v s i i i p v a c m 时p v b m w p v s p i t n p v s l n p v a c m n p v b m n p v s p i t 忏v s i 妒v m c v l f p v ei d v s o tl l r d c q 一、，d l q t r e l w i 瞅im n 一t o l t k p 讥m 胪hi s g pi r i i i c v l f p v ei d v s q i r d c h 一 , d e q t r e l v 丫i1 1 km n 一t q l t k p v l m m f ni s g pl r 埘c v li p - t f d a s a t ti v d c _ a i | l s d s s l r d li y v n n v a v s k t g n y in r s v im _ a l ni s g p w m c v l _ i p - t f n 艇淑t ti 、帕c a n l s d s s m r d li y v n n v a v s k n g n y in r a v im a l ni s g p l v 槲：幸：木木木料幸奉：卓：奉：丰：丰：丰：丰扫h 肆： s 、丌雕n n n l r d rk s k 、a ) e q f d q l e r - d y s d o m d g ri d sii c y f k d 刚y s v s c q s k s s v t r k n n d l r d rk s k v d e q f d q l e r e y s d kd g f h d nq y f k d e h y s v ：j c o n g s , l k 8 s v n r v s m hl 、，h m y r s d ri f d r f n r i _ t y s a t v i d g g di d r 、a _ k s d c i y t w c m s r s e l l d c v n r v s 刖i 、d - i i i y r s hi d r v f d k f n k lt y s a t v t d g g g k ) r v f 惦d d y t 圮h s r g d l l n 幸：幸：t # ：#：| c ：丰爿c 幸 k f a kl k s h d y t d k k si e 月e k 衄p a 、 ) e r d 一一m ， 、f e k p g f k f a kl k s h o y t d k k se t y e k y c l p q l 、d k h n d 一一c 1 、目v c _ v l k p g f n y k k c ln e m g a t q d d v e k f r k y c l k p l 、，e t e n d g g v 印r k k p y v vc s l k p k l n ( h c l l n e m g a t y d l d v e k f r k y c l 略l t e t e n d m i 、船d ( k k p n ，ic s l k p l ：书：丰：丰擀走：丰丰幸：幸木料： e n g s i l l 0 、i l s f e y i i i