（细胞生物学专业论文）钙调蛋白和pololike激酶1对哺乳动物细胞有丝分裂进入调控机理研究.pdfVIP

学位论文独创性声明 本人郑重声明 1 、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。 2 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成 果。 3 、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。 4 、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构已 经发表或撰写过的研究成果。 5 、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示了 谢意。 作者签名： 日期： 学位论文使用授权声明 垫：! ! ：堑 ， 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子 版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文 进入学校图书馆被查阅 有权将学位论文的内容编入有关数据库进行 检索：有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解 密后适用本规定。 作者签名： 日期： 聋生 蛰! ! ! ：奴 鞋 博i 学位论文 桶篮 摘要 细胞周期调控是一个多层次、多步骤的复杂过程。前期的研究表明，钙调蛋 白( c a l m o d u l i n ，c a m ) 对细胞顺利通过检验点的监视。完成细胞周期的萨常运转 具有重要调节作用但是对其下游底物仍不清楚。p o l o - 1 i k ek ir l a s e1 ( p l k l ) 是 一种丝氨酸苏氨酸傲酶，它的作用贯穿整个有毖分裂的始终。我们通过，士物信息 学筛选发现p o l o l i k e 激酶( p 1 k 1 ) 可能是一种c a m 下游效应分子的候选蛋白质。 分析显示p l k l 具有三个潜在的c a m 结合结构域，其中一个位于与定位密切相关的 c 端p o l o 盒内，两个位于n 端的催化区。越来越多的证掘表明，它的时空定位和 顺序激活是发挥作用的关键，我们的结果显示，与p l k l 发生时空特异性分布的钙 调蛋白将激活p l k l 并促使有丝分裂的进入。 1 c a m 和p l k1 在细胞分裂中期发尘共定位。免疫荧光染色发现c a m 和p l k l 在细胞分裂中期主要共分布于纺锤体两极的微管组织中心处；免疫共沉淀及 w e s t e r nb l o t t i n g 的结果办显示在细胞有丝分裂中期，c a m 和p l k l 两者可以互相 被对方所共沉淀。 2 c a m 对p l k1 的活性起着调控作用。p l k l 的活性在细胞周期的g 2 m 转换期 达到最高，用c a m 的抑制剂处理同步化在此时的细胞可以抑制p l k l 的活性。与对 照细胞系相比，稳定表达c a m 的细胞系具有较高的p l k l 的活性。在h e k 2 9 3 细胞 中过量表达突变型的c a m 无法使p l k l 的活性上升。 3 c a m 通过提高p l k l 的活性促进g 2 m 转换。c d c 2 5 c 是p l kl 的一种直接底 物，它在g 2 佛转换时发生高度磷酸化。在同步化到g 2 期的h e l a 细胞中，抑制c a m 的活性可以抑制c d c 2 5 c 的磷酸化水平；和对照细胞系相比，稳定表达c a m 的细胞 系c d c 2 5 c 发生高度磷酸化。在h e k 2 9 3 细胞中过表达突变型的c a m ，则不能使p l k l 的底物c d c 2 5 c 发生高度磷酸化。 4 p l k l ，c d c 2 5 c 和p 5 3 在g 2 i v l 期可以发7 e 直接的瓦相作用并形成一个复合 物，p l k l 通过使c d c 2 5 c 发生超磷酸化而激活其磷酸酶的活性，活化的c d c 2 5 c 使 p 5 3 的s e r l 5 发生去磷酸化并通过m d m 2 介导的方式发生降解。 博l 学位论文橘型 总之，c a m 在有丝分裂中期与p 】k l 发生时牵特斤性分钿，并f l 以一种c a m k i i 雄依艘豹方式调控它的激酶活性，它们的相r e 作j 促进了有鲐分裂的进入。 关键词：c a m 、p o l o l i k e 放酶l 、自丝分裂进入、p 5 3 、c d c 2 5 c 霹 学位论文 a b s ”a n a b s t r a c t t h ec e l l d i v i s i o nc y c l ei nm a m m a l i a nc e l l sh a st ob er e g a l a t e di nb o t ht l m ea n d s p a c e o r d e r e da n dt i g h t l ye o m r o l l e dm o l e c u l a re v e n t sb ya c t i v a t i o na n d d e a c t i v a t i o n o f as e r i e so fp r o t e i n st h a ta c ta te a c hs t a g ee n s u r en o r m a lc e l l u l a rp r o g r e s s i o n c a l m o d u l i ni sau n i v e r s a ls i g n a l i n gm o l e c u l ea n dt h o u g h tt ob ei n v o l v e di nr e g u l a t i n g m i t o t i ci r a n s i t i o n s ，b u tt h ee s s e n t i a lt a r g e t so f c a 2 + c a m m e p e n d e n tp a t h w a y sr e q u i r e d f o rc e l lp r o l i f e r a t i o nr e m a i ne l u s i v e p o l o l i k ek i n a s ei sas e r t h rk i n a s ea n dr e g u l a t e sa w i d ev a r i e t yo f m i t o t i ce v e n t sf r o mt h eb e g i n n i n gt ot h ee n do fm i t o s i s b i o i n f o r m a t i o n s u g g e at h a tp l k lh a st h r e ep o t e n t i a lc a mb i n d i n gs i t e s , o n ei st h ep o l o b o xd o m a i na n d t h eo t h e rt w oi si nt h ek i n a s ed o m a i n m o r em a dm o r ee v i d e n c es u g g e s tt h a tt i m e l y a c t i v a t i o n a n d d y n a m i cs u b e e l l u l a r l o c a l i z a t i o no f p l k la l ec r i t i c a l f o rr e g u l a t i n gp l k l f u n a i o n o u rr e s u hs u g g e gam e c h a n i s mt h a tt h es p a t i o - t e m p o r a ld i s t r i b u t i o no f c a l m o d u l i nw i t hp l k lw i l la c t i v ep l k la n dp r o m o t em i t o t i ce n t r y 1 i nm e t a p h a s e ，c a mc o l o c a l i z a t i o nw i t hp o l o - l i k ek i n a s e1 ( p l k l ) a tc e n t r o s o m e 1 m m u n o f l u o r e s e n c es u g g e s tt h a tc a mc o l o c a l i z e dw i t hp l k la ts p i n d l ep o l eb o d y a n di m m u n o p r e c i p i t a t i o nr e s u l t sa l s os h o w st h a tt h e yc a l lc o i m m u n o p r e c i p i t a t i o n w i t he a c ho t h e ri nm e t a p h a s ec e l ll y s a t e 2 c a mc a n r e g u l a t ep l k la c t i v i t y p l k la c t i v i t yw a sh i g ha tg 2 mt r a n s i t i o n p l k l a c t i v i t yc a nb ei n h i b i tb yc a ma n t a g o n i s ti ns y n c h r o n i z e dh e l ac e l l s c o m p a r e d w i t ht h ec o n t r o lc e l l s ，c a ms t a b l ec e l ll i n eh a sh i g h e rp l k la c t i v i t y o v e r e x p r e s s i o n o f m u t a n tc a mi nh e k 2 9 3c e l lw i l ln o te l e v a t ep l k la c t i v i t y 博 学位论文a b s t r a c t 3 c a mp r o m o t eg 2 mt r a n s i t i o nb ye l e v a t ep l klk i n a s ea c t i v i t y c d c 2 5 ci sad i r e c t s u b s t r a t eo f p l k l ，w h i c hi sh y p e r p h o s p h o r y l a t i o ni ng 2 m i ns y n c h r o n i z e dg 2 p h a s eh e l ac e l l t h ep h o s p h o d l a h o nl e v e lo f c d c 2 5 cc a nb ei n h i b i tb ) c a m i n h i b i t o r c o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o lc e l l s ，t h ec d c 2 5 ci sh y p e r p h o s p h o r y l a t e di n c a ms t a b l ec e l ll i n e i nh e k 2 9 3c e l l o v e r e x p r e s s i o no fm u t a n tc a mw i l ln o tm a k e c d c 2 5 ch y p e r p h o s p h o r y l a t i o n 4 i m m t m o p r e c i p i t a t i o nd a t as h o w s t h a tp l k l ，p 5 3a n dc d c 2 5 cc a nf o r mal a r g e c o m p l e x c d c 2 5 ca n d p l k lc o u l db i n dt ot h ed i f f e r e n td o m a i no f p 5 3 p l k lm a y f i r s tp h o s p h a r y l a t ec d c 2 5 ca n da c t i v ei t t h e na c t i v a t e dc d c 2 5 cm a y d e p h o s p h a t e p 5 3a ts e r 一15a n dc a u s ei t sd e g r a d a t i o n i na 1 1 t h es p a t i o t e m p l ed i s t r i b u t i o no fc a mw i t hp l k li nm i t o t i cm e t a p h a s ew i l l a c t i v ec d c 2 5 cp h o s p h a t a s ei nc a m k i ii n d e p e n d e n tp a t h w a y ，t h e i ri n t e r a c t i o np r o m o t e m i t o t i ce n t r y k e yw o r d s ：c a m 、p o l o l i k ek i n a s e1 、m i t o t i ce n t r y 、p 5 3 、c d c 2 5 c 4 博i 学位论文前吉 目u吾 核分裂和胞质分裂是细胞周期中最令人瞩目的两大部分，它们的顺利进行是 细胞内多种信号途径共同作用，精确凋控的结果。特定的c d k s 和特定的周期蛋白 结合形成一个活性复合物，与细胞外信号分子结合调控细胞周期进程。除了已经 对c d k s 进行了大量的研究外，许多研究证实了在脊椎动物中，p 1 k 1 在与c d k l 相 互作用调控有丝分裂进程和细胞增埴上起了至关重要的作用。p l k s 是一个广泛存 在于真核生物中的s e r t h r 蛋白激酶家族，包括p l k l 、s n k ( p l k 2 ) 和 f n k p r k ( p l k 3 ) ，其中p l k l 研究的最为深入。p l k l 显示与c d k l 相互作用引起了一 系列有丝分裂事件，诸如有丝分裂进入、双极纺锤体的形成、姊妹染色单体分离、 有丝分裂退出及胞质分裂的完成等。一个激酶如何能够在有丝分裂过程的不同时 间点上调控如此众多的细胞内过程呢? 有关这个问题的答案，我们认为( 至少部 分是) 在于p l k l 的动态的时空定位。 既然p l k l 在细胞周期转换过程中起了如此重要的作用，了解p l k l 的活性是如 何被调控的就显得格外重要。在哺乳动物细胞中，p l k l 的m r n a 和蛋白水平在晚 g 2 期和早m 期达到高峰，但其激酶活性却在g 2 m 期爿丌始显现，这暗示在转 译后存在另一个调控其活性的过程。但有关调控p l k l 活性的上游成分知之甚少， 1 9 9 8 年，在爪蟾，一个新发现的s t e 2 0 相关的激酶，称为x p l k k l 的，是第一个被 确认调控激活p i x l 的激酶，但事隔六年，同一研究小组却又推翻了自己的结论， 提出相反的证据，证明该激酶是p l x l 下游的效应物，以一种讵反馈循环的方式激 活p l x l ，因此确定p l k l 的激活子是未来的研究重点。我们认为，顺序激活及p l k l 的动态分却是调控p l k l 活性的关键所在。 在有丝分裂过程中，激酶的时空调控越束越成为一个理解细胞分裂中细胞是 如何调控如此众多事件的一个关键领域。参与细胞周期调控的分子对细胞周期的 调控存在两个层次上的四维控制：即在时间上对细胞周期特定事件次序上的调节 和在空日j 上对细胞三维结构的调节。在时f b j 层面上，细胞通过在特定的时j 日j 合成 和降解特定的细胞周期调节蛋白来保证细胞周期事件的顺序进行如有丝分裂只 博i 学位论尘韵 在d n a 复制完成，而且损伤的d a 得到修复后爿能进行，而d n p - , 复制也只能在有 丝分裂完成，细胞经过一定生长后爿能丌始。而在宅问p ，细胞通过细胞周期调 节蛋白如蛋白激酶和磷酸酶在细胞内的空1 日j 上和在特定细胞器的特异分如柬保让 细胞周期t f 确进行，如细胞周期调控最重耍的蛋白复合物c y c l i nb 卜c d k l 位于细 胞质内，发挥作用的部位在细胞核。在发生( ；2 m 期转换前，c y c l i nb 1 一c d k l 被活 化，其最早发生活化的部位是在中心体，位于中心体上的p o l o - 1 i k e 激酶1 ( pl k i ) 将c y c l l nb 1 磷酸化，对c y c l i nb 1 一c d k l 复合物启动宵丝分裂的功能起整合作用。 以往对细胞周期调控的研究大多往重在时酬甚卣上，研究绍胞如何通过在特 定的时 日j 合成和降解特定的细胞周期调节蛋白柬保证细胞周期事件的顺序进行， 但是存在最大的缺陷就是不能够提供在时间和空甘j 上蛋白质之| 日j 的相互作用信 息。而近来对细胞如何通过细胞周期调节蛋白如蛋白激酶和磷酸酶在细胞内的空 问上和在特定细胞器的特异分布柬保证细胞周期币确进行的研究受到越束越多的 重视。我们的前期的工作表明c a m 在调控有丝分裂的进行时存在特别明显的空间 分布。我们认为c a m 多种调控功能的发挥与其在细胞内的特异时空分布密切相关。 通过分离鉴定和c a m 存在时空特异性结合的蛋白质并研究其空间分如和与c a m 的相互作用对有丝分裂的影响，将使我们可以更好的了解c a m 对有丝分裂的调控 机制。 在哺乳动物细胞中钙调蛋白是一个广泛存在的细胞内蛋白，是细胞内c a + - + 信号的主要受体，在细胞增飧、分化、凋亡，迁移，细胞信号传递的许多方面起 着重要的作用。前期的研究结果表明细胞内钙调蛋白的水平随着细胞周期而被调 控着，过表达这一蛋白将使体细胞分裂加速，阻断钙调蛋白依赖的蛋白激酶将阻 断有丝分裂进程。我们利用绿色荧光蛋白( g f p ) 标记技术观察活体细胞c a m 的分布 表明，钙调蛋白在h e l a 细胞有丝分裂时存在对应于特定细胞事件的分布，特别是 在有丝分裂时期，c a m 存在特别明显的空间分布：前期分布在细胞核，中期分布在 纺锤体的两极、后期和未期分白在分裂沟和中区微管部位，胞质分裂时分白在收 缩环，胞质分裂后分佰在细胞质桥中体的部位等。钙调蛋白的这种时空非均一性 的分布及活化方式显示了随之而束的钙凋蛋白与其靶蛋白相互作用的时空特异 性。我们的观点是：c a m 多种调控功能的发挥与其在细胞内的特异时空分钿密切相 关。 博卜位论文 前三 但目l j i 一个有待解决的问题是c a m 在细胞周期的不同阶段如何调节不同的功 能。由于c a m 本身并不具有任何酶活性，其发挥，上物学效应的关键在于它能够和 钙调蛋白结合蛋白( c a m b p s ) 结合，引起c a b p s 生物学活性的改变，进而参与生 命活动的调控。但是，目日0 对绌胞分裂上i 程中c a m 的卜赫放应分f 一直了解l 匕较 少。因此，研究c a m b p s ，揭示c a 2 + c a m 信号在这个调控过程中的分子机理，将是 一个令人着迷的挑战。 前期的研究结果发现p l k s 在整个细胞有距分裂过程中分却很有特点，p l k s 在中期聚集在纺锤体两极( s p b ) 处，并n r 以磷酸化a 、p ，启动中心粒的纺锤体组织 功能。当有丝分裂进入中后期，p t k s 的分1 1 】发生剧烈变化，p l k s 逐渐从s p b 上消 失，聚集在中间纺锤体上，成为调节微管组装的关键因子；当细胞分裂进入木期， p l k s 完全从s p b 上消失，聚集在中体上，促进胞质分裂的完成。 p l k l 调控大量的有丝分裂进程，贯穿了有丝分裂的始终。细胞同样也需要 c a 2 + c a m 依赖的过程束控制生长和分裂，而这些过程可能在细胞周期进程的多个 点上起作用。有趣的是，p o l ol i k ek i n a s e ( p l k s ) 的分向模式与c a m 在有丝分裂 时期的分布模式类似：在晚s 期及g 2 期早期，p l k l 和钙调蛋白都分布在中心体位 置。虽然，有报道显示，p l k 2 和p l k 3 可以和c a 2 + 和整合蛋白结合蛋白( c a l c i u m a n d i n t e g r i n b i n d i n g p r o t e i n ( c i b ) ) 相作用，但至今没有报道显示钙调蛋白与p l k ! 发生相互作用。 我们的实验结果显示与p l k l 发生时空特异性分白的钙调蛋白将和p l k l 发生 相互作用并激活p l k l ，它们的相互作用促使有丝分裂的进入。 竖! ：兰些笙塞 苎二! 竺塑堂堂塑! ! 塑：! 坠! 丝堕! 型型坐型塑塑丝坐! ! 些壁! 垒些! 第一章钙调蛋白和p o l o l i k e 激酶1 对细胞周期调控 研究进展( 综述) 一、哺乳动物的细胞周期 哺乳动物的细胞增殖与其他真核，上物相类似，都是受到进化上保守的一系列 严格的时序调控。它通过使一系列蛋白敬酒和失活的分子事件柬保汪细胞周期的 有序进行。 1 细胞周期及检验点 细胞周期( c e l lc y c l e ) ，顾名思义，即为细胞增殖一次所经历的活动和所需要 的时日j 。更具体地既，细胞周期是指连续分裂的细胞从一次有丝分裂结束到下一 次有丝分裂完成所经历的整个连续过程。 细胞周期概念的由来可以追述到1 9 世纪细胞学说( c e l lt h e o r y ) 的创立时 期。可以认为，细胞周期概念是v i r c h o w 于1 8 5 5 年在发现细胞分裂的基础上而提 出的“细胞来自细胞”这一创建性论断的衍生与发展。然而，关于细胞周期时相 的划分以及随之而进行的调控机制研究是在现代细胞生物学和分子生物学兴起 后，才得到迅速发展。 最先采用现代细胞生物学技术研究真核细胞的细胞周期并将细胞周期划分为 4 个时相的学者是h o w a r d 和p e l c 。1 9 5 1 年，h o w a r d 和p e l t 采用放射自显影 4 ( a u t o r a d i o g r a p h y ) 技术，用同位素3 2 p 标记蚕豆根尖细胞，证明d n a 合成只能 在分裂l 日j 期的特定时期进行，从而把细胞周期划分为4 个时相，即从有丝分裂完 成到d n a 复制之前的间隙期( g 印1p h a s e ) ，简称g l 期：d n a 复制期( s y n t h e s i s p h a s e ) ，简称s 期：从d n a 复制完成到有丝分裂丌始的第二次间隙期( g a p 2p h a s e ) ， 简称g 2 期；从有丝分裂丌始到结束，即有丝分裂期( m i t o s i s ) ，简称m 期；自此 以后，随着细胞培养技术的发展和细胞同步化诱导技术的产生，以及显微分光光 度术( m i c r o s p e c t m p h o t o m e t r y ) 定鼋测定和胸睁柄i 记放射自显影技术的应用，不 仅使有关细胞周期的知识不断丰富起来，而且很快发展成为一个细胞生物学家、 发育生物学家、分子生物学家、生物化学家和遗传学家共同感兴趣的热门领域。 博 学位论文 l ；一帝饥调出 j f np o l o 1 l k e 触酶1 对细胞用期侧拧研究址艟( 综述) 2 0 0 1 年的诺贝尔医学生理学奖和2 0 0 4 年的诺贝尔化学奖便是一个很好的见证。 哺乳动物的细胞周期是由一系，0 的检验点末保b f 它的有序进行的。第一个榆 验点是在g 1 期的后期，被称为限制点( r e s t r i c t i o np o i n t ，r 点) ( f i 9 1 ) 。一日细胞 越过这个点，通常它们将进入一个细胞周期。另外的检验点包括存在于s 期，以 在必要的时问激活d n a 修复机制：以及存在于g 2 m 转换期，以保证细胞在进入 核分裂前已经完成了自身d n a 的复制，并且是无损伤的；m 期中期至后期纺锤体 组装检验点则监视染色体排列是否f 常等，以保证染色体能下常平均分配到子细 胞中。最后，有丝分裂的检验点调控机制保证存在合适的条件以完成胞质分裂。 可见，通过这些检验点监视和调控周期时相萨常转换与严格地顺序进行，保证了 子代细胞与亲代细胞之间遗传物质的稳定性。 细胞周期的每一个时期的进程是受到许多细胞周期分子严格的调控的，例如， 细胞周期蛋白、依赖于细胞周期蛋白激酶( c y c l i n d e p e n d e n tk n a s e s ，c d k s ) 以及 依赖于细胞周期蛋白激酶的抑制子( c d ki n h i b i t o r s ，c d k i s ) ，它们是通过磷酸化 以及去磷酸化而被调控的 a l b e r t se ta 1 ，2 0 0 3 。c d k s 在调控细胞周期进程中 起了重要的作用，细胞周期蛋白作为调节亚基与c d k s 形成复合物，细胞周期蛋白 的水平通过转译以及泛蛋白介导的降解，随着细胞周期发生改变 b i c k n e l le ta 1 ， 2 0 0 0 ，n u r s e2 0 0 0 。c d k 的活性通过和多种c d k i s 的结合而被负调控。特定的 c y c l i n c d k 复合物被激活，调控特定的细胞周期进程。 c 。儿j k i l 博1 学位论丘旃一辛钒删盘白羊1p o l o l i k e 撒酶l 对缃咆州期训摊蝌c j 【腱( 述 2 细胞周期蛋白和依赖于细胞周期蛋白激酶 和其它真核生物一样，哺乳动物细胞周期是通过顺序形成、活化雨l1 夫活 系 勋细胞周期蛹节分子而被渊控的包括细胞用期噩臼( 调节q e 基) 和c d k s ( 催化 亚基) b i c k n e l le ta 1 ，2 0 0 0 ，n u r s e2 0 0 0 。不同的周期蛋白和特定的小同的 c d k s 结台，在细胞周期的不同时相形成特定的复合物，驱动细胞周期从一个时期 进入另一个时期。细胞周期蛋白是一个蛋白家族，币如名字所示，它随着细胞的 各个时期而发生合成和降解。至今，已有八种细胞周期蛋白被攀定出真接参与影 响细胞周期进程：周期蛋白a i 、a 2 、b i 、b 2 、b 3 、c 、d 1 、d 2 、d 3 、e l 、e 2 、 f 、g 1 、g 2 、h ，它们都共同拥有一个由大约1 5 0 个氨基酸构成的同源区，称为周 期蛋白框 b i c k n e l le ta 1 ，2 0 0 0 。大多数周期蛋白的m r n a 和蛋自在整个细胞 周期种的表达显示显著的波动性。例如，周期蛋白a 周期蛋白b 分别在s 期早期 和晚g 2 期瞬i 日j 集聚，随后，通过泛蛋白介导的通路迅速降解，而周期蛋白dl 的 水平在g 1 期开始上升并一直维持到有丝分裂 n u r s e2 0 0 0 。与此相反的是，各种 各样的c d k 分子的表达在整个细胞周期种相对稳定。 c d k s 是一类丝氧酸苏氨酸蛋白激酶家族，它通过和特定的周期蛋白结合而 被激活在细胞周期的不同时相起作用( f i 9 2 ) m o r g a n1 9 9 5 ，1 9 9 7 ，m o r g a ne ta 1 ， 1 9 9 8 。至今，已发现至少有九种c d k s ：c i ) c 2 ( c d k l ) 、c d k 2 、c d k 3 、c d k 4 、c d k 5 、 c d k 6 、c d k 7 、c d k 8 和c d k 9 。c d k 4 、5 、6 复合物主要和周期蛋白d 家族结合并在细 胞周期的g o g 1 期起作用；c d k 2 也可以和周期蛋白d 家族结合，但更倾向于结合 周期蛋白a 和e 并在细胞周期的g 1 期和g l s 转换起作用；和周期蛋白a 和b 形 成复合物的c d k 在细胞周期的g 2 期和m 期起作用 9 u 沁e ta 1 ，1 9 9 2 ，k o f fe t a 1 。1 9 9 2 ，d r a p k i ne ta 1 ，1 9 9 6 。这些c y c l i n c d k 复合物一旦被激活，将磷 酸化一系列与细胞周期进程相关的特定的底物。这些底物包括r b 蛋白、核纤层蛋 白和组蛋白等 m i l l e r a n dc r o s s , 2 0 0 1 。例如：当细胞进入g l 期，c y c l i n w c d k 4 复合物最先被激活，便肿瘤抑制蛋白r b 发生磷酸化 5 h e r re ta l ，1 9 9 9 ，s h e r r 1 9 9 6 e k h o l ma n dr e e d ，2 0 0 0 ，随后，c y c l i n e c d k 2 复合物使r b 进一步磷酸化 l u n d b e r ga n dw e i n b e r g ，1 9 9 8 ，高度磷酸化的r b 能够激活转录因子e 2 f 家族， 调节许多与s 期进程有关的基因的表达 w e i n b e r g ，1 9 9 5 ，n e v i n ge ta 1 。1 9 9 7 ( a ) ， 博f 学位论立第一幸鹕调搬山和p o l o ，l i k e 撒晴1 对自i l 咆h 焖州柠，e 道艟( 综述) 1 9 9 7 ( b ) ：当细胞进入s 期，丌始活化，并一直持续到g 2 期 y a me ta 1 ，2 0 0 2 ， s t i l l m n ，1 9 9 6 ；在晚g 2 期，c y c l i n b c d k 2 丌始活化，使细胞进入分裂期 k is m m o t oa n do k u m u r a ，t 9 9 7 。 3 依赖于细胞周期蛋白激酶的抑制子 周期蛋白和c d k s 通常作为真核细胞周期的f 调控因子，但细胞内同样也存在 一个负调控因子的蛋白家族，c d k l s r e e de ta 1 ，1 9 9 4 ，p i n e s1 9 9 7 ，b r o o k se ta 1 ， 1 9 9 8 1 。c d k i s 包括两个结构不同的家族，i n k 4 ( c d k 4 的抑制子) 和c i p ( c d k i m e r a c t i n gp r o t e i n ) k i p ( k i n a s e i n h i b i t o rp r o t e i n ) 家族 p a v l e t i c h l 9 9 9 】。i n k 4 家族包括p 1 4 、p 1 5 、p 1 6 、p i g 和p 1 9 ，它们特异地抑制g i 期c y c l i n c d k 复合物 ( c y c l i nd c d k 4 和c y c l i nd c d k 6 ) 并参与g l 期调控。c i p k i p 家族包括p 2 1 ， p 2 7 和p 5 7 ， 在它们的氨基端的7 0 个氨基酸有3 8 - 4 4 的同源性，氨基端是一个 包括周期蛋白结合以及抑制激酶功能的区域 r e e de ta 1 ，1 9 9 4 ，p i n e s1 9 9 7 ，g a r t e le t a 1 1 9 9 6 1 。c i p k i p 家族比i n k 4 家族具有更为广泛的特异性，因为它的成员可以 和c y e l i ne c d k 2 、c y c l i nd c d k 4 、c y c l i nd c d k 6 、c y c l i na c d k 2 和e y e l i nb i c d c 2 发生相互作用，抑制它们的激酶活性，并在真个细胞周期中起作用( p i n e s1 9 9 7 ) 。 这两个c d k i s 家族的成员通过截然不同的方式抑制c d k 活性。c i p k i p 家族成员 与e y c l i n c d k 复合物结合并抑制该复合物全部的激酶活性 s h c r r , 1 9 9 6 1 ，而烈k 4 家族成员通过引起c d k 构象变化，改变周期蛋白的结合位点从而日j 接阻止周期蛋 白的结合；但这两个蛋白家族都通过扰乱a t p 结合位点导致与a t p 的亲和能力下 降 s e r r a n o 。1 9 9 7 1 。 c d k s 的活化在整个细胞周期中是被严格调控的，c d k s 家族通常受到四个主要 的调控方式 m o r g a n1 9 9 5 ，1 9 9 7 ，m o r g a ne t a l ，1 9 9 8 ，s h e r re ta l ，1 9 9 9 ； 第一，活化依赖于和它相应的周期蛋白的结合；第二，c d k s 是通过磷酸化而被活 化，这既包括通过磷酸化而被证反馈活化也包括通过酪氮酸磷酸化而被负调控； 第三。一些c d k s 通过与c d k i s 结合而抑制其活性；第四，许多e y e l i n c d k 复合 物通过调节亚细胞定位，使它们得以接近靶蛋白。 博l 。学位论文 第一帝竹侧盘1 0 和p o l o 1 i k e 馓酶l 对匀胞川明埘拧兜i 【胜( 述) 二、钙信号对细胞周期进程的调控 许多激素、生长因子和细胞因子调控了它们靶细胞的增殖，然而，导致增殖 反应最广泛存在的信号级联机制口丁能就是道j 豆瞬问提高细胞内的钙离子& 度 c a 2 + 】i 。细胞内c a 2 + 的主要受体就是钙调蛋白( c a m ) 。钙调蛋白足一个小蛋白分 子，含有四个钙离子结合的，在真核生物中保守的“e f h a n d ”位点。虽然c a 2 + c a m 在单细胞和多细胞真核生物的增殖过程中是必须的，但是有关c a 2 + c a m 依赖的增 殖过程的下游基本靶点仍然神秘萸测。c a ”c a m 依赖的靶蛋白包括丝氦酸苏氨酸 磷酸酶c a l c i n e u r i n 以及多功能的c a + c a m 依赖的蛋白激酶家族。然而，c a 2 + c a m 和它下游的靶点，如c a l c i n e u r i n 以及c a 2 + c a m 依赖的蛋白激酶调节细胞周期主要 调节蛋白的机理仍是个未解的迷。 1 钙离子对细胞周期进程的作用 钙离子是细胞中普遍存在的第二信号分子，它调控了许多不同的细胞内进程， 包括细胞增殖、发育、迁移、分泌、学习和记。t l b e r r i d g e e ta 1 ，2 0 0 0 ，c a r a f o l i ，2 0 0 2 。 一个离子是如何执行如此纷繁复杂的细胞内过程? 激素、生长因子、细胞因子和 神经递质的刺激都会导致细胞内钙离子浓度的上升，但是瞬间的上升在时| b j 和空 问上本质的不同确保一个细胞对一个给定的激素产生相应的反应 p e t e r s e ne t a 1 1 9 9 4 ，t a y l o r , 1 9 9 5 。钙离子可以直接和它的靶蛋白发生反应，或者通过它的结合 蛋白的介导而发生效应。钙信号的复杂本性和细胞内难以计数的钙离子结合蛋白 使一个细胞得以借助钙信号发挥其独特的生理功能。 2 博i 学位论文 第一章硼生f i 事np o l o h l , e 触j 每l 对钏胞州明硼押+ o c f f 道啵综述， p r bp h o s p h o r y l a d o n ( 1 ) 细胞增殖需要c a 2 + 的参与 在所有的真核细胞中，细胞外环境中的c a 2 + 和细胞内贮存的c a 2 + 对细胞生长 和分裂同等重要。在哺乳动物细胞中，把细胞外c d + 浓度从i o m m 降低到0 1 m m 将导致逐级下降的增殖速率 h i c k i ee ta 1 ，1 9 8 3 。哺乳动物细胞中胞外c a 2 + 在多个 点上调控细胞周期，当把证在活跃增殖的鼠或人的成纤维细胞臂于低浓度c a 2 + 的 培养基中，它们将停止分裂，并阻断在g l 期 h a z e l t o ne ta 1 ，19 7 9 ，w h i t f i e l de ta 1 ， 1 9 7 9 ，b o y n t o ne ta 1 ，1 9 7 6 1 ，在b a l b c 3 t 3 成纤维细胞中这一阻断是可逆的，当 恢复胞外c a 2 + 到达正常值时，可以使细胞在几个小时内丌始d n a 复$ 1 j b o y n t o ne t a 1 ，1 9 7 6 。细胞在细胞周期的两个点上对外源c a 2 + 非常敏感，一个是在早g l 期， 另一个是在接近g 1 s 转换期 b o y m o ne ta 1 ，1 9 7 7 1 。 哺乳动物细胞增殖不仅需要胞外c d + ，胞内c a 2 + 库同样重要，去除胞内i p 3 敏感的c a 2 + 库，例如：t h a p s i g a r g i n ，该试剂阻断内质网膜上的c d + 泵的活性，使 内质网内c a 2 + 下降，胞内c a 2 + 库的消失导致d n a 合成、蛋白合成以及核转运的 阻断，最终使细胞分裂阻断 s h o ae ta 1 ，1 9 9 3 ，g r e b e ra n dg e r a c e ，1 9 9 5 ，h u s s a i ne t a 1 ，1 9 9 5 1 ，直到洗去t h a p s i g a r g i n ，细胞j 。从静息期释放进入，重新进入s 期。因 此，讵常细胞增殖既需要胞外c a 2 + ，亦需要胞内c a 2 + 库，细胞在g 1 期时对c d + 缺乏最为敏感。 在多数哺乳动物细胞中，胞内静息状念的钙离子浓度 c a 2 + 】，( i n t r a c e l l u l a r c a l c i u mc o n c e n t r a t i o n ) 通常保持在1 0 - 5 0 n m 范围内：当细胞受到诸如生长因子、 博i 学位论文 第一章饥埘生 j 御p o l o h k e 触酶i 对细i f 6 1 硐期t 吲挣 f ，l j ! t 键( 述) 多肽激素的刺激后，会引发受体电压门控的钙离f 通道介导的胞外钙离子内流或 l n s p 3 介导的胞内钙库钙离子外流，胞质中彭j c a “ ，可达5 0 0 1 0 0 0n m 。这种【c a 2 + 1 的升高在时空上受到严格调控：一方面，细胞通过质膜和内质网膜上的 c a 2 + _ a t p a s e ( c a 2 + 泵) 维持胞内 c a 】的稳态；另一方面，细胞内存在的大量钙 离子结合蛋白限制了钙离子的弥散 s o d e r l i n ga n ds t u l l ，2 0 0 1 】。这种短暂的钙离子 波动究竟是如何传递不同信息，介导多种生理反应的，现在仍然不清楚。一般猜 测认为，这种钙离子脉冲本身的振幅和频率代表了某种特定信号，而在特定时f 日j ， 分白在胞内特定部位的钙离子结合蛋白则扮演了“解码分子”的角色。将这些生 命信号转化为特定的生化反应。这些钙离子结合蛋白与钙离子具有较高的特异性 亲和力，其中一部分蛋白的活性受钙离子的直接调控，是钙离子信号的直接效应 子，例如蛋白激酶c ；另一部分蛋白则作为钙离子信号的感应子，再将钙离子信 号传递至不同的效应予。进而引发多种生理反应，钙调蛋白( c a m ) 就是这样一 种重要的钙离子信号传递分子 c h i na n dm e a n s ，2 0 0 0 1 。 ( 2 ) c a 2 + 信号与细胞周期 c a 2 + 作为一个广泛存在的第二信使，它瞬i 日j 波动的时空复杂性赋予细胞利用 这一信号对大量的生理变化作出反应，在细胞周期中，c a 2 + 瞬间波动发生在g 1 期 和分裂期 s a n t e l l a , 1 9 9 8 ，b e r r i d g e ，1 9 9 5 。同样也有证据表明它也仍然存在于有丝 分裂进程的许多阶段，特别是在中，后期转换以及胞质分裂期 w h i t f i e l de ta 1 。1 9 9 5 ， w h i t a k e r a n dl a r m a n , 2 0 0 1 】。在海腰卵中，c a ：+ 瞬问波动发生在原核迁移、核膜破 裂、中后期转换以及分裂沟形成处 p o e n i ee ta 1 。1 9 8 5 。在哺乳动物的p t k l 细胞中， 中后期转换中同样也显示出这一现象 p o e n i ec ta 1 ，1 9 8 6 1 。不论c a 2 + 瞬问波动发生 的振幅的大小核持续的时l 日j 长短如何，它进入细胞内，都是通过直接核靶点结合 或者通过和胞内受体，如c a m 结合，使c a m 暴露出疏水区，促进与靶酶的结合。 2 钙调蛋白对细胞周期进程的调控 c a m 普遍存在于真核细胞中，是由1 4 8 个氨基酸残基组成的小分子( m w 1 6 7 k d ) 酸性蛋白质，结构、功能高度保守无组织和种属特异性。c a m 含有4 个同源性钙离子结合位点，x 一射线晶体苻丁射分析发现，每个结合位点都有基本的 “e f - h a n d ”结构。c a m 对钙离子的亲和力与胞内游离的钙离子浓度密切相关。当 细胞内钙离子浓度在l o 。m 以下时，钙离子不能与c a m 结合；当胞内钙离子浓 4 博i 学位论文 第一帝钒调坐 j 和p o l o 1 i k e 檄晦l 对訇胞州期州挡研究迎腱( 综述) 度升高