（发酵工程专业论文）双水相萃取法从桑蚕蛹等三种原料中提取sod的工艺研究.pdf

摘要 目前国内外对超氧化物歧化酶( s o d ) 的研究，丰要集中在动物组织、植物中提取的s o d ， 因动物体内s o d 含量多，活性高，但是动物组织提取的s o d 安全性低，含有致热因予等缺陷。 丽植物中s o d 含量低。为了开发s o d 含量多、活性高、缺陷少的资源丰富的原料，本文以条 件温和、产品活性损失小、处理量大，分离步骤少，无有机溶剂残留等优点的双水相萃取分 离法在黄粉虫、啤酒酵母和桑蚕蛹三种原料中，进行提取纯化s o d 比较研究。 本实验确定了双水相筚取提取s o d 工艺流程，研究了双水相体系最佳条件：提取黄粉虫 和蚕蛹中s o d 最佳双水相体系的质量组成为聚乙二醇浓度1 2 ，磷酸钾浓度2 4 ，p h7 1 ；提 取啤酒酵母s o d 最佳双水相体系的质量组成为聚乙二醇浓度l o ，磷酸钾浓度2 4 ，p h7 3 。 在此条件下测定出黄粉虫中提取的s o d 仁t , 活力达到3 7u m g 蛋白质，s o d 纯化倍数达3 7 4 ， 酶活性回收率达7 1 ；啤酒酵母中提取s o d 的比活力达到1 5 5u m g - 1 蛋白质，s o d 纯化倍数 达2 1 8 ，酶活性回收牢达4 7 8 ；蚕蛹中提取s o d 的比活力达到1 0 2 0 u m g 一蛋白质，s o d 纯 化倍数达2 9 1 ，酶活性回收率达7 3 9 。综合s o d 提取的比活力、酶活力回收率和纯化倍数三 个因素考虑，本文认为蚕蛹是最佳原料。 采用s d s p a g e 法测定了s o d 分子量：黄粉虫中提取的s o d 分了量为3 3 2 k d a ；蚕蛹 中提取的s o d 分子量为3 1 0 k d a ；啤酒酵母中提取的s o d 分了量为3 8 2 k d a 。并鉴定三种原 料中提取的s o d 都是c u z n s o d 。 关键词：超氧化物歧化酶：双水相萃取；黄粉虫：啤酒酵母：蚕蛹 a b s t r a c t a t p r e s e n t ，t h e s t u d yo n s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s cd ) m a i n l yf o c u s e do nt h es o d e x t r a c t e df r o ma n i m a lt i s s u ea n dp l a n ti nt h ew o r l d a n i m a lt i s s u ec o n t a i n sa b o u n d e ds o dw h o s e a c t i v ei sh i g h ，b u ti th a sal o to fd e f e c t ss u c ha sl o ws e c u r i t y , c o n t a i n i n gh e a t i n d u c e df a c t o r s s o d c o n t e n to fp l a n t si sr e l a t i v e l yl o w i no r d e rt od i go u tr e s o u r c e r i c hm a t e r i a l sw i t hl e s sd e f e c t sa n d h i g h e rs o dc o n c e n t r a t i o n ，t h i ss t u d yc a r r y so u tc o m p a r a t i v es t u d yo ft h ee x t r a c t i o no fs o df r o m t e n e b r i om o l i t o rl i n n e ，s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ea n dm u l b e r r ys i l k w o r mc h r y s a l i su s i n gt w o p h a s e a q u e o u se x t r a c t i o nm e t h o dw h i c hh a sm a n ya d v a n t a g e ss u c ha sm i l dc o n d i t i o n ，l o w e ra c t i v i t yl o s s ， l e s ss e p a r a t i o ns t e p s ，n oo r g a n i cs o l v e n tr e s i d u ea n de a s yt os c a l eu p i nt h i ss t u d y ，t h ep r o c e s si sd e t e r m i n e dt oe x t r a c ts o du s i n ga q u e o u st w o p h a s ee x t r a c t i o n m e t h o d t h eb e s te x t r a c t i o nc o n d i t i o n s0 1 1a q u e o u st w o p h a s es y s t e ma r ei n v e s t i g a t e d ：t h eb e s t c o m p o s i t i o n so fa q u e o u st w o p h a s es y s t e mo fs o de x t r a c t e df r o mt e n e b r i om o li t o rl i n n ea n d s i l k w o r mp u p aa r ep o l y e t h y l e n eg l y c o lc o n c e n t r a t i o no f12 ，p o t a s s i u mp h o s p h a t ec o n c e n t r a t i o no f 2 4 a n dp h7 1 ；t h eb e s tc o m p o s i t i o n so fa q u e o u st w o p h a s es y s t e mo fs o de x t r a c t e df r o m s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ea r ep o l y e t h y l e n eg l y c o lc o n c e n t r a t i o no f10 a n dp o t a s s i u mp h o s p h a t e c o n c e n t r a t i o no f2 4 ，p h7 3 u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s ，t h ep u r i f i e dm u l t i p l ei s3 7 4 ，t h es p e c i f i c a c t i v i t yi s3 7 u 。m g - a n dt h er e c o v e r yr a t eo fs o df r o mt e n e b r i om o l i t o rl i n n ei s7l ；t h e a c c o r d i n gp a r a m e t e r ss u c ha ss p e c i f i ca c t i v i t y ，p u r i f i e dm u l t i p l ea n da c t i v i t yr e c o v e r yr a t eo fs o d f r o ms a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e a n da r e1 5 5 u m g - 1 ，2 1 8a n d4 7 8 ，r e s p e c t i v e l y ；a n dt h o s ef o r t h e s i l k w o r mc h r y s a l i s ，i s10 2 0 u m g 一，2 91a n d7 3 9 r e s p e c t i v e l y i nv i e wo ft h r e ef a c t o r so ft h e s p e c i f i ca c t i v i t ya n dt h ep u r i f i e dm u l t i p l ea n dt h ea c t w i t yr e c o v e r yr a t e ，s i l k w o r mc h r y s a l i si st h e b e s tr a wm a t e r i a l s d s p a g ei su s e dt od e t e r m i n e m o l e c u l a r w e i g h to fs o d m o l e c u l a rw e i g h to fs o d e x t r a c t e d f r o mt e n e b r i om o l i t o rl i n n ea n ds a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ea n ds i l k w o r mc h r y s a l i si s 3 3 2 k d a ， 3 8 2 k d aa n d31 0 k d a r e s p e c t i v e l y s o df r o ma l lt h r e er a wm a t e r i a l si si d e n t i f i c a t i o na sc u z n s o d k e yw o r d s ：s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ；a q u e o u st w o p h a s ee x t r a c t i o n ；t e n e b r i om o l i t o rl i n n e ； s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ；s i l k w o r mc h r y s a l i s 发表论文、参加科研情况说明以及学位论文使用授权声明 发表论文、参加科研情况说明以及学位论文使用授权声明 一、发表论文 李东旭，吴蕾，任云霞超氧化歧化酶的提取和纯化技术研究进展【j 】食品研究与开发， 2 0 0 8 ，2 9 ( 3 ) ：l8 3 - 18 6 李东旭，吴蕾，陈庆森，等双水相体系提取s o d 的工艺研究【j 】，食品工业科技。2 0 0 9 ， 7 二、基金项目 教育部留学回国人员科研肩动基金，天津市高等学校科技发展基金项目( 重点z d 2 0 0 7 1 6 ) 三、学位论文使用授权声明 本人同意授权天津商业大学将论文的全部内容或部分内容提供给有关方面，编入中 国学位论文全文数据库、中国优秀博硕士学位论文全文数据库、天津商业大学博硕士学 位论文全文数据库等有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇 编以供查阅或借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 第一章前言 第一章前言帚一早月l j 苗 超氧化物歧化酶( s o d ) 是广泛存在于牛物体内，防御氧化损伤( 抗氧化) 的一类金属酶【1 捌， 是目前为止所发现的唯一的以超氧阴离予( 0 2 。) 为底物的酶，能催化细胞内超氧化物阴离子 ( 0 2 。) 的歧化反应，使0 2 转化为双氧水( h 2 0 2 ) 和氧气( 0 2 ) 【3 】os o d 被广泛地应用于牛产日用化 工品，食品，医疗等，如s o d 化妆护肤品，具有抗衰老，云除腧面雀斑，抗肿瘤，抗辐射， 增强人体免疫的功能，被誉为人体内垃圾的清道犬。目前临床上丰要用于延缓人体衰老，防 止色素沉着，并治疗慢性多发性关节炎等【4 】，对躁郁症发病也起重要的作用【5 】。 目前s o d 牛产工艺存在着使用大量的有机溶剂，并难以回收，提取程序复杂，致使产品 的成本较高，牛产周期较长，产琦墨不高等一些不足之处【6 】。目前丰要以动物血液和植物为原料 提取s o d ，对昆虫类研究较少，有待开发。随着人们对s o d 需求量的增高，对s o d 原料的 开发和提取和纯化牛产工艺提出了更高的要求，因此国内外对s o d 的提取和纯化的研究日益 深入。 1 1 超氧化物歧化酶与氧自由基的概述 1 9 3 8 年m a n n 和k e i l i n 在进行牛血的分离处理时，分离得到一种淡蓝色的含铜蛋白，命 名为血铜蛋白。直到1 9 6 8 印m c c o r d 在f r i d o v i c h 的指导下，在美蓝、黄嘌吟氧化酶和黄嘌吟 系统研究细胞色素c 还原作用时意外发现血铜蛋白是一种专一性清除超氧阴离子( 0 2 、) 的酶蛋 白，并在1 9 6 9 年将其命名为超氧化物歧化酶( s o d ，e c 1 1 5 i i ) 。此后，关于s o d 的研究及应 用开发目益深入，也促进了自由摹牛物学的发展。超氧化物歧化酶的发现被认为是2 0 世纪的 重大发现，“s o d 自被发现以后接踵而来的有关氧代谢的分了牛物学方面的一系列杰出的和创 造性的研究工作，简直可以与l9 5 3 年w a t s o n 和c r i c k 发表有名的d n a 双螺旋结构学说后引 起的结果相比拟【7j 。随后人们对s o d 进行了广泛的研究，它是已知的2 0 0 0 多种酶中研究报道 最多的酶之一，也是当今牛物学前沿研究。 第一章前言 1 1 1 氧自由基的产生 自由基是指带有未成对电予的分予、原予或离子。因为未成对电了具有成双的趋向，因 此常易发牛失去或得到电了的反应而显示出较活泼的化学性质。在牛物物体内，氧分子可以 通过单电了接受反应，依次转变为0 2 一、h 2 0 2 与o h 等中间产物。由于这些物质都是直接或 间接地由分子氧转化而来，而且具有比分予氧更活泼的化学反应性，统称为氧自由基，其中 0 2 。为丰要的氧自由基。在牛物体系中，产牛自由基方式有以下几种：物理化学方式：共价 键的热分解、辐射分解和单电了氧化还原反应体系内许多酶的反应是进行单电予转移产生氧 自由基。从细胞生物学与生物化学的角度，所有细胞内线粒体、内质网、细胞核、质膜和 胞液中产生氧自由基。在胞浆代谢及呼吸链中，体内的某些代谢中产生氧自由基。 例如，大量体育运动、吸烟、食用脂肪和腌熏烤肉、发牛炎症、某些抗癌药物、安眠药、 射线、农药、有机物腐烂、塑料用品制造过程、油漆干燥、石棉、空气污染、化学致癌物、 大气中的臭氧、有机体内的吞噬作用等都能产牛自由基。氧自由基是体内正常代谢的中间产 物，但具有毒性的自由基丰要是0 2 。、h 2 0 2 与o h ，这样愈来愈多的氧自由基在细胞内出现 会损伤细胞，引发各种疾病。很多研究表明，含氧自由基关系到多种疾病，可使细胞质和细 胞核中的核酸链断裂，会导致肿瘤、炎症、衰老、血液病以及心、肝、肺、皮肤等方面病变 的产生。已知自由基可损伤蛋白质，可使蛋白质的转换增加；氧自由基与d n a 分予中的嘌呤、 嘧啶、脱氧核糖作用，引起d n a 单链或双链的断裂、降解和修饰，从而影响d n a 的复制【8 】； 作用于巯基( 一s h ) 可使某些酶的活性降低或丧失；攻击未饱和脂肪酸可引起脂质过氧化，其氧 化产物可引起一s h 氧化、酶失活、膜功能受损、干扰膜的运送功能等。另外，由燃料废气、 香烟和一些粉尘造成的大气污染，使大气上空的自由基占分予污染物总量的i 1 0 ，因此 环境污染中的自由基反应也是不可忽视的。 1 1 2s o d 与氧自由基 氧自由基对牛物体既有必需的一面，又有损伤的一面，平衡机体内的氧自由基，己成为 化学及生物化学研究领域中热门的研究课题 引。定量低浓度的具有高活性的自由基不但不会 损伤机体，妨碍机体正常新陈代谢，而且可以发挥对机体有益的牛物效应。缺少自由基，不 少正常的牛理功能就不能完成：t u 是如果自由基的浓度过高，就会导致机体严重的氧化性损 伤。生物体内存在着产牛和消除超氧阴离子的平衡体系，一旦平衡被打破，生物体将可能产 第。章前言 生某些疾病死亡。幸好生物体内己发展出的s o d 可有效地清除超氧阴离予，s o d 是防御活性 氧，尤其是超氧化物阴离予防御系统中最重要的酶。0 1 。但同时生物也会迅速调节s o d 的相应 变化，以利牛存。然而有时调节是不够的，尚需有外源的清除氧自由基的s o d ，这将涉及到 药物s o d 治疗疾病的情况。 1 1 3s o d 、氧自由基与衰老有极密切的关系 如果体内自由基过多，机体自身清除过慢，就会加速机体衰老而诱发各种疾病。s o d 通过清除人体内过多的氧自由基延缓衰老、提高机体免疫力并增强对疾病的抵抗力，具有抗 炎、抗衰老和抗辐射的作用。它对人体内多余的自由基( 0 2 1 具有强大、高效、专一的歧化作 用，使毒性氧转化为无毒氧，减缓了自由基对人体细胞的损伤。由于自由基对我们人体细胞 损伤，正常细胞复制从4 0 代6 0 代降低至2 0 代 - 3 0 代，甚至只有几代，细胞很快就凋亡了。 人类寿命从此大大缩短，多病早衰，牛命质量极为低劣。s o d 消除了这些多余自由基，保证 了人类健康。 近年来国内外学者对灵长目、啮齿目动物等的研究发现：s o d 活性愈高，寿命越长：人 类s o d 的含量新牛儿最低，成年人最高，进入老年活性逐步下降，随之而来的是高血压、冠 心病、动脉硬化、老年痴呆等，s o d 活性下降越快，衰老速度越快，可见s o d 与抗衰老密切 相关。 1 1 4 氧自由基的清除 牛物体清除氧自由基的功能是由一些抗氧化剂和完整的酶系统来组成的。目前已经发现 了许多氧自由基的克星，也就是氧自由基清除剂或者抑制剂，如维牛素c 和e 、谷胱甘肽、 抗坏血酸、胡萝卜素、别嘌呤醇、超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化物酶( p o d ) 、过氧化氢酶 ( c a t ) 。s o d 是细胞内最重要的防御氧自由基的酶，它能去除新成代谢作用产生的超氧化物， 使其转化成氧分了和过氧化氢，过氧化氢再通过过氧化氢酶降解成氧气和水，从而保护细胞 防止氧化损伤。能较好的抵御氧自由基和其他氧化物自由基对细胞膜的毒性，在机体保护方 面起重要作用。0 2 还原为水的过程中第一个中间物就是0 2 一。s o d 的丰要功能是将0 2 。 歧化生成h 2 0 2 。其反应式为： 第一章前言 20 2 。 +2 h + c a t 催化h 2 0 2 分解为水这一步骤，需要谷胱甘肽作为电了供体，而谷胱甘肽过氧化物酶 是使过氧化氢以及广泛的脂类氢过氧化物失活的硒酶【i ，它将过氧化物还原成的羟基化合物， 以免它们分解成自由基重新对不饱和脂肪酸分予发牛过氧化作用。 根据营养流行病学的研究发现，经常食用新鲜的蔬菜与水果，有延缓衰老的作用，可以 降低肿瘤，特别是消化道肿瘤的发病率，就是因为蔬菜可以清除氧自由基的主要前身产物， 也就是超氧负离子，超氧负离了减少，氧自由基也就相应减少，由此也就可以延缓人的衰老。 营养学家研究发现，日常的水果、蔬菜大多数都具有清除超氧负离了的活动，蔬菜当中以荠 菜、青菜、蒜头、黄芽菜为最强，另外，经常吃富含维牛素a 的花菜、胡萝1 - 、菠菜、甘薯、 富含维生素c 的葡萄、桔了、青椒、含维素e 的柠檬、豌豆、未加工的麦胚芽、葵花籽油和 含硒的卷心菜、洋葱、燕麦片、海产品等等都是大有帮助的。 1 2 超氧化物歧化酶的类型 超氧化物歧化酶是一类金属酶，根据所含金属离予的不同，可将s o d 分为c u z n s o d 、 f e s o d 、m n s o d ，最近又发现种n i s o d i l 2 1 和f e z n s o d t l 3 】。 1 2 1c u z n - s o d 的结构和性质 金属离予为c u 、z n ，称为c u z n s o d ，呈蓝绿色，它丰要存在于高等植物的细胞质和叶 绿体中。动物血、动物脏器、菠菜叶、豌豆、酵母、麦叶、刺梨等动植物均含有c u z n s o d 。 近年来研究表明，不同来源的c u z n s o d 分了量有所不同( 从人肺中提纯s o d 分予量为 1 3 5 0 0 0 ，且含有4 个亚基外) ，亚基均为2 个。通过对已完成的c u z n s o d 全部氨基酸序列分 析结果的比较研究，不同来源的c u z n s o d 在氨摹酸序列上有高度的同源性，而且结构上也 有高度的同一性，且理化性质相似【1 4 , 1 5 。c u z n s o d 由两个亚基组成，每个亚基各含有一个 c u 和z n 。在每个亚基中c u 分别与4 个h i s 残基( h 4 6 4 8 6 3 1 2 0 ) f l d 位，z n 则与3 个h i s ( h 6 3 , 7 1 8 0 ) 和1 个天冬氨酸( d 8 i ) 配位，见图1 i ： 第章前言 图l lc u z b s o d 二聚体的结构 不同来源的c u z n - s o d 的紫外吸收光谱略有差异，c u z n s o d 具有独特的紫外吸收光谱， c u z n s o d 的紫外吸收光谱的共同特点是在2 5 0 2 7 0 r i m 之间均有不同程度的光吸收，由于色 氨酸和酪氢酸的含量较低，它在2 8 0 n r a 处并没有最大吸收峰。c u z n s o d 的可见光最大吸收 波长部在6 8 0 n m 寿右，这反映了酶分予中c u 2 + 的光学特性。 22m ns o d 的分子结构和陛质 金属离子为m b ，称为m n s o d ，里紫红色，丰要存在于原核细胞和真核细胞的基质中， 人和狒狒肝细胞及线粒体山也含有一定量的m n s o d 。m n s o d 分了量大于c u z n - s o d ，如小 鸡肝的m n - s o d 为四聚体分予量为7 9 4 0 0 ，太肠杆菌m n - s o d 为二聚体分予量为3 9 5 0 0 。 m b - s o d 在氨基酸的组成上与c b z b - s o d 不同的是含有较多的色氧酸和酪氢酸。不同来源的 m n - s o d 氨基酸序列也有较高的同源性不同来源的植物m n s o d 同源性达7 0 以上。 2 3f e s o d 的分子结构和性质 金属离子为f e ，称为f e s o d ，呈黄褐乜，f e s o d 一般位于一些植物的州绿体中。f e - s o d 的理化性质粪似于m n - s o d ，大多数原核牛物的f e s o d 葺um b s o d 是同源二聚体，而植物等 真核牛物的f e s o d 和m b s o d 是同源四聚体组成f e s o d 和m n s o d 的每个亚摹的分了质 5 第一章前言 量约为2 0k d a ，而且每个亚基结合有一个f e m n 原子。氨基酸残基组成也相似，均含有相当 多的色氨酸与酪氨酸，紫外吸收光谱中在2 8 0 n m 处呈最大吸收峰。 1 2 4n i - s o d 和f e z n - s o d 的结构和性质 h o n g d u ky o u n 等发现了包含y n i 和f e 、z n 金属离予的n i s o d 矛i - i f e z n s o d ，它们是同源 四聚体，n i s o d 亚基分了量大约为1 3 k d a ，其吸收光谱有两个峰在2 7 6 n m 、3 7 8 n m 和一个宽峰 在5 3 0 n m 。n i s o d , i ；基分了量大约为2 2 k d a ，其吸收光谱的吸收峰为3 0 0 5 0 0 n m 【17 1 。 1 3 超氧化物歧化酶的物理化学性质 1 3 1 氰化物和h 2 0 ：对s o d 活性影响 所有的c u z n - s o d 对氰化物敏感，只有1 m m o l l 2 m m o l l 的氰化物浓度即使其活性完全 丧失，而m n s o d 和f e s o d 却不被氰化物抑制。长时间用过氧化氢处理可使c u z n s o d 和 f e s o d 失活，而m n s o d 不受影响【l s 】。 1 。3 2 酸碱对s o d 活性影响 s o d 的等电点偏酸性，是一种酸性蛋白，在酶分了上以共价键连接金属辅基，因此它对 热、p h 及某些理化性质表王兕出异常的稳定性。s o d 在p h 5 3 9 6 间催化性能良好，在p h4 5 p h i l 间能稳定存在。p h3 6 时，c u z n s o d 中9 5 的z n 要脱落，在p h1 2 2 时，s o d 的构象会 发牛不可逆的转变而使酶失活。另外，有机酸对s o d 活力影响的实验结果表明，低浓度的有 机酸可使s o d 活力下降，f u 加入较高浓度有机酸时，s o d 活力下降的程度减轻。 1 3 3 温度对s o d 活性影响 s o d 对热的稳定性与溶液中离了强度有关。当离予强度很低时，即使加热到9 5 c ，其活 性损失也很少。s o d 在模拟胃酸和模拟胃肠道蛋白酶、胰蛋白酶环境中的稳定性研究表明， s o d 在动物胃肠道中具一定的稳定性，在胃酸的环境中，3 7 。c 保温1 5 0 m i n ，活性仍残存8 1 ， 在胃蛋白酶和胰蛋白酶环境中，保温2 1 0 r a i n 活性残存率分别为8 2 和8 4 。 第一章前言 1 。3 4 其他因素对s o d 活性影响 s o d 的一级结构和功能比较稳定，它耐受多种物理和化学因素的作用而保持结构和功能 完整，t u 它对氧自由基却异常敏感。多元醇和糖类一直用来作为保护牛物大分子活性的稳定 剂，在s o d 中加入不同浓度的海藻糖溶液均可提高酶活力，以0 2 8 m o l l 海藻糖溶液保护作 用最明显，随着时间的延长，海藻糖使s o d 的稳定性增加，保护作用更明显。s o d 活性还受 饮料的色泽、成分、酸碱度、乙醇含量等多种因素的影响，只有在无色、近中性、无乙醇饮 料中s o d 活性较稳定。 1 4 超氧化物歧化酶的应用 i 氢t s o d 具有理疗作用，而被广泛应用临床治疗、食品、化妆品中【1 9 2 0 1 。 1 4 1 用于化妆品类 可添加在化妆品中，具有抗氧化抗腐蚀的优良性能。以s o d 为丰要成份的产品风靡世界， 引发了化妆品历史上的一场革命，使人类永葆青春美丽梦想成真，s o d 添加于化妆品中可起 到4 方面的作用：一是有明显的防晒效果，光照使皮肤变黑的丰要原因是氧自由基损害，s o d 可有效防止皮肤受电离辐射( 特别是紫外线) 的损伤，从而起到防晒效果；二是s o d 为抗氧化 酶，能有效防止皮肤衰老、祛斑、抗皱：三是有明显的抗炎效果，对防治皮肤病有一定效果。 另外，s o d 具有一定的防治瘢痕形成的作用。国内外不少的高级化妆品添加有s o d ，可制成 面膜、奶液、霜剂等形式的化妆品。s o d 应用于化妆品的实验研究证明，当即1 2 5 i 标记s o d 外涂时，外源s o d 能透过皮肤进入体内。还有大量资料和实验表明，s o d 无毒、无副作用， 人甚至次面涂上几万乃至几十万单位的s o d 也不会出现不良反应，故s o d 用于化妆品是 安全的。作为s o d 化妆品，每l g 基质中s o d 的活性不应低于1 0 0 u 。采用修饰s o d 代替天 然s o d t 2 l 】，选择好化妆品基质，向其中添加适当的保护剂，如维牛素类抗氧剂、其它抗氧酶， 再就是注意选择化妆品中防腐剂和表面活性剂的品种和浓度等，都可明显提高s o d 的活性保 留牢。 第一章前言 1 4 2s o d 在食品中应用 经过多年的研究证明口摄入s o d 是有效的，这一论断为s o d 运用于开发功能食品提供 了理论前提。当s o d 作为功能性食品基料加入食品中时，可有效抵抗许多疾病的发生、发展， 对人体健康有很大作用。s o d 具有的抗氧化性及独特的生理功能使其作为食品添加剂和重要 的功能性基料而用于食品工业。在饮料、糖果、糕点等食品辛加入s o d 既可利用其抗腐蚀性 延长保质期，又可调节人体内分泌系统。被视为“生命科技中最具神奇魔力的酶”s o d 也是人体内的垃圾清道犬【6 】。目前已开发s o d 的丰要功能食品和保健食品：s o d 糖、s o d 干啤，强化s o d 牛奶，酸牛乳，冰淇淋，s o d 绞股蓝口服液等。由于牛奶中s o d 的含量低 于入乳中s o d 的水平，前者每m l 中含3 2 单位( u ) ，后者每m l 中含7 1 单位( u ) ，因此在牛 奶中添加s o d 使牛奶中的s o d 水平与人乳相近具有重要的意义。目前市场上的s o d 强化牛 奶和冰淇淋为试产品，批量正式投产还要解决好关键的工艺操作。 s o d 在啤酒中的应用，复方s o d 型啤酒经过一系列试验，证明其具有一定的“免疫调节” 功能。另外，由于s o d 、茶多酚等的抗氧化作用，对s o d 啤酒与普通啤酒对照品评时发现， s o d 的抗氧化性能非常显著，啤酒氧化速度大大低于普通u 卑酒，口味新鲜度明显延长。在新 鲜和加工的食品中往往存在有超氧游离基，这些超氧游离基能迅速氧化诸如抗坏血酸和生育 酚之类的重要营养组分。 对哺乳动物源中s o d 的研究表明，s o d 对乳本身起到抗氧化的作用，现已发现在牛乳中 s o d 在7 1 7 下经1 5 s 后，仍对巴氏消毒作用有抵抗作用，s o d 能除去诱发脂类过氧化作用 的超氧游离摹，从而达到防止牛乳败坏的目的。试验表明，超氧游离基可能是引起异味和变 色化合物的潜在前体，这些化合物在某些条件下经过氧化酶的氧化作用而形成。过氧化酶活 性通常被人们认为对植物性食品的品质有害，s o d 对防止由于过氧化酶活性而引起质量降低 有定的作用。脂肪过氧化反应可以通过黄嘌呤氧化酶体系产生0 2 “或通过脂氧化酶来诱发， 但存在s o d 时则被抑制，已发现鲚油自动氧化作用由于s o d 的存在而延缓。由此可见，超 氧化物歧化酶是一种可能作为食品中天然抗氧化剂的酶，匪于其来源于动植物，所以该物质 具有较高的安全性。功能食品是2 l 世纪食品工业的发展方向，当今在欧美，日等过利用s o d 开发的功能食品都走在我国前面，所以开发功能食品迫在眉睫。 第一章前言 1 4 3s o d 在治疗疾病中应用 s o d 作为一种生化酶制剂，作为药品在临床上有广泛的应用，作为药用s o d ，在美国、 德国等国已有产品【2 2 1 ，具有极强的搞衰老、抗肿瘤、调节人体内分泌系统作用【2 3 1 ，在医药上 主要集中在炎症病患者，尤其治疗类风湿关节炎、慢性多发性关节炎、心肌梗塞、心血管病、 肿瘤患者以及放射性治疗炎症病患者，它作为一种临床药物在治疗自由基损伤引起疾病方面 的效果是显著的，且用s o d 治疗炎症的优点是不损伤软骨，而类固醇类和非类固醇类药物都 可能破坏软骨组织。对人体疲劳迅速恢复体力也有独特的效用。宫颈癌是妇科最常见的恶性 肿瘤，严重影响广大妇女的身心健康，通常采用综合治疗。化学治疗的丰要机制是诱导肿瘤 细胞凋亡，国外报道抗肿瘤药物诱导肿瘤细胞凋亡与氧自由基产生增多有密切关系，抗癌剂 可使某些肿瘤细胞株活性氧产生增多。超氧化物歧化酶( s o d ) 是机体内最重要的抗氧化剂，可 用于临床肿瘤患者放化疗防护 2 4 1 。 此外，s o d 还可作辐射防护剂、治疗白内障，应用于肾、肝、心脏等器官的保存和移植、 断肢再植和整形美容等于术过程。研究还表明对非外排机制的砷解毒，s o d 必不可少的，其 作用是保护超敏感的巯基【2 川，在抵抗重金属时也起到重要的作用。 陈百华等【2 6 】研究表明，氧自由摹产牛和清除系统的失衡，氧化应激的增加，是早期糖尿 病视网膜病变中视网膜毛细血管周细胞选择性丧失的重要原因【2 7 】，糖基化终产物诱导培养的 视网膜毛细血管周细胞凋亡伴有细胞内s o d 活性的下降，随着糖基化终产物促周细胞凋亡率 的增加，周细胞内s o d 的活性也相应下降，而增加s o d 又能明显抑制糖摹化终产物作用下 周细胞的凋亡。说明，s o d 是周细胞凋亡的重要调节因子。超氧化物岐化酶为氧自由基清除 剂。脊髓组织中自由基增多后，s o d 则显消耗性减少。即脊髓损伤后脊髓内s o d 含量逐渐下 降，显然其参与继发性损伤的病理过程。郑望萄等研究表明，早期应用s o d 可降低脊髓组织 丙二醛的牛成( p 0 0 5 ) ，t u 早期外源性供氧与s o d 联合应用则可显著降低脊髓组织丙二醛的 生成( p 0 。0 1 ) 。组织形态学观察可见，联合用药组脊髓组织损害程度明显较单独用药组轻，髓 鞘结构大致正常。说明控制了急性脊髓损伤，联合用药在神经功能恢复及细胞修复方面较单 一用药组优。提示外源性供氧与s o d 的应用可通过降低自由基的氧化损害而发挥保护受伤脊 髓组织的【2 8 j 。 第一章前言 1 5 超氧化物歧化酶提取原料 凡是需氧的原核牛物和真核牛物体内都含有s o d 。以前认为厌氧微生物细胞不含s o d ， 现在己发现多种厌氧细菌也含有s o d 。到目前为止，人们己经从细菌、真菌、原生动物、藻 类、昆虫、鱼类、植物和哺乳动物等生物体内分离得到了s o d ，但注意力大都集中在动物组 织与血液中，如鸡干【2 9 】、虾【3 0 1 、兔血【3 l j 、马血、牛血、鸭血、鼠肺和植物，如沙棘【3 2 】，玉 米【3 3 j ，大甜3 4 1 、蔬菜、莴笋、茶n i 、蚕豆、绿豆、大豆中提取s o d 有关研究。从牲畜中提取 所用原料有限，s o d 质量不稳定 3 5 1 ，而植物原料中s o d 含量低。从昆虫中提取s o d 虽也有 研究，但仅停留在初步验证阶段。目前对整个过程工艺状况报道很少，已报道的也多是稍有 涉及。 1 5 1 黄粉虫 黄粉虫，学名( t e n e b r i om o l i t o rl i n n e ) ，别名大黄粉虫、黄粉甲、汉虾，俗称面包虫。属 鞘翅目，拟步行虫科，粉虫属，分布于我国各地 3 6 1 。是一种大型仓贮害虫和牛理、遗传学实 验材料，又是一种高蛋白、高脂肪、氨基酸含量较全面的昆虫资源，被誉为动物的营养宝库， 并可进行加工，使其具有更好的饲用、药用和食用价值。黄粉虫蛋白质中氨基酸种类齐全， 组成合理，含有人体不能合成的8 种必需氨基酸，其必需氨基酸总量高于猪肉、羊肉和大豆， 接近于牛肉和鱼的含量。目前，黄粉虫作为对人有益的资源昆虫在饲料、食品和医药保健品 以及抗菌蛋白等方面具有的综合利用价值备受人们的青睐，正处在大力开发中【3 7 1 。黄粉虫适 应能力很强，为多食性昆虫，以麦麸、玉米面、农作物秸秆、青菜、秧蔓等为食，每5 _ 7 天 投喂一次，生产周期5 0 6 5 天，饲料成本低，饲料转化率达3 0 以上( 一般只需要2 5 - 3 0 k g 饲料可牛产l k g 黄粉虫) ，饲养用具只是一些木盒了、木架予等，投资千元即可生产，它具有 经济效益高，饲料来源广，饲养设施简单，好饲养、易箭殚、无疫病、饲养不受场地、季节 等条件的限制，适合进行工j 。化牛产等特点，是一种极具开发潜力的昆虫。在所有昆虫中， 黄粉虫的营养价值高的惊人，蛋白质含量更高达5 6 ，堪称营养家魁首。追求绿色昆虫蛹菜， 成为一种时尚，而把昆虫加工成保健品，更成了人们进补的佳品。目前对黄粉虫的开发利用， 丰要作为饲料或对其酶解产物的利用。而从黄粉虫中提取高附加值的酶类的报道较少【3 8 1 。 第一章前言 1 5 2 蚕 我国是世界上最大的养蚕国，蚕属于一种经济昆虫，分布广泛，在东北、河南地区饲养 比较多。柞蚕的蛹是当地居民的美味佳肴，俗称“小神仙”，不仅味道鲜美，还具有预防心血 钱：疾病、护肤、美容等神奇功效。蚕蛹( b o m b y x m o r i l ) 是蚕丝业的主要副产品，我国蚕蛹资源 丰富，年产蚕蛹3 0 万吨以上，约占全世界总产量的8 0 【3 9 l 。蚕蛹为药膳同源的传统中药材， 具有丰富的营养价值，开发蚕蛹蛋白具有很高的经济价值。f u 是目前国内外对蚕蛹的深开发 较少，大部分蚕蛹直接用作畜禽例料及水产养殖。我国有极少数用于药物和保健食品，日本 试用蚕蛹蛋白粉加入面包、蛋糕中，韩国用蚕蛹蛋白开发了2 0 多种食品，绝大多数都停留在 蚕蛹蛋白的简单加工水平上【4 0 1 。纪平雄、侯君以柞蚕蛹粉为材料，经提取及一系列纯化步骤， 获得菱形结晶的s o d ，并证明是一种c u z n s o d ，且有较高的活性。我国的产蚕蛹量大，蚕 蛹将是s o d 的新酶源【4 。 1 5 3 啤酒酵母 啤酒是以谷物为原料，经麦汁糖化和酵母发酵而成，在整个酿造过程中不可避免的会产 生一定量的副产物或者称之为废弃物。啤酒酿制过程中的废弃物丰要是啤酒糟和废酵母，也 有硅藻土污泥和少量蛋白沉淀物，另外还有废二氧化碳气体等。随着啤酒产业的迅猛发展， 啤酒废酵母产量也与日俱增。我国现有啤酒企业5 0 0 多家，年产啤酒近3 0 0 0 多万吨，每年产 啤酒废酵母6 0 9 0 万吨，目前我国啤酒废酵母尚未得到充分利用，除将小部分酵母泥留作种子 使用外1 4 引，一些啤酒废酵母被干燥为饲料蛋白，大部分连同其中的残留啤酒直接排入下水道， 严重污染环境瞰】，或者是加工成附加值较低的一些产品。实际上，啤酒酵母( s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ) 含有许多营养成分，且无毒，这是一巨大的宝贵资源，在欧美发达国家，由于受环 境保护法的严格制约，啤酒副产品及废弃物的开发利用获得高度重视。在中国，人们也逐渐 重视这个问题，近几年，啤酒企业和高校。研究所联下，共同寻找出了许多啤酒副产品及废 弃物的应用领域和综合回收利用途径。研究酵母中牛物活性物质，合理开发利用啤酒废酵母， 将产牛良好的经济效益和社会效益，其中从部分啤酒废酵母泥中提取开发s o d 就是重要的一 条途径，不仅作为商品供应市场，且自产自制s o d 啤酒，既不必从外购买s o d ，又开发了创 新产品增效创收。因此，这是一条利国利民的好路了。从s o d 市场分析，其良好的效果和应 第一章前言 用范围，仍在不断扩大。从啤酒废酵母中提取的c u z n s o d 较之从其它动物血液中提取的最 大特点是不存在抗原反应，成本低。啤酒企业的管理者可就地取材，产品紧销，效益可观4 3 1 。 1 6 超氧化物歧化酶提取方法研究进展 目前获得的s o d 粗提液，含有大量的杂蛋白，为了纯化s o d 常采用沉淀的方法，有选 择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分，以提高酶的比活。传统的丰要方法有：热变性法 是提取工艺中一种较为廉价的方法，可以降低牛产成本，并且简单易行。热变性法不引入其 他杂质，对提取工艺非常有利。s o d 是一种热稳定性较好的酶，并且大部分杂蛋白在5 5 时 就可变性，因此可以利用s o d 和杂蛋白变性温度的差异来实现初步分离。丙酮分级沉淀法： 向蛋白质溶液中加入丙酮有机溶剂，水的活度降低。随着有机溶剂浓度的增大，水对蛋白质 分子表面荷电集团或亲水基团的水化程度降低，溶液的介电常数下降，蛋白质分子间的静电 引力增大，从而沉淀【4 引。n i n gh e ，q i n g b i a ol i 【2 l 等人研究发现，加入粗提液等量的冷丙酮，效 果最好，去除近4 0 蛋白质，酶活力仅轻微降低。硫酸铵盐析法：硫酸铵是常用的盐。因 为价格便宜，操作简单，安全，且可较好的保持s o d 的活性。溶解度大且受温度影响小，具 有稳定蛋白质的作用，它常用在蛋白质初级纯化和浓缩。n a m i ri a ，h a d d a d ，q i n s h e n gy u a n 【4 副 采用5 0 - 7 5 硫酸铵沉淀部分蛋白质，然后依次采用阴离子交换柱( d e a e 5 2 ) 、葡聚糖凝胶 g 2 0 0 和阴离了交换柱( d e a e 5 2 ) 层析，获得s o d 提取液比活力高达4 8 4 3u m g 。层析是获 得s o d 精品的重要一步，对s o d 比活力有很大提高，在经过沉淀分级后常采用层析方法纯 化s o d 提取液，目前国内外对层析的多步组合纯化研究较泞跃。c u i l u a ny a o ，a n l iw a n g 【4 6 j 等人依次采用了热处理、硫酸铵分级沉淀法、d e a e 纤维素3 2 离了交换层析和羧甲基纤维素 阳离了交换层析方法纯化s o d 粗提取液。c h e r y ll f a t t m a n ，j a nj e n g h i l d l 4 7 l 等人提取鼠肺细胞 外s o d 采用1 5 聚乙二醇离心，肝磷脂琼脂糖凝胶层析柱( 2 5c m x 2 0c m ) 层析，q 琼脂糖凝 胶层析，伴刀豆球蛋白a 琼脂糖凝胶层析，m o n oo 一琼脂糖凝胶层析，m o n os 琼脂糖凝胶层 析等步骤进行纯化，伴j 豆球蛋白a 琼脂糖凝胶层析是重要的一步，比活力提高3 倍，仅失 去1 6 的酶活性。最后获得的s o d 粗提液比活力高达1 5 0 0 0 u m g 。 1 7 双水相萃取技术概述 第一章前言 早在l8 9 6 年，b e i j e r i n c k t 4 8 j 观察到，明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉溶液混合时，得到一 种不透明的混合溶液，静置后可分为两相，上相中含有大部分的明胶，下相中含有大部分琼 脂( 或淀粉) ，这种现象被称为聚合物的不相容性，从而产牛了双水相。将两种不同的水溶性聚 合物的水溶液混合时，当聚合物浓度达到一定值，体系会自然的分成互不相溶的两相，这就 是双水相体系。 聚合物与聚合物、聚合物与盐的双水相系统在牛物工艺研究中的使用已