胡俊论文 不同水中细菌总数及大肠菌群的测定.doc

2011届本科生毕业论文 水中细菌总数及大肠菌群的测定不同水中细菌总数及大肠菌群的测定胡俊（化学与生命科学院2007级生物科学班）指导老师：王海潮摘要：本实验采用平板菌落计数法、多管发酵法和滤膜法等方法测定东区自来水、珍珠湖和柳溪水中细菌总数和总大肠杆菌群，按照我国饮用水卫生标准（GB5749-85）规定每毫升水样细菌总数37培养24h不得大于100个，每升水中总大肠菌群37培养48h小于3个，来判断这三种水是否符合饮用水标准。结果表明：自来水的细菌总数为30CFU/mL，总大肠菌群数1CFU/L；珍珠湖水的细菌总数为1.0104CFU/mL，总大肠菌群为2.4103CFU/L；柳溪湖水的细菌总数为3.0105CFU/mL，总大肠菌群为2.8103CFU/L。自来水符合饮用标准，而珍珠湖和柳溪湖水不适合饮用。关键词：细菌总数； 总大肠菌群； 平板菌落计数法； 多管发酵法； 滤膜法引言水对我们的生命起着重要的作用，它是生命的源泉，是人类赖以生存和发展的不可缺少的最重要的物质资源之一。人的生命一刻也离不开水，水是人生命需要最主要的物质。水也是细菌存在的天然环境，水中的细菌来自土壤、尘埃、污水、人畜排泄物及垃圾等。水中细菌种类及数量因水源不同而异。一般地面水比地下水含菌数量多，并易被病原菌污染。许多可致病的细菌种类也常常存在于水中，人们饮用后引发疾病，例如：痢疾、伤寒、霍乱等流行于世界各地，猖狂为虐，大多是饮用水污染了这些病原菌之故1。水质细菌学检验是培水和污水水质分析工作中的一项重要指标。作为水质日常检测的七项指标(色度、浊度、细菌总数、大肠菌群、余氯、铁、锰)之一的细菌总数和大肠杆菌指数，能非常直观地反映水被细菌污染的程度。作为水质卫生学检测的两个常用的微生物基础指标，细菌总数和大肠杆菌指数在环境水质监测中起着非常重要的指标意义2。大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。水的大肠菌群数是指100mL水样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数(MPN)表示3。良好的饮用水细菌总数应小于100CFU/mL,而大于500CFU/mL则不宜饮用，我国饮用水卫生标准规定每毫升水样细菌总数37培养24h不得大于100个；每升水中总大肠菌群37培养48h小于3个；每升饮用水的水源中，总大肠菌群不得超过1000个4。长期以来，微生物学工作者在探索新的细菌学检测方法方面做了大量的研究工作，一些先进方法应运而生，如快速荧光法和检测片法。快速荧光法5的原理是通过试剂促进活菌释放出较多的ATP活性物质，当活性物质与荧光酶反应时会发出荧光。对荧光计数就能得到细菌总数，该方法只需要短暂培养。检测片6是一种已经固化好培养基的纸制培养片。以3M公司的PetrifilmtmTM (Aerobic CountPlate)检测片为例，在检测时先用移液管在培养纸面上滴加lmL水样，马上盖上保护膜。再用有凹面的压板压出圆型(压出的凹人体积正好为lmL)，lmin后水样即溶解，培养基并固定，最后倒置培养。本次实验采用传统的平皿计数法检测水质中的细菌总数，不需要复杂的仪器和试剂，操作简单，方便。 水中大肠菌群的传统检验方法包括：试管发酵技术和滤膜过滤技术。现在新兴发展的方法包括：酶活性检测法、纸片法、免疫学方法、分子生物学方法和试剂盒法等。由于样品中大肠菌群的数量通常很少，因此发展特异、敏感的检测方法至关重要，新的检测体系可能会满足这一要求，但技术上的复杂性以及检测成本的昂贵制约了这些新技术的广泛应用7。本次实验采用常用多管发酵法和滤膜法来检测水中大肠菌群。多管发酵法的优势在于运用广泛，适用于各种水样的检验，不受浊度的影响，可以检验浊度比较大的水样，结果比较稳定，价格便宜，不需昂贵设备。滤膜法的优势在于操作简单、快速，非常便于检测大批量的低浊度水样，特别适用于自来水厂作为常规监测之用8。1 实验部分1.1 实验材料1.1.1 材料来源水样取自微生物学实验室，珍珠湖和柳溪。1.1.2 主要的实验仪器与工具SHP-250型生化培养箱（上海三发科学仪器有限公司），DHG-9053A型恒温干燥箱（上海一恒科技有限公司），SW-CJ-IFD型超净工作台（苏净集团安泰公司），GI54DWS型高压灭菌箱（致微（厦门）仪器有限公司），XS-212-201型显微镜（江南江光科学仪器有限公司），YP202N型电子天平（上海精密科技仪器有限公司），海尔冰箱（青岛海尔有限公司），控温电炉，接种环，酒精灯，烧杯，培养皿，三角烧瓶，记号笔，载玻片，盖玻片，双层瓶，擦镜纸，玻璃棒，pH试纸。1.1.3 实验药品牛肉膏，蛋白胨，NaCl，乳糖，琼脂，KH2PO4，美蓝，伊红，碘片，95%乙醇，草酸铵，溴甲酚紫，番红，碘化钾，结晶紫，NaOH，HCl。1.2 实验方法1.2.1 水样的采取9将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧3min后，水流5min，以灭菌三角瓶接取水样备用；在距珍珠湖和柳溪岸边5m处，取距水面10-15cm的水样，将灭菌的具塞三角瓶瓶口向下浸入水中，后翻转过来，除去玻璃塞，水流入瓶中，盛满后，盖好瓶塞，从水中取出，放入4冰箱中保存。1.2.2 培养基的配制91.2.2.1 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基称取牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂18g，倒入1000mL大烧杯中，电炉上加热至完全溶解，定容至1000mL。用NaOH或HCl调pH值至7.0-7.2，倒入三角烧瓶中，121C，灭菌20min。1.2.2.2 乳糖蛋白胨培养基:称取牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，乳糖5 g，倒入1000mL大烧杯中，电炉上加热至完全溶解，后定容至1000mL。用NaOH或HCl调PH至7.27.4.。加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于有发酵管的试管中。115C，灭菌20 min。1.2.2.3 伊红美蓝琼脂培养基将100mL已灭菌的蛋白胨水琼脂培养基加热熔化，冷却至60C左右时，把已灭菌的2mL 20%乳糖溶液、2mL2%伊红水溶液和1 mL0.5%美蓝水溶液以无菌操作加入，摇匀后，立即到平板。1.2.3革兰氏染液10的配制草酸铵结晶紫染液：结晶紫2g， 95%酒精20mL，草酸铵0.8g和蒸馏水80mL混合，静置48h后使用；卢戈氏碘液：碘化钾2.0g，碘片1.0g蒸馏水定容至300mL；番红复染液：番红2.5g溶于10mL95%的酒精中，再用80mL蒸馏水混合而成。1.2.4 水中细菌总数的测定91.2.4.1 自来水样的检测无菌吸管吸取1mL水样，注入灭菌培养皿中，共做2个。将熔化后保温至45的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平皿，每皿约15mL，趁热转动。另取一培养皿，不加水样，倾注牛肉膏蛋白胨琼脂培养基15mL，作空白对照。待琼脂凝固后，37培养24h，计数。1.2.4.2 珍珠湖水样的检测将珍珠湖水样稀释成10-1、10-2、10-3三种稀释度的稀释液，分别吸取1mL于灭菌平皿内，每个稀释度作2个重复。将熔化后保温至45的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平皿，每皿约15mL，趁热转动。待琼脂凝固后，37培养24h，计数，乘以稀释倍数，得1mL水样中的细菌菌落总数。1.2.4.3 柳溪河水样的检测柳溪水样稀释成10-2、10-3、10-4三种稀释度，分别吸取1mL于灭菌平皿内，每个稀释度作2个重复。将熔化后保温至45的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平皿，每皿约15mL，趁热转动。待琼脂凝固后，37培养24h，计数，乘以稀释倍数，得1mL水样中的细菌菌落数。计算方法如表1-1。表1-1 水中菌落总数的测定方法例次稀释度及菌落数两个稀释度菌落数之比菌落总数/（cfu/mL）报告方式菌落总数/（cfu/mL）10-110-210-31多不可计16420-1640016000或1.61042多不可计295461.63775038000或3.81043多不可计271602.22710027000或2.71044多不可计多不可计313-313000310000或3.1105527115-270270或2.71026000-10107多不可计30512-3050031000或3.11041.2.5 多管发酵法测定水中总大肠菌群1.2.5.1 自来水样的检测12初发酵实验：在2个各装有50mL的三倍浓缩乳糖蛋白胨培养基的三角瓶中(内有倒置发酵管)，以无菌操作各加水样100mL。在10支装有5mL的三倍浓缩乳糖蛋白胨培养基的发酵试管中，以无菌操作各加入水样10mL。摇匀后，37培养24h。平板分离：经24h培养后，将产酸产气及只产酸的发酵管，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板(EMB培养基)上，37培养1824h。大肠菌群在EMB平板上，菌落呈紫黑色，具有或略带有或不带有金属光泽，或者呈淡紫红色，仅中心颜色较深；挑取符合上述特征的菌落进行涂片，革兰氏染色，镜检。复发酵试验：将革兰氏阴性无芽胞杆菌的菌落的剩余部分接种于普通浓度乳糖蛋白胨培养基发酵试管中，为防止遗漏，每管接种来自同一初发酵管的平板上同类型菌落3个，37培养24h，若产酸又产气，证实有大肠菌群存在。最后根据证实有大肠菌群存在的复发酵管的阳性管数，查表1-2，报告每升水样中的大肠菌群数。表1-2 总大肠菌群检数表 012备注每升水样中大肠菌群数012345678337111418222731481318243036435111182738527092120161接种水样总量300mL（100 mL2份，10 mL10份）936602301040692301.2.5.2 珍珠湖水样的检测13 将珍珠湖和柳溪水稀释成10-1。分别吸取1mL10-1的稀释度水样和原水样，注入有10mL普通浓度乳糖蛋白胨发酵（内有倒置发酵管）管中。另取10mL和100mL原水样分别注入装有5mL和50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中。混匀后，37培养24h，24h未产气的继续培养至48h。以下步骤与上述自来水的平板分离和复发酵实验相同。证实有大肠菌群的存在后，将100mL、10mL、1mL、0.1mL 水样的发酵管结果查表1-3，获得每升水样的检测结果。 表1-3 总大肠菌群检数表接种水样量/mL每升水样中大肠菌群数备注1001010.1-9接种水样总量为111.1 mL（100，10，1，0.1mL各一份）-+9-+-9-+-9.5-+18-+-+19-+-22+-23-+28+-+92+-+-94+-+180+-230+-+960+-2380+2380注：“+”表示大肠菌群发酵阳性，“-”表示大肠菌群发酵阴性，下同。1.2.5.3 柳溪河水样的检测13检测方法与珍珠湖水样相同。1.2.6 滤膜法测定水中总大肠菌群14将水样注入已灭菌的放有滤膜的滤器中，经过抽滤，细菌即被均匀地截留在膜上，然后将滤膜贴于大肠菌群选择性培养基上进行培养。再鉴定滤膜上生长的大肠菌群的菌落，计算出每升水样中含有的大肠菌群(MPN)。滤膜灭菌：滤膜放入烧杯中蒸煮3次，每次15min。前两次煮沸后换无菌水洗涤3次；滤器灭菌：容量为500mL的滤器，121，灭菌20min。过滤水样：用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，粗糙面向上贴放于已灭菌的滤床上，固定漏斗，注入100mL摇匀珍珠湖和柳溪水样，抽滤。然后将滤膜移放在伊红美蓝琼脂培养基上，滤膜截留细菌面向上与培养基完全紧贴，37，培养16-18h。自来水样则注入1000mL过滤。结果判定：挑选紫红色，具有金属光泽；深红色，不带或略带金属光泽；淡红色，中心颜色较深的菌落，进行革兰氏染色，镜检。革兰氏阴性无芽胞杆菌，再接种于乳糖蛋白胨培半固体养基上，37培养6-8h，产气，判定为大肠菌群阳性。 计算：自来水样直接计数，珍珠湖和柳溪水样计算公式如下：1L水样中大肠菌群数=滤膜上的大肠菌群菌落数10。2 结果与分析2.1 水中细菌总数的测定结果2.1.1 自来水样的检测平板1中菌落数为32，平板2中菌落数为28，两者平均数为30，求得自来水中细菌总数为30 CFUmL-1，根据我国饮用水卫生标准（GB5749-85），宿州学院自来水符合饮用标准。数据见表2-1。表2-1 自来水样的细菌总数平板菌落数自来水中细菌总数/（CFU.mL-1)132302282.1.2 珍珠湖水样的检测珍珠湖10-1、10-2和10-3三种稀释度水样中平均细菌数分别为500、101和24。只有10-2稀释度水样中平均细菌数在30-300之间，将其值乘以该稀释倍数得珍珠湖水中细菌数为1.0104 CFUmL-1，数据见表2-2。表2-2 珍珠湖水样的检测结果稀释度10-110-210-3平板121212菌落数500530115872523平均菌落数51510124稀释度菌落数之比-细菌总数/（CFUmL-1)10100或1.01042.1.3 柳溪河水样的检测柳溪10-2、10-3 和10-4三种稀释度水样中平均细菌数分别为688、215和39。 10-3 和10-4 两种稀释度水样中平均细菌数在30-300之间，二者比值为1.8小于2，取两者平均数，得柳溪水中细菌总数数为3.0105 CFUmL-1，根据我国饮用水卫生标准（GB5749-85），不可以饮用。数据见表2-3。表2-3 柳溪水样的检测结果稀释度10-210-310-4平板121212菌落数7566202262044533平均菌落数68821539稀释度菌落数之比1.8细菌总数/（CFUmL-1)302500或3.01052.2 多管发酵法测定水中总大肠菌群结果2.2.1 自来水样的检测100mL水样的阳性管数为0，10mL水样的阳性管数为0。参照表1-2自来水总大肠菌群检数表得每升自来水样中总大肠菌群数小于3个。根据我国饮用水卫生标准（GB5749-85），宿州学院自来水符合饮用标准。 表2-4 自来水总大肠菌群检测结果 012每升水样中大肠菌群数01233748131118272.2.2 珍珠湖水样的检测接种100mL、10mL和1mL的发酵管呈阳性反应，接种0.1mL 的发酵管呈阴性反应。查表1-3得珍珠湖每升水样中总大肠菌群数为2.4103。根据我国饮用水卫生标准（GB5749-85），宿州学院珍珠湖水不符合饮用标准。表2-5.珍珠湖水总大肠菌群检测结果接种水样量/mL每升水样中大肠菌群数1001010.1+-+960+-23802.2.3 柳溪河水样的检测接种100mL、10mL、1mL、和0.1mL的发酵管都呈阳性反应。查表1-3可得柳溪每升水样中总大肠菌群数大于2.4103 ，具体的数值，可由滤膜法测出，但是根据我国饮用水卫生标准（GB5749-85），宿州学院柳溪水不符合饮用标准。表2-6 柳溪河水总大肠菌群检测结果接种水样量/mL每升水样中大肠菌群数1001010.1+-+960+-2380+23802.3 滤膜法测定水中总大肠菌群结果抽滤过自来水，珍珠湖和柳溪三种水样的滤膜，经过培养计数，共做三组求得膜上的大肠菌群数为的平均值为1、240和252。自来水样抽滤1000mL直接计算。珍珠湖和柳溪水样参照计算公式：1L水样中大肠菌群数=滤膜上的大肠菌群菌落数10得到自来水中总大肠菌群数为1CFUmL-1 ，珍珠湖水中大肠菌群数为2.4103 CFUmL-1，柳溪水中总大肠菌群数为2.8 103 CFUmL-1，数据见表2-7。表2-7 滤膜法测定水中总大肠菌群结果水样滤膜上的大肠菌群菌数平均值1L水样中大肠菌群数自来水10111珍珠湖2402382472412410柳溪28128927728228203 讨论细菌总数和总大肠菌群数是环境水质监测工作中的必测项目，检测的结果直接反应了环境水质的生物学指标的好坏。我国各地环保、防疫部门等开展这两个项目的检测比较普及，开展的时间也比较长。但是，这两个项目同一般的理化检测手段相比，又有较大的差异性，有它自身的特点，要做好它们也不是件容易的事。这两个项目的实验中常遇到的几个技术问题一定要注意：培养基与稀释水的准备；无菌条件试验；细菌总数的报告；总大肠菌群数测定的精确度问题；检测的范围与报告的形式15。平板菌落计数技术测定水中细菌总数很方便，但是由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以某种培养基平板升生长出来的水中细菌总数仅是近似值。目前一般采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，该培养基营养丰富，能使大多数细菌生长16。多管发酵法和滤膜法常用来测定水中大肠菌群数，两种方法各有优劣。 多管发酵法的优势在于不受浊度的影响，可以检验浊度比较大的水样，结果比较稳定，价格便宜，不需昂贵设备，但缺点在于操作繁重，工作量大，需要时间长，每种水样都需要作系列稀释，加上后续确认试验大约需要 96h 以上，还有它实际上是根据统计学理论估计水体的大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法，属于半定量试验，通常饮用水待检样品中大肠杆菌的数量很少，无法得出具体的值，不适用出厂水及管网水等生活饮用水的检验。滤膜法的优势在于非常便于检测大批量的低浊度水样，特别适用于自来水厂作为常规监测之用，缺点是不适用于杂质较多 易于阻塞滤孔的水样，特异性不高，结果容易受水样中其它细菌的影响而出现误判，需要结合进一步的确认试验才能最终确定结果，但结果的确认至少需要 2- 3d 的时间，不利于预防和应对突发公共卫生事件17。珍珠湖和柳溪不论从哪个指标看不符合饮用标准，受到一定程度的的污染。我们要采取相应的方法进行治理，因为水体受到污染后危害极大，比如含有大量氮、磷、钾的生活污水的排放，大量有机物在水中降解放出营养元素，促进水中藻类丛生，植物疯长，使水体通气不良，溶解氧下降，以致使水生植物大量死亡，水面发黑，形成水的富营养化。富营养化的水臭味大、颜色深、细菌多，这种水的水质差，不能直接利用，并致水中鱼大量死亡。4 结论1.自来水每毫升水样中细菌总数为30个，每升水样中总大肠菌群为1个。 2.珍珠湖每毫升水样中细菌总数为1.0104个，每升水样中总大肠菌群为2.4103个。3.柳溪河水样细菌总数为3.0105个，每升水样总大肠菌群为2.8103个。4.实验室自来水符合饮用标准，而珍珠湖和柳溪河水严重超标，不符合饮用标准，必须采取一定措施治理。参考文献1 王少沛,曹煜成,李卓佳,等.水生环境中细菌与微藻的相互关系及其实际应用J.南方水产,2008,4 (1):76-80.2 黄有芳.水中细菌总数与大肠杆菌检测方法的比较研究J.化学工程与装备,2007,5(9): 99-102.3 马颖,龙腾锐,方振东.PCR技术检测饮用水中大肠杆菌数J.中国给水排水,2004,20(6): 93-95.4 金银龙.生活饮用水标准检验方法S.北京:中国标准出版社,2007.5 陈静春,陈国强,微生物学实验指导M.北京:北京科学出版社,2005.6 吴咏今,马中飞,张淑颖,等.几种水中细菌总数检测方法的比较J.中国公共卫生, 2009,6 (6):123-126.7 Prescott L M. 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